Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Extrazelluläre Nukleotide fungieren als auto- und parakrine Signalstoffe aus. Im peripheren und zentralen Nervensystem dienen Nukleotide als Neurotransmitter und Neuromodulatoren. Die nahezu ubiquitäre Expression von Purin-Rezeptoren läßt auf umfassende physiologische Funktionen schließen. Nukleotide konnen über ionotrope P2X-Rezeptoren oder metabotrobe P2Y-Rezeptoren ihre Signalwirkung vermitteln. Via P1-Rezeptoren kann Adenosin, ein Baustein bzw. Abbauprodukt von ATP, seine neuromodulatorische und neuroprotektive Wirkung entfalten. Alkalische Phosphatasen, die Ekto-Nukleotid-Pyrophosphatase/Phosphodiesterase Familie (NPP-Familie) und die Ekto-Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase-Familie (E-NTPDasen) können Nukleosiddiphosphate und Nukleosidtriphosphate hydrolysieren. Die E-NTPDasen sind die wahrscheinlichsten Kandidaten für die Moduluation purinerger Signale im Nervensystem. In dieser Arbeit wurde die Klonierung und Charakterisierung der NTPDase3 der Ratte beschrieben. Ein vollständiger cDNA-Klon der NTPDase3 wurde aus einer Rattenhirnbank isoliert, sequenziert und anhand der familientypischen Sequenzmuster (ACRŽs) als E-NTPDase identifiziert. Die Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen der für ein 529 Aminosäuren großes Protein kodierte. Sequenzvergleiche zeigten eine große Ähnlichkeit des Proteins mit den NTPDasen 1, 2 und 8, welche plasmamembranständige Ekto-Enzyme sind. Eine plasmamembranständige Lokalisation konnte in NTPDase3-transfizierten CHO-Zellen und in PC12-Zellen mit endogener NTPDase3-Expression nachgewiesen werden. Anhand von Computeranalysen und Sequenzvergleichen wurden Überlegungen zur Sekundär- und Tertiärstruktur angestellt und Ähnlichkeiten zur Zuckerkinase/ Hitzeschock-Protein 70/Aktin-Superfamilie aufgezeigt. Das Protein war entsprechend der in silico-Analyse glykosiliert und ließ sich über das Lektin ConcavalinA anreichern. Messungen an Membranfraktionen heterelog transfizierter CHO-Zellen zeigten die Hydrolyse verschiedener Nukleosidtriphosphate und Nukleosiddiphosphate mit einer Präferenz für Nukleosidtriphosphate. Das Enzym ist primär Kalziumabhängig und a rbeitet optimal im physiologischen pH-Bereich von pH 7,5 bis pH 8,0. Mit einem ATPase:ADPase-Verhältnis von 5:1 liegt die NTPDase3 zwischen der NTPDase1 und der NTPDase2. Seine biochemischen Eigenschaften machen das Ekto-Enzym zu einem Kandidaten für die Modulation purinerger Signale. Nukleotid-vermittelte Signale können via Hydrolyse durch die NTPDase3, möglicherweise in Kombination mit anderen E-NTPDasen, beendet werden. Als Bestandteil einer Enzymkette mit der Ekto-5Ž-Nukleotidase kann das Enzym zur Produktion des neuromodulatorisch und neuroprotektiv wirkenden Adenosins beitragen. Mögliche Rollen bei der Regulation autokriner, parakriner und synaptischer Signale in nichtneuronalen wie neuronalen Geweben wurden für die Gewebe diskutiert, in denen die NTPDase3 per Westernblot nachgewiesen werden konnte. Neben Dünndarm, Prostata, Pancreas, Nebenhoden und Samenleiter wurde ein NTPDase3-Band vor allem im zentralen Nervensystem gefunden. In allen geprüften Hirnteilen (Bulbus olfactorius, Cerebellum, Cortex, Mesencephalon, Diencephalon, Hippocampus, Striatum, Medulla oblongata), dem Rückenmark und der Hypophyse wurde die NTPDase3 im Westernblot detektiert. Das Enzym könnte an der Regulation exokriner Drüsenfunktionen im Pancreas und am epithelialem Ionentransport involviert sein oder auch bei endokrinen Funktionen des Pankreas und der Hypophyse mitwirken. Möglicherweise hat die NTPDase3 funktionelle Bedeutung bei der Termination und Modulation purinerger Neurotransmission im enterischen Nervensystem, im Rückenmark und in verschiedenen Hirnregionen. An verschiedenen zentralnervösen Funktionen, wie Schmerzwahrnehmung, Atmungs- und Kreislauf-Regulation sowie Gedächtnis- und Lernprozessen sind purinerge Signale maßgeblich beteiligt und es ist wahrscheinlich, daß E-NTPDasen an der Modulation dieser Signale mitwirken. Die in dieser Arbeit beschriebene NTPDase3 ist ein viel versprechender Kandidat für die Regulation purinerger Signale im peripheren und zentralen Nervensystem.
In der vorliegenden Arbeit wird ein neu entwickeltes Erfassungsinstrument für die pflanzliche Artenvielfalt in der Normallandschaft vorgestellt, dass den Namen GISMap trägt. Die standardisierte Vorgehensweise und eine große Reproduzierbarkeit des Aufnahmeverfahrens sind wichtige Eigenschaften der Methode. GISMap basiert auf der GIS-gestützten Auswertung der Landschaftsstruktur, die in Form eines digitalen Landschaftsmodells (DLM) zugrunde gelegt wird. Im Zentrum der Methode steht ein im Rahmen der Arbeit entwickelter Algorithmus, der eine zufallsgesteuerte Festlegung von Aufnahmeflächen in der zu untersuchenden Landschaft vornimmt und sich dabei an den Ökotonen orientiert, die sich zwischen zwei benachbarten Landschaftselementen ausbilden. Ökotone sind als Übergangsbiotope häufig sehr reich an Strukturen und können daher eine große Artenvielfalt aufweisen. GIS-Map macht sich diese ökologische Gegebenheit zunutze, um auf möglichst kleinem Raum eine große Artenzahl zu erfassen. Die von GISMap errechneten Aufnahmeflächenkoordinaten wurden mit Hilfe eines GPS-Empfängers im Gelände lokalisiert und einer floristischen Untersuchung unterzogen. Als geeignete Aufnahmeflächengröße erwies sich dabei ein Kreis mit einer Fläche von 700 m². Die Flächen wurden mit Magneten markiert, um sie zur Dauerbeobachtung der Flora nutzen zu können. In dem 33 km² großen Untersuchungsgebiet, das im östlichen Bereich des Taunus liegt, wurden insgesamt 141 Aufnahmeflächen für 16 64tel-MTB-Rasterfelder angelegt. Um den mit der Methode zu erzielenden Erfassungsgrad abschätzen zu können, wurden umfangreiche Vergleichsuntersuchungen durchgeführt, die auch eine Auswertung vorliegender Literaturquellen mit einschlossen. In den 16 untersuchten Rasterfeldern konnten durchschnittlich 73 % der insgesamt vorkommenden Arten mit der Methode erfasst werden. Dazu müssen nur 0,3 % der Fläche tatsächlich einer floristischen Untersuchung unterzogen werden. Alle kartierten Arten erhalten dabei eine punktgenaue Koordinate. Die Methode wurde als Basisinstrument konzipiert und sollte mit bereits vorliegenden Fachdaten kombiniert werden, um die Erfassung der Farn- und Samenpflanzen eines Gebietes zu vervollständigen. Diskutiert wird der Einsatz im Rahmen eines Landschaftsinformationssystems (LIS). Durch eine Ergänzung der mit GISMap erhobenen Daten mit anderen vegetationskundlichen Daten aus dem Untersuchungsgebiet konnte der Erfassungs-grad von 73 % auf 85 % gesteigert werden. Im Rahmen der Arbeit werden zahlreiche Möglichkeiten der technischen Weiterentwicklung dargestellt, die zu einer Optimierung der Methode beitragen können. Ausgehend von den Daten des digitalen Landschaftsmodells wurden zur Beschreibung der landschaftlichen Struktur des Untersuchungsgebietes verschiedene Landschaftsstrukturmaße berechnet, wie sie in der modernen landschaftsökologischen Forschung mittlerweile häufig zum Einsatz kommen. Diese wurden mit den erfassten Sippenzahlen korreliert, um Zusammenhänge zwischen der Landschaftsstruktur und dem auftretenden floristischen Ar-tenreichtum darzustellen. Dabei wurde auch der Fragestellung nachgegangen, ob auf der Basis von Maßzahlen für die Landschaftsstruktur Prognosen über die zu erwartende pflanzli-che Artenvielfalt getroffen werden können. Ein weiterer Aspekt der Untersuchungen bestand in der Nutzung des entstandenen Aufnahmeflächennetzes zur langfristigen Beobachtung von Veränderungen der Vegetation des betrachteten Landschaftsausschnittes. Anhand der Frequenzen in den Aufnahmeflächen kann mit GISMap ein langfristiges Monitoring auf der Ebene einzelner Arten durchgeführt werden. Dies wird u. a. in Hinblick auf die im Untersuchungsgebiet auftretenden Neophyten diskutiert. Als Möglichkeit zum Monitoring der gesamten Vegetation wurde der Ansatz verfolgt, die Verteilung der kartierten Arten auf 24 häufig in der Literatur beschriebene Pflanzenformationen festzustellen. Es wird vorgeschlagen, eine langfristige Beobachtung dieses Verteilungsmusters vorzunehmen, um einen Aufschluss über ökologische Veränderungen der Landschaft anhand der Vegetation zu erhalten. Weitere Auswertungen der gesammelten floristischen Daten beziehen sich auf ihre Eignung zum Monitoring von klimatischen Veränderungen. Die Berechnung mittlerer Temperaturzahlen für 6 Höhenstufen erwies sich dabei als ungeeignet, da ihre Unterschiede zwischen den Höhenstufen nicht statistisch abzusichern waren. Darüber hinaus wurde die Verteilung von Kühlezeigern in dem entstandenen Aufnahmeflächennetz für die verschiedenen Höhenstufen untersucht. Hinweise zu ihrer Eignung als Indikatoren für klimatische Veränderungen werden diskutiert.
Die Hitzestressantwort stellt einen universellen Schutzmechanismus aller lebenden Organismen dar. Infolge einer Temperaturerhöhung werden Hitzestresstranskriptionsfaktoren (Hsf) aktiviert und bewirken eine gesteigerte Expression von Hitzestressproteinen (Hsp). Als molekulare Chaperone schützen diese die Zelle vor durch Hitze verursachten Schäden. In höheren Pflanzen ist dieses Phänomen sowohl auf der Ebene der Hsf als auch der Hsp besonders komplex. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Funktion von Komponenten des Chaperonsystems in der pflanzlichen Thermotoleranz. Zur Untersuchung der Thermotoleranz wurde ein transientes Expressionsystem mit Mesophyllprotoplasten aus steril angezogenen Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum) zweier Linien (WT und CS) verwendet. CS-Pflanzen zeigen Cosuppression von HsfA1 und zeichnen sich durch eine Integration zweier direkt aufeinander folgender Transgenkassetten in invertierter Orientierung aus. Die fehlende Expression von HsfA1 in CS-Pflanzen ist die Folge eines Prozesses, der als RNA-interference (RNAi) bezeichnet wird. In unserem transienten Expressionssystem wurden Mesophyllprotoplasten mit einem Expressionsplasmid transformiert, das für Luciferase aus Photinus pyralis als thermosensitivem, leicht nachweisbarem Reporterprotein kodiert. Mit Hilfe dieses Testsystems konnten wir den Schutz der Luciferase gegen eine thermische Denaturierung bei 41°C (30 min) und die nachfolgende Renaturierung für 120 min bei 25°C in Abhängigkeit von endogenen und transient exprimierten Hsp und Hsf beobachten. Mit Hilfe der RNAi-Technologie und unter Verwendung von genspezifischen inverted repeat-Konstrukten konnten wir weiterhin die Bildung einzelner Komponenten des endogenen Chaperonsystems verhindern und damit ihre Funktion untersuchen. Es zeigte sich, dass in Protoplasten aus CS-Pflanzen praktisch alle hitzestressinduzierten Proteine fehlten und diese nicht in der Lage waren, Thermotoleranz auszuprägen, wie unter Verwendung des Reporterproteins Luciferase nachgewiesen werden konnte. Weiterhin fand keine Bildung cytoplasmatischer Multichaperonkomplexe, der sogenannten Hitzestressgranula (HSG), statt. Dieser Defekt in der Ausprägung von Thermotoleranz konnte durch Expression von HsfA2, HsfA3 und HsfA4b repariert werden. Die Überexpression dieser Hsf führte gleichermaßen zu (1) einer Expression von Chaperonen, (2) Thermoprotektion des Reporterenzyms Photinus pyralis-Luciferase und (3) Bildung von HSG-Komplexen. In weiteren Analysen lag unser Augenmerk insbesondere auf Vertretern der sHsp, sowie der Hsp70- und Hsp101-Chaperonfamilien. Hierbei erwies sich, dass vor allem Klasse CI-sHsp und Vertreter der Hsp70-Famile beim Schutz der Luciferase gegen Denaturierung während eines Hitzstresses eine Rolle spielen, während hauptsächlich Hsp101 und Vertreter der Hsp70-Familie in der darauf folgenden Erholungsphase von Bedeutung sind. Die Untersuchung der Interaktionen von drei Klassen cytoplasmatischer sHsp und ihrer intrazellulären Verteilung im Rahmen meiner Arbeit zeigte, dass jeder dieser Klassen eine unterschiedliche Funktion im Netzwerk cytoplasmatischer sHsp zukommt. Unter Verwendung nativer Gelelektrophorese und indirekter Immunfluoreszenz konnte nachgewiesen werden, dass sHsp der Klassen CI, CII und CIII in der Lage sind, auf der Ebene oligomerer Komplexe zu interagieren und ihre intrazelluläre Lokalisation wechselseitig zu beeinflussen. Proteine der Klasse CII zeigten eine starke Tendenz zur Bildung von Aggregaten, in die Klasse CIII-sHsp rekrutiert wurden. Im Unterschied dazu verfügten Klasse CI-Proteine über die Fähigkeit, diese Aggregate aufzulösen. Die detaillierte Untersuchung von fünf Isoformen der Klasse CI und zwei Isoformen der Klasse CII aus Lycopersicon esculentum ergab, dass diese oligomere Komplexe einer unterschiedlichen Anzahl von Untereinheiten bilden. Nach Coexpression waren Proteine beider Klassen in heterooligomeren Komplexe zu finden. Allerdings deuteten sich bei der Analyse der Fähigkeit einzelner Isoformen der Klasse CI, Heterooligomere mit Klasse CII-Proteinen zu bilden, Unterschiede an. sHsp kommt weiterhin eine Funktion in der Kontrolle der Aktivität von HsfA2 zu. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass sHsps der Klassen CI und CII völlig unterschiedliche Rollen in der Regulation der intrazellulären Verteilung von HsfA2 spielen. Nach Überexpression in Mesophyllprotoplasten bildete LpHsp17.4-CII, nicht aber das nahe verwandte LpHsp17.3-CII mit HsfA2 große, cytoplasmatische Aggregate. Hsp17-CI dagegen verhinderte die Coaggregation von Hsp17.4-CII mit HsfA2.
Die Grundlage dieser Arbeit bilden Befunde über den Kupfer-Metabolismus des Ascomyceten Podospora anserina. In der Kupfermangel-Mutante grisea ist der Transkriptionsfaktor GRISEA inaktiv, welcher die Aktivität der hochaffinen Kupfer(I)-Permease PaCTR3 kontrolliert. Der Kupfer-Mangel aller Zellkompartimente führt zu pleiotropen Effekten und zu einer moderaten Verlängerung der mittleren Lebensspanne (60%). Um Effekte des Kupfermangels, die positiven bzw. negativen Einfluß auf die Lebensspanne zeigen, voneinander zu trennen, erschien es vielversprechend, den Kupfermangel auf ein Kompartiment der Zelle zu beschränken. In Hefe komplexiert COX17 Kupfer und gibt es im mitochondrialen Intermembranraum an SCO1 und COX11 (Assemblierungsfaktoren der Cytochrom-c-Oxidase) weiter. Zur Aufschlüsselung Kupfer-abhängiger Stoffwechsel-Wege wurde in dieser Arbeit eine PaCox17-Nullmutante konstruiert und charakterisiert. Die PaCox17::ble-Deletionsmutante ist durch AOX-Respiration, hohe Aktivität der Cu/Zn-SOD und ein stabilisiertes Chondriom charakterisiert. Eine vergleichende Analyse von Mutante und Wild-Stamm führte zu folgenden Ergebnissen: 1. Die Disruption des PaCOX17-Weges verhindert die Assemblierung der COX beinahe völlig. COX-Respiration kann nur in sehr geringem Umfang nachgewiesen werden. 2. Der Ausfall der COX induziert die alternative Oxidase und führt zu AOX-Respiration. 3. Die Atmungsrate der Mutante PaCOX17::ble ist, aufgrund der AOX-Respiration, gegenüber dem Wild-Stamm annähernd verdreifacht. 4. Weiterhin zeigen PaCox17::ble-Stämme ein stabilisiertes mitochondriales Genom, normalerweise wird weder plDNA amplifiziert noch wird beta-senDNA gebildet. 5. Der Kupfer-Spiegel des Zytoplasmas ist gegenüber Wild-Stämmen stark erhöht. 6. PaCox17::ble-Stämme sind durch konstant starke Expression der Cu/Zn-SOD charakterisiert. Die Mn-SOD spielt eine untergeordnete Rolle. 7. Die beschriebenen Effekte führen zu einer enormen Verlängerung der mittleren Lebensspanne (1250% des Wild-Stammes). Neben der Isolation und Charakterisierung der Mutante PaCox17::ble wurde PaSco1 isoliert und initial charakterisiert. PaSco1 liegt in P. anserina wahrscheinlich in einer Kopie vor. Es kodiert das Kupferbindeprotein PaSCO1, welches Kupfer vermutlich von PaCOX17 übernimmt und an die Untereinheit 2 der COX weitergibt. In dieser Arbeit wurden Teilaspekte des Kupfermetabolismus von P. anserina untersucht. Von besonderem Interesse waren Zusammenhänge zwischen Kupfer-Metabolismus und mitochondrialen Funktionen. Einen weiteren Schwerpunkt bildeten entwicklungsbiologische Prozesse, der Alterungsprozess war von übergeordneter Bedeutung. Es konnte gezeigt werden, daß Störungen der Kupfer-Homöostase die Respiration, den zellulären oxidativen Stress, die Stabilität des Chondrioms und diverse Entwicklungsprozesse, wie beispielsweise Fortpflanzung und Alterung des Hyphenpilzes beeinflussen.
Das für die Phytoen-Desaturase (CrtI) aus Rubrivivax gelatinosus kodierende Gen konnte aus genomischer DNA amplifiziert und in unterschiedliche Expressionsvektoren kloniert werden. Die Funktion der Phytoen-Desaturase wurde in vivo durch Komplemetierung einer Phytoen bildenden E. coli-Transformante überprüft. Die heterologe Expression von crtIRg in E. coli, als lösliches und aktives Enzym mit einer molekularen Masse von 57 kDa, konnte nur mit dem Plasmid pPEUcrtIRg erreicht werden. Mittels in vitro Enzymtests konnten kinetische Parameter und der Kofaktor des Enzyms bestimmt werden. Der Km-Wert für das Substrat Phytoen lag bei 14,8 μM, der Vmax-Wert bei 5,2 nmol/h*mg CrtIRg. Für das Substrat Neurosporin konnte ein Km-Wert von 33 μM und ein Vmax-Wert von 0,6 nmol/h*mg CrtIRg ermitteltwerden. FAD steigerte als Kofaktor den Umsatz des Substrates um das 39-fache. Sowohl für die Phytoen-Desaturase aus Rvi. gelatinosus, als auch für die Phytoen-Desaturase aus Rba. sphaeroides konnte in vitro gezeigt werden, dass die Anzahl der an einem Carotinoidmolekül katalysierten Reaktionsschritte stark von der Enzym- bzw. Substratkonzentration abhängt. Bei einer hohen Phytoen- und einer niedrigen Enzymkonzentration wird fast nur Neurosporin gebildet (3 zusätzliche Doppelbindungen), während bei einer hohen Enzym- und einer niedrigen Phytoenkonzentration deutlich mehr Lycopin synthetisiert wird (4 zusätzliche Doppelbindungen). In den jeweiligen Organismen spielt die Konkurrenz der bakteriellen Phytoen-Desaturase mit dem sich in der Carotinoidbiosynthesekette anschließenden Enzym in Bezug auf die Anzahl der eingefügten Doppelbindungen eine wichtige Rolle. Dies konnte in Hemmstoffuntersuchungen am Beispiel zweier Xanthphyllomyces dendrohous-Mutanten gezeigt werden. Die Verringerung der aktiven CrtI-Menge in der Torulin-Mutante DQ1 förderte die Bildung von β-Carotin (nur 4 Desaturierungsschritte). Dagegen führte die Senkung der aktiven Lycopin-Zyklase-Menge in der β-Carotin-Mutante PR1-104 zur Förderung der durch CrtI katalysierten Reaktion mit der Folge, dass hauptsächlich Torulin gebildet wurde (5 Desaturierungsschritte). Mittels Error Prone PCR sowie dem E. coli-Stamm XL1-Red konnte das Gen crtI aus Rvi. gelatinosus mutagenisiert werden. Die erstellten Mutationsbibliotheken konnten in Phytoen bildenden E. coli-Transformanten exprimiert und Klone mit veränderten Phytoen-Desaturasen mittels Farbscreening identifiziert werden. Aus Klonen mit einem veränderten Lycopin/Neurosporin-Verhältnis wurde die DNA isoliert und crtI sequenziert. Dadurch konnten mutierte Gene ermittelt werden, deren modifizierte Expressionsprodukte entweder mehr Lycopin oder fast ausschließlich Neurosporin bildeten. Es zeigte sich, dass die Veränderung der Aminosäure an Position 208 einen starken Einfluss auf die Anzahl der eingefügten Doppelbindungen hat. Die Aminosäure befindet sich in einer membrangebundenen Helixstruktur bei der es sich vermutlich um einen direkt an der katalytischen Reaktion beteiligten Bereich handelt. Es konnte gezeigt werden, dass alle Mutationen, die die Anzahl der katalysierten Reaktionsschritte senkten, Leucin-Prolin-Austausche (oder umgekehrt) waren. Prolin (bzw. Leucin) veränderte in diesen Fällen die Sekundärstruktur des Proteins wodurch, die Funktion gestört wurde. Neben diesen strukturellen Veränderungen wurden Mutationen ermittelt, die zu einer verstärkten Expression der Phytoen-Desaturase führten, was eine erhöhte Lycopinbildung bewirkte. Es zeigte sich, dass bei einigen dieser Mutanten die Replikation der Plasmid-DNA erhöht war. Die starke Replikation ist wahrscheinlich auf eine Verarmung an beladenen tRNA Molekülen zurückzuführen. In ColE1-Plasmiden (pPEU) kann es zu einer unkontrollierten Replikation kommen, die auf Wechselwirkungen zwischen den Replikationsregulierenden Strukturen RNAI und RNAII mit den unbeladenen tRNA Molekülen zurückzuführen ist. Auf der Grundlage der erlangten Erkenntnisse und mittels Computer gestützter Analysen konnte ein Modell der Sekundärstruktur und der Membranassoziation des Enzyms erstellt werden.
Soluble guanylyl cyclase (sGC) is a cytosolic enzyme producing the intracellular messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) on activation with nitric oxide (NO) which leads to the activation of GMP dependent protein kinases and to vasodilation. NO signaling may be affected by altered expression of sGC subunits, as has been shown in different pathological and physiological conditions and developmental stages. The molecular mechanisms underlying altered sGC expression in these and other conditions have not yet been revealed. Gene expression can also be regulated at the level of mRNA through alterations in translational efficiency and in mRNA stability. HuR (Human R) is a ubiquitously expressed member of the embryonic lethal abnormal vision (ELAV) family of RNA-binding proteins. Among other RNAs, there has been recent evidence that the expression of sGC is subject to post-transcriptional regulation by HuR. It has been shown that chronic hypertension induces changes in HuR expression and activity, which account for decreased sGC expression and activity in the aorta of hypertensive rats. This thesis should study was performed in an effort to provide some insight to the transcriptional and post-transcriptional regulation of sGC expression in a mammal, the rat. We investigated rat sGC alpha-1 transcriptional regulation in rat lung fibroblast (RLF-6) cells. The 3000bp 5' upstream region of the alpha-1 sGC gene was isolated and analyzed for promoter activity by using luciferase reporter constructs- Alpha3000 (with -2794 bp), Alpha1100 (-1092 bp), Alpha350 (-346 bp) and Alpha200 (-200 bp). The promoter activity was the highest in the 200bp construct (about 6-fold higher than Alpha3000) suggesting that this fragment contains all the crucial elements necessary to support basal transcription of the alpha-1 sGC gene. Analysis of the 200 bp of the 5’ UTR of the alpha-1 gene was performed using the MATINSPECTOR V2.2 software for putative transcription factors. The constructs containing the deleted sites for NFY and Sp1 showed a significant decrease in constitutive promoter activity by almost 80% and 60% respectively, implying that these transcription factors are crucial elements in the basal expression of the of sGC alpha-1 subunit. Treatment of RLF-6 cells with genistein 50 microM and mithramycinA 100 nM, known to inhibit the NFY and Sp1 binding to DNA respectively, reflected the same effects. Furthermore the cGMP content of the cells was significantly reduced by both inhibitors, almost completely by genistein, and by about 40 % by mithramycinA. Electrophoretic mobility-shift assay (EMSA) clearly showed the formation of multiple complexes with the biotinylated ODN (decoy oligodeoxynucleotide) probes for NFY and Sp1 when incubated with RLF-6 nuclear extract. A “supershift” observed in the presence of antibodies to the individual transcription factors confirmed that these factors were present in the shifted band, indeed. NFY and Sp1 are instrumental in several physiological and pathophysiological effects mediated by several growth factors in smooth muscle cells. Thus the regulation of the promoter, in response to serum, was also analysed. 10% foetal calf serum led to decreased alpha-1 sGC level as shown by western blots performed with rat aorta. Decreased sGC alpha-1 mRNA expression was observed in RLF-6 cells and cultured rat aortic smooth muscle cells incubated with FCS for 24 hours. This decrease was reflected in the promoter activity in RLF-6 cells using both Alpha3000 and Alpha200 constructs confirming that the regulation took place at promoter level. EMSA performed with nuclear extracts from FCS treated RLF-6 cells led to diminished binding to NFY, but to an enhanced binding to Sp1 site. We concluded that the factors Sp1 and NFY (the sites overlapping) compete for binding, and in the presence of FCS, it is Sp1 that binds stronger, and hence results in diminishing promoter activity. In order to delineate the post-transcriptional regulation of sGC alpha-1 subunit, studies were performed to demonstrate the regulation of expression of the mRNA stabilizing protein HuR. It has been observed that exposure of isolated rat aortic segments to the activator of adenylyl cyclase, forskolin, strongly reduced sGC alpha-1/beta-1 and HuR protein and mRNA expression in a time-dependent and actinomycin D-sensitive fashion. Transcription factor decoy approach proved that the cAMP-induced down-regulation of HuR is mediated by the activation of AP-1. It has been established that HuR stabilises the sGC alpha-1 and beta-1 mRNA. However the pathway underlying this regulation remains unknown. In order to identify the mechanism of this regulation, we looked for HuR interacting proteins employing the yeast two hybrid assay. The enzyme of the polyamine catabolic pathway spermidine/spermine N1-acetyltransferase (SSAT) was found to interact with the hinge region of HuR. This interaction was confirmed by performing immunoprecipitation and GST-pulldown experiments. A direct effect of these proteins on each other’s biological activity was not visible as tested through the SSAT activity assay and HuR gel shift. It might be possible that SSAT-mediated modulation of local polyamine concentrations enhances/reduces HuR activity and sGC expression to affect cell proliferation. In summary, this study represents an analysis of the rat sGC alpha-1 promoter regulation in rat fibroblast cells and identifies NFY and Sp1 as important factors in sGC alpha-1 expression. It also gives first evidence of sGC regulation at the transcriptional level in response to an external stimulus, and proposes the possible mechanism. It also identifies SSAT as a HuR interacting protein. These might have implications in the various pathophysiological conditions where sGC plays an important role.
Mitochondrien, Organellen der oxidativen Phosphorylierung, sind in vielfältiger Weise an Alterungsprozessen in unterschiedlichen Modellorganismen beteiligt. Viele Mechanismen und Faktoren, die das Altern beeinflussen, scheinen konserviert zu sein. In dem in dieser Arbeit untersuchten Ascomyzeten Podospora anserina treten z. B. altersabhängige Reorganisationen der mtDNA auf, die zu einem Verlust lebensnotwendiger Gene führen können. In Menschen wurden ebenfalls Umstrukturierungen des mitochondrialen Genoms in unterschiedlichen Geweben mit fortschreitendem Alter beschrieben. Umgekehrt treten manche Faktoren, die die Lebensspanne beeinflussen, nur in einigen Modellsystemen auf. Hierzu gehört z. B. die Induktion der alternativen Oxidase in vielen langlebigen P. anserina-Mutanten. Diese Modifikation in der Atmungskette kann in S. cerevisiae und Säugern nicht beobachtet werden, da diesen Organismen eine alternative terminale Oxidase der oxidativen Phosphorylierung fehlt. Der Fragestellung, wie die Atmungskette im Falle der exklusiven PaAOX-abhängigen Respiration in der unsterblichen Mutante ex1 hinsichtlich der Zusammensetzung und kinetischer Eigenschaften des Elektronentransports charakterisiert ist, wurde in der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Über die funktionalen Eigenschaften der Mitochondrien hinaus ist auch die Morphologie dieser Organellen altersabhängiger Änderungen unterworfen. Hinsichtlich der Gestalt der Mitochondrien in verschiedenen Altersstadien ist nur sehr wenig bekannt. Bisher steht nur fest, dass der P. anserina-Wildstamm „S“ im mittelalten Stadium filamentöse Mitochondrien aufweist. Ob und in welchem Ausmaß es zu Veränderungen der mitochondrialen Morphologie während des Alterns im Wildstamm „s“ und der Mutante grisea kommt, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus PaDnm1 als putativer mitochondrialer Teilungsfaktor charakterisiert. Insbesondere die Modulation der PaDnm1-Expression durch Überexpression bzw. Deletion soll zeigen, welchen Einfluss PaDnm1 auf die mitochondriale Morphologie und andere phänotypische Parameter wie z. B. die Lebensspanne hat. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Im Wildstamm „s“ wurde im Gegensatz zu ex1 durch enzymkinetische Analysen eine starke Interaktion der Komplexe I und III nachgewiesen. Ein Großteil der Komplexe I und III ist im Wildstamm „s“ in Form von Superkomplexen organisiert. In der Mutante ex1 liegen die Komplexe I und III dagegen hauptsächlich frei vor. Die spezifische Aktivität der Cytochrom-c-Reduktase ist in ex1 niedriger als im Wildstamm „s“. 2. Seneszente Isolate des Wildstammes „s“ und der PaDnm1::ble-Mutante weisen im Gegensatz zur Mutante grisea eine starke Freisetzung von Wasserstoffperoxid auf. 3. Juvenile und mittelalte Wildstamm „s“-Isolate enthalten überwiegend kurze, filamentöse Mitochondrien, die entlang der Hyphenachse im Cytoplasma orientiert sind. Im seneszenten Stadium kommt es zu einer starken mitochondrialen Fragmentierung. Der Übergang von einer filamentösen zu einer sphärischen Morphologie dieser Organellen tritt auch in Mutante grisea auf. In ex1-Hyphen sind hauptsächlich filamentöse Mitochondrien enthalten. Initiale Analysen zur mitochondrialen Feinstruktur zeigen, dass in Wildstamm „s“ und Mutante grisea eine lamellenartige Cristaestruktur erkennbar ist. In der Mutante ex1 hingegen erscheinen die Cristae ungeordneter und weniger zahlreich. 4. Die Mitochondrienfragmentierung im seneszenten Wildstamm „s“ korreliert mit einer Induktion der Transkription von PaDnm1. In Mutante grisea ist die PaDnm1-Transkriptmenge während des Alterns konstant, obwohl sich die mitochondriale Morphologie wie im Wildstamm „s“ verändert. Überexpression von PaDnm1 führt zur Mitochondrienfragmentierung während die gezielte Deletion dieses Gens eine starke Elongation der Mitochondrien zur Folge hat. PaDnm1 ist somit das erste in einem filamentösen Pilz charakterisierte Gen der mitochondrialen Teilungsmaschinerie. 5. PaDnm1::ble-Isolate zeigen im seneszenten Stadium mitochondriale Fragmentierung wie Wildstamm „s“ und Mutante grisea. Das mitochondriale Genom von PaDnm1::ble ist stabilisiert, d. h. die Bildung der seneszenzfördernden plDNA wird unterdrückt. Die mittlere Lebensspanne der PaDnm1::ble-Mutante ist deutlich (> Faktor 10) gegenüber der des Wild-stammes „s“ erhöht. Bemerkenswerterweise zeigt PaDnm1::ble im Gegensatz zu anderen langlebigen P. anserina-Mutanten nach der Sporenkeimung keine physiologischen Defekte: Wuchsrate, männliche und weibliche Fertilität, Myzelmorphologie und Mitochondrien-segregation während der Ascosporengenese sind nicht eingeschränkt. Allerdings weist PaDnm1::ble eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Ammoniumazetat auf. Dies äußert sich in einer Inhibierung der Sporenkeimung und einer Verringerung der Wuchsrate bei Anzucht der Mutante auf AmAc-haltigem Medium.
Since its recognition as an endothelium-derived relaxing factor, the control and consequences of nitric oxide (NO) production have been investigated intensely. We know now that NO is not simply a vasodilator or regulator of smooth muscle tone but is a potent anti-platelet agent, neuromodulator and regulator of gene expression. NO is synthesized from the amino acid Larginine by a family of enzymes termed NO synthases (NOS). The ‘endothelial’ (eNOS or NOS III) and ‘neuronal’ (nNOS, NOS I or bNOS) NOS isoforms, which were named after the tissues in which they were first identified, are expressed constitutively and are generally regulated by Ca2+/calmodulin (CaM). Endothelium-derived NO is thought to be responsible for maintaining the vasculature in an anti-atherosclerotic state and a decrease in the bioavailability of NO (a state generally referred to as endothelial dysfunction) results in “proatherosclerotic” alterations in vascular gene expression. Recently it has become clear that the activity of eNOS is largely determined by its association with regulatory proteins as well as by the phosphorylation of the enzyme on serine, threonine and possibly tyrosine residues. Moreover, the enzyme can be “uncoupled” i.e. transformed from a NO generating to a superoxide (O2-)-generating enzyme, which would be expected to attenuate vasodilator responses and enhance vascular inflammation. The aim of this thesis was to study the consequences of phosphorylation on specific serine, threonine and tyrosine residues on the activity and intracellular localisation of eNOS and in particular to determine whether a phospho-switch for eNOS uncoupling exists. eNOS is phosphorylated under basal conditions and its serine phosphorylation can be enhanced following cell stimulation with hemodynamic stimuli such as cyclic stretch and fluid shear stress as well as by hormonal stimuli such as histamine and bradykinin. Our group has previously demonstrated the importance of Ser1177 in the activation of eNOS and here I set out to determine the relative importance of phosphorylation on Ser633 and Ser114. By generating point mutants in which serine was replaced by either alanine (nonphosphorylatable mutants) or aspartate (phosphomimetic mutants) it was observed that the activity of the S633D and S114A eNOS mutants exhibited an 2-fold increase over the activity of the wild-type enzyme or either of the S633/634A or S114D eNOS mutants as determined by monitoring the conversion of L-arginine to L-citrulline. eNOS is basally phosphorylated on Thr495 and stimulation of endothelial cells with Ca2+-elevating agonists generally results in the transient dephosphorylation of this residue. The latter is essential to allow the binding of calmodulin to the enzyme and is the actually initiating step in the generation of NO. Correspondingly, the T495A eNOS mutant can be activated at lower Ca2+ and calmodulin concentrations than the T495D mutant. However, some eNOS mutants (T494A/S1177D and T495A) showed an enhanced ability to generate O2- in a NOS inhibitor-sensitive manner suggesting that the phosphorylation of the enzyme may also play a role in the uncoupling process. To determine the physiological relevance of eNOS dephosphorylation on Thr495 we assessed the consequences of treating cells with oxidised low-density lipoprotein (ox-LDL) on eNOS phosphorylation as well as on the eNOS-dependent generation of NO and O2-. Oxidised LDL concentration- and time-dependently decreased phosphorylation of eNOS on Thr495 and led to a concomitant decrease in cellular levels of cyclic GMP and an enhanced production of O2 - compared to cells treated with native LDL. Alterations in the activity of protein kinase C (PKC) were related to the change in eNOS Thr495 phosphorylation. There was not only the basal activity of PKCα inhibited by ox-LDL but the PKC activator phorbol-12-myristate-13-acetate also failed to elicit the phosphorylation of Thr495 in ox-LDL-treated endothelial cells. The dephosphorylation of eNOS on Thr495 in response to the addition of ox-LDL was not associated with an increase in the binding of calmodulin to eNOS, an association usually necessary for the activation of eNOS. Moreover, following treatment with ox-LDL for 24 hours eNOS was no longer detected at the plasma membrane but was redistributed to the cytosol indicating that ox-LDL may disrupt the eNOS signalling complex or signalosome. To date the role played by the tyrosine phosphorylation of eNOS in the regulation of its activity or intracellular association is controversial. However, during the preparation of this thesis we have been able to demonstrate a link between the tyrosine phosphorylation of eNO and the activation of the tyrosine kinases Src and PYK2. The application of fluid shear stress to endothelial cells resulted in the activation of Src and PYK2 as well as in the association of PYK2 with eNOS. Co-expression of eNOS and PYK2 led to the putative identification of Tyr657 as a potential modulatory site. Mutating eNOS at Tyr657 to Asp or Glu resulted in the localisation of the mutant eNOS predominantly in the cytoskeleton and also in a complete inactivation of the enzyme. The Y657F mutants, on the other hand, did not demonstrate any marked alteration in the activity when compared with the wild-type eNOS. However, the In conclusion, the results describe in this thesis indicate that eNOS is regulated by phosphorylation at multiple sites. Depending on the phosphorylation site involved phosphorylation can inhibit or activate NO production or even uncouple the enzyme so that it generates O2-. While the phosphor-status of eNOS on Ser114 and Ser633 influenced NO release they did not contribute to O2 - production and the dephosphorylation of Thr495 seems sufficient to uncouple eNOS. Cell treatment with ox-LDL, which is known to increase eNOS-derived O2- output was correlated with a dephosphorylation of Thr495 as well as a decrease in the activity of the kinase that phosphorylates this site i.e., PKCα. The phosphorylation status of all the eNOS serine and threonine residues studied however did not influence the ability of the enzyme to dimerise, indicating that contrary to previously published reports the eNOS dimer is highly stable in endothelial cells. The tyrosine phosphorylation of eNOS was not initially expected to play a determinant role in the regulation but rather to facilitate the docking of associated regulatory proteins. However, Tyr657 seems to play a critical role in the generation of NO as its mutation resulted in the generation of a completely inactive enzyme as well as in an apparent intracellular mislocalisation of the protein. The physiological relevance of these findings remain to be further elucidated.
The melibiose permease (MelB) of E.coli functions as a secondary-active symporter by using the electrochemical H+, Na+, or Li+ gradient to accumulate, e.g., melibiose [review in Pourcher et al. 1990a]. The global and primary objective of this thesis was to apply pre-steady state methods for the investigation of reaction rates of individual steps in the cycle of MelB. Especially the melibiose binding induced transition was investigated by the solid-supported membrane (SSM) technique [Seifert et al. 1993] in combination with a rapid solution exchange system [Pintchovius and Fendler 1999] and with the Stopped-flow technique [Roughton 1934]. To approach this goal, either wild-type or mutated MelB were purified and reconstituted into liposomes as described [Pourcher et al. 1995]. Although the orientation of the proteins is a critical factor for the activity of MelB, it was, so far, unknown. To determine the orientation of the proteins in the liposomes, single Cys mutants R139C and R141C [Abdel-Dayem et al. 2003] were selectively labeled with 3-(N-maleimidylpropionyl)biocytin (MPB) and analyzed by SDS-PAGE and Western Blot. The assay indicated that most of the proteins are inside-out (ISO) oriented permitting to relate the pre-steady state electrical and fluorescence signals to the reverse transport activity of MelB. The melibiose induced electrical signal was investigated in wild-type MelB with the SSM technique. The transporter was activated by a substrate concentration jump, and transient currents were measured. When the transporter was preincubated with Na+ at saturating concentrations, a charge translocation in the protein upon melibiose binding could still be observed. This result demonstrates that binding of the uncharged substrate melibiose triggers a charge displacement in the protein. Further analysis showed that the charge displacement is neither related to extra Na+ binding to the transporter, nor to the displacement of already bound Na+ within MelB. Electrogenic melibiose binding is explained by a conformational change with concomitant displacement of charged amino acid side chains and/or a reorientation of helix dipoles. A kinetic model is suggested, in which Na+ and melibiose binding are distinct electrogenic processes associated with approximately the same charge displacement. Melibiose binding is fast in the presence of Na+ (k > 50 s-1). Furthermore, two previously identified transport deficient mutants of loop 4-5, R141C and E142C [Abdel-Dayem et al. 2002, Séry 2002], were purified and extensively studied with the SSM. Whereas the electrical signals from control cysteine-less mutant showed a bi-exponential time course of decay, those from R141C or E142C consisted of only a single fast exponential component, and the slow decaying component associated with substrate translocation was missing. The electrical signals evoked by a melibiose concentration jump in the presence of Na+ were much smaller than the corresponding signals in C-less MelB. Furthermore, R141C lost the stimulating effect of melibiose on Na+ binding. Steady-state Trp fluorescence spectroscopy revealed impaired conformational changes after melibiose binding in the mutants and fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements indicated that the mutants still show cooperative modification of their sugar binding sites by Na+. These data suggest that loop 4-5 contributes to the coordinated interactions between the ion- and sugar binding site and participates in conformational changes after melibiose binding that are essential for the subsequent obligatory coupled translocation of substrates. By using the Stopped-flow technique, three different approaches were followed. First, the intrinsic Trp fluorescence of MelB, known to increase upon melibiose binding [Mus-Veteau et al. 1995], revealed a signal with a T 1 of ~15 ms in C-less. This time constant is of the same order of magnitude as that determined with the SSM method suggesting that Trp fluorescence and electrical signal are related processes. Conformation for this assumption came from the fact that the activation energies Ea for both processes are similar (around 45 KJ/mol). Second, by using the fluorescent sugar analog Dns2-S-Gal, which monitors events close to the sugar binding site [Maehrel et al. 1998], a signal with a T 1 of ~18 ms was recorded upon Na+ addition. Finally, the fluorescent dye MIANS was used to selectively label the single Cys mutant E365C of loop 10-11. Stopped-flow measurements revealed a melibiose-induced fluorescent signal with a T 1 of 45 ms. Since electrical measurements with the MIANS-labeled E365C excluded the possibility that the label is responsible for the slower kinetics, the conformational change detected by the MIANS fluorescence was assigned to a slow transition in the cycle of MelB after melibiose binding. Ea was determined to be 96 KJ/mol corroborating, thus, the hypothesis of a different process. In conclusion, it was possible to correlate the electrical and fluorescence signals to partial reactions of the transport cycle and to determine their rate constants. According to this new model, the melibiose-induced signal detected with the Trp and electrical measurements corresponds to a step preceding the carriers’ reorientation (3 <-> 3*, k ~ 65s-1), and the melibiose-induced signal detected with the MIANS fluorescence to the reorientation itself (3* <-> 4, k ~ 20s-1).
Humanpharmaka stellen eine permanente Belastung von Gewässern dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gemäß dem von der Europäischen Arzneimittelagentur EMEA entwickelten Konzept zur Durchführung von Umweltrisikobewertungen von Humanpharmaka mit mehreren ausgewählten Substanzen Umweltrisikobewertungen durchgeführt. Die hierfür ausgewählten Pharmaka sind das Antiepileptikum Carbamazepin (CBZ), das Antibiotikum Sulfamethoxazol (SMX) und das synthetische Östrogen 17a-Ethinylöstradiol (EE2). Als Vertreter der Inhaltsstoffe von Körperpflegeprodukten wurde der polyzyklische Moschusduftstoff Tonalid (AHTN) in die Untersuchungen mit einbezogen. Mit Hilfe von Literaturrecherchen wurde die Datengrundlage für Expositions- und Wirkungsabschätzungen bereitgestellt. Der vorhandene recherchierte Datensatz wurde mit entsprechenden Kurz- und Langzeitstudien ergänzt. Die mit den Ergebnissen der Expositions- und Wirkungsabschätzungen vorgenommenen Umweltrisikobewertungen ergaben im ersten Schritt basierend auf Kurzzeitstudien unter den ausgewählten Substanzen lediglich für den Moschusduftstoff AHTN ein erhöhtes Umweltrisiko für Oberflächengewässer. Basierend auf weiterführenden Langzeitstudien konnte das zunächst erkannte, durch AHTN indizierte Umweltrisiko entkräftet werden, jedoch ergaben die Risikocharakterisierungen für EE2 und SMX ein erhöhtes Risiko für das aquatische Kompartiment. Auf Grund der erhöhten Adsorptionspotenziale von CBZ, EE2 und AHTN wurden für diese Substanzen kompartimentspezifische Umweltrisikocharakterisierungen durchgeführt. Dabei wurde ein erhöhtes Umweltrisiko durch CBZ für das Kompartiment Sediment angezeigt. Basierend auf den Ergebnissen einer Sediment-Bioakkumulationsstudie mit dem endobenthischen Oligochaeten Lumbriculus variegatus, welche in einen unerwartet hohen Akkumulationsfaktor resultierte, und aus der Literatur verfügbaren Fisch-Biokonzentrationsfaktoren wurde anhand der Nahrungskette Wasser-Sediment-Wurm-Fisch die Möglichkeit des ‚secondary poisonings’ durch EE2 bei wurmfressenden Fischen unter natürlichen Bedingungen aufgezeigt. Zur Verwendung dieses Ergebnisses in einer Umweltrisikobewertung zum Zwecke der Zulassung von Pharmaka sollten weitergehende Untersuchungen zur Bestätigung durchgeführt werden. Bezugnehmend auf die Resultate der eigenen Studien und auf die besonderen Eigenschaften von Humanpharmaka wurde der EMEA-Richtlinienentwurf diskutiert und Verbesserungsvorschläge erarbeitet. Bis auf wenige Anpassungen geht das EMEA-Bewertungsschema nicht auf die Besonderheiten und spezifischen Eigenschaften von Humanpharmaka ein. Hauptkritikpunkte bezogen sich auf (1) die Anwendung eines konzentrationsabhängigen Schwellenwertes als Entscheidungsgrundlage zur Durchführung einer Risikocharakterisierung, (2) das stufenweise Vorgehen bei der Wirkungsabschätzung mit zuerst ausschließlich auf Kurzzeitstudien basierenden Effektdaten, und (3) unzureichende Angaben zu Vorgehensweisen in der höheren Stufe des Bewertungsschemas, vor allem bei Substanzen mit außergewöhnlichem ökotoxikologischen Potenzial. Trotz der zur Zeit intensiven internationalen Diskussion über mögliche Auswirkungen durch endokrine Disruptoren auf Mensch und Umwelt sieht der EMEA-Richtlinienentwurf nicht ausdrücklich vor, die Umweltgefährdung durch potenziell endokrin wirksame Substanzen mit spezifischen Testmethoden festzustellen und zu bewerten. Die Erkenntnis, dass spezifische Wirkmechanismen bei Chemikalien, speziell bei Arzneimitteln und Bioziden, auch in sehr niedrigen Konzentrationen zu Wirkungen in der Umwelt führen können, bleibt im EMEA-Richtlinienentwurf auf Grund der Einführung eines expositionsbezogenen Schwellenwertes und der Wirkungsabschätzung mittels Akutstudien nur unzureichend berücksichtigt. Zur Schließung dieser Lücke, die durch Untersuchungen zu endokrinen Wirkungen in der Umwelt offensichtlich wurde, müssen neue und bessere ökotoxikologische Instrumente entwickelt werden und das Umweltrisikobewertungsschema entsprechend erweitert und angepasst werden.