Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Das Steroid-Hormon 17ß-Estradiol ist maßgeblich an der Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs beteiligt. Die intrazelluläre Verfügbarkeit des aktiven Estrogens, 17ß-Estradiol, wird durch die 17ßHydroxysteroiddehydrogenase (17ßHSDl) reguliert, die die NADPH-abhängige Reduktion von Estron zu Estradiol katalysiert. Damit stellt die 17ßHSD1 einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Inhibitoren im Hinblick auf potente Wirkstoffe gegen Brustkrebs dar. Die 17ß-Hydroxysteroiddehydrogenase 2 bevorzugt hingegen die oxidative Aktivität und wandelt die biologisch aktiven Hydroxysteroide wie Estradiol in ihre inaktiven Ketoformen um. Ein möglicher Inhibitor der 17ß-HSD1 sollte demnach die Funktion der 17ß-HSD2 nicht beeinträchtigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Strategien und Methoden entwickelt, die 17ßHSD1 durch heterologe Expression erstmals in E. coli darzustellen. Durch NMR-Spektroskopie in Kombination mit Docking konnten detaillierte Aussagen über die Bindungsepitope der untersuchten Liganden gemacht werden. Diese Informationen sind für eine gerichtete Optimierung von Leitstrukturen von großer Bedeutung.
Optimierung Apolipoprotein-modifizierter Albumin-Nanopartikel zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke
(2007)
Das Gehirn höherer Säugetiere ist durch die Blut-Hirn-Schranke vor dem Eindringen toxischer und schädlicher Substanzen geschützt. Allerdings bildet diese Barriere auch ein Hindernis für die gezielte medikamentöse Therapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel Alzheimer, Gehirntumore oder Parkinson. Leider sind nur wenige potentielle Arzneistoffe für die Therapie dieser Krankheiten in der Lage die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Somit stellt die Blut-Hirn-Schranke einen limitierenden Faktor für die Arzneimitteltherapie dar. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Herstellung, Charakterisierung, in vitro und in vivo Testung Liganden-modifizierter Nanopartikel auf Proteinbasis zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke. Als Ligand wurde das Apolipoprotein E, ein Bestandteil von physiologisch vorkommenden HDL, VLDL und LDL-Partikel, verwendet, welches sich in vorangegangenen Untersuchungen als potentieller Ligand zum Transport von Nanopartikeln ins Gehirn erwiesen hat. Diese so mit Apolipoprotein modifizierten Nanopartikel wurden mit dem Modellarzneistoff Loperamid, einem nicht gehirngängigen Opioid, beladen. Diese Zubereitung wurde Mäusen injiziert und der analgetische Effekt mittels des Tail-Flick-Tests bestimmt. Um auch eine therapeutische Anwendung zu erzielen, wurden Apolipoprotein modifizierte Partikel beladen mit dem Zytostatikum Doxorubicin entwickelt und die chemotherapeutische Effizienz an Gehirntumor tragenden Ratten getestet.
Anti-T-Lymphozyten-Globuline (ATG) sind Immunglobuline zur Anwendung am Menschen. Sie werden aus den Seren von Kaninchen oder Pferden gewonnen, die zuvor mit humanen Thymozyten oder einer etablierten humanen T-Zell-Linie immunisiert wurden. ATG besitzen ein sehr starkes immunsuppressives Potenzial. In der klinischen Anwendung werden sie überwiegend bei Organtransplantationen, Knochenmarktransplantationen und zur Behandlung einzelner Autoimmunerkrankungen, wie z. B. der aplastischen Anämie, eingesetzt. Wissenschaftliches Ziel der Arbeit war, einen umfangreichen Beitrag zur immunologischen Charakterisierung und Spezifizierung unterschiedlicher ATG-Präparate zu erbringen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die Entwicklung und Validierung experimenteller Methoden, sodass die bisher verwendeten Praktiken der Wirksamkeitsprüfung von ATG entsprechend dem Stand der Wissenschaft abgelöst und der Tierversuch (Affenhaut-Transplantationstest; Balner H et al., 1968) ersetzt werden können. Darüber hinaus wurde in diesem Zusammenhang der Entwurf einer Arzneibuch-Monografie für ATG vorgelegt. Der immunsuppressive Wirkmechanismus von ATG ist selbst nach 40 Jahren klinischer Erfahrung nicht eindeutig geklärt. Ihre Wirksamkeit vermitteln sie über ihre spezifische Bindung an Lymphozyten, woraus sich modellhaft vier Effekte unterscheiden lassen: Die Reihe der Fc-abhängigen zytotoxischen Mechanismen, eine von ATG ausgelöste Aktivierung, eine über Todesrezeptoren (z.B. Fas/Apo-1) von ATG direkt induzierte Apoptose sowie die Maskierung von Rezeptoren. Die zytotoxische Wirkung von ATG und die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) wurde am Durchflusszytometer (FACS) nach Färbung der toten Zellen bzw. durch den Nachweis von DNA-Fragmentierung analysiert. Der Einfluss von ATG auf die Lymphozyten-Aktivierung in vitro sowie auf die gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reaction, MLR) wurde durch Messung der Lymphozyten-Proliferation anhand des Einbaus von radioaktiv markiertem Thymidin bestimmt. Biochemisch wurden die in ATG enthaltenen anti-Lymphozyten-Antikörper durch den sog. Kinase-Assay charakterisiert. In einer nicht radioaktiven Methode wurden Zelloberflächenmoleküle zunächst biotinyliert. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteine mit ATG präzipitiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt sowie mittels Streptavidin und Chemilumineszenz im Westernblot nachgewiesen. Für das Verständnis der klinischen Wirksamkeit von ATG ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen der komplement-unabhängigen, zytotoxischen Wirkung von erheblicher Bedeutung, da die enorme zytolytische, aber auch die breite immunsuppressive Wirkung von ATG nicht allein durch die Fc-abhängige Zytotoxizität erklärt werden kann. ATG können bei bestimmten Zielzellen Fas-abhängige Apoptose auslösen; darüber hinaus sind ATG aber auch in der Lage, einen komplement-unabhängigen Zelltod in Fas-resistenten Zell-Linien und T-Zell-Klonen, die resistent gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (AICD) sind, auszulösen. In Kompetitionsversuchen konnte gezeigt werden, dass ATG entsprechende Antikörper-Spezifitäten gegen das Molekül CD95 (Fas/Apo-1) enthalten. Ferner konnten wir nachweisen, dass die durch ATG initiierte Fas-abhängige Apoptose und/oder der AICD durch Fas-neutralisierende Antikörper inhibiert werden können, was auch von anderen Arbeitsgruppen gezeigt wurde (Genestier L et al., 1998). Die DNA-Fragmentierung, als Nachweis von Apoptose, lässt sich nach der ATG-Inkubation von Fas-sensitiven Zielzellen durch Inhibitoren der Caspase-1 (Z-VAD-FMK) komplett sowie durch Inhibitoren der Caspase-3 (Ac-DMQD-CHO) und -6 (Ac-VEID-CHO) teilweise inhibieren. Die zytotoxische Wirkung von ATG lässt sich jedoch nicht in gleichem Maße durch Inhibitoren der Caspase-1 reduzieren, wie bei einem Apoptose induzierenden mAk gegen Fas. Es wird deutlich, dass ATG eine breit gefächerte zytotoxische Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen ausüben, die alle mehr oder weniger eine Rolle in der klinischen Wirksamkeit von ATG spielen können. ATG sind in der Lage, periphere blutmononukleäre Zellen (PBMC) zu aktivieren, wobei der Proliferationsindex in etwa dem eines Standardmitogens, wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA), entspricht. Isolierte T-Lymphozyten werden ebenfalls aktiviert, zeigen jedoch eine geringere Proliferationsrate. In PHA-Blasten lassen sich schwache Veränderungen im Muster der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung erkennen, wobei eine gewisse Ähnlichkeit im Bandenmuster sowie in der Intensität zwischen der Stimulation mit ATG und dem anti-CD2 mAk zu erkennen ist. Im Unterschied zu publizierten Studien konnte in dieser Arbeit kein spezifisch hemmender Effekt der ATG auf die MLR nachgewiesen werden. Aus den Untersuchungen zur Charakterisierung der ATG hat sich der komplement-abhängige Zytotoxizitätstest, gemessen am Durchflusszytometer, als die Methode herausgestellt, die, bezogen auf den Wirkmechanismus der ATG und im Hinblick auf eine Routineanwendung in der Chargenprüfung, am besten geeignet ist. Eine Evaluierung der Methode wurde im Rahmen eines Ringversuches, an dem sich sieben verschiedene Labore beteiligten, durchgeführt. Die mittlerweile gültige Arzneibuch-Monografie für ATG (Ph. Eur.: 1928) sieht diese in vitro Methode zur Wirksamkeitsprüfung von ATG vor, womit die Voraussetzungen zur Abschaffung des Affenhaut-Transplantationstests geschaffen wurden. Neben einer zellulären Charakterisierung der ATG konnte gezeigt werden, dass sich insbesondere biochemische Methoden, wie z. B. der Kinase-assay oder die Biotinylierung von Zelloberflächenmolekülen, sehr gut zur Identitätsprüfung von ATG eignen. Mit beiden Methoden ließen sich produktspezifische Bande nachweisen. Im Rahmen der Entwicklung von ATG sind diese Methoden geeignet, die Konsistenz der Chargenproduktion zu überprüfen, sodass auch hier Alternativen zum Tierversuch vorhanden sind.
Leukemia inhibitory factor enhances neurogenin's pro-neural effect during mouse cortical development
(2007)
Die Entwicklung von unterschiedlichen Zelltypen waehrend der embryonalen ZNS-Entwicklung ist abhaengig von zellintrinsischen und positionsabhaengigen, aeusseren Einfluessen. Dabei bilden sich die verschiedenen Zellen in nacheinander ablaufenden bzw. sich teilweise ueberlappenden Zeitraeumen. Zuerst entstehen Radiaglia und Neuronen, nachfolgend Astrozyten und zuletzt Oligodendrozyten. Werden neurale Stammzellen/Vorlaeuferzellen (NPCs – neural precursor cells) zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen und ohne den Einfluss von Wachstumsfaktoren kultiviert, so entwickeln sich diese Zellarten in der gleichen Reihenfolge. Die Neurogenese, die bei Mausembryos am Tag E11-12, nach dem Etablieren der Radialglia, beginnt, findet an E14 ihren Hoehepunkt. Zu diesem Zeitpunt werden die Gene Neurogenin1 (Ngn1) und Ngn2 in den neuralen Vorlaeuferzellen der Ventrikularzone des dorsalen Cortexes in hohem Masse exprimiert. Wie aus Untersuchungen von unserm Labor gezeigt wurde, beguenstigt es die Entstehung von Neuronen und blockiert gleichzeitig Pro-Astrozyten-Einfluesse. Zum einen inhibiert Ngn den JAK/STAT Signalweg, dessen Aktivierung fuer die Gliogenese noetig ist, indem es die Phosphoylierung von STAT1/3 auf bisher noch unbekannte Weise blockiert. Ausserdem bindet der Transkriptions-Coaktivator cAMP-response element binding protein (CBP), welches auch von den STATs fuer die Transkription benoetigt wird, bevorzugt an Ngn sobald dieses von den Vorlaeuferzellen exprimiert wird. Mit dem Tag E16 nimmt die Neurogenese in vivo wieder stark ab und es setzt die Gliogenese ein, bei der zunaechst ueberwiegend Astrozyten gebildet werden. Faktoren wie leukemia inhibitory factor (LIF) sowie ciliary neurotrophic factor (CNTF) beguenstigen dabei die Astrozytogenese indem sie den JAK/STAT Signalweg aktivieren. Die Bindung von LIF/CNTF fuehrt zur Phosphorylierung von STAT-Transkriptionsfaktoren, die ihrerseits dann an den CBP/p300 Komplex binden und schliesslich die Expression von Astrozyten-spezifischen Genen aktivieren. Die STAT-Faktoren koennen aber erst nach Abfall des Ngn-Spiegels an den Transkriptions-Coaktivator binden, da sich die Bindungsstellen dieser beiden ueberlappen. Um die Hypothese zu ueberpruefen, dass LIF auch die Neurogenese, oder spezifischer, die Wirkung von Ngn positiv beeinflusst, wurden cortikale NPCs von murinen Embryos entnommen und der Wirkung von LIF via Luciferase Assay untersucht. Dabei wurden die Vorlaeuferzellen mit Ngn und einem Reporter transfiziert, welcher den NeuroD-Promoter beinhaltete. NeuroD-Expression findet in der Regel gegen Mitte/Ende der Neurogenese statt und ist wichtig fuer die Reifung von Neuronen. Der Promoter von NeuroD beinhaltet ein E-box Element, an welches Ngn bindet und die Transkription einleitet. Wie unsere ersten Versuche zeigten, verstaerkt LIF die Transkriptionsaktivitaet von Ngn und somit die Transkription von NeuroD. Wenn aber im selben Versuch ein NeuroD-Reporter transfiziert wurde, dessen E-box mutiert war, wurde keine Transkriptionsaktivitaet gemessen, was wiederum bestaetigte, dass der pro-neurale LIF-Effekt ueber Ngn lief und E-box-Bindung noetig war. Um den Einfluss des pro-neuralen Effekts von LIF auf Proteinebene zu testen, wurden NPCs mit Ngn-Adenovirus infiziert und mit LIF stimuliert. Dabei wurden die Zellen auf die Expression von Neuron-spezifischem class III β-tubulin (TuJ1) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass LIF bei Zellen, die Ngn exprimierten, die Rate der Neuronen von etwa 5% auf etwa 50% anstiegen liess, waehrend LIF bezueglich der Gliogenese (gezeigt durch die Expression von GFAP) in Ngn-exprimierenden Vorlaeuferzellen kaum Wirkung zeigte. Als naechstes sollte untersucht werden ueber welchen Signalweg LIF Ngn aktivierte. LIF bindet zunaechst an LIF receptor β (LIFRβ), der dann an glycoprotein 130 (gp130) bindet. Diese Bindung fuehrt dann zur Aktivierung mehrerer Signalkaskaden: dem JAK/STAT, dem MAPK, dem Akt/PI3K und dem PLCγ/PKC Signalweg. Da der JAK/STAT Signalweg fuer die Gliogenese wichtig ist, lag unser Fokus auf den anderen Signalwegen. Deren Aktivierung wurde dann mit spezifischen Inhibitoren blockiert und, wie auch in den Vorversuchen, die Wirkung von LIF auf Transkriptionsebene (NeuroD) in neuralen Vorlaeuferzellen bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Blockierung des PLCγ/PKC Signalweges die NeuroD-Promoteraktivitaet am starksten inhibierte, waehrend auch LIF´s pro-neurale Wirkung verloren ging. Dementsprechend zeigte die Western Blot Analyse, dass die Expression von class III β-tubulin (TuJ1) durch die Anwendung der PKC Inhibitoren am staerksten inhibiert wurde, wobei auch hier die Stimulation durch LIF keine erhoehte Neurogenese mit sich zog. In weiteren Versuchen konnten wir dann mit Hilfe von Immunoprezipitation demonstrieren, dass LIF die Bindung von Ngn an CBP verstaerkte (eine Bindung, welche durch PKC Inhibitoren aufgehoben wurde), was wiederum zu einer erhoehten Bindung dieses Transkriptionskomplexes an den NeuroD Promoter fuehrte, wie unsere Chromatin Immunoprezipitation (ChIP) Daten beweisen. Dies wiederum laesst darauf schliessen, dass womoeglich diese erhoehte Ngn-CBP/NeuroD-Promoter Bindung der Grund fuer die erhoehte NeuroD-Transkriptionsaktivitaet ist daher auch fuer die erhoehte neuronale Differenzierung. Interessanterweise konnten wir auch zeigen, dass Brahma-related gene 1 (Brg1), eine katalytische Untereinheit des SWI/SWF Komplexes, an den Ngn/CBP cotranscriptionalen Komplex bindet und dass diese Bindung durch LIF-Stimulation verstaerkt wurde. Dies suggeriert wiederum, dass auch Brg1 eine wichtige Rolle waehrend der murinen, cortikalen Neurogenese spielt. Dennoch, in folgenden Experimenten verblieb der Fokus auf Ngn und CBP. Um unsere Hypothese zu bestaetigen, dass PKCδ ein moeglicher Mediator des LIF-Effekts sein koennte, zeigten wir zunaechst, dass die PKCδ-Expression in cortikalen NPCs waehrend der Neurogenese erhoeht ist. Desweiteren demonstrierten wir, dass die Inhibition von PKCδ einen aehnliche Wirkung zeigte wie die Inhibition von PKC mit einem generellen PKC Inhibitor: weder war nach PKCδ-Inhibition eine LIF-induzierte NeuroD-Transkription erzielbar, noch wurde nach LIF-Stimulation der pro-neurale Marker class III β-tubulin/TuJ1 in Ngn1-infizierten NPCs exprimiert. Um aber mehr spezifisch die PKC- und PKCδ-Aktivitaet/Expression zu blockieren transfizierten wir NPCs mit PLCγ oder PKCδ siRNA. Unsere Daten zeigten hierbei, dass siRNA-transfizierte Zellen kein class III β-tubulin mehr aufweisen, was darauf hindeuted, dass PKCδ der potentielle Mediator des pro-neuralen LIF-Effekts ist. Durch unsere in vivo Daten demonstrierten wir schliesslich, dass LIF auch hierbei fuer die Neurogenese von Bedeutung ist. Verglichen wurden die Cortices von E13 LIF Het (heterozygote) und KO (knock out) Maeusen mit denen von WT (wild type) Maeusen. Durch Immunohistologie von Hirnschnitten konnten dabei keine groesseren Unterschiede bezueglich der Expression neuraler Marker beobachtet werden, waehrend aber mit Hilfe der Western Blot Analyse, eine quantitativere Methode, gezeigt wurde, dass LIF Het und KO Maeuse weniger pro-neurale Marker im Cortex exprimieren wie WT Mause. Um auch zu beweisen, dass dies auf eine verringerte Transkription von NeuroD zurueckzufuehren ist, demonstrierten wir mit Hilfe des ChIP Assay, dass LIF Het und KO Maeuse weniger Ngn1-CBP Bindung an den NeuroD-Promoter aufweisen wie WT Maeuse. Diese Experimente veranschaulichen einen eleganten Regulationsmechanismus, durch welchen ein einzelner, extrazellulaerer Faktor die unterschiedliche Differenzierung einer Zelle verstaerkt, abhaengig von der Anwesenheit oder Abwesenheit eines einzelnenn intrazellulaeren Faktors. Auch koennen durch die erlangten Resultate Strategien entworfen werden, durch die in Zukunft die Produktion bestimmter Neurone zur Heilung von verschiedenen, neurodegenerativen Krankheiten erhoeht wird.
Many environmental chemicals are suspected of disturbing the human and animal endocrine system. These so-called endocrine disruptors can operate in many ways. The interaction of endocrine disruptive effects that eventually endanger human health is still unclear. However, one of the basic mecha-nisms of endocrine disruption is the inhibition of key enzymes in the hormone metabolism. In this study, we focused on the inhibitory potency of suspected endocrine disrupting compounds on aromatase (P450arom) and 5alpha-reductase (5alpha-Re) activities in human tissue and human cancer cells. Both enzymes are essential for the human sex steroid hormone metabolism. We were able to demonstrate that the organotin compounds tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPT) are potent unspecific inhibitors of P450arom and 5alpha-Re activity. Prochloraz and fenarimol inhibited P450arom activity at low concentrations (IC50<2 µM), while 5alpha-Re activity was only impaired at higher concentrations (IC50>10 µM). While the human tissue assay proved to be more practical and sensitive as a screening tool for putative endocrine disruptors, the cell assay reflected partly the situation in vivo. In another experimental series, we investigated the inhibitory effect of TPT on P450arom, 5alpha-Re, 3beta-HSD type 2, 17beta-HSD type 1 and type 3 alone and in combination with the strong antioxidant dithioerythrithol (DTE). TPT inhibited unspecifically all enzymes that were tested. The experiments also showed that DTE is able to compensate the adverse effects of TPT, and that the effectiveness of the compensatory activity of DTE differs among the enzymes investigated. The suppressed 5alpha-Re activity could not be reactivated with DTE. Conceivably, cysteine residues that are responsible for the tertiary and quarternary structure of the enzyme are critical targets for TPT. A human sampling study was undertaken with the COMPRENDO partner in Gdansk. 60 Polish and 15 German blood samples were investigated for chemical residues and sex hormone concentrations. In addition, 15 placenta samples from Poland and Germany, respectively, were tested for chemical residues, P450arom activities and CYP19 mRNA contents. The chemical analysis was performed by the COMPRENDO partners in Milan (p,p´DDE), Orleans (TBT and TPT) and Ioannina (diuron, fenarimol, linuron und vinclozolin). The results showed that individual sex hormone concentrations in blood were not correlated with chemical body burden. The detected differences in sex hormone concentrations, specific aromatase activity and relative CYP19 mRNA content of Polish and German donors were presumably the result of other factors than the ones determined in this study. Another task of the EU-project was the investigation of the effects of chemical exposure of the aquatic model organisms Pimephales promelas, Rutilus rutilus and Xenopus laevis. We investigated the specific P450arom and 5alpha-Re activities in brain and gonads of the animals. During the qualitative investigation of the androgen metabolism in Xenopus laevis brain, 5alpha-reductase activity was discovered for the first time. In contrast to the inhibitory potency of TPT discovered in our enzyme assays, TPT exposure of aquatic model organisms had no observed effect on enzyme activity in the organs investigated, except for P450arom activities in female gonads of Pimephales promelas at 320 ng TPT/L. In this group, mean P450arom activities were elevated, possibly as a result of an overshooting upregulation due to the inhibition of P450arom by TPT. The exposure of Rutilus rutilus and Xenopus laevis to the effector substances methyltestosterone and letrozole resulted in slightly different mean enzyme activities compared to the control group. In conclusion, many of the tested pesticides are able to inhibit P450arom and 5alpha-Re, and thus might be of clinical relevance. However, results are not always coherent, and possible risks for human and wildlife health are therefore difficult to predict. Risk assessment will require large studies with an additional number of short and long term in vitro and in vivo assays. Any extrapolation to humans should be very meticulously performed.
The retinoic acid related orphan receptor alpha (RORalpha) regulates the expression of various target genes by binding to specific response elements in their promoter region. RORalpha is an interesting pharmaceutical target since it positively affects several pathophysiological processes of clinical relevance. RORalpha enhances the expression of Apo-AI protein, the major constituent of HDL, which is responsible for the cholesterol transportation. RORalpha notably contributes to the bone mineralization and generation of the extracellular bone matrix, demonstrating its involvement in osteoporosis, and by up-regulating the gene for IKBalpha, RORalpha has anti-inflammatory effects. Moreover, RORalpha is necessary for cerebellar development and the maintenance of the mammalian day-night periodicity governed by the core-clock within the suprachiasmatic nuclei. RORalpha receptors have been reported to bind cholesterol, melatonin, or to function ligand-independent. By monomeric binding to the recognition motif AGGTCA preceded by an A/T-rich sequence (ROR response element, RORE), RORalpha constitutively activates gene transcription. However, RORalpha activity is passively suppressed by its opponents RevErbalpha and RevErbbeta, which both bind to the same target sequence. ...
Photosystem II (PSII) is a polypeptide-cofactor complex organised as a homodimeric multisubunit protein embedded in the thylakoid membrane. PSII monomers are heterooligomers related to each other by a pseudo-twofold axis perpendicular to the membrane plane (Loll et al. 2005). PSII acts as a photochemical enzyme that through the chlorophylls and the other cofactors catalyses photon capture and electron transfer from water to the plastoquinone pool with concomitant evolution of oxygen. Photon capture and charge separation take place in the PSII core which consists of the D1 and D2 proteins, the cytochrome b559 alpha- and beta-chains (PsbE and F subunits) and the chlorophyll a-binding antenna proteins CP43 and CP47 (Loll et al. 2005). The remaining polypeptides are low molecular mass proteins with not clearly understood fuctions; they include chloroplast-encoded (PsbH, I, J, K, L, M, N, T and Z) and nucleus-encoded (PsbR, S, W and X) proteins consisting of one to four transmembrane helices (Barber et al. 1997). The oxygen-evolving part of PSII consists of a Mn-Ca transition complex called Mn cluster or oxygen evolving complex that is situated on the luminal side of PSII. In higher plants it is stabilised by the PsbO (33 kDa), PsbP (23 kDa) and PsbQ (17 kDa) extrinsic subunits (Soursa et al. 2006; Ifuku et al. 2005). The structure and mechanisms related to the oxygen evolving complex of PSII are not completely clarified. Currently two high resolution structures from the cyanobacteria S. elongatus are available (Loll et al. 2005; Ferreira et al. 2004) Nevertheless structural information is not as well defined in green algae and higher plants as in cyanobacteria. In fact the 8Å structure available from spinach has too low resolution for addressing questions such as the structural and functional differences in respect to PSII from cyanobateria (Rhee et al. 1997).. Therefore it is obvious that for PSII from higher plants the main general questions are still open: is the structure of PSII from higher plants equivalent to the structures observed in cyanobacteria? Is the typical higher plants subunit PsbS stably or transiently bound to PSII? Finding an answer to these questions was the main focus of this work. In this work a simple and rapid protocol to isolate the oxygen-evolving photosystem II (PSII) core complex from Nicotiana tabacum was developed. A PSII having a His-tag extension made of six or ten consecutive histidine residues at the N-terminus of the PsbE subunit was purified by a single-step Ni2+ NTA-affinity column chromatography after solubilisation of the thylakoid membranes using different mild detergents. Characterization of the oxygen evolution and the subunit composition by immunoblotting and mass spectroscopy revealed that the His-tagging did not affect the functional integrity of the PSII reaction center. The final PSII core complex was purified in a single step from solubilised thylakoids in less than 14 hours getting a very pure sample in high amount. The isolated core complex was in a dimeric form as demonstrated by Blue Native PAGE, analytical gel filtration and single particles analysis; with a molecular mass of about 500 kDa, consisting of D1, D2, CP43, CP47, 33 kDa and low molecular weight proteins. The preparation retains a high rate of oxygen-evolving activity but showed different stabilities of the binding of the three extrinsic proteins. The subunit of 33 kDa was always present in the preparations with a constant amount, whereas the 23 and 17 kDa subunits were always in less and unconstant amounts. Nevertheless the oxygen evolution was not depending on the amount of the 23 and 17 kDa subunits. Furthermore the preparation showed a high oxygen-evolving activity of 1390 micromol/mg Chl·h-1 in presence of betaine, while its activity was 440-680 micromol/mg Chl·h-1 in its absence. The presence of 1.0 mol/L betaine during the isolation of PSII increased the preservation of the photochemical activity hence the oxygen evolution. It was inferred from these results that His-tagging does not affect the functional and structural integrity of the PSII core complex and that the “Histag strategy” is highly useful for biochemical, physicochemical and structural studies of higher plant PSII. PSII is directly involved in two essential processes, the efficient capture and funnelling of light energy to the reaction centre and the controlled dissipation of excess excitation energy. Those functions require structural and functional flexibility in order to be performed with high efficiency. Moreover light-harvesting proteins respond to an external signal, the thylakoid pH, to induce feedback control regulating those activities in every moment. This process called non-photochemical quenching (NPQ) is mainly depending on the xanthophyll cycle and the PsbS protein (Szabo et al. 2005). In this work several new evidences related with those two processes were found. The subunit PsbS is a polypeptide whose involvement in the NPQ processes is debated. Nevertheless, its position in the PSII complex and the mechanisms by which this subunit contributes to carry out the NPQ functions are not definitely known. In addition it is not sure if it is a pigment binding protein or not. Currently several lines of evidence indicate that this subunit is able to bind two molecules of zeaxanthin, one of the pigments involved in the xanthophyll cycle. In this work immunolabelling indicated that PsbS is tightly bound to the PSII core dimer, monomer and incomplete PSII particles as Reaction Centre-CP47 (RC-CP47). Furthermore qualitative HPLC indicates a complete absence of zeaxanthin in the sample and the presence of violaxanthin, another pigment involved in the xanthophyll cycle. The absence of zeaxanthin was expected considering that the plants were harvested after the dark period and that the particles were purified in complete dark (or in green light), whereas the presence of violaxanthin was unexpected considering that so far no evidence of violaxanthin bound to PSII cores devoid of LHC proteins was reported. Furthermore the amount of chlorophyll b was not relevant for suspecting this pigment bound to PsbS. Therefore we conclude that if PsbS is able to bind chlorophyll it has to be a chlorophyll a. The results indicate that PsbS could be able to bind not only zeaxanthin but also violaxanthin. The extrinsic subunit Psb27 was also found in this preparation. The presence and the amount of this subunit, reported to be involved in the repair of damaged PSII, was not constant and therefore behaving as the other two extrinsic proteins 23kDa (PsbP) and 17kDa (PsbQ). Electron crystallography studies on spinach PSII particles purified by differential solubilisation resulted in crystalline tubes with new unit cell constants. From data analysis a density map at 15Å resolution was obtained with a P22121 symmetry. However, at this resolution it cannot be said if the internal symmetry axis is related with the two-fold axis of the dimer or the pseudo two-fold axis of the monomer. In conclusion a method to isolate functional, pure PSII core complexes was developped. These samples, together with the improved 2d crystallisation protocol could lead to crystals with higher quality hence better resolution density maps in the future.
Intrinsic response properties of auditory thalamic neurons in the Gerbil (Meriones unguiculatus)
(2007)
Neurons in the medial geniculate body (MGB) have the complex task of processing the auditory ascending information from the periphery and a more extensive descending input from the cortex. Differences in the pattern of afferent and efferent neuronal connections suggest that neurons in the ventral and dorsal divisions of the MGB take different roles in this complex task. The ventral MGB (vMGB) is the primary, tonotopic, division and the dorsal MGB (dMGB) is one of the higher order, nontonotopic divisions. The vMGB neurons are arranged tonotopically, have sharp tuning properties, and a short response delay to acoustic stimuli. The dMGB neurons are not tonotopically arranged, have broad tuning properties, and a long response delay to acoustical stimuli. These two populations of neurons, with inherently different tasks, may display differences in intrinsic physiological properties, e.g. the capacity to integrate information on a single cell level. Neurons of the ventral and dorsal divisions of the MGB offer an ideal system to explore and compare the intrinsic neuronal properties related to auditory processing. Coronal slices of 200 μm thicknesses were prepared from the thalamus of 4 - 5 week old gerbils. The current-clamp configuration of the patch-clamp technique was used to do experiments on the dorsal and ventral divisions of the medial geniculate body. Slices were subsequently Nissl stained to verify the location of recording. Recordings from the dorsal and ventral divisions exhibited differences in response to depolarizing current injections. The ventral division responded with significantly shorter first spike latency (vMGB = 41.50 ± 7.7, dMGB = 128.43 ± 16.28; (p < 0.01)) and rise time constant (vMGB = 6.95 ± 0.90, dMGB = 116.67 ± 0.13; (p < 0.01)) than the dMGB. Neurons in the dorsal division possessed a larger proportion of slowly accommodating neurons (rapidly accommodating: vMGB: 89%, dMGB: 64%), including a subpopulation of neurons that fired at resting membrane potential. Neurons in the vMGB are primarily responsible for relaying primary auditory input. Dorsal MGB neurons relay converging multimodal input. A comparative analysis with the primary auditory neurons, the Type I and Type II spiral ganglion neurons, reveals a similar pattern. Type I neurons relay primary auditory input and exhibit short first spike latencies and rise time constants. The Type II neurons relay converging input from many sources, while possessing significantly slower response properties and a greater subpopulation of slowly accommodating neurons. Hence, accommodation, first spike latency, and rise time constant are suggested to be a reflection of the amount of input that must be integrated before an action potential can be fired. More converging input correlates to slower accommodation, a longer first spike latency and rise time. Conversely, a greater capacity to derive discrete input is associated with rapid accommodation, along with a short first spike latency and rise time.
Background: In sequencing the genomes of two Xenorhabdus species, we encountered a large number of sequence repeats and assembly anomalies that stalled finishing efforts. This included a stretch of about 12 Kb that is over 99.9% identical between the plasmid and chromosome of X. nematophila.
Results: Whole genome restriction maps of the sequenced strains were produced through optical mapping technology. These maps allowed rapid resolution of sequence assembly problems, permitted closing of the genome, and allowed correction of a large inversion in a genome assembly that we had considered finished.
Conclusion: Our experience suggests that routine use of optical mapping in bacterial genome sequence finishing is warranted. When combined with data produced through 454 sequencing, an optical map can rapidly and inexpensively generate an ordered and oriented set of contigs to produce a nearly complete genome sequence assembly.
Humane hämatopoetische Stammzellen (HSCs) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und übernehmen die kontinuierliche Neubildung aller zellulären Bestandteile des Blutes. Aufgrund der zunehmenden klinischen Bedeutung der HSCs ist es essentiell die molekularen Mechanismen, die den Prozess der Vermehrung und Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen steuern, aufzuklären und deren funktionelle Bedeutung zu verstehen. Das Ziel der Arbeit war die Identifizierung, Charakterisierung und gerichtete Modulation funktionell relevanter Signalwege, die am Differenzierungsprozess von HSCs zu myeloiden Effektorzellen beteiligt sind. Für diese Untersuchung wurde ein Expansionsprotokoll für humane HSCs, sowie ein Differenzierungsprotokoll für das humane myeloide DC Differenzierungsmodell entwickelt. In der Arbeit wurden drei wichtige Signalwege der Zelle, die Mitogenen Signalkaskade (MAPK), Protein Kinase C (PKC) gekoppelten Prozessen und dem JAK/STAT Signalweg untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die Stimulation der HSCs mit GM-CSF und IL-4 zu einer zeitlich begrenzten Aktivierung von MAPK/ERK1/2, PKC delta, JAK2, sowie STAT5 und STAT6 führte. Kommerzielle Inhibitoren von MEK, PKC und Januskinase hemmten selektiv diese Aktivierung und führten zu einer veränderten Hämatopoese. Die Aktivierung dieser Signalwege ist daher für die myeloide Differenzierung von HSCs zu Dendritischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Einer der entscheidenden nuklearen Faktoren für die myeloide Differenzierung ist der Ets-Transkriptionsfaktor PU.1, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert sein könnte. Obwohl die funktionelle Rolle von PU.1 in der Differenzierung von HSC in der vorliegenden Arbeit nicht vollständig geklärt werden konnte, wurde jedoch erstmals im in vitro Kinase-Assay gezeigt, daß PU.1 durch PKC delta, aber nicht durch MAPK/ERK2 spezifisch phosphoryliert wird. In einem PU.1-spezifischen Luciferasereporter-Assay wurde die transkriptionelle Aktivität von PU.1 durch die Inhibition von PKC delta und MAPK/ERK1/2 deutlich reduziert. Weiterführende Experimente in einem komplexen Differenzierungsmodell von humanen HSCs wiesen darauf hin, daß durch den gezielten Einsatz von Signalweginhibitoren eine Verschiebung der Verhältnisse der gebildeten Blutzellkolonieformen erreicht werden kann. So war die Differenzierung zu Erythrozyten von der Mitogenen Signalkaskade unabhängig, wohingegen die Differenzierung zu Makrophagen eine deutliche Abhängigkeit von der Aktivität der Mitogenen Signalkaskade sowie von der Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs zeigte. Im Gegensatz dazu führte die Inhibition der Januskinasen (JAKs) zu einer Hemmung der Differenzierung in allen Kolonieformen. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, daß der MAPK/ERK und PKC delta Signalweg bei der Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen eine wichtige Rolle spielen und eine gerichtete Steuerung der Differenzierung durch den Einsatz spezifischer Signalweginhibitoren möglich erscheint.