Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Das Auftreten von plötzlichem Herztod, das häufig durch ventrikuläre Tachyarrhythmien ausgelöst wird, stellt bis heute eine Herausforderung bei der Therapie der Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz dar. Derartige Arrhythmien werden bei über 85% der Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz beschrieben und über 50% der Todesursachen werden dabei auf das Auftreten von plötzlichem Herztod zurückgeführt. Es wird vermutet, dass das elektrische Remodeling als Teil der gesamten kardialen Umbauvorgänge bei der Entstehung einer Herzinsuffizienz die pathophysiologische Grundlage dieser Arrhythmien darstellt. Das Renin-Angiotensin-Aldosteron System spielt eine zentrale Rolle bei der Ausbildung des elektrischen Remodeling und insbesondere erhöhte Aldosteronkonzentrationen korrelieren mit dem Risiko kardiovaskulärer Zwischenfälle. Darüberhinaus konnte in zwei klinischen Studien (RALES und EPHESUS) gezeigt werden, dass die Therapie herzinsuffizienter Patienten mit den Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon die Mortalität und Morbidität und insbesondere auch das Auftreten von plötzlichem Herztod signifikant senken konnte. Weitere Studien zeigen eine Verbindung zwischen dem Auftreten einer Herzinsuffizienz und Veränderungen in der Funktion und Expression kardiospezifischer repolarisierender K+-Kanäle. Neben den klinischen Daten, die einen protektiven Effekt der Aldosteronantagonisten bei plötzlichem Herztod belegen, ist wenig über die Auswirkungen von Aldosteron auf das elektrische Remodeling des Herzens bekannt. In dieser Arbeit sollte daher die Auswirkung einer chronischen Aldosteronexposition in Ratten auf die elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzens untersucht werden. Dazu wurde Wistar-Ratten Aldosteron verabreicht und einigen Tieren die Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon, um die Effekte der unspezifischen (Spironolacton) und spezifischen (Eplerenon) MR Blockade auf die elektrischen Eigenschaften der Kardiomyozyten zu untersuchen. Die Aldosteron exponierten Tiere entwickelten eine linksventrikuläre Hypertrophie, die sich unabhängig von Blutdruckveränderungen entwickelte, sowie ein signifikant verlängertes QT-Intervall, vermehrt auftretende ventrikuläre Extrasystolen und ventrikuläre Tachykardien. Die Elektrolytwerte (K+, Na+, Cl-) waren dabei nicht verändert. Die Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon waren in der Lage, die unter Aldosteron auftretenden Veränderungen zu verhindern. Die Transkription der Untereinheiten kardiospezifischer K+-Kanäle (Ito, IKur, IK1) und des L-Typ Ca2+-Kanals war unter Aldosteronstimulation im linken Ventrikel signifikant erniedrigt. Auf Proteinebene konnte dies für die Kanaluntereinheiten Kv1.5 (IKur), Kir2.3 (IK1) und Cav1.2 (L-Typ Ca2+-Kanal) bestätigt werden. Die Untersuchung eventuell zugrunde liegender Signaltransduktionswege lieferte erniedrigte mRNA Expressionslevel der kardiospezifischen Proteinkinase C Isoformen PKC-α und PKC-ε, wohingegen die mRNA-Expression von PKC-δ unter Aldosteronstimulation unverändert war. Diese Veränderungen in der Transkription der PKC Isoformen wurden durch Behandlung der Tiere mit den Aldosteronantagonisten inhibiert, was für einen MR vermittelten Effekt spricht. Weiterhin zeigte eine chronische Aldosteronstimulation eine erniedrigte mRNA Expression von Calcineurin Aß (PPP3CB) sowie Calcineurinaktivität in linksventrikulärem Gewebe der Tiere. Dieser Effekt konnte durch die Aldosteronantagonisten nicht aufgehoben werden, so dass ein Signaltransduktionsweg, der nicht über den MR vermittelt wird, zugrunde liegen könnte. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass chronisch erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Rattenherz blutdruckunabhängig zu strukturellen und elektrischen Veränderungen führen, die das Auftreten maligner ventrikulärer Arrhythmien begünstigen. Beide Aldosteronantagonisten Spironolacton und Eplerenon sind in der Lage, die durch Aldosteron vermittelten Effekte in gleicher Weise zu inhibieren. Die Ergebnisse zeigen pathophysiologische Zusammenhänge auf, die die Bedeutung von Aldosteron und der Therapie mit Aldosteronantagonisten für die Behandlung der Herzinsuffizienz und in Zukunft möglicherweise der Hypertrophie unterstreichen.
Primäre Hirntumore des Zentralen Nervensystems (gehen aus Nervenzellen, Gliazellen, Hirnhäute (Meningen) und auch Hirngefäße aus. Das anaplastische Astrozytom, Oligodendrogliom und Oligoastrozytom (WHO-Grad III) und auch die bösartigste Form, das Glioblastoma multiforme (WHO-Grad IV) bilden den wesentlichen Anteil der astrozytären Tumoren. Bedingt durch die ungünstige Prognose für Patienten mit Glioblastomen bedarf es einer Optimierung der therapeutischen Maßnahmen. Die momentane Therapie besteht nach Konstitution des Patienten und der Lokalisation des Tumors meist aus der Operation mit angeschlossener Strahlen- und eventueller adjuvanten Chemotherapie. Die Prognose ist abhängig von verschiedenen Faktoren, wie der Ausbreitung und der Lokalisation des Tumors und hat sich in den letzten Jahren leider nur unwesentlich verbessert, da immer noch von einer medianen Überlebenszeit des Patienten zwischen 8 und 15 Monaten im Falle eines Glioblastoms ausgegangen werden kann. Die Entstehung und Progression von malignen Tumorerkrankungen sind eng mit Störungen und Defekten in Signalwegen, die das Zellüberleben und den Zelltod regulieren, verknüpft. Aberrationen, wie die Blockade von Tumorsuppressorgenen, oder die Aktivierung bzw. Überexpression von Onkogenen, führen zur veränderten Expression von Zelltod-inhibitorischen Genen wie den anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedern, und letztendlich zu Abweichungen der normalen zellulären Homöostase. Veränderungen dieser Art bewirken, dass Tumorzellen die Fähigkeit erhalten, unkontrolliert zu proliferieren, infiltrativ zu wachsen und eine eigene Vaskularisierung zu initiieren. Tumorzellen besitzen eine erhöhte Apoptose- und Zelltodresistenz, die maßgeblich durch die stark erhöhte Expression von anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen gekennzeichnet ist. In der vorliegenden Arbeit stand daher die Fragestellung im Mittelpunkt, inwieweit anti-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie zur Resistenz von malignen Gliomzellen gegen die Apoptose und den autophagischen Zelltod beitragen und wie diese Mechanismen gezielt überwunden werden können. Die Blockade der vier Familienmitglieder der Bcl-2-Subfamilie (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-w) wurde über den Einsatz von spezifischen Inhibitoren, den sogenannten BH3-Mimetika, vermittelt. BH3-Mimetika besitzen eine hohe Affinität zur Bindungstasche der Bcl-2-Proteine, wobei durch die Bindung eine Blockade des Proteins hervorgerufen wird. Die eingesetzten BH3-Mimetika haben unterschiedliche Bindungsprofile und können daher ein, zwei oder mehrere Proteine der Bcl-2-Familie inhibieren. Die verwendeten Inhibitoren BH3I-2, HA14-1 und ABT-737, die nur eine limitierte Wirkung auf den Zelltod von Gliomzellen entfalteten, sind allesamt nicht in der Lage, Mcl-1 zu blockieren. Deshalb wurde zusätzlich ein Pan-Bcl-2-Inhibitor, das (-)-Gossypol, verwendet. Dieser Inhibitor hemmt alle anti-apoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder, und steigerte über die Inhibition und Degradation von Mcl-1 effizient den Zelltod von Gliomzellen. Dagegen zeigte die (-)-Gossypol-Behandlung in nicht transformierte Astrozytenkulturen keine zytotoxischen Effekte. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass durch das BH3-Mimetikum (-)-Gossypol ein autophagischer Zelltod induziert wird. Unter der Verwendung eines charakteristischen Markerproteins, dem LC3-Protein, konnte nach Induktion des nicht-apoptotischen, autophagischen Zelltodes durch (-)-Gossypol eine Translokation von GFP-LC3 in die Autophagosomen und Autolysosomen festgestellt werden. Viele Gliome weisen eine Methylierung des MGMT-Promotors auf, die es den Zellen erschwert, schnell DNA-Schäden zu reparieren. Aufgrund dieser Methylierung sind diese Tumoren sensitiv für eine Behandlung mit alkylierenden Substanzen (Temozolomid). Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurden die kombinatorischen Effekte von BH3 Mimetika und Temozolomid in MGMT-positiven (U87) und MGMT-negativen (U343) Gliomzelllinien verglichen, wobei sich lediglich in MGMT-negativen U343-Gliomzellen signifikante, kombinierte Effekte ergaben. Dieser Zelltod war mit einer Potenzierung der Autophagie assoziiert, nicht jedoch mit einer Aktivierung von Caspasen und einer lysosomalen Dysfunktion. Die Depletion des endogenen Autophagieinhibitors mTOR bewirkte nach den Behandlungen mit (-)-Gossyol und TMZ einen zusätzlichen zytotoxischen Effekt. Im Gegensatz dazu wurde durch lentivirale RNA-Interferenz gegen die Autophagiegene ATG5 und Beclin1 eine potente Reduktion der zellulären Autophagie und des autophagischen Zelltodes erreicht. Insgesamt unterstreichen diese Daten die zentrale Rolle von Bcl-2 Proteinen für die Regulation der Autophagie und legen nahe, dass durch (-)-Gossypol und (-)-Gossypol in Kombination mit Temozlomid in Gliomzellen zytotoxische Autophagie induziert wird.
Um Materie mit Nanometergenauigkeit anzuordnen, ist Selbstorganisation die mächtigste Strategie. DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist hierfür ein hervorragendes Baumaterial, da sie ein billiges, programmierbares, biokompatibles und gut verstandenes Polymer ist. Aus diesen Gründen ist DNA zur Basis für ein schnell wachsendes Gebiet geworden: die DNA-Nanotechnologie. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Interaktionsmöglichkeiten für die DNA-Nanotechnologie zu entwickeln und neuartige Strukturen aus DNA-minicircles aufzubauen, einem bislang vernachlässigten Konstruktionselement. ...
Obwohl zahlreiche zelluläre Funktionen von RNAs in direktem Zusammenhang mit Proteinen stehen, wurde auch eine Vielzahl von, unter anderem regulatorischen, RNA-Motiven identifiziert, die ihre Funktion ohne eine initiale Beteiligung von Proteinen ausüben. Das detaillierte Verständnis der zu Grunde liegenden Regulationsmechanismen beinhaltet die Charakterisierung von beteiligten RNA-Architekturen und deren funktionaler Stabilitäten, von dynamischen Aspekten der RNA-Faltungsprozesse sowie die Korrelation dieser Charakteristika mit zellulären Funktionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden strukturelle, thermodynamische und kinetische Aspekte der Ligand-bindenden Guanin Riboswitch-RNA Aptamerdomäne des xpt-pbuX Operons aus B. subtilis und eines Cofaktor-abhängigen katalytischen RNA-Motivs, des 'Adenin-abhängigen Hairpin Ribozyms', untersucht. ...
Die Bedeutung verschiedener CRASP-Proteine für die Komplementresistenz von Borrelia burgdorferi s.s.
(2010)
Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des molekularen Mechanismus der Immunevasion von B. burgdorferi s.s., insbesondere der Bedeutung einzelner CRASP-Proteine für die Komplementresistenz. Sie trägt dazu bei, die Relevanz dieser Proteine für die Pathogenese dieses Erregers zu untermauern. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, verschiedene Vektoren mit den ursprünglichen oder mutierten CRASP-kodierenden Genen cspA, cspZ, erpP und erpA aus B. burgdorferi s.s. zu generieren und diese in das CRASP-negative Isolat B. garinii G1 zu transformieren. Die Expression der speziesfremden Gene als auch der Transport der CRASP-Moleküle auf die Zelloberfläche von B. garinii G1 konnten nachgewiesen werden. Für die konstitutiv CRASP-1- oder CRASP-2-produzierenden Borrelienzellen konnte gezeigt werden, dass diese, auf der Zelloberfläche lokalisierten CRASP-Moleküle mit Faktor H und FHL-1 interagieren, die gebundenen Komplementregulatoren ihre funktionelle Aktivität zur C3b-Inaktivierung aufrechterhalten und die Zellen in Gegenwart von Komplement überleben. Damit wurde erstmals der Nachweis erbracht, dass beide CRASP-Moleküle unabhängig voneinander Schutz vor komplementvermittelter Lyse verleihen. Untersuchungen mit den veränderten CRASP-1-Molekülen ergaben, dass die Transformante G1/pCRASP-1 E147K eine verringerte Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, welche sich jedoch nicht auf die Komplementresistenz der Zellen auswirkte. Im Gegensatz dazu führte eine Aminosäuresubstitution im C-Terminus des CRASP-1-Moleküls an Position 240 zum Verlust der Bindung von Faktor H und einer stark verminderten Bindung von FHL-1, so dass auch keine Kofaktoraktivität nachgewiesen werden konnte. Trotz des Bindungsverlustes beider Komplementregulatoren zeigte die Transformante G1/pCRASP-1 Y240A nur geringe Ablagerungen des lytischen, terminalen Komplementkomplexes (TCC) auf der Zelloberfläche und Wachstum in Gegenwart von aktiven Komplement. Mittels eines Hämolyse-Assays wurde schließlich festgestellt, dass CRASP-1 direkt mit Komponenten des Komplementsystems interagiert und dadurch die Assemblierung des TCC verhindert. Die Bedeutung der Aminosäuren an den Positionen 81, 139, 207 und 211 im CRASP-2-Molekül für die Faktor H / FHL-1-Bindung und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Komplementresistenz der Borrelien wurde gleichfalls nachgewiesen. Dabei wies insbesondere die Transformante G1/pCRASP-2 Y211A ein inhibiertes Wachstum in Humanserum und verstärkt Komplementablagerungen auf der Zelloberfläche auf, was auf den Verlust bzw. der sehr schwachen Bindung von FHL-1 und Faktor H zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu den Transformanten, welche ein CRASP-2-Molekül mit nur einem Aminosäureaustausch produzierten, zeigten die Transformanten, deren CRASP-2-Molekül zwei Aminosäuresubstitutionen aufwies (G1/pCRASP-2 R139A-Y207A, G1/pCRASP-2 R139A-Y211A, G1/pCRASP-2 Y207A-Y211A) keine Bindung der beiden Regulatorproteine und keinen Schutz der Zellen vor der lytischen Wirkung von Komplement. Neue, unerwartete Erkenntnisse ergaben sich aus den Untersuchungen mit Borrelienzellen, welche das CRASP-3- oder CRASP-5-kodierende erpP- bzw. erpA-Gen enthielten. Obwohl gereinigtes als auch denaturiertes CRASP-3 und RASP-5 in der Lage war, Faktor H zu binden, wiesen die vitalen Zellen der Transformanten G1/pCRASP-3 und G1/pCRASP-5 keine Bindung von Faktor H und keinen Schutz der Zellen vor komplementvermittelter Lyse auf. Aus den durchgeführten Untersuchungen konnten für gereinigtes CRASP-3 und CRASP-5 als auch für die CRASP-3- und CRASP-5-produzierenden Transformanten neue Liganden, nämlich CFHR-2 und CFHR-5, aus Humanserum identifiziert werden. Zusammenfassend lassen sich folgende Aussagen hinsichtlich des molekularen Mechanismus der Komplementresistenz bei B. burgdorferi s.s. aus den erhobenen Daten dieser Arbeit mit transformierten Borrelienzellen formulieren: *Die Komplementresistenz der Borrelien wird durch die Faktor H- und FHL-1-bindenden Proteine CRASP-1 und CRASP-2, jedoch nicht durch CRASP-3 und CRASP-5 determiniert, *CRASP-1 als multifunktionelles Protein ist zusätzlich in der Lage, direkt mit Komplement zu interagieren, *Die C-terminalen Domänen von CRASP-1 und CRASP-2 sind für die Bindung der beiden Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 relevant, *CRASP-3 und CRASP-5 auf der Borrelienoberfläche lokalisiert, interagieren mit CFHR-1, CFHR-2 und CFHR-5, aber nicht mit Faktor H.
NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Bindung kleiner Moleküle an das Zellzyklusprotein CDC25A
(2010)
Viele verschiedene Funktionen der Zelle werden durch posttranslationale Modifikationen von Proteinen reguliert. Die reversible Phosphorylierung der OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der Möglichkeiten die Aktivität von Proteinen an- und abzuschalten und Interaktion mit Bindungspartnern zu ermöglichen oder zu verhindern. Die Phosphatase CDC25A übernimmt eine zentrale Rolle in der Steuerung des Zellzyklus, unterliegt selbst wiederum einer differenzierten Kontrolle durch Änderung des Expressionslevel, Phosphorylierung und Lokalisation innerhalb der Zelle. Da eine Überfunktion von CDC25A mit einer Vielzahl von verschiedenen Krebserkrankungen assoziiert ist, wird die Entwicklung starker und selektiver Inhibitoren, die auch in vivo wirksam sind, vorangetrieben. Die strukturellen Grundlagen selektiver Inhibition sind allerdings noch unzureichend erforscht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine erfolgreiche Durchführung von NMR-Experimenten gelegt, für die Proteinproben mit hoher Konzentration und Langzeitstabilität benötigt werden. CDC25A kann nicht in der vollen Länge exprimiert werden und wäre als Vollkonstrukt auch zu groß, um effektiv per NMR untersuchbar zu sein. Durch Erzeugung diverser Konstrukte der katalytischen Domäne von CDC25A konnte ein Expressionslevel erreicht werden, der die Erzeugung ausreichender Mengen an Protein praktikabel macht. Neben des oftmals geringen Expressionslevels ist ein weiteres Problem bei NMR-spektroskopischen Untersuchungen vieler Phosphatasen deren geringe Stabilität während der Aufreinigung und in der endgültigen Probe. Durch Optimierung der Pufferbedingungen für den Zellaufschluss in Bezug auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Kations per „Incomplete Factorial Design“ konnte die Ausbeute an löslichem Protein erheblich gesteigert werden. Die Verwendung dieser Pufferbedingungen während der ersten Aufreinigungsschritte verminderte auch die Tendenz des Proteins während der Chromatografie auszufallen. Die Zusammensetzung des Puffers für die endgültige NMR-Probe wurde schließlich durch das aus der Kristallografie entlehnte Verfahren der Dampfdiffusion ebenso in Hinblick auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Anions optimiert. Unter diesen optimierten Pufferbedingungen wurde die katalytische Aktivität des Proteinkonstrukts anhand der Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat nachgewiesen. Acht Substanzen wurden auf Inhibition dieser katalytischen Aktivität getestet. Das natürliche Substrat Phosphotyrosin zeigte eine kompetitive Hemmung, zwei starke und ein schwacher Inhibitor zeigten entsprechend verminderte Reaktionsraten. Von den restlichen 4 Substanzen (Inhibitoren anderer Protein-Tyrosin-Phosphatasen und strukturelle Verwandte) zeigten 3 weitere eine starke Wirkung. Diese hohe Promiskuität gegenüber Inhibitoren stellt ein großes Problem für die strukturgetriebene Wirkstoffentwicklung bei CDC25A und generell aller Phosphatasen dar. Nach Erhalt der fertigen Proben zeigten erste 2D-NMR-Spektren eine geringer als zu erwartende Zahl von Signalen und starke Überlappungen der sichtbaren Signale. Um auszuschließen, das Dimerisierung oder unspezifische Aggregation hierfür verantwortlich sind, wurden DOSY-Spektren gemessen. Aus der Eigendiffusionsrate ergibt sich ein hydrodynamischer Radius, der mit durch HYDROPRO simulierten Werten übereinstimmt und sich deutlich von dem des putativen Dimers absetzt. Daher wird davon ausgegangen, dass die Signalverluste im NMR nicht durch Dimerisierung oder Aggregation ausgelöst werden. Um die Bindung von Inhibitoren auch durch NMR-Spektroskopie nachzuweisen, wurden Saturation-Transfer-Difference-Experimente (STD) durchgeführt. In diesen war aber sowohl für das natürliche Substrat Phosphotyrosin als auch für alle im Enzymtest aktiven Inhibitoren kein Effekt nachweisbar. Dies weist auf eine sehr hohe koff-Rate der Bindung an das Protein hin oder auf eine irreversible chemische Modifikation des aktiven Zentrums, die bis zum Zeitpunkt der Messung bereits abgeschlossen war. Für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung werden spezifische Interaktionspunkte auf der Proteinoberfläche gesucht. Hierfür wurden 15N-HSQC-Spektren mit und ohne Bindungspartner gemessen und die Veränderungen der chemischen Verschiebung bestimmt („chemical shift perturbation“). Es konnten für Phosphotyrosin und die beiden starken Inhibitoren BN82002 und NSC663284 signifikante Veränderungen nachgewiesen werden. Für alle drei Moleküle gab es sowohl komplett einzigartige Veränderungen als auch paarweise übereinstimmende als auch ein Signal das für alle 3 übereinstimmt. Neben den Inhibitoren wurden drei Peptide auf spezifische Interaktion getestet. Das erste entspricht der Zielsequenz des natürlichen Substrats CDK, die anderen beiden sind Teile der Sequenz von CDK an einer nachgewiesenen als auch einer putativen sekundären Interaktionsfläche der beiden Proteine. Auch für die drei Peptide konnten wie für die Inhibitoren individuelle als auch übereinstimmende Signalveränderungen nachgewiesen werden. Als Voraussetzung für die Bestimmung der Oberflächenkontakte, die für die spezifische Bindung von Substrat, Inhibitoren und Interaktionspeptiden nötig sind, wird eine Zuordnung der Signale des 15N-HSQC-Spektrums zu den Aminosäureresten des Proteins benötigt. Hierzu wurden 3D-Tripelresonanz-NMR-Experimente an 15N, 13C-markierten Proben (zusätzlich auch noch 2H-markierte Proben zur Unterdrückung von Relaxationseffekten) durchgeführt. Um die Zuordnung zu unterstützen wurden außerdem Proben mit individuell 15N-markierten Aminosäuren hergestellt, um einem Signal im HSQC zumindest den Typ der Aminosäure zuordnen zu können. Aufgrund der trotz Pufferoptimierung, Deuterierung des Proteins und verringerter Signalüberlagerung in den Spektren der individuell markierten Proben zu geringen Anzahl an Signalen konnten nur kurze Bereiche der Aminosäuresequenz zugeordnet werden. Aufgrund dieser Basis konnte kein aussagekräftiges Mapping erzielt werden.
Im ersten Teil der Arbeit wurde eine genetische Disposition für Vorhofflimmern (VHF) untersucht. Der Einzelnukleotidpolymorphismus ("single nucleotide polymorphism", SNP) 38G/S befindet sich im N-Terminus der ß-Untereinheit KCNE1. Diese ß-Untereinheit konstituiert gemeinsam mit der alpha-Untereinheit KCNQ1 die langsame Komponente des verzögerten Gleichrichterstromes, IKs. Die ß-Untereinheit hat hierbei eine modulierende Funktion. Frühere Studien beschäftigten sich hauptsächlich mit der transmembranären Domäne und dem C-Terminus. Über die Rolle des N-Terminus war bislang wenig bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Aufgabe des N-Terminus bei der Modulation der alpha-Untereinheit zu identifizieren. Außerdem sollte festgestellt werden, welche Aminosäuren hierbei besonders von Bedeutung sind. Zu diesem Zweck wurden diverse Konstrukte synthetisiert. Für das Konstrukt delta1-38’ wurden die Aminosäuren 1-38 und damit der Großteil des N-Terminus entfernt. Das Konstrukt "linker" enthält anstelle des Glyzins oder Serins an Position 38 fünf Alanine. In der Nähe der von dem SNP betroffenen Aminosäure befinden sich des Weiteren drei Arginine, die mit jeweils einem Alanin substituiert wurden. Für alle Versuche diente die nicht VHF-assoziierte Variante des SNPs als Kontrolle. Alle Konstrukte konnten erfolgreich heterolog exprimiert werden und gleichermaßen mit der alpha-Untereinheit immunopräzipitiert werden. Die aus der Co-Transfektion von KCNQ1 und KCNE1 resultierende Stromdichte wurde mittels "Patch-clamp"-Technik untersucht. Im Vergleich zum Kontrollstrom (KCNQ1 + KCNE1-38S) waren die Ströme aller anderen Gruppen während De- und Repolarisation signifikant kleiner. Zellfraktionierung und konfokale Mikroskopie zeigten, dass im Vergleich zur Kontrolle alle anderen Konstrukte eine verminderte Plasmamembranlokalisation aufwiesen. Die Aufgabe des N-Terminus liegt offensichtlich im Transport beider Untereinheiten an die Plasmamembran und/oder der Verankerung dort. Sowohl die Aminosäure in Position 38 als auch die drei N-terminalen Arginine in der Nähe scheinen für den hier gesuchten Mechanismus von Bedeutung zu sein. Zukünftige Experimente könnten beispielsweise 3D-Simulationen der Proteinfaltung beinhalten, um die potentielle Membranverankerung weiter zu untersuchen. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte erworbene elektrophysiologische Veränderungen im Rahmen von VHF am Beispiel der einwärts gleichrichtenden Kaliumströme IK1 und IKACh. Es sollten die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen für die Heraufregulierung von IK1 und IKACh bei VHF untersucht werden. Alle Experimente wurden an humanem Gewebe des linken Vorhofs durchgeführt. Das Gewebe stammt von VHF-Patienten, die sich einer Mitralklappen-Operation unterzogen. Als Kontrolle wurde Gewebe von Patienten im Sinusrhythmus (SR) verwendet. Zunächst wurde untersucht, ob transkriptionelle und/oder posttranskriptionelle Veränderungen oder funktionelle Effekte der Heraufregulierung der Ströme zugrunde liegen. Entsprechend wurde die Proteinexpression mittels Western Blot quantifiziert. Die Quantifizierung der mRNA erfolgte per Realtime-PCR. Veränderungen für IK1 konnten sowohl auf mRNA- als auch auf translationaler Ebene beobachtet werden. Protein- und mRNA-Expression von Kir2.1, der zugrunde liegenden Proteinuntereinheit, waren bei VHF signifikant erhöht; die Expression der inhibitorischen miR-1 war reduziert. Die Bestimmung der Protein- und mRNA-Expression der zugrunde liegenden Proteinuntereinheiten für den Strom IKACh zeigte dagegen keinen Unterschied zwischen Gewebe von Patienten mit VHF und SR. Eine funktionelle Regulierung schien daher möglich. Die Expression der IKACh modulierenden Proteine Calmodulin und G alpha i-3 unter VHF zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zu der SR-Gruppe. Es war eine Tendenz zur Reduktion des inhibierenden G alpha i-3 zu beobachten. Die Regulierung von IKACh,c bei VHF bleibt in zukünftigen Arbeiten zu untersuchen. Ein möglicher Versuch wäre, therapeutisch in die Regulation der Kir-Untereinheiten einzugreifen, um das VHF-unterstützende, elektrische "Remodeling" des IK1 zu verhindern.
Funktionelle Analyse der Helper-Component Proteinase (HC-Pro) aus Zucchini Yellow Mosaic Virus
(2010)
In dieser Arbeit wurde der Einfluss einer Punktmutation der ZYMV HC-ProFINK auf die RNA Silencing Suppressor-Aktivität und die miRNA-Akkumulation in N. benthamiana-Pflanzen untersucht. Dabei konnte eine RNA Silencing Suppressor-Aktivität der HC-ProFINK nachgewiesen werden. Sowohl die HC-ProFRNK als auch die HC-ProFINK zeigten in vivo keinen Einfluss auf die Änderung der miRNA-Mengen in N. benthamiana-Pflanzen. Untersuchungen der in vitro sRNA-Bindung mit rekombinanten HC-Pro-Proteinen aus Pflanzen führte zu einer Bindung von 21 bp siRNAs und miRNAs durch die HC-ProFRNK, wobei kein Einfluss zwischen der Anzahl und Lage der Basenfehlpaarungen der miRNAs und der Bindungskapazität identifiziert werden konnte. Diese Bindung ist vermutlich abhängig von der Sequenz der miRNAs. Die Mutation von HC-ProFRNK zu HC-ProFINK bewirkte dagegen den Verlust der Bindung von kleinen RNA-Molekülen. Die HC-Pro Proteine konnten rekombinant mit einem N-terminalen Fusionsprotein exprimiert und gereinigt werden. Die funktionelle Analyse des MBP-HA-HC-ProFRNK-Proteins wies eine längenspezifische Bindung von 21 bp siRNAs auf. Die Analyse der in vitro Bindung von unterschiedlichen miRNAs aus A. thaliana und Mensch durch das rekombinante HC-ProFRNK-Protein aus Bakterien zeigte keinen Zusammenhang zwischen der Anzahl und Lage der Basenfehlpaarungen in den miRNAs und der Bindekapazität. Die Mutation im MBP-HA-HC-ProFINK-Protein führte zum Verlust der sRNA-Bindung. Diese Ergebnisse bestätigten die Beobachtungen der Gelshift-Analysen mit den rekombinanten HC-Pro-Proteinen aus Pflanzen. Durch die Fraktionierung eines A. thaliana-Proteinextrakts konnte ein nicht näher beschriebenes Protein unbekannter Funktion, welches eine Cupin-Domäne (QP) besitzt, identifiziert werden. Dies hat einen Einfluss auf die in vitro Bindung von sRNA-Molekülen durch die HC-Pro. Eine funktionelle Analyse des Trx-QP-His-Proteins mit Hilfe von Gelshift-Analysen nach der Expression in Bakterien und Reinigung zeigte einen konzentrationsabhängigen verstärkenden Effekt der siRNA Bindung durch das rekombinante MBP-HA-HC-Pro-Protein. Die Zugabe eines fraktionierten N. benthamiana-Proteinextrakts zur in vitro Bindungsreaktion führte ebenfalls zu einer verstärkten siRNA-Bindung durch die HC-Pro; Proteinextrakte von N. tabacum und der ZYMV Wirtspflanze Zucchini zeigten jedoch keinen Effekt. Die ZYMV HC-Pro besitzt eine von der TEV HC-Pro abweichende proteolytisch aktive Domäne. Durch eine rekombinante Expression des MBP-HA-HC-Pro-GFP-Fusionsproteins in Bakterien und Deletionsanalysen konnten zwei kritische Aminosäuren im C-terminalen Bereich der HC-Pro identifiziert werden. Eine Deletion der AS Asn-353 oder Glu-356 führte zum vollständigen Verlust der autoproteolytischen Aktivität des Proteins. Ein Austausch der AS Gly-456 innerhalb der Schnittstelle sowie eine N-terminale Deletion von 93 AS der HC-Pro hatten dagegen keinen Einfluss auf die autoproteolytische Aktivität. Mit Hilfe einer N-terminalen Sequenzierung des C-terminalen Spaltproduktes des MBP HC Pro mut C7-GFP, welches vermutlich in Folge einer Spaltung durch bakterielle Proteasen entsteht, sollten durch Deletionsmutanten die kritischen Aminosäuren für die Spaltung untersucht werden. Eine Deletion der konservierten AS Thr-146 von ZYMV HC-Pro sowie der flankierenden AS Val-145 bzw. Gln-147 hatte jedoch keinen Einfluss auf die Spaltung der HC-Pro. Dies deutet darauf hin, dass die Schnittstelle der Protease von deren Erkennungssequenz abweicht. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass die ZYMV HC-Pro neben der sRNA-Bindung einen weiteren Mechanismus besitzt, um die Funktion als RSS auszuüben. Weitere Analysen sind nötig, um die Interaktion mit pflanzlichen Komponenten zu identifizieren und den Einfluss auf den RNA Silencing-Mechanismus aufzuklären.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Synthese von spaltbaren Linkern. Dabei wurden zwei unterschiedliche Themengebiete bearbeitet: 1) Entwicklung eines enzymatisch spaltbaren Safety-Catch-Linkers, der eine flexible Modifizierung ermöglicht für den potentiellen Einsatz zur zielgerichteten Zellaufnahme von (Antisense-)Oligonukleotiden. 2) Entwicklung eines Fluorid-spaltbaren Linkers für die reversible Fluo¬reszenz¬markie¬rung von Triphosphaten zum Einsatz in einer neuen Methode der DNA-Sequenzierung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuer, variabler enzymatisch spaltbarer Safety-Catch-Linker entwickelt und es wurden drei Derivate synthetisiert. Die drei neuen Safety-Catch-Linker sind über Amid- bzw. Esterbindungen an die 5' Position von 2' Desoxythymidin angebunden und sind Substrate für zwei unterschiedliche Enzyme. Zwei der synthetisierten Derivate des Linkers sind Substrate der Penicillin G Acylase und eins ist ein Substrat für die Pyroglutamyl Aminopeptidase I. Sie wurden hinsichtlich ihrer Spaltungs- und Stabilitätseigenschaften intensiv untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Ester-verknüpften Linker für eine Anwendung unter physiologischen Bedingungen geeignet sind. Es wurden kinetische Spaltungsexperimente durchgeführt und dabei eine sehr effektive enzymatische Spaltung durch das entsprechende Enzym beobachtet. Es wurde außerdem der Mechanismus einer, bei höheren pH-Werten beobachteten, nicht-enzymatischen Spaltung aufgeklärt. Darüber hinaus konnte das sehr basenlabile, mit Pyroglutamyl Aminopeptidase I spaltbare Derivat unter Anwendung einer aminoschutzgruppenfreien Oligonukleotidsynthesemethode erfolgreich in ein Antisense-Oligonukleotid eingebaut werden. Für das EU-Projekt „ArraySBS“ wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuer, hoch effizient mit Fluoridionen spaltbarer Linker für die reversible Anbindung eines Fluoreszenzfarbstoffs an die Baseneinheit eines Nukleotids entwickelt. Die spaltbare Einheit des Linkers basiert auf dem Strukturmotiv der 2-Cyanoethylgruppe, als Spacer zwischen dem Nukleotid und dem Fluoreszenzfarbstoff wurde eine Triglykoleinheit verwendet. Die Spaltungseigenschaften wurden an einer Modellverbindung, einem modifizierten Nukleosid und einem immobilisierten Oligonukleotid intensiv untersucht. Dabei wurde eine vollständige Spaltung mit 1 M TBAF in THF in weniger als einer Minute gefunden und die erwartete beta-Eliminierung als Spaltungsmechanismus bestätigt. Mit Hilfe des entwickelten Linkers wurden vier neue, Fluoreszenz-markierte, reversible Terminatoren in sehr hoher Reinheit hergestellt und analytisch eindeutig identifiziert. Dabei handelt es sich um ein Fluorescein-markiertes 2'-Desoxyuridin Derivat, ein Cy3-markiertes 2' Desoxycytidin, ein Cy5-markiertes 2'-Desoxyguanosin und ein TexasRed-markiertes 2' Desoxyadenosin Derivat. Diese wurden dann in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern des EU Projekts erfolgreich durch eine DNA-Polymerase in DNA-Template eingebaut und in einem ersten Anwendungsexperiment an immobilisierten Hairpin-Templaten in zwei Sequenzierungszyklen eingesetzt.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) rücken in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering immer mehr in den Vordergrund. Im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen bergen sie keine ethischen Probleme und sind leicht zu isolieren. Die ursprünglich aus Knochenmark gewonnenen MSC können inzwischen aus vielen verschiedenen Quellen wie Nabelschnurblut [Kern et al. 2006], Dentalgewebe [Huang et al., 2009], Plazenta [Huang et al., 2009], Haut [Salvolini et al., 2009] und aus Fettgewebe isoliert werden [Zuk et al., 2001]. Der Immunphänotyp variiert zwischen den aus verschiedenen Quellen gewonnenen MSC nur gering. Die Gewinnung aus Fettgewebe hat den Vorteil, dass eine minimal invasive Prozedur und eine hohe Ausbeute zusammenkommen. Die Stammzellen aus Fettgewebe (ASC) können in der Therapie eingesetzt werden und zu der Regeneration von Geweben nach Verletzungen beitragen [Wong et al., 2008; Poulsom et al., 2001]. Der genaue Mechanismus mit dem die Stammzellen wirken ist allerdings noch nicht geklärt. Sowohl die Integration der MSCs in das Gewebe als auch ein rein parakriner Einfluss wurden nachgewiesen. Klar ist nur, dass ein positiver Effekt von einer Therapie mit MSC ausgeht [Mizuno et al., 2009]. In vivo sind Zellen verschiedenen Einflüssen ausgesetzt, die den Zustand einer Zelle bestimmen. Lösliche Faktoren wie Wachstumsfaktoren, Hormone oder Vitamine wirken dabei ebenso wie die extrazelluläre Matrix und Zell-Zell-Kontakte auf die Zelle ein, die mit Wachstum, Zellform, Differenzierung oder Ähnlichem antwortet. In meiner Arbeit wurden daher drei unterschiedliche Ansätze für die in vitro Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen untersucht: (1) die Wirkung von löslichen Faktoren, die dem Medium zugesetzt wurden, (2) der Einfluss der extrazellulären Matrix aus zum einen Tubuluszellen und zum anderen Matrigel und (3) die Co-Kultur, bei der auch direkter Zell-Zell-Kontakt untersucht wurde. Damit, und mit einer Kombination der einzelnen Bereiche, sollte das natürliche Umfeld der Tubuluszellen simuliert werden und epitheliale Differenzierung initiieren. Die Zugabe von ATRA, ActA und BMP-7 führte zu einer Differenzierung in die epitheliale Richtung, während die extrazelluläre Matrix aus Tubuluszellen nicht dafür ausreichte. Matrigel hingegen, konnte besonders in der Verbindung mit konditioniertem Medium eine Differenzierung induzieren. Die indirekte Co-Kultur über Membraneinsätze, über die u. a. der parakrine Einfluss der Tubuluszellen untersucht werden sollte, führte zu morphologischen Veränderungen der ASC, die aber nicht mit den hier verwendeten epithelialen Markern nachgewiesen werden konnte. Der direkte Zell-Zell-Kontakt zeigte eine Reduktion des Oberflächen Markers CD90 verbunden mit einer Erhöhung der Expression von CK18. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Zellen ist also auf drei verschiedenen Wegen möglich. Zwischen verschiedenen Isolationen von ASC traten hohe Schwankungen bezüglich der Expression von Oberflächenmarkern und Proliferation auf, was auch einen Einfluss auf die Differenzierung haben könnte. Ein Grund dafür könnte die Heterogenität von ASC sein. Zur Reduzierung dieser wurden daher ein Waschschritt eine Stunde nach Kulturbeginn und eine immunomagnetische Isolation mit CD49a, CD90, CD105 oder CD271 durchgeführt. Die immunomagnetische Aufreinigung führte nur zu einer leichten Verbesserung der Heterogenität, aber zu einer sehr geringen Zellausbeute. Für den Waschschritt konnte gezeigt werden, dass die Expression der Stammzellmarker Nestin, oct4 und sall1 signifikant erhöht und Desmin und smA Expression reduziert wurden, was auf eine Reduktion der Heterogenität hindeutete. Der zusätzliche Waschschritt kann also schnell und unkompliziert die Heterogenität der ASC reduzieren. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen durch den Einfluss von Zell-Zell-Kontakten zeigt vielversprechende Ansätze und sollte weiter verfolgt werden. Eine verlängerte Kulturdauer sollte dabei angestrebt werden, da auch die adipogene Differenzierung zumeist erst nach 14 bis 21 Tagen nachweisbar war. Dafür müsste die Markierung mit CellTracker länger nachweisbar sein. Eine Inhibierung der Proliferation könnte die Grundlage dazu liefern. Um den Stand der Differenzierung in die epitheliale Richtung nachzuweisen, könnten andere epitheliale Marker, Ionenkanäle, die erst spät in den Tubuluszellen angelegt werden, und funktionelle Mechanismen untersucht werden. Das Zusammenspiel der verschiedenen Einflüsse auf die Zelle könnte ebenfalls noch genauer untersucht werden. Für die Regenerative Medizin ist es aus Gründen der GMP sinnvoller, die Zellen nur mit dem Zusatz an löslichen Faktoren zu differenzieren. Der Ansatz mit ATRA, ActA und BMP-7 scheint sehr vielversprechend zu sein und könnte in dieser Hinsicht weiter ausgebaut werden.