Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Weiterentwicklung und Evaluation eines drei-dimensionalen Hautmodelles zur pharmakologischen Testung
(2008)
Stressorinduzierte ökotoxikologische Effekte und Genexpressionsveränderungen bei Chironomus riparius
(2008)
Die Effekte von Stressoren auf Chironomus riparius wurden im Lebenszyklustest und auf genomischer Ebene mit dem Ziel untersucht, ein auf einem DNA-Mikroarray („ChiroChip“) basierendes Screeningverfahren zu entwickeln. Die empfindlichsten Endpunkte der Lebenszyklustests waren die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie das Gewicht der Männchen. Temperaturveränderungen um ± 6°C gegenüber einer normalen Hälterungstemperatur von 20°C führten in allen Endpunkten zu hochsignifikanten Effekten. Eine LC10 konnte nur für die Salinität berechnet werden (0,66‰, KI: 0,26 − 1,68‰). Aufgrund der nicht-linearen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen konnte nur für den mittleren Schlupfzeitpunkt der Weibchen nach einer Exposition gegenüber Cadmium eine EC50 (0,53 mg/kg, KI: 0,29 − 0,97 mg/kg) bestimmt werden. In den Versuchen mit Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Carbamazepin, Fluoxetin, Blei und Tributylzinn (mit denen auch molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt wurden) waren die empfindlichsten Endpunkte die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie die Populationswachstumsrate. Carbamazepin (CBZ) wirkte schlupfverzögernd bei den Weibchen. 10 mg CBZ/kg führte zu einer höheren Mortalität, weniger Eigelegen, die vermehrt unfruchtbar waren, sowie zu einer geringeren Populationswachstumsrate. Fluoxetin (FX) wirkte bei beiden Geschlechtern schlupfverzögernd. 0,9 mg FX/kg führte zu einer erhöhten Mortalität, weniger und vermehrt unfruchtbaren Eigelegen und einer geringeren Populationswachstumsrate. In der höchsten Konzentration (5,9 mg/kg) waren die Weibchen leichter als die Kontrolltiere. Tributylzinn (in µg Sn/kg angegeben) bewirkte eine höhere Mortalität und geringere Populationswachstumsrate bei 100 µg Sn/kg und führte zu einer Verzögerung im Schlupfverlauf bei den Weibchen. Bei 160 µg Sn/kg gab es weniger Eigelege, die vermehrt unfruchtbar waren. Die Männchen, die gegenüber Konzentrationen von 120 und 160 µg Sn/kg exponiert wurden, waren leichter als die Kontrolle. Expositionen gegenüber Blei (Pb) in Konzentrationen von 0,65 − 65 mg/kg führten bei 6,5 mg Pb/kg zu einer erhöhten Mortalität und zu mehr unfruchtbaren Gelegen. Bei 0,65 mg Pb/kg waren die Männchen leichter und bei 6,5 mg Pb/kg schwerer. Die Anzahl der fruchtbaren Gelege pro Weibchen war bei 3,25 und 6,5 mg Pb/kg geringer als in der Kontrolle. Die gegenüber 17alpha-Methyltestosteron (MET) exponierten Mücken hatten geringere Mortalitäten als in der Kontrolle und zeigten einen verfrühten Schlupf beider Geschlechter. Ab 27 µg MET/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege, leichtere Männchen sowie erhöhte Populationswachstumsraten. 17alpha-Ethinylöstradiol (EE2) führte zu einem verfrühten Schlupf bei beiden Geschlechtern sowie zu erhöhten Populationswachstumsraten. Bei 9 µg EE2/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege. Die Exposition von Chironomus-Larven gegenüber Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Fluoxetin, Carbamazepin, Tributylzinn und Blei führte zur differenziellen Expression von neun (Methyltestosteron) bis 49 (Carbamazepin) Genen. Bei der Untersuchung der exprimierten Proteine fällt auf, dass kaum bekannte Stressproteine (z.B. Glutathion-S-Transferase oder Cytochrom P450) differentiell reguliert wurden. Bei der Exposition wurden verschiedene Prozesse durch eine veränderte Genexpression beeinflusst. Eine Exposition gegenüber Methyltestosteron führte zu einer Beeinträchtigung von drei identifizierten biologischen Prozessen, während bei den anderen Substanzen sieben bis acht Prozesse beeinflusst waren. Die am häufigsten beeinflussten Prozesse waren der Protein- und der Energiemetabolismus. Der Sauerstofftransport ist ein Prozess, der bei allen Substanzen beeinflusst wurde, jedoch mit unterschiedlichen Anteilen. Bei einer Exposition gegenüber Methyltestosteron war der Anteil des Sauerstofftransports an den beteiligten Prozessen mit 84,6% am größten und mit 10,5% bei Fluoxetin am geringsten. Die veränderte Genexpression der Globine kann möglicherweise aufgrund der schadstoffspezifischen Veränderungen als Biomarker für das Monitoring von Freilandgewässern angewendet werden. Da Tubulin und Aktin häufig nach einer Exposition gegenüber Stressoren differenziell exprimiert wird (bei Tributylzinn und CBZ in der vorliegenden Arbeit und bei Antidepressiva und Östrogenen in anderen Studien) wären die beiden Proteine möglicherweise ebenfalls als Biomarker für Chemikalienstress geeignet. Vor der Verwendung des ChiroChips als Screeninginstrument für die Chemikalienuntersuchung und das Biomonitoring müssen noch Untersuchungen zur konzentrationsabhängigen Genexpression und zur Expression in unbehandelten Larven und weiteren Lebensstadien erfolgen. Des Weiteren müssen die vorliegenden Daten verifiziert und die Funktion der differentiell regulierten Gene vertieft untersucht werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Eignung von Pseudorezeptoren im virtuellen Screening untersucht. Hierzu wurde nach intensiver Auseinandersetzung mit bisher bekannten Konzepten ein neues Computerprogramm zur automatischen Konstruktion von Pseudorezeptormodellen entwickelt. Das Ziel von Pseudorezeptoren ist die Konstruktion eines alternativen, artifiziellen Wirtssystems aus bekannten Liganden eines Zielproteins, dessen dreidimensionale Struktur unbekannt ist. Der generierte Pseudorezeptor ist zu verstehen als die Menge aller Pseudoatome, die um die Ausgangssubstanz(en) projiziert werden. Bei multiplen Referenzliganden wird eine Gewichtung der Pseudoatome durchgeführt. Zudem wird ausschließlich von Distanz- und Winkelparametern Gebrauch gemacht, die aus Untersuchungen von Kokristall-strukturen gewonnenen wurden. Eine abschließende Kodierung generierter Pseudorezeptoren als 90-dimensionalen Korrelationsvektor wurde zum virtuellen Screening eingesetzt. In zwei retrospektiven Fallbeispielen wird gezeigt, dass die generierten Pseudorezeptoren für COX-2 und PPARα mit den realen Zuständen ihrer kokristallisierten Bindetaschen in den PDB Einträge 6cox und 2p54 kompatibel sind. Im retrospektiven virtuellen Screening in der Wirkstoffdatenbank COBRA (8.311 Moleküle) nach COX-2 Inhibitoren (136 Aktive) konnte eine Anreicherung der aktiven Strukturen in den ersten zwei Perzentilen gezeigt werden (54% der Aktiven). Zudem konnten 80% der aktiven Moleküle bereits nach Vorhersage von 10% Falsch-Positiven gefunden werden. Im Falle des retrospektiven Screenings nach 94 PPAR Liganden konnten 30% der aktiven Moleküle nach der Vorhersage von 10% Falsch-Positiven entdeckt. Nach 20% Falsch-Positiver wurden 46% der PPAR Liganden wieder gefunden. Weiterhin konnte mit den ligandenbasierten Informationen eines H4 Pseudorezeptors eine Justierung einer potentiellen Bindetasche des Histamin H4 Rezeptors aus einer molekularen Dynamiksimulation vorgenommen werden. Schließlich wurde in einem prospektiven virtuellen Screening nach Histamin H4 Liganden mit einem Pseudorezeptor zwei Strukturen mit unterschiedlichem Grundgerüst und einem Ki ~ 30 µM identifiziert.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Taspase1 stellt die bisher einzige Typ2-Asparaginase mit proteolytischer Aktivität dar. Das wichtigste Substrat der Taspase1 ist das MLL-Protein, einem Homolog des Trithorax- Proteins aus Drosophila melanogaster, das auch dort eine wichtige Rolle bei Differenzierungsprozessen spielt. Bei Patienten mit einer t(4;11)-Translokation ist Taspase1 maßgeblich an der Ausbildung einer t(4;11)-assoziierten Leukämie beteiligt. Die Inhibierung der proteolytischen Aktivität der Taspase1 könnte daher einen Ansatzpunkt für eine neuartige Krebstherapie darstellen. Aufgrund der ungewöhnlichen Eigenschaften von Taspase1 ist es bisher nicht gelungen einen selektiven Inhibitor für das katalytische Zentrum der Taspase1 zu identifizieren. Unter nativen Bedingungen (ca. 50 mM NaCl) befindet sich Taspase1 bereits in einem nahezu vollständig inhibierten Zustand, da im katalytischen Zentrum der Taspase1 ein Chloridion komplexiert ist. Dieses Chloridion wird einzig und allein nach Interaktion mit dem natürlichen Substrat MLL aus dem katalytischen Zentrum verdrängt, was zu einer kurzfristigen Aktivierung der Taspase1 führt. Nach Ablauf der hydrolytischen Spaltung des Substrates nimmt das Chloridion wieder seine Position im katalytischen Zentrum ein. Unter diesen Bedingungen ist aus sterischen Gründen die Bindung eines potentiellen Inhibitors im katalytischen Zentrum nicht möglich. Durch Herstellung von Mutanten der Taspase1 und deren Substrats konnte der Mechanismus der katalytischen Spaltung durch Taspase1 aufgeklärt werden. Dabei erwiesen sich drei Aminoäuren als essentiell für die Hydrolyse. Interessanterweise ist die Anwesenheit des Substrates, insbesondere des Aspartates an Position Sieben der cleavage sites CS1 bzw. CS2 notwendig um den katalytischen Prozess zu starten. Das negativ geladene Aspartat, verdrängt zunächst das Chloridion von seiner Position und aktiviert dadurch das katalytische Zentrum (Rotation von Threonin 234). Erst dadurch wird Threonin 234 zu einer katalytisch aktiven Aminosäure und kann einen nukleophilen Angriff auf die Peptidbindung zwischen Aspartat und Glycin des Substrates durchführen. Die Hydrolyse wird dabei durch die OH-Gruppe des Serins 252 durch Wechselwirkung mit dem Carboxylsauerstoff unterstützt. Durch Mutation beider Aspartate an Position sieben im artifiziellen Substrat 2CL zu Glycin oder Lysin führte zu einem vollständigen Verlust der hydrolytischen Spaltung an CS1 und zu einem starken Rückgang der hydrolytischen Spaltung an CS2. Die Mutationen T234D und S252D der Taspase1 führten beide zum vollständigen Verlust der katalytischen Spaltung, sowohl in cis, als auch in trans. Unter Verwendung des Taspase1-Aktivitätsassays konnte der transkriptionelle Regulator MLL4 als potentielles Substrat der Taspase1 identifiziert werden.
Die Komplementarität der molekularen Oberflächen und der Pharmakophorpunkte ist ein verbreiteter Konzept im rechnergestützen Moleküldesign. Diesem Konzept folgend wurde die Software SQUIRREL neu entwickelt und in der Programmiersprache Java implemetiert. Die Software generiert die Vorschläge für den bioisosteren Ersatz von Molekülen und Molekülfragmenten. SQUIRREL kombiniert Oberflächen- und Pharmakophoreigenschaften bioaktiver Substanzen und kann im virtuellen Screening und fragment-basierten de novo Design eingesetzt werden. In einer prospektiven Studie wurde SQUIRREL verwendet, um neue selektive PPARalpha-Agonisten aus einer kommerziellen Moleküldatenbank zu identifizieren. Die Software lieferte eine potente Substanz (EC50 = 44 nM) mit über 100facher Selektivität gegenüber PPARgamma. In einer zweiten Studie wurde eine Leitstruktur de novo generiert und synthetisiert. Als Ausgangstruktur diente der bekannte PPARalpha-Agonist GW590735. Während des Designvorgangs wurden zwei Teilstrukturen, die für die Aktivität von GW590735 verantwortlich sind, durch bioisostere Gruppen ersetzt, die von SQUIRRELnovo vorgeschlagen wurden. Die neue Leitstruktur aktiviert PPARalpha in einem zellbasierten Reportergen-Testsystem bei einem EC50 von 0.51 µM.
Das Ziel dieser Arbeit war es, RNA-Strukturen als potentielle Zielstrukturen für die Medikamentenentwicklung zu untersuchen. Hierbei ging es im Speziellen um die Anwendung Virtueller Screening Verfahren für die RNA-Liganden-Vorhersage. Hierzu wurde die als TAR-Motiv (transactivating response element) bekannte RNA-Struktur der mRNAs des HI-Virus ausgewählt. Diese Struktur wurde gewählt, da mit den vier PDB-Einträgen 1ANR, 1ARJ, 1LVJ und 1QD3 bereits experimentell motivierte Strukturmodelle zum Beginn der Untersuchung vorlagen. Ausschlaggebend war hierbei auch das Vorhandensein eines Tat-TAR-FRET-Assays im Rahmen des SFB 579, in welchem diese Arbeit angefertigt wurde. Die Aufmerksamkeit, welche dem HI-Virus im Rahmen der Bekämpfung der Immunschwächekrankheit bereits zukam, führte bei dem gewählten Testmodell ebenfalls zu einem, wenn auch immer noch überschaubaren Datensatz bereits getesteter Substanzen, der als Grundlage für einen Liganden-basierten Ansatz als erste Basis dienen konnte. Basierend auf diesen Voruntersuchungen ergaben sich die weiteren Schritte dieser Arbeit. Die Arbeit lässt sich zusammenfassend in vier zum Teil parallel verlaufende Phasen einteilen: Phase 1:Bestandsaufnahme bekannter Informationen über die Zielstruktur · experimentell bestimmte Zielstrukturen · experimentell bestimmte Liganden/Nichtliganden der Zielstruktur Phase 2: Ableiten eines ligandenbasierten Ansatzes zur Vorhersage von potentiellen Bindern der Zielstruktur aus Substanzbibliotheken, der nicht auf Strukturdaten der Zielstruktur beruht. Phase 3: Analyse der bekannten Konformere der Zielstruktur auf konstante Angriffspunkte für ein spezielles Liganden-Design. Phase 4: Einbinden der bekannten Strukturinformationen der Zielstruktur zur weiteren Verfeinerung der Auswahlverfahren neuer Kandidaten für die weitere experimentelle Bestimmung des Bindeverhaltens. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels der Anwendung von künstlichen neuronalen Netzen in einem ligandenbasierten Ansatz durch virtuelles Screening der Chemikalien-Datenbanken verschiedener Lieferanten fünf neue potentielle TAR-RNA-Liganden identifiziert werden (drei davon mit einem Methylenaminoguanidyl-Substrukturmotiv), sowie als „Spin-Off“ durch die Anwendung der ursprünglich nur für den Tat-TAR-FRET-Assay vorgesehenen Testsubstanzen in einem Kooperationsprojekt (mittels CFivTT-Assay) zwei neue potentiell antibakterielle Verbindungen identifiziert werden. Die Beschäftigung mit der offensichtlichen Flexibilität der TAR-RNA und damit einer nicht eindeutig zu definierenden Referenz-Zielstruktur für das Liganden-Docking führte zur Erstellung eines Software-Pakets, mit dem flexible Zielstrukturen – basierend auf den Konformer-Datensätzen von MD-Simulationen – auf konstante Angriffspunkte untersucht werden können. Hierbei wurde ausgehend von der Integration eines Taschenvorhersage-Programms (PocketPicker) eine Reihe von Filtern implementiert, die auf den hierzu in einer MySQL-Datenbank abgelegten Strukturinformationen eine Einschränkung des möglichen Taschenraums für das zukünftige Liganden-Design automatisiert vornehmen können. Des Weiteren ermöglicht dieser Ansatz einen einfachen Zugriff auf die einzelnen Konformere und die Möglichkeit Annotationen zu den Konformeren und den daraus abgeleiteten Tascheninformationen hinzuzufügen, so dass diese Informationen für die Erstellung von Liganden-Docking-Versuchen verwendet werden können. Ferner wurden im Rahmen dieser Arbeit ein neuer Deskriptor für die Beschreibung von Taschenoberflächen eingeführt: der auf der „Skalierungs-Index-Methode“ basierende molekulare SIMPrint. Die Beschäftigung mit der Verteilung der potentiellen Bindetaschen auf der Oberfläche der Konformerensemble führte ferner zur Definition der Taschenoberflächenbildungswahrscheinlichkeit (Pocket Surface Generation Probability – PSGP) für einzelne Atome einer Zielstruktur, die tendenziell für die Einschätzung der Ausbildung einer potentiell langlebigen Interaktion eines Liganden mit der Zielstruktur herangezogen werden kann, um beispielsweise Docking-Posen zu bewerten.
Resistenz polyklonaler, reifer T-Zellen gegenüber der Transformation durch retrovirale Transduktion
(2008)
Nach den ersten Erfolgen der Gentherapie bei angeborenen Immundefekten wurden einige Fälle von Leukämie nach gammaretroviralem Gentransfer in Blutstammzellen bei Patienten mit „severe combined immunodeficiency“ (SCID-X1) veröffentlicht. Diese entfachten eine Diskussion über das Risiko der Insertionsmutagenese bei der Verwendung gammaretroviraler Vektoren. Durch eine insertionsbedingte Transaktivierung potentieller Onkogene und damit verbundenen malignen Veränderungen können gammaretroviral transduzierte Blutstammzellen Leukämien hervorrufen. Aber nicht nur Blutstammzellen werden als Zielzellen in der Gentherapie genutzt. In der Gruppe von Laer wurde in den letzten Jahren eine neue Gentherapie der HIV-1 Infektion entwickelt. Hierbei werden dem Patienten genetisch geschützte, autologe T-Lymphozyten infundiert. Die Gefahr einer Leukämie durch Insertionsmutagenese sollte im Zuge dieser Studie für reife T-Lymphozyten evaluiert werden. In einer vergleichenden Analyse wurde untersucht, ob der gammaretrovirale Gentransfer in reife T-Lymphozyten die gleiche Genotoxizität birgt wie in hämatopoetische Stammzellen. Hierzu wurden reife T-Lymphozyten und hämatopoetische Progenitoren von C57BL/6(Ly5.1)-Mäusen mit multiplen Kopien gammaretroviraler Vektoren transduziert, die für die potenten T-Zell Onkogene LMO2, TCL1, dTrkA oder das Kontrollgen GFP kodierten. Es wurden sehr hohe Transduktionseffizienzen mit bis zu 70% für reife T-Lymphozyten und bis zu 98% für hämatopoetische Progenitoren erzielt, um möglichst leukämiefördernde Bedingungen zu schaffen. Nach Transplantation in kongene Rag-1 defiziente Empfängertiere (Ly5.2) entwickelten Onkogen-modifizierte Stammzellen nach einer charakteristischen Latenzperiode Leukämien/Lymphome. Am häufigsten wurden unreife, CD8+CD4+ doppelpositive T-Vorläufer Leukämien/Lymphome beobachtet. In einigen Rezipienten führte außerdem eine Überexpression von TCL1 in hämatopoetischen Stammzellen zu der Entwicklung von reifzelligen T-Zell Leukämien/Lymphomen und B-Zell Leukämien/Lymphomen. Die Integrationsanalyse ergab oligo- bis monoklonale Tumore, wobei keine offensichtlich tumorfördernden, die gammaretroviralen Insertionen flankierenden Gene identifiziert werden konnten. Bemerkenswerterweise entwickelte keines der T-Zell transplantierten Empfängertiere ein/e Lymphom/Leukämie, obwohl auch diese Zellen mit den gleichen Vektoren modifiziert wurden und über einen sehr langen Zeitraum persistierten. Um die Kontrollmechanismen dieser Resistenz näher zu untersuchen, wurde eine für den TCR monoklonale, adulte T-Zell Population mit dTrkA transduziert. Nach einer kurzen Latenzperiode entwickelten sich reifzellige T-Zell Leukämien/Lymphome. Anscheinend existiert eine Verbindung zwischen der relativen Transformationsresistenz reifer T-Lymphozyten und dem Konkurrenzverhalten verschiedener T-Zell Klone um stimulatorische MHC-TCR Nischen. Weiterhin wurde in vitro durch gammaretroviralen Transfer von LMO2 ein immortalisierter T-Zell Klon generiert. Dieser zeigte zwar nach einer langen Beobachtungszeit einen CD8-CD4-doppelnegativen Phänotyp, aber auch einen rekombinierten TCR. In vitro überwuchs er eine unmanipulierte Kompetitorpopulation, konnte jedoch nach Transplantation kein/e T-Zell Lymphom/Leukämie induzieren. Die LM-PCR Analyse des Klons lieferte eine sehr interessante Integration zwischen den Genen für die alpha-Ketten des IL-2 und des IL-15 Rezeptors, welche dadurch konstitutiv exprimiert wurden. Dies könnte das erste Beispiel für eine insertionsbedingte Immortalisierung eines adulten T-Zell Klons sein. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal eindeutig gezeigt werden, dass polyklonale, reife T-Zell Populationen in vivo eine hohe Transformationsresistenz aufweisen. Durch bestimmte Bedingungen können jedoch durchaus maligne Veränderung adulter, reifer T-Lymphozyten induziert werden. Für die Sicherheitsabschätzung gammaretroviraler Gentherapie-Studien mit reifen T-Lymphozyten sind die vorgestellten Ergebnisse von großer Bedeutung und könnten darüber hinaus Aufschluss über die populationsdynamischen Kontrollmechanismen reifer T-Zell Leukämien/Lymphome geben.
Viele physiologische Prozesse, wie zum Beispiel der Schlaf-Wach-Rhythmus, die Nahrungsaufnahme, die Aktivität, sowie unbewusstes Verhalten unterliegen circadianen Rhythmen. Diese Rhythmen werden durch die circadiane Uhr erzeugt, deren Sitz der SCN im Hypothalamus ist. Der SCN übermittelt das circadiane Signal in viele verschiedene Gehirnregionen (Reuss 1996). Die circadianen Rhythmen werden einerseits durch Umweltreize, wie Licht oder Nahrungsverfügbarkeit, eingestellt. Diese externen Signale beeinflussen direkt den SCN oder andere hypothalamische Nuclei, wie den lateralen Hypothalamus oder den N. arcuatus. Andererseits werden die circadianen Rhythmen jedoch auch an die physiologischen Parameter des Individuums angepasst. Diese externen und internen Signale werden durch den Signalaustausch zwischen den hypothalamischen Nuclei integriert. Zur Untersuchung dieser gegenseitigen Verbindungen wurden immunzytochemische Studien an Gehirnschnitten von Maus und Ratte durchgeführt, um das Vorkommen verschiedener Neuropeptide in Zellkörpern und Fortsätzen der Neurone in den entsprechenden hypothalamischen Gebieten aufzuzeigen. Untersucht wurden Vasopressin und VIP, die im SCN selbst synthetisiert werden, sowie Orexin A und MCH, die in den Zielgebieten des SCN vorkommen. Die Verteilungen der Neuropeptide bei Ratten und Mäusen stimmten weitgehend überein. Lediglich die Vasopressin-Expression im SCN weist Abweichungen im Vergleich der beiden Spezies auf. Weiterhin gibt es unterschiedliche Verbindungen zwischen den hypothalamischen Kerngebieten: Im SCN der Ratte, jedoch nicht im SCN der Maus, innervieren Orexin A-enthaltende Fasern VIP-exprimierende Zellen, sowie MCH-positive Fortsätze Vasopressin-enthaltende Neurone. Demzufolge variiert die Signalübertragung im Hypothalamus der Maus und der Ratte. GABA und Glyzin sind wichtige hemmende Neurotransmitter im ZNS. Daher wurden die transgenen Mauslinien GAD67-GFP knock-in und GlyT2-EGFP als Marker für GAD67-positive beziehungsweise Glyzin-positive Zellen verwendet. Gehirnschnitte dieser Mauslinien wurden immunzytochemisch gegen die oben genannten Neuropeptide gefärbt, um die Neuronenpopulationen in den hypothalamischen Kerngebieten zusätzlich zu charakterisieren. Viele Vasopressin- oder VIP-exprimierende Zellen im SCN sind GAD67-positiv. Im lateralen Hypothalamus sind einige MCH-positive Zellen GAD67-positiv. Orexin A enthaltende Zellen sind nicht positiv für GAD67. Orexin A-positive und GAD67-positiv Zellen sind miteinander durch direkte Kontakte verbunden. Der hemmende Neurotransmitter Glyzin wird von wenigen Zellen im lateralen Hypothalamus gebildet. Glyzin ist dort weder mit Orexin A, MCH oder Vasopressin kolokalisiert. Der gesamte Hypothalamus ist von einem dichten Netz stark verzweigter, Glyzin-enthaltender Fasern überzogen, deren Ursprung im Rahmen dieser Arbeit nicht eindeutig geklärt werden konnte. Die glyzinergen Fasern innervieren im lateralen Hypothalamus Orexin A-, Vasopressin- und MCH-exprimierende Neurone. Glyzinerge Fasern projizieren im lateralen Hypothalamus auf VIP-positive Fortsätze und im SCN auf Vasopressinenthaltende Fortsätze. Der hemmende Neurotransmitter Glyzin spielt vermutlich eine bedeutende Rolle bei der Signalübertragung zwischen Hypothalamus und anderen Gehirnbereichen. Damit wirkt Glyzin vermutlich auf diverse physiologische Abläufe ein, die durch hypothalamische Kerngebiete gesteuert und reguliert werden. Neben der Untersuchung der hypothalamischen Nuclei in Gehirnschnitten wurden die Zellen dieser Kerngebiete in histiotypischen primären Zellkulturen charakterisiert. Die Neuropeptid-Expressionen sowie synaptische Verbindungen wurden an den kultivierten Zellen untersucht. Der Vergleich der Neuropeptid-Expression bei Gehirnschnitten und bei Zellkulturen bestätigte, dass histiotypische Zellkulturen ein geeignetes Modell für Studien von Einzelzell- und Netzwerkeigenschaften sind. Die Ausbildung von zahlreichen Synapsen innerhalb nur weniger Tage bestätigt, dass die Signalübertragung in den Zellkulturen wie vermutlich auch im Hypothalamus überwiegend synaptischer Natur ist.
Eine Reihe kurzer synthetischer Peptide, die auf verschiedenen Ebenen während des mehrstufigen Infektions-Prozesses HIV-1 hemmen konnten, wurden in unserer Gruppe über Phage-Display identifiziert. Diese Peptide hatten allerdings nur geringe Affinitäten zu gp120 und eine kurze Halbwertszeit. In der vorliegenden Arbeit wurden diese und andere HIV-1 „Entry“ hemmende Peptide über gentechnische Methoden in eukaryotischen Zellen exprimiert, um ihre Stabilität und antivirale Aktivität zu verbessern. Durch die angeknüpfte Multimerisierungsdomäne C4bp sind die therapeutischen Peptide groß genug, um von Zellen sekretiert zu werden. Die eukaryotisch sekretierten Multimere sind posttranslational modifiziert, besitzen eine höhere Stabilität und die Anzahl der funktionellen Valenzen ist erhöht. Außerdem bietet das System die Möglichkeit, auch Heteromultimere mit verschiedenen Teilstrukturen in einem Molekül zu kombinieren. Wir konnten zeigen, dass sich das C4bp-System zur Expression des Fusions-Inhibitorischen C46-Peptids in löslicher multimerer Form eignete, welches in monomerer Form nicht vollständig durch ER und den Golgi-Apparat geleitet und sekretiert werden konnte. Außerdem hatte multimeres C46 eine deutlich höhere Plasma-Halbwertszeit und wies eine höhere antivirale Aktivität gegenüber dem monomeren Peptid auf (Dervillez et al. 2006). In dieser Arbeit standen die hoch konservierten CD4i-Epitope von gp120, welche an die HIV Corezeptoren binden, als Target für die HIV-Inhibition im Mittelpunkt. Verschiedene Peptidliganden für diese Epitope, wie die zweite extrazelluläre Schleife und der N-Terminus des CCR5-Rezeptors, die sulfatierte CDR3-Domäne des E51-Antikörpers, sowie durch Phage Display gezielt selektionierte Peptide wurden in den C4bp-Expressionsvektor kloniert und nach Transfektion in 293T-Zellen als lösliche Multimere vom Überstand aufgereinigt und funktionell analysiert. Die Multimere waren sowohl in Protein-Protein-Interaktionsstudien als auch bei in vitro HIV-1 Neutralisationsversuchen funktionell aktiv. In den meisten Hemmversuchen war die HIV-1 Inhibition multimerer Peptide mindestens vergleichbar mit dem Fusionsinhibitor T20. Insbesondere im Hinblick auf eine in vivo Applikation ist zudem die verlängerte Halbwertszeit der Multimere im Plasma von Vorteil, da dadurch möglicherweise die Anzahl der Injektionen verringert werden könnte.