Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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This cumulative thesis discusses the development of optimized force field parameters for Magnesium and resulting improved simulations of Magnesium-RNA interactions, including the in silico exploration of binding sites. This thesis is based on four publications as well as unpublished data. A fifth publication that was written during the time of the Ph.D. is discussed in the Appendix. This publication analyzes monovalent ion-specific effects at mica surfaces.
Nucleic acids in general and RNA in particular are fundamental to life itself. Especially in the folding and function of RNA, metal cations are crucial to screen the negatively charged nucleic acid backbones to allow for complex functional structures. They stabilize the tertiary structure of RNA and even drive its folding. Furthermore, similarly to proteins, RNAs can catalyze multiple reactions, rather than consisting of the 20 amino acids of a protein, RNA constitues of only four different building blocks. Metal cations play an important role here as additional cofactors. One essential ion is Magnesium (Mg2+), commonly referred to as the most important cofactor for nucleic acids. Mg2+ carries two positive charges. Its comparably small size and high charge result in a high charge density that has strong polarizing effects on its surroundings. Furthermore, Mg2+ forms a sharply defined first hydration shell with an integer number of coordinating water molecules. As a result, an exclusion zone exists around the ion within which no water molecules are observed. Moreover, Mg2+ displays a high solvation free energy and a low exchange rate of waters from its first hydration shell. Finally, it contains a strong preference towards oxygens . Together, this makes Mg2+ a particularly well suited interaction partner for the charged non-bridging phosphate oxygens on nucleic acid backbones and explains its crucial biological role.
The immense number of physiological and technological functions and applications indicates the significant scientific attention Mg2+ received. In experimental studies, however, severe difficulties arise for multiple reasons: Mg2+ is spectroscopically silent and cannot be detected directly by resonance techniques like NMR or EPR. Indirect observation is possible, either by detecting changes in the overall RNA structure with and without bound Mg2+, or by replacing the Mg2+ ion with another spectroscopically visible ion. In the latter, however, it cannot be guaranteed that the altered ion does not also alter the interaction site or even the whole structure. Another detection method is X-ray crystallography, but here challenges arise from Mg2+ being almost indistinguish- able from other ions as well as from water if not for very high resolutions and precise stereochemical considerations.
Alternatively, molecular dynamics (MD) simulations can be performed, with the power of adding atomistic insight to the interplay of metal cations and nucleic acids. MD simulations, however, are only as accurate as their underlying interaction models and the development of accurate models for the description of Mg2+ faces challenges especially in describing three properties:
(i) Polarizability. Commonly used simple models like the 12-6 type Lennard-Jones model typically fail to reproduce simultaneously thermodynamic and structural properties of a single ion in water. Alternative strategies include the use of a 12-6-4 type Lennard-Jones potential as proposed by Li and Merz, where the additional r−4 term explicitly accounts for polarization effects. The resulting Lennard-Jones potential is thereby more attractive and more long-ranged than for typical models of the 12-6 type.
(ii) Kinetics. Most Mg2+ models either fully ignore considerations about the timescales on which water exchanges from the first hydration shell of the ion or use inappropriate methodology to calculate the underlying kinetics. A realistic characterization of the involved timescales is imperative to be able to describe a seemingly simple process like the transition from inner-to-outer sphere binding and vice versa. This transition governs most biochemical reactions involving Mg2+ and therefore subsequent processes can only by as fast as the transition itself. However, already the previous step – the exchange of a water from the first hydration shell of the ion – is described my current Mg2+ models up to four orders of magnitude too slowly, which makes the observation of such events on the timescale of a typical simulation difficult or even impossible. Alln ́er et al. [48] as well as Lemkul and MacKerell explicitly considered the exchange rate into their parameter optimization procedure. To compute the rate, both studies applied Transition State Theory along a single reaction coordinate – the distance towards one of the exchanging waters. However, it could be shown that the water exchange from the first hydration shell requires at least the consideration of both exchanging water molecules in order to be able to realistically record the underlying rate using Transition State Theory. Furthermore, the model of Alln ́er et al. significantly underestimates the free energy of solvation of the ion.
(iii) Interactions between Mg2+ and nucleic acids. Typically, ionic force field parame- terization concentrates on the optimization of solution properties. The trans- ferability of these solution optimized parameters towards interactions with biomolecules, however, often fails.
Riboswitches are an important class of regulatory RNA elements that respond to cellular metabolite concentrations to regulate gene expression in a highly selective manner. 2’-deoxyguanosine-sensing (2’dG) riboswitches represent a unique riboswitch subclass only found in the bacterium Mesoplasma florum and are closely related to adenine- and guanine-sensing riboswitches. The I-A type 2’dG-sensing riboswitch represses the expression of ribonucleotide reductase genes at high cellular concentrations of 2’dG as a result of premature transcription termination.
Increasing evidence within the last decade suggests that transcriptional regulation by riboswitches is controlled kinetically and emphasizes the importance of co-transcriptional folding.2–4 Addition of single nucleotides to nascent transcripts causes a continuous shift in structural equilibrium, where refolding rates are competing with the rate of transcription.5,6
For transcriptional riboswitches, both ligand binding and structural rearrangements within the expression platform are precisely coordinated in time with the rate of transcription. The current thesis investigates the mechanistic details of transcriptional riboswitch regulation using the I-A 2’dG-sensing riboswitch as an example for a riboswitch that acts under kinetic control.
Proteinen die ExHepatitis C ist eine entzündliche Erkrankung der Leber, die durch das Hepatitis-C-Virus (HCV) verursacht wird. Trotz vieler Bemühungen ist heutzutage immer noch keine prophylaktische Vakzinierung verfügbar. Neuartige Therapien versprechen eine hohe Heilungsrate, sind aber mit hohen Kosten verbunden. HCV induziert oxidativen Stress, welcher für das Auftreten und die Progression der Pathogenese eine zentrale Rolle spielt. Um zellulären Stress (z.B. durch ROS) entgegenzuwirken, haben Zellen cytoprotective und detoxifizierende Mechanismen entwickelt, die die zelluläre Homöostase aufrechterhalten. Dabei kontrolliert der redoxsensitive Transkriptionsfaktor Nrf2 als Heterodimer zusammen mit sMaf- pression von cytoprotective und ROS-detoxifizierenden Genen. Vorherige Studien haben gezeigt, dass HCV den Nrf2/ARE-Signalweg beeinträchtigt. Dabei induziert HCV eine Translokation der sMaf-Proteine aus dem Zellkern in das Cytoplasma, wo diese das virale Protein NS3 binden. Im Cytoplasma lokalisierte sMaf-Proteine verhindern dadurch eine Translokation von Nrf2 in den Zellkern. Folglich ist die Expression von Nrf2/ARE-abhängigen cytoprotective Genen inhibiert und intrazelluläre ROS-Spiegel dauerhaft erhöht. Ein weiterer zentraler cytoprotective Mechanismus ist die Autophagie. Sie dient der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase durch den Abbau von defekten Proteinen und Organellen. Des Weiteren ist bekannt, dass Autophagie nicht nur im Laufe von Nährstoffmangel induziert wird, sondern auch durch erhöhte Mengen an ROS. In sämtlichen Studien konnte beobachtet werden, dass Autophagie für die Aufrechterhaltung des viralen Lebenszyklus eine wesentliche Rolle spielt, da sie mit der Ausbildung des membranous web, der Translation, der Replikation und der Freisetzung des Virus interferiert. Ausgehend davon sollte in dieser Arbeit zunächst die Relevanz von HCV-induziertem oxidativen Stress, resultierend aus der Nrf2/ARE-Signalweginhibition, als möglicher Aktivator der Autophagie untersucht werden. Dabei wurde in HCV-positiven Zellen eine Akkumulation von LC3-II beobachtet, was auf eine Induktion der Autophagie schließen lässt. In Übereinstimmung damit wurde eine erhöhte Expression von Autophagie-Markerproteinen in HCV-infizierten PHHs detektiert. Im Laufe der Autophagie wird p62 abgebaut. Somit sollte eine Induktion der Autophagie in einer Verminderung der Menge an p62 resultieren. Nichtsdestotrotz ist eine Akkumulation von p62 in HCV-positiven Zellen nachzuweisen. Dies erscheint zunächst widersprüchlich. Aufgrund der Tatsache, dass die Expression der katalytischen Untereinheit des Proteasoms (PSMB5) Nrf2-abhängig ist, führt die beeinträchtigte Nrf2-Aktivität in HCV-positiven Zellen jedoch zu einer verringerten Aktivität des konstitutiven Proteasoms. Dieser Befund kann auch die erhöhte Halbwertzeit von p62 in HCV-positiven Zellen erklären. Kürzlich wurde ein Zusammenspiel des Nrf2/ARE-Signalwegs und der Autophagie beobachtet. Dabei kann Nrf2 nicht nur über den kanonischen Signalweg aktiviert werden, sondern auch durch eine direkte Interaktion des phosphorylierten Autophagie-Adaptorproteins p62 (pS[349] p62) mit Keap1. In HCV-positiven Zellen können nicht nur eine Zunahme der Gesamtmenge von p62 beobachtet werden, sondern auch erhöhte Mengen an pS[349] p62. Die Berechnung des Quotienten aus pS[349] p62 und p62 zeigt in etwa eine Verdopplung der Menge an pS[349] p62 , was auf eine vermehrte Phosphorylierung von p62 in HCV-positiven Zellen rückschließen lässt. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass erhöhte Mengen an ROS, wie sie auch in HCV-positiven Zellen vorkommen, Autophagie induzieren können, die durch eine Akkumulation von LC3-II und die Zunahme von LC3 Puncta charakterisiert ist. Auch eine Zunahme von pS[349] p62 konnte beobachtet werden. Ferner resultierte die Überexpression der phosphomimetischen Mutante (p62 [S351E]) in einer Akkumulation von LC3-II, was auf die Fähigkeit von pS[349] p62 rückschließen lässt, Autophagie zu induzieren. Eine Modulation der Autophagie mittels der Inhibitoren 3-Methyladenin und Bafilomycin führte zu einer inhibierten Freisetzung von infektiösen viralen Partikeln und unterstreicht damit, dass der Autophagie eine essentielle Bedeutung bei der Freisetzung viraler Partikel zukommt. Eine HCV-Infektion wird sowohl von erhöhten Mengen an ROS als auch von einer Induktion der Autophagie begleitet. Dementsprechend führte eine Verminderung des intrazellulären Radikalspiegels durch eine Inkubation mit den Radikalfängern PDTC und NAC zu geringeren Mengen an LC3-II und pS[349] p62. Dabei konnte auch eine Abnahme der freigesetzten infektiösen viralen Partikel beobachtet werden, was ein Zusammenspiel zwischen erhöhten Mengen an ROS, Induktion der Autophagie und Virusfreisetzung nahelegt. Vorschlag: Erhöhte Mengen an ROS werden durch eine Aktivierung des Nrf2/ARE-Signalwegs detoxifiziert und würden somit den zuvor beschriebenen viralen Mechanismus verhindern. HCV die Aktivierung Nrf2/ARE-regulierter Gene beeinträchtigt, wurde die Hypothese aufgestellt, dass in HCV-positiven Zellen dieser komplexe Mechanismus dazu dient, die Translokation des pS[349] p62-abhängig freigesetzte Nrf2 in den Zellkern zu verhindern. Das wiederum hat eine eingeschränkte Expression von Nrf2/ARE-abhängigen Genen und Detoxifizierung von ROS zur Folge. Um diese Hypothese experimentell zu untersuchen, wurden HCV-positive und negative Zellen cotransfiziert mit dem p62 Wildtyp (p62 [wt]), der p62 phosphomimetischen Mutante (p62 [S351E]) oder einem Kontrollplasmid in Kombination mit einem Reporterkonstrukt, welches die Nrf2-Aktivierung darstellt (OKD48). Während in HCV-negativen Zellen im Vergleich zum p62 [wt] eine Transfektion mit p62 [S351E] zu einer signifikanten Aktivierung des Nrf2-abhängigen Reportergens führt konnte dies in HCV-positiven Zellen nicht beobachtet werden. Zusammengenommen beschreiben diese Ergebnisse einen neuartigen Mechanismus wie HCV das Zusammenspiel zwischen dem Nrf2/ARE-Signalweg, erhöhten Mengen an ROS und Autophagie beeinflusst. Dabei übt HCV einen negativen Effekt auf den Nrf2/ARE-Signalweg aus, um dem pS[349] p62-abhängig freigesetzten Nrf2 zu entkommen. Folglich werden erhöhte Mengen an ROS aufrechterhalten, die eine Induktion der Autophagie ermöglichen, welche für die Freisetzung viraler Partikel essentiell ist.
Die Paarverteilungsfunktion (PDF) beschreibt die Wahrscheinlichkeit, zwei Atome eines Materials in einem Abstand r voneinander zu finden. Diese Methode bewährt sich seit längerer Zeit zur Untersuchung von Gläsern, Flüssigkeiten, amorphen, stark fehlgeordneten und nanokristallinen anorganischen Substanzen. Die Anwendung für organische Substanzen ist jedoch relativ neu, mit etwa 20 Veröffentlichungen und Patenten insgesamt.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Methoden zur Strukturverfeinerung und Strukturlösung organischer Substanzen anhand von PDF-Daten erfolgreich entwickelt und an diversen Beispielen validiert. Als erster Schritt hierzu wurde eine Methodenverbesserung vorgenommen. Hierbei handelte es sich um eine Verbesserung der Simulation der PDF-Kurven organischer Verbindungen anhand eines gegebenen Strukturmodells. Mit Hilfe der bisherigen Methoden können die PDF-Kurven anorganischer Substanzen erfolgreich simuliert werden. Für organische Substanzen werden bei Anwendung der bisherigen Methode die Signalbreiten der intramolekularen und intermolekularen Beiträge zu der PDF-Kurve falsch wiedergegeben, dies führt zu einer schlechten Anpassung der simulierten PDF-Daten and die experimentellen PDF-Daten. Deshalb wurde ein neuer Ansatz entwickelt, in welchem für die Berechnung der intramolekularen Beiträge zum PDF-Signal ein anderer isotroper Auslenkungsparameter verwendet wurde, als bei der Berechnung der intermolekularen Beiträge zum PDF-Signal. Mit diesem Ansatz konnte eine sehr gute Simulation der PDF-Kurve für alle Testbeispiele erzielt werden. Zur Strukturverfeinerung organischer Substanzen anhand von PDF-Daten wurden zwei Ansätze entwickelt: der Rigid-Body-Ansatz zur Behandlung starrer organischer Moleküle und der Restraint-Ansatz zur Behandlung flexibler organischer Moleküle.
Neben methodischen Entwicklungen wurden in dieser Arbeit zwei weitere Untersuchungen organischer Verbindungen mittels PDF-Analyse durchgeführt.
Es wurden drei, auf unterschiedliche Weise hergestellte, amorphe Proben des Wirkstoffes Telmisartan untersucht. Des Weiteren wurde mittels PDF-Analyse eine pharmazeutische Nanosuspension untersucht.
Rhabdomyosarcoma is the most common paediatric soft-tissue sarcoma, and for tumour recurrence, the prognosis is still unfavourable. The current standard therapy consisting of surgery, radiation and combined chemotherapy does not consider the specific biology of this tumour.
Histone deacetylases (HDACs) and the Lysine-specific demethylase-1 (LSD1) are two epigenetic modifiers which are both part of repressor complexes leading to transcriptional silencing of target genes. Whereas HDACs lead to deacetylation of several lysine-residues within the histone tail, LSD1 is specific for demethylation of H3K4me2 and H3K4me1, as well as in a different context for H3K9me2. Rhabdomyosarcoma is reported to harbour high levels of LSD1, but the functional relevance is yet unclear. HDAC inhibition proved to be effective as single agent treatment, however, the proximity of HDAC1/2 and LSD1 in repressor complexes at the DNA implies a suitable rationale for a combination therapy potentially leading to cooperative effects on target gene transcription. In this study, we aimed to evaluate the potential of a combined LSD1 and HDAC inhibition for cell death induction in rhabdomyosarcoma cell lines. Whereas LSD1 inhibitors failed to induce cell death on their own, the combined inhibition of HDACs and LSD1 resulted in highly synergistic cell death induction. This effect extended to several combinations of LSD1 and HDAC inhibitors as well as to four different rhabdomyosarcoma cell lines, two of embryonal and two of alveolar histology.
With the use of the HDAC inhibitor JNJ-26481585 and the reversible LSD1 inhibitor GSK690, we demonstrated that the cell death induced by the combination matches with the details of intrinsic mitochondrial apoptosis. JNJ-26481585/GSK690-induced cell death is partially caspase-dependent and leads to caspase cleavage, followed by substrate cleavage as shown for PARP, as well as loss of the mitochondrial membrane potential.
Furthermore, JNJ-26481585 and GSK690 acted together to transcriptionally upregulate the proapoptotic proteins NOXA, BIM and BMF, which resulted in respective changes on protein level for both cell lines. However, the antiapoptotic BCL-2 family proteins BCL-2, MCL-1 and BCL-xL displayed only minor changes in protein levels upon treatment with GSK690 and JNJ-26481585, which did not rely on transcriptional activity. Therefore, the increase in proapoptotic proteins induces a shift towards proapoptotic signalling at the mitochondrial membrane. This shift is functionally relevant since knockdown of a proapoptotic protein or overexpression of one of the antiapoptotic proteins BCL-2 and MCL-1, as well as a stabilized mutant MCL-1, can significantly protect from GSK690/JNJ-26481585-induced cell death.
Knockdown of the mitochondrial membrane protein BAK, which is directly guarding the mitochondrial membrane integrity, potently protected from GSK690/JNJ-26481585- induced cell death, directly linking the shift in the BCL-2 family proteins to the observed loss of mitochondrial membrane potential and the further downstream activation of caspases. Furthermore, treatment with JNJ-26481585 and GSK690 resulted in a cell cycle arrest in G2/M phase, indicating additional effects on the tumour cells beside apoptosis induction. Taken together, the combined inhibition of LSD1 and HDACs is a promising strategy for rhabdomyosarcoma treatment.
Pulsed electron-electron double resonance (PELDOR), also called Double Electron-Electron Resonance, (DEER) is a pulsed EPR technique that can provide structural information of biomolecules, such as proteins or nucleic acids, complementary to other structure determination methods by measuring long distances (from 1.5 up to 10 nm) between two paramagnetic labels. Incorporation of the rigid Ç-label pairwise into DNA or RNA molecules enables the determination not only of the distance but also of the mutual orientation between the two Ç-labels by multi-frequency orientation-selective PELDOR data (X-, Q- and G-band frequencies). Thus, information about the orientation of secondary structure elements of nucleic acids can be revealed and used as additional angular information for structure determination. Since Ç does not have motion independent from the helix where it resides, the conformational flexibility of the nucleic acid molecule can be directly determined. This thesis demonstrates the advancement of PELDOR spectroscopy, beyond its original scope of distance measurements, to determine the mutual orientation between two rigid spin labels towards the characterization of the conformational space sampled by highly flexible nucleic acid molecules. Applications of the methodology are shown on two systems: a three-way junction, namely a cocaine aptamer in its bound-state, and a two-way junction, namely a bent DNA.
More in detail, the conformational changes of the cocaine aptamer upon cocaine binding were investigated by analysis of the distance distributions. The cocaine-bound and the unbound states could be differentiated by their conformational flexibility, which decreases in the presence of the ligand. Moreover, the obtained distance distributions revealed a small change in the mean distance between the two spin labels upon cocaine binding. This indicates a ligand-induced conformational change, which presumably originates at the junction where cocaine is known to bind. The investigation of the relative orientation between the two spin-labeled helices of the aptamer revealed further structural insights into the conformational dynamics of the cocaine-bound state. The angular information from the orientation-selective PELDOR data and the a priori knowledge about the secondary structure of the aptamer were helpful in obtaining a molecular model describing its global folding and flexibility. In spite of a large flexible aptamer, the kink angle between the Ç-labeled helices was found to be rather well-defined.
As for the bent DNA molecule, a two-step protocol was proposed to investigate the conformational flexibility. In the first step, a database with all the possible conformers was created, using available restraints from NMR and distance restraints derived from PELDOR. In a second step, a weighted ensemble of these conformers fitting the multi-frequency PELDOR data was built. The uniqueness of the obtained structural ensemble was checked by validation against an independent PELDOR data set recorded at a higher magnetic field strength. In addition, the kink and twist angle pairs were determined and the resulting structural ensemble was compared with the conformational space deduced both from FRET experiments and from the structure determined by the NMR restraints alone.
Overall, this thesis underlines the potential of using PELDOR spectroscopy combined with rigid spin labels in the context of structure determination of nucleic acids in order to determine the relative orientation between two helices, the conformational flexibility and the conformational changes of nucleic acid molecules upon ligand binding.
Recently, two of the most common types of bone cancers in children and young adults have been proven to exhibit vulnerability to poly(ADP)-ribose polymerase, (PARP) inhibitors (e.g. olaparib, talazoparib). Ewing’s sarcoma (ES) are reported to harbor a fusion gene EWS-FLI1 (85%), inducing tumorigenesis. Additional, as the fusion gene acts as aberrant transcription factor, it similarly induces elevated PARP expression levels sensitizing ES to PARP inhibition. Second, by an exome sequencing approach in a set of primary osteosarcomas (OS) we identified mutation signatures being reminiscent of BRCA deficiency. Therefore, the sensitivity of a panel of OS cell lines to either talazoparib single treatment or in combination with several chemotherapeutic drugs was investigated.
To screen ES tumor cell lines against PARP inhibitors we applied four different PARP inhibitors (talazoparib, olaparib, niraparib and veliparib) that are frequently being used for clinical studies. We combined those PARP inhibitors with a set of chemotherapeutics (temozolomide (TMZ), SN-38, etoposide, ifosfamide, doxorubicin, vincristine and actinomycin D) that are part of the first-line therapy of ES patients. Here, we demonstrate how PARP inhibitors synergize with TMZ or SN-38 to induce apoptosis, whereas the combination of PARP inhibitors with the other drugs are not favorable. By investigation of key checkpoints in the molecular mechanisms of cell death, the pivotal role of the mitochondrial pathway of apoptosis mediating the synergy between olaparib and TMZ was revealed.
Employing talazoparib monotherapy in combination with or without several chemotherapeutic drugs (TMZ, SN-38, cisplatin, doxorubicin, methotrexate and etoposide/carboplatin), the correlation between homologous recombination (HR) repair deficiency (BRCAness) and the response to talazoparib as prototypical PARP inhibitor was validated in different OS cell lines. By calculation of combination indices (CI) and fraction affected (Fa) values, we identified TMZ as the most potent chemotherapeutic drug in combination with talazoparib inducing the mitochondrial apoptotic pathway in OS.
In our studies of two independent tumor entities with contrary genetic background we identified the combination of PARP inhibitor and TMZ as being most effective. Our studies point out that after TMZ induced DNA methylation and concomitant PARP trapping, DNA damage-imposed checkpoint kinase activation consequently induces G2-cell cycle arrest. Subsequent, PARP inhibitor/TMZ causes MCL-1 degradation, followed by activation of BAK and BAX, succeeding in loss of mitochondrial outer membrane potential (LMMP) and activation of downstream effector-caspases in mitochondrial apoptosis. Our findings emphasize the importance of PARP inhibition in order to chemosensitize ES, which express high PARP levels, or OS that bear features of BRCAness.
Weltweit sind ca. 130–180 Millionen Menschen mit HCV infiziert und jährlich sterben etwa 500.000 Menschen an dessen Folgen. Die neuartigen Therapien versprechen zwar eine sehr hohe Heilungsrate, sind aber aufgrund ihrer enorm hohen Kosten nur in Industrieländern verfügbar. Noch immer gibt es keine prophylaktische Vakzinierung gegen HCV. Deshalb ist es wichtig, den HCV-Lebenszyklus und die Interaktion zwischen Wirtszelle und Virus detailliert zu verstehen, um die Entwicklung von Therapien und Impfungen zu ermöglichen. Außerdem kann ein fundiertes Wissen von HCV translatiert werden und auf neuartige Erreger der Familie der Flaviviridae, wie Denguevirus und Zikavirus, angewendet werden. Während der Zelleintritt und die Replikation von HCV relativ gut charakterisiert sind, bleiben die Assemblierung und Freisetzung der viralen Partikel schlecht verstandene Schritte des HCV-Lebenszyklus. In dieser Arbeit sollte die Rolle des zellulären Proteins α-Taxilin im Lebenszyklus von HCV untersucht werden. In einer späteren Phase der Arbeit wurde der endosomale Freisetzungsweg von HCV untersucht. Dazu wurden HCV Varianten generiert und charakterisiert, die Fluoreszenz-Proteine im NS5A- und E1-Protein enthalten, durch die es möglich ist, den Replikationskomplex und die Viruspartikel zu visualisieren und zu quantifizieren und den viralen Lebenszyklus dadurch besser untersuchen zu können...
Entwicklung neuer Multikomponentenreaktionen zur Synthese von Amin- und α-Aminosäurederivaten
(2016)
Die Entwicklung neuer Synthesemethoden ist von enormer Bedeutung hinsichtlich der Darstellung von neuen Verbindungen mit speziellen, anwendungsorientierten Eigenschaften und in Bezug auf die Suche nach ökologisch verträglicheren und effizienteren Herstellungsmethoden. Multikomponentenreaktionen (MCRs) bieten hierbei eine gute Ansatzmöglichkeit. Gegenüber den klassischen, linear verlaufenden 2-Stufen-Reaktionen weisen MCRs eine hohe Atom-Ökonomie und effiziente Bindungsbildung auf, können zur Minimierung von Zeit-, Energie-, Material- und Kostenaufwand sowie zur geringeren Generierung von Abfallmengen beitragen und ermöglichen einen schnellen Aufbau diverser Molekülstrukturen. Vor diesem Hintergrund gelang im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Entwicklung mehrerer 3-Komponentenreaktionen basierend auf der nukleophilen Addition von Arylboronsäuren an in situ gebildete N-Acyl- bzw. N-Sulfonylimine, womit die Synthese von diversen alpha-substituierten Amiden, chiralen, alpha-substituierten Sulfonamiden, chiralen alpha-Arylglycinen sowie von Arylmethylsulfonamiden erfolgte. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Umsetzung hinsichtlich der Methode mit Amiden war die Verwendung eines dualen Katalysatorsystems aus Lewis-Säure und Pd(II) sowie die Anwesenheit von Wasser. Die enantioselektiven Varianten konnten mittels Sulfonamide anstelle der Amide sowie unter Einsatz von Pd(II) und einem chiralen Oxazolin-Liganden erreicht werden. Die neuen Methoden sind einfach in der Durchführung, weisen einen breiten Substrat-bereich auf und im Falle der asymmetrischen Varianten hohe Enantioselektivitäten.
Allerdings besitzt die Reaktionsführung über Organoboronsäuren zwei entscheidende Nachteile: Zum einen bedarf es der Verwendung vorfunktionalisierter Boronsäuren und zum anderen werden stöchiometrische Mengen borhaltiger Abfälle erzeugt. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Prozesse untersucht, bei denen hinsichtlich der Atom-Ökonomie keine unnötig vorfunktionalisierten Startmaterialien eingesetzt werden und bei denen keine oder nur ökologisch vollkommen unbedenkliche Nebenprodukte entstehen. Ein erster Ansatz in diese Richtung gelang dabei mit der Entwicklung einer neuen 3-Komponentenreaktion basierend auf einer Brønsted-Säurekatalysierten, benzylischen C–H-Bindungsfunktionalisierung von 2-Alkylazaarenen.
Die Arachidonsäurekaskade spielt bei Entzündungsprozessen und der Schmerzentstehung eine wichtige Rolle. Deren primäre Produkte, die Leukotriene und die Prostaglandine, sind entzündungsfördernde Mediatoren und nehmen Einfluss auf den Entzündungs-auflösendenprozess und sind bei einer Dysregulation für diverse Erkrankungen wie z.B. Asthma bronchiale und allergische Rhinitis mitverantwortlich. Die Kaskade gliedert sich mit ihren beiden Hauptenzymen, Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase (5-LO), in zwei Wege auf. Beide Enzyme sind außerdem in der Lage entzündungsauflösenden Mediatoren zu bilden. Die Mediatoren wie z.B. Lipoxin können im Zellstoffwechsel einerseits über die Lipoxygenase-Route, oder andererseits wie „aspirin-triggered“-Lipoxin von der durch geeignete Wirkstoffe acetylierten Cyclooxygenase-2 (COX-2) katalysiert werden. Diese Mediatoren werden benötigt, um (chronische) Entzündungen und beschädigtes Gewebe zurück zur Homöostase zu führen.
Die Pharmakotherapie chronisch entzündlicher Erkrankungen mit guter Wirksamkeit und verträglichem Profil bei Langzeiteinnahme stellt jedoch eine Herausforderung dar. Die Therapie verzögern oft, z. B bei Einnahme von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR), die Entzündungsauflösung, da die Bildung von entzündungshemmenden und entzündungs-auflösenden Lipidmediatoren gehemmt werden. Die gezielte Modulation und Einflussnahme auf die Arachidonsäurekaskade an einem der beiden Enzyme, stellt daher einen guten Ansatz für eine verbesserte Therapiemöglichkeit von (chronischen) entzündlichen Krankheiten dar. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von Modulatoren und Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade. Zum einen befasst sie sich mit der Entwicklung von irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen als neues anti-entzündliches und entzündungsauflösendes Prinzip. Zum anderen mit der Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) von 2-Aminothiazolen als direkte 5-LO-Inhibitoren ausgehend von SKI-II, welches zuvor als Leitstruktur zur Entwicklung von 5-LO-Inhibitoren entdeckt wurde.
Als Leitstrukturen für die irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen wurden bekannte COX-2 selektive Substanzen ausgewählt sowie vereinzelte nicht-selektive NSAR. Es wurden an der COX-2 Kristallstruktur Docking-Studien durchgeführt, um die geeignetsten Positionen für die Einführung einer (labilen) Acetylgruppe zu identifizieren. Aufgrund dieser Studien wurden drei Positionen ausgewählt zur Derivatisierung. Es wurden daraufhin zahlreiche Derivate synthetisiert von Celecoxib, Valdecoxib, Rofecoxib, Etericoxib, als Vertreter der (COX-2) selektive Inhibitoren, sowie von Acetylsalicylsäure, Diclofenac und Nimesulid-Analoga als Vertreter der nicht-selektiven NSARs. Zusätzlich wurden Derivate synthetisiert mit Michael-Akzeptoren als kovalente bindende Komponente. Alle synthetisierten Substanzen wurden sukzessiv auf ihre COX inhibitorischen Eigenschaften hin untersucht und auf COX-2 Selektivitäten überprüft. Weiterhin wurden von allen Derivaten Auswaschungs-Studien durchgeführt als Vorversuche welche Derivate eine irreversible COX-2-Inhibition hervorrufen. In den Vorversuchen zeigte die Verbindung ST-1650 am deutlichsten eine COX-2-Selektivität sowie eine starke irreversible Inhibition der COX-2. Die Verbindung ST-1650 wurde weiterhin auf indirekte Hinweise zur Entstehung von heilungsfördernden Mediatoren untersucht anhand von: M1-Macrophagen Polarisation und einem Schmerzmodell, dem Zymosan-Überempfindlichkeit Pfotenmodell. Im Makrophagen-Modell konnte ST-1650 keine Phänotypverschiebung hinzu entzündungsauflösenden M2-Makrophagen bewirken, sowie in den Schmerzmodellen leider keine schnellere Schmerzauflösung als die Kontrollgruppe. Ob diese Effekte durch mangelnde oder zu geringer Entstehung von entzündungshemmenden Mediatoren zurückzuführen ist, ist noch unklar.
Für die SAR der 2-Aminothiazole als direkte 5-LO-Inhibitoren wurden über 60 Verbindungen synthetisiert und untersucht. Zu Beginn erfolgte eine Optimierung der Grundstruktur als 5-LO-Inhibitor. Es wurden die Einflüsse der Substituenten des Thiazolsrings und des Aminolinkers auf die 5-LO-Aktivität ermittelt, um die SAR initialer Arbeiten zu vertiefen. Nach der SAR-Untersuchung im intakten Zellsystem konnten durch Kombination bevorzugter Strukturelemente die zwei Verbindungen ST-1853 und ST-1906, als neue potente 5-LO-Inhibitoren entwickelt werden, die sich als nicht-toxisch herausstellten. Diese beiden 5-LO-Inhibitoren wirken um einen Faktor 10 potenter und sind weniger toxisch verglichen mit der Leitstruktur SKI-II. ST-1853 wurde innerhalb der Arachidonsäurekaskade auch auf Off-targets getestet, deren Aktivitäten sie erst bei 100-fach höherer Konzentration beeinflusst, sowie in humanem Vollblut, wo sie sich ihre 10-fach bessere Wirksamkeit im Vergleich zu SKI-II bestätigte. Darüber hinaus erwies sich ST-1853 bei den ersten Überprüfungen seiner Stabilität unter physiologischen Bedingungen wie bei der in vitro Metabolisierung durch Rattenlebermikrosomen als ausreichend stabil und daher zur weiteren Charakterisierung gut geeignet.
Habituation ist eine der einfachsten Formen des Gedächtnisses. Hierbei handelt es sich um die erlerne Gewöhnung an einen harmlosen Reiz. Dies bedeutet, dass nach mehrfacher wiederholter Repräsentation eines harmlosen Reizes die Reaktion darauf stetig abnimmt, bis sie völlig zum erliegen kommt. Je nach Trainingsprotokoll kann diese Gewöhnung bis zu mehren Tagen andauern. Habituation ist hoch konserviert und ein Verhaltensmuster, dass auch bei sehr einfachen vielzelligen Organismen zu finden ist und untersucht werden kann. Zur Untersuchung des Zusammenspiels innerhalb eines neuronalen Netzwerkes, welches für die Habituation des Rückzugsreflexes (Ausweichreaktion nach Berührung) verantwortlich ist wurde hier der Fadenwurm Caenohabditis elegans (C. elegans) als Modell Organismus verwendet. Aufgrund seines einfachen, nur 302 Zellen umfassenden, Nervensystems eignet sich C. elegans sehr gut für Grundlagenforschung in diesem Bereich. Das neuronale Netzwerk, das verantwortlich ist für den Rückzugsreflex ist in drei Ebenen organisiert. Wahrgenommen wird der Reiz von sensorischen Neuronen (ASH, ALM, AVM, PLM, PVM). Die Weiterleitung erfolgt über verschiedene Interneuronen (AVA, AVB, AD, AVE, PVC) hin zu den Motorneuronen, welche die Muskeln enervieren und somit die Reaktion auf den in erster Ebenen wahrgenommen Reiz auslösen.
Mit Hilfe von optogenetischen Werkzeugen wurde hier Untersucht welche Rolle einzelne Zellen innerhalb dieses Netzwerkes innehaben und an welcher Stelle innerhalb des Netzwerkes die kurzzeitige Habituation des Reizes, nach einem Einfachen Lernprotokoll stattfindet. Zuerst musste eine Möglichkeit gefunden werden die zur Verfügung stehenden optogenetischen Werkzeuge zellspezifisch zu exprimieren. In dieser Arbeit wurden hierfür Rekombinasesysteme verwendet, die es ermöglichten zur Expression eine Kombination aus 2 verschiedenen Promotoren zu verwenden. Beide Promotoren dürfen hierbei nur in einer Zelle, der Zielzelle, überlappen. Es konnte zellspezifische Expression des Kationenkanals Chanelrhodopsin 2 (ChR2) in den beiden Zellparen AVAL/R und ASHL/R (nimmt aversive Reize wahr) erreicht werden.
Zur Untersuchung der Habituation wurde zusätzlich noch ein Wurmstamm verwendet, welcher ChR2 unter dem mec-4 Promotor exprimiert. ChR2 ist hier in den Mechanorezeptorneuronen (MRN) ALM, AVM, PLM und PVM exprimiert. Die hier durchgeführten Experimente deuten darauf hin das den MRNs die Größte Rolle bei der Ausbildung einer Habituation zukommt. Es gibt jedoch auch Hinweise darauf, dass AVA zusätzlich eine Rolle spielt.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Rolle von AVA genauer untersucht. AVA gilt als der Hauptsignalgeber für eine Rückwärtsbewegung (spontan und nach Reizempfang). Es konnte gezeigt werden dass eine Unterbrechung der ’Gap Junktionen’ zwischen AVA und PVC eine stärkere Reaktion zur Folge haben. AVA scheint also durch PVC inhibiert zu werden. Ebenfalls mit AVA direkt interagierende Neuronen sind AVD und AVE. Mit den hier zur Verfügung stehenden Mitteln konnte die genaue Modulation von AVA durch diese Zellen jedoch nicht gezeigt werden.
In dieser Arbeit konnte der Grundstein für eine funktionale Aufklärung des Nervensystems von C. elegans gelegt werden. Vor allem durch die Möglichkeit der zellspezifischen Expression kann es zukünftig gelingen das Zusammenspiel der einzelnen Nervenzellen und ihren Anteil an einem bestimmtem Verhalten zu Untersuchen.
Das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO) spielt eine entscheidende Rolle in der Generierung von Leukotrienen. Diese fungieren als wichtige proinflammatorische Mediatoren. Darüber hinaus ist die 5-LO anhand ihrer N-terminalen Domäne in der Lage mit verschiedenen Proteinen zu interagieren. Unter den Interaktionspartnern befindet sich Dicer, ein Enzym welches für den finalen Schritt der microRNA (miRNA)-Biosynthese verantwortlich ist. MiRNA sind kurze, nicht kodierende RNA Stränge mit einer typischen Länge von etwa 23 Nukleotiden, die an der posttranskriptionalen Regulierung der Proteinbiosynthese beteiligt sind.
Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der 5-LO auf die miRNA-Prozessierung im zellulären Kontext zu untersuchen. Als Modellsystem wurde die MonoMac6 (MM6) Zelllinie ausgewählt. MM6-Zellen exprimieren im undifferenzierten Grundzustand nur geringe Mengen an 5-LO. Erst nach Differenzierung mittels transformierenden Wachstumsfaktors ß (TGFß) und Calcitriol kommt es zur Induktion der 5-LO Proteinbiosynthese. Darüber hinaus war es Basavarajappa et al. möglich die 5-LO-Expression in diesen Zellen mittels RNA-Interferenz stark herunter zu regulieren (Δ5-LO).
Um die Frage der Auswirkungen des 5-LO knockdowns auf die miRNA-Expression analysieren zu können, wurde ein Microarray in differenzierten Kontroll-und Δ5-LO-Zellen durchgeführt.Es wurden 37 miRNAs identifiziert deren Expression 5-LO abhängig ist. Dabei war das Niveau von 30 Vertretern in Abwesenheit der 5-LO erhöht, wohingegen die Expression von sieben miRNAs reduziert war. Unter diesen sieben herunter regulierten miRNAs befanden sich miR-99b-5p und miR-125a-5p, die einem gemeinsamen Cluster entstammen. Als Cluster wird eine Gruppe von miRNAs bezeichnet, die aus einem gemeinsamen primären Transkript (pri-miRNA) hervorgeht. Diese Eigenschaft führte zur Vermutung, dass bereits die Expression dieser pri-miRNA durch die 5-LO reguliert wird. Allerdings zeigte sichim Verlauf dieser Arbeit, dass die Expression der pri-miRNA 5-LO unabhängig verläuft. Im Gegensatz dazu wies die Zwischenstufe zwischen pri-miRNA und reifer miRNA eine reduzierte Expression in Δ5-LO Zellen auf. Für die Prozessierung dieser sogenannten precursor miRNAs (pre-miRNA) ist die Ribonuklease III Drosha verantwortlich, welche die pre-miRNA aus der jeweiligen pri-miRNAs chneidet. Das verringerte pre-miR-99b-und pre-miR-125a-Niveau ist daher ein Hinweis darauf, dass überDicerhinausmöglicherweise ebenfalls die Drosha Aktivität mittels 5-LO reguliert wird.
Des Weiteren wurde untersucht iniefern Leukotriene beziehungsweise 5-LO-Inhibitoren die Expression von miR-99b-5p und miR-125a-5p beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass das miRNA-Niveau unabhängig von der vorhandenen Leukotrien-Menge ist. Das 5-LO aktivierende Protein (FLAP) besitzt dahingegen einen mit der 5-LO vergleichbaren Einfluss auf die reife miRNA. FLAP ist ein weiterer Interaktionspartner der 5-LO und essentiell für die Leukotrien-Biosynthese in vivo. Anhand von Protein-Lokalisationsstudien mittels Immunofluoreszenz konnte gezeigt werden, dass FLAP außerdem in der Lage zu sein scheint die Relokalisation der 5-LO aus dem Zytoplasma in den Nukleus einzuschränken. Im Zytoplasma ist die 5-LO in der Lage mit Dicer zu interagieren. Daten bezüglich einer Interaktion zwischen Drosha und 5-LO im Zellkern liegen bisher nicht vor. Eine etwaige Interaktion könnte allerdings helfen die reduzierten pre-miRNA Spiegel in Abwesenheit der 5-LO zu erklären.
Im Laufe dieser Arbeit wurden weiterhin die Auswirkungen von proinflammatorischen Lipopolysacchariden (LPS) auf die Prozessierung von miR-99b-5p und miR-125a-5p analysiert. Ausschließlich in Anwesenheit von 5-LO zeigte sich eine differenzierungsunabhängig gesteigerte Biosynthese der pri-und der reifen miRNA. Allerdings konnte kein Einfluss von LPS auf die 5-LO-Lokalisation beziehungsweise Expression festgestellt werden. Aufgrund dessen sind weiterführende Studien, die den Zusammenhang zwischen LPS induzierter miR-99b-5p- beziehungsweise miR-125a-5p-Biosynthese und 5-LO herstellen, nötig.
Abschließend hat sich diese Arbeit mit den Zielgenen der durch 5-LO regulierten miRNAs auseinandergesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von miR-99b-5p und miR-125a-5p die Freisetzung der beiden durch LPS stimulierten Zytokine Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα) gesteigert ist. Interessanterweise besitzt TNFα einen stimulierenden Effekt auf die Leukotrien-Biosynthese. Allerdings konnte kein direkter Zusammenhang zwischen miR-99b-5p/miR-125a-5p Expression, TNFα und der 5-LO Aktivität hergestellt werden. Der Einsatz von miR-99b-5p-und miR-125a-5p-Inhibitoren zeigte keine Auswirkungen auf die Leukotrien-Biosynthese nach LPS Stimulation. Im Gegensatz dazu konnte in unstimulierten Zellen eine signifikante Aktivitätssteigerung in Abwesenheit von miR-125a-5p festgestellt werden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass miR-125a-5p einen TNFα unabhängigen Einfluss auf die 5-LO Aktivität besitzt. In LPS stimulierten Zellen kommt es möglicherweise zu Überlagerungen dieses Effektes.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass 5-LO eine regulierende Funktion auf die Reifung der beiden miRNAs miR-99b-5p und miR-125a-5p aufweist. Dieser Effekt könnte einer direkten Interaktion zwischen 5-LO und Dicer zuzuschreiben sein. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Regulierung der Expression bestimmter miRNAs mittels 5-LO nicht auf deren kanonischer enzymatischer Aktivität beruht. Diese Ergebnisse schlagen eine neue Richtung der 5-LO-Forschung ein und können in Zukunft dazu beitragen 5-LO vermittelte Effekte besser charakterisieren zu können.
Rotary adenosine triphosphate (ATP)ases are ubiquitous, membrane-bound enzyme complexes involved in biological energy conversion. The first subtype, the so-called F1Fo ATP synthase, predominantly functions as an ATP synthesizing machinery in most bacteria, mitochondria and chloroplasts. The vacuolar subtype of enzyme, the V1Vo ATPase, operates as an ATP driven ion pump in eukaryotic membranes. The subtype found in archaea and some bacteria is called A1Ao ATP (synth)ase and is capable of working in both directions either to synthesize ATP or to generate an ion motive force by consuming the same.
All the three above-mentioned subtypes of rotary ATPases work as nanomolecular machines sharing a conserved mechanism to perform the energy conservation process. The simplest form of these enzymes is the bacterial F1Fo ATP synthase. Here, ions are channelled via the membrane stator subunit a to the rotor ring of the enzyme. After almost a complete rotation of the ring the ions are released again on the other side of the membrane. This rotation is further transmitted via the central stalk to the soluble part of the enzyme, the F1-complex, where conformational changes within the nucleotide binding sites result in the synthesis of ATP from ADP and Pi.
The rotor or c-ring of the enzyme is the key protein complex in mediating transmembrane ion translocation. Several structural and biochemical methods have been applied in the past years to study the rotor rings from many different organisms. The results revealed that the stoichiometry of a c-ring of a given species is constant while it can vary between different species within a range of 8 to 15 c subunits. The c-ring stoichiometry determines directly the number of ions transported through Fo per rotation whereby three molecules of ATP are concurrently synthesized in the water-soluble F1 headgroup. Hence the number of c subunits has an important influence on the bioenergetics of the corresponding enzyme and thus the entire organism.
The c-ring of a rotary ATPase is able to specifically bind either protons (H+) or sodium ions (Na+) as the coupling ion for the enzyme. Several structures are already available revealing the coordination network of both types of rotor rings. In each case ion binding includes a highly-conserved carboxylic acid residue (glutamate or aspartate), in addition to a more varying combination of amino acid residues, whereby Na+ coordination is structurally more demanding than H+ binding.
In the first part of my PhD thesis, I aimed to characterize the F1Fo ATP synthase rotor ring of the opportunistic pathogenic bacterium Fusobacterium nucleatum on a functional and structural level. F. nucleatum is an anaerobic bacterium which uses peptides and amino acids as a primary energy source. It is one of the most frequently occuring bacteria in human body infections and involved in human periodontal diseases.
The protein complex was heterologously expressed within a hybrid ATP synthase in Escherichia coli and purified without an affinity tag for further analysis. Two high resolution X-ray structures of the c-ring were solved at low (5.3) and high (8.7) pH to 2.2 and 2.64 Å, respectively. In both structures, the conserved glutamate is in an ion-locked conformation, revealing that the conformational state of the ion binding carboxylate is not depending on the pH of the crystallization condition, which is in good agreement with previous structural and biochemical studies of other c-rings.
A Na+ ion is present within the c-ring binding site and directly coordinated by four amino acid residues and a structural water molecule. Remarkably, the Na+ is bound by two glutamate residues instead of one as is the case in the I. tartaricus Na+ binding c-ring, of which the first high resolution X-ray structure of a c-ring has been solved in 2005. Thus, a new type of Na+ coordination in an ATP synthase rotor ring with a two-carboxylate ion binding motif is described here, which also occurs in other bacteria, including several pathogens. Na+ specificity of the investigated c-ring was further confirmed by a competitive biochemical labeling reaction performed with a fluorescent ATP synthase inhibitor molecule (N-cyclohexyl-N`-[4(dimethylamino)-α-naphtyl] carbodiimide, NCD-4).
We furthermore complemented our functional and structural data of the F. nucleatum c-ring by computational studies to explore the ion translocation mechanism of this enzyme in more details. We therefore analyzed the protonation state of the second, additional glutamate in the ion binding site. Molecular dynamics (MD) simulations and free-energy calculations indicated that this glutamate is constitutively protonated, in the ion-locked as well as in a simulated, more hydrated open-conformation of the ion binding glutamate as when it is travelling through the a/c-ring interface upon c-ring rotation.
Künstliche Ribonucleasen, die sequenzspezifisch und effizient die Spaltung von RNA-Phosphordiesterbindungen katalysieren, könnten potenziell nicht nur als biochemische Werkzeuge dienen, sondern auch als Wirkstoffe gegen eine Vielzahl von Erkrankungen, bei denen mRNA oder miRNA involviert sind, eine wichtige Rolle spielen. Obwohl in den letzten beiden Jahrzehnten zahlreiche sequenzspezifische RNA-Spalter entwickelt wurden, bleibt die Spaltaktivität dieser Verbindungen nach wie vor deutlich hinter der ihrer natürlichen Äquivalente zurück. Die Optimierung künstlicher Ribonucleasen und grundlegend dafür die Erforschung der Faktoren, die die Spaltaktivität einer Verbindung beeinflussen, sind daher weiterhin von großem Interesse. Zwar enthalten die meisten künstlichen Ribonucleasen Metallionen, doch sind auch metallfreie RNA-Spalter, zum Beispiel auf der Basis heterocyclischer Guanidine, bekannt. Prinzipiell kann die Hydrolyse des RNA-Rückgrates durch Deprotonierung der nucleophil am Phosphoratom angreifenden 2‘-OH-Gruppe, durch Protonierung der als Abgangsgruppe fungierenden 5‘-OH-Gruppe sowie durch Stabilisierung des bei der Spaltung durchlaufenen dianionischen Phosphorans katalysiert werden. Daher sollten potenzielle RNA-Spalter in der Lage sein, sowohl als Base als auch als Säure wirken zu können, was bei einem pKa-Wert im Bereich von 7 am besten gegeben ist. Fungiert ein und dasselbe Molekül als Protonenakzeptor und -donor, so kommt es im Fall von Guanidinanaloga zu einer Tautomerisierung vom Amino- zum Iminoisomer. Eine möglichst kleine Energiedifferenz zwischen beiden Formen sollte sich daher positiv auf die Spaltaktivität auswirken. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Reihe heterocyclischer Guanidine synthetisiert, deren pKa-Werte bestimmt und die jeweiligen Energiedifferenzen zwischen Amino- und Iminotautomer grob mittels AM1-Rechnungen abgeschätzt. In Spaltexperimenten wurden Cy5-markierte RNA-Substrate mit den verschiedenen Verbindungen inkubiert (Spalter-Konzentration: 2 bzw. 10 mM). Die Analyse und Quantifizierung der Spaltprodukte erfolgten anschließend mithilfe eines DNA-Sequenziergerätes. Alle untersuchten und ausreichend löslichen Substanzen, die sowohl einen geeigneten pKa-Wert (6 – 8) als auch eine niedrige Energiedifferenz zwischen Amino- und Iminotautomer (≤ 5 kcal/mol) aufwiesen bzw. bei denen nur der pKa-Wert oder nur die Energiedifferenz in geringem Maße vom Idealwert abwich, spalteten RNA, wenn auch teilweise nur mit einer geringen Aktivität. In den Spaltexperimenten erwiesen sich Guanidinanaloga mit einem großen aromatischen System als besonders aktiv, allen voran 2-Aminoperimidin und seine Derivate, die auch bei Konzentrationen unter 50 µM Spaltaktivität zeigten. Gleichzeitig offenbarten diese Verbindungen in Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie Experimenten eine große Tendenz zur Aggregation mit RNA, so dass die Spaltung in diesen Fällen möglicherweise nicht durch Einzelmoleküle, sondern durch Aggregate erfolgte. Um RNA-Substrate auch sequenzspezifisch spalten zu können, wurden PNA-Konjugate des bereits bekannten RNA-Spalters Tris(2-aminobenzimidazol) hergestellt, wobei der Spalter über eine neue, quecksilberfreie Route synthetisiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass diese PNA-Konjugate RNA sequenzspezifisch mit einer Halbwertszeit von etwa 11 h spalten, was im Rahmen der Halbwertszeit vergleichbarer DNA-Konjugate liegt. Um zu untersuchen, ob 2-Aminoperimidine auch als Einzelverbindungen aktiv sind, wurden zwei PNA-Konjugate von am Naphthylring substituierten 2-Aminoperimidin-Derivaten synthetisiert. Beide Konjugate zeigten keinerlei Spaltaktivität, was darauf hindeuten könnte, dass die Hydrolyse des RNA-Rückgrates nur durch mehrere Spalter-Einheiten – kovalent verknüpft oder in Form von Aggregaten – effizient katalysiert werden kann.
The RAF family of kinases constitutes the members A, B and CRAF. They mediate RAS signaling by linking it to the MEK/ERK transduction module, which regulates cellular processes such as cell proliferation, migration, survival and cell death. As the RAS/RAF/MEK/ERK (MAPK) pathway is found to be activated in human cancers, the RAF kinases have been exploited as valuable therapeutic targets and RAF inhibitors show promising results in the clinic, esp. with tumors harboring an activating BRAFV600E mutation. However, RAF inhibitors paradoxically accelerate metastasis in RAS mutant and BRAF wildtype tumors. They also become ineffective over time in BRAFV600E tumors because of reactivation of downstream mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling by promoting RAF dimerization. Aims of the present work were 1) to investigate the role of ARAF kinase in the paradoxical activation of the enzymatic cascade by RAF inhibitors downstream of mutated RAS and 2) to study the consequences of the loss of ARAF function on signal transduction in vitro and in vivo (nude mice). We have engineered several cell lines that would allow the study of basal and RAF inhibitor induced effects on MAPK activation, tumor cell migration and invasion.
In summary, we were able to show that the RAF isoform ARAF has an obligatory role in promoting MAPK activity and tumor cell invasion in a cell type dependent manner. In these cell types, ARAF depletion prevented the activation of MAPK kinase 1 (MEK1) and extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) and led to a significant decrease of protrusions growing out of tumor cell spheroids in a three-dimensional (3D) culture that were otherwise induced by BRAFV600E-specific or BRAF/CRAF inhibitors (GDC-0879 and sorafenib, respectively). RAF inhibitors stimulated homodimerization of ARAF and heteromerization of BRAF with CRAF and the scaffolding protein KSR1. However, induced oligomerization was not sufficient to activate MAPK signaling if ARAF was depleted. By employing full length recombinant kinases, we were able to show for the first time that the three RAF isoforms competed for the binding to MEK1. In cell culture models, the overexpression of dimer-deficient ARAF mutants impaired the interaction between ARAF and endogenous MEK1 and thus prevented the subsequent phosphorylation of MEK1 and ERK1/2. Our findings reveal a new role for ARAF in directly activating the MAPK cascade through homodimerization and thereby promoting tumor cell invasion, suggesting the conserved RAF-dimer interface as a target for RAS- and RAF mediated cancer therapy.
Collectively, we provide evidence for the dual role ARAF plays in controlling MAPK signaling and cancer as loss of ARAF promoted strong lung metastasis formation in nude mice. Preliminary data describing the underlying mechanisms behind ARAF-regulated metastases have been presented and discussed.
In dieser Arbeit wurden zwei Themenblöcke bearbeitet. Zum einen der Aufbau und die Charakterisierung des Kerr-Schalters, einer Anlage zur Messung von Fluoreszenz mit einer Zeitauflösung im Femtosekundenbereich. Zum anderen die Charakterisierung von pyrenmodifizierten Nukleobasen, sowie deren Anwendung in einem neomycinbindenden Aptamer.
To overcome poor treatment response of pediatric high-risk acute lymphoblastic leukemia (ALL), novel treatment strategies are required to reactivate programmed cell death in this malignancy. Therefore, we take advantage of using small-molecule antagonists of Inhibitor of apoptosis (IAP) proteins, so called Smac mimetics such as BV6, which are described to overcome apoptosis resistance and thereby sensitize tumor cells for several apoptotic stimuli. To address the question whether redox alterations can sensitize leukemic cells for Smac mimetic-mediated cell death, we interfered with the cellular redox status in different ALL cell lines. Here, we show for the first time that redox alterations, mediated by the glutathione depleting agent Buthioninesulfoximine (BSO), prime ALL cells for BV6-induced apoptosis. Besides ALL cell lines, BV6/BSO cotreatment similarly synergizes in cell death induction in patient-derived primary leukemic samples. In contrast, the combination treatment does not exert any cytotoxicity against peripheral blood lymphocytes (PBLs) or mesenchymal stroma cells (MSCs) from healthy donors, suggesting some tumor selectivity of this treatment. We also identify the underlying molecular mechanism of the novel synergistic drug interaction of BSO and BV6. We demonstrate that both agents act in concert to increase reactive oxygen species (ROS) production, lipid peroxidation and finally apoptotic cell death. Enhanced ROS levels in the combination treatment account for cell death induction, since several ROS scavengers, like NAC, MnTBAP and Trolox attenuate BSO/BV6-induced apoptosis. BSO/BV6-induced ROS can be mainly classified as lipid peroxides, since the vitamin E derivate α-Tocopherol as well as Glutathione peroxidase 4 (GPX4), which both specifically reduce lipid-membrane peroxides, prevent lipid peroxidation, caspase activation and cell death induction. Vice versa, GPX4 knockdown and pharmacological inhibition of GPX4 by RSL3 or Erastin enhance BV6-induced cell death. Importantly, cell death induction critically depends on the formation of a complex consisting of RIP1/FADD/Caspase-8, since all complex components are required for ROS production, lipid peroxidation and cell death induction. Taken together, we demonstrate that BSO and BV6 cooperate to induce ROS production and lipid peroxidation which are eventually required for caspase activation and cell death execution. Collectively, findings of this study indicate that BV6-induced apoptosis is mediated via redox alterations offering promising new treatment strategy to overcome apoptosis resistance in ALL.
Tumor development usually follows predictable paths where tumor cells acquire common characteristics and features known as the hallmarks of cancer. Recently, additional characteristics have been added to these hallmarks since solid tumors are composed of a very heterogeneous population of transformed, formerly normal tissue cells and stromal cells, e.g. immune cells and fibroblasts. Compelling evidence suggests that stromal cells and tumor cells maintain a symbiotic relationship to build up the tumor microenvironment and to fuel tumor growth. In cancer therapies, common features of tumors such as unrestricted cell growth, suppression of immunological responses, and the ability to form new blood vessels (angiogenesis) have emerged as the main targets of interest. The lipid mediator prostaglandin E2 (PGE2) is known to promote all these features and thus, is connected to cancer progression in general. Its synthesis is triggered in response to stress factors or during inflammation. Inducible PGE2 production relies on the enzymes cyclooxygenase 2 (COX-2) and microsomal prostanglandin E synthase 1 (mPGES-1), which are simultaneously expressed in response to a variety of different stimuli and are functionally coupled. Inhibition of COX-2 with non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) for cancer treatment is, however, limited by cardiovascular risks, since selective COX-2 inhibition disrupts the prostacyclin/thromboxane balance. Therefore targeting mPGES-1 downstream of COX-2 for PGE2 inhibition was evaluated in this work in different steps of carcinogenesis. Knockdown of mPGES-1 in DU145 prostate cancer cells revealed that the mPGES-1 status did not affect growth of monolayer tumor cells, but significantly impaired 3D growth of multi-cellular tumor spheroids (MCTS). Spheroid formation induced COX-2 in DU145 and other prostate cancer spheroids. High levels of PGE2 were detected in supernatants of DU145 MCTS as opposed to monolayer DU145 cells. Pharmacological inhibition of COX-2 and mPGES-1 confirmed the pivotal role of PGE2 for DU145 MCTS growth. Besides promoting spheroid growth, MCTS-derived PGE2 also inhibited cytotoxic T lymphocyte (CTL) activation. When investigating the mechanisms of COX-2 induction during spheroid formation, the typical tumor microenvironmental factors such as glucose deprivation, hypoxia or tumor cell apoptosis failed to enhance COX-2. Interestingly, when interfering with apoptosis in DU145 spheroids, the pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK triggered a Summary 12 shift towards necrosis, thus enhancing COX-2 expression. Coculturing viable DU145 monolayer cells with isolated heat-shocked-treated necrotic DU145 cells, but not with necrotic cell supernatants, induced COX-2 and PGE2, confirming the impact of necrosis for MCTS growth and CTL inhibition. As mentioned, in vivo tumors are very heterogenous mixtures of tumor cells and stromal cells e.g. immune cells. Hence, the interaction of the immune system with tumors was investigated in further experiments. When coculturing MCF-7 breast cancer spheroids with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), only low levels of PGE2 were detected, since MCF-7 cells did not upregulate COX-2 during spheroid formation and did not induce PGE2 production by PBMCs. Under inflammatory conditions, by adding the toll-like receptor 4 (TLR4) agonist lipopolysaccharide (LPS) to cocultures, PGE2 production was triggered, spheroid sizes were reduced, and numbers of high levels of granzyme B expressing (GrBhi) CTLs were increased, while CD80 expression by tumor-associated phagocytes was also elevated. Inhibition of CD80 but not CD86 diminished numbers of GrBhi CTLs and attenuated spheroid lysis. To determine the role of ctivation-induced PGE2 production, use of the COX-2 inhibitor celecoxib and the experimental mPGES-1 inhibitor C3 further increased CD80 expression. Addition of PGE2, the prostaglandin E2 (EP2) receptor agonist butaprost, and the phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitor rolipram reduced LPS/C3-triggered CD80 expression, confirming the impact of COX- 2/mPGES-1-derived PGE2 on shaping phagocyte phenotypes in an EP2/cAMP-dependent manner. In a spontaneous breast cancer model (MMTV-PyMT), mPGES-1-deficiency significantly delayed tumor growth in mice, confirming an overall protumorigenic role of mPGES-1 in breast cancer development in vivo. However in tumors of mPGES-1-/- mice, tumor-infiltrating phagocytes expressed low levels of CD80 similar to their wildtype counterparts. These data suggest that the immunosuppressive microenvironment does not allow for immunostimulatory effects by mPGES-1 inhibition without an activating stimulus. Evidences in this study recommend the application of mPGES-1 inhibitors for treating cancer diseases, since mPGES-1 promotes tumor growth in multiple steps of carcinogenesis, ranging from well-characterized effects of tumor cell growth to immune suppression of CTL activity and phagocyte polarization. Regarding the latter, blunting PGE2 during immune activation may limit the tumor-favoring features of inflammation and improve the efficiency of TLR4 based immune therapies.
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignant tumor and third leading cause of cancer-related death worldwide. Most cases arise as a consequence of underlying liver disease, e.g. developed from chronic hepatitis B or C infectionsalcohol abuse or obesity, and are most often associated with liver cirrhosis. Hypoxiand the hypoxia inducible factors (HIF)-1α and -2α promote tumor progression of HCC, not only affecting tumor cell proliferation and invasion, but also angiogenesis and lymphangiogenesis and thus, increasing the risk of metastasis.
HCC is characterized as one of the most vascularized solid tumors. While HIF-1α and HIF-2α are frequently up-regulated in HCC only HIF-2α is correlated with high patientlethality. HIF-dependent regulation of HCC angiogenesis is controversially discussed.VEGFA, for example, as the most prominent factor inducing tumor angiogenesis represents not only a HIF-1 target, but also a HIF-2 target gene in HCC. This questions whether both isoforms have overlapping functions in regulating the angiogenic switch in HCC.
Besides angiogenesis also tumor-associated lymphangiogenesis significantly influences patient survival in HCC. Lymphatic spread is an important clinical determinant for the prognosis of HCC, but little is known how lymphangiogenesis is controlled in this context. To date, mainly HIF-1α was positively correlated with olymphatic invasion and metastasis in HCC, while a defined role of HIF-2α is missing. Thus, although HIF-1α and HIF-2α are structurally alike and regulate overlapping but not identical sets of target genes, they promote highly divergent outcomes in cancer progression and may even have counteracting roles. The aim of my work was to characterize the specific role of HIF-1α and HIF-2α in the angiogenic switch and lymphangiogenesis induction during HCC development.
Therefore, I created a stable knockdown of HIF-1α and HIF-2α in HepG2 cells and generated cocultures of HepG2 spheroids and embryonic bodies derived from embryonic mouse stem cells as an in vitro tumor model mimicking the cancer microenvironment to analyze which HIF isoform has key regulatory functions in HCC (lymph)angiogenesis. In cocultures with a HIF-2α knockdown angiogenesis was attenuated but lymphangiogenesis increased, while the knockdown of HIF-1α was without effect. Microarray analysis identified plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1)and insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP1) as HIF-2 target genes.However, prominent angiogenic and lymphangiogenic factors such as VEGFs, PDGFB, ANG and their receptors were not regulated in a HIF-dependent manner. As PAI-1 was linked to angiogenesis in literature and IGF-signaling, which is negatively regulated by IGFBP-1, was correlated with lymphangiogenesis, I decided to investigate their HIF-2α-dependent influence on HCC (lymph)angiogenesis. The knockdown of PAI-1 in HepG2 cells also lowered angiogenesis in PAI-1k/d cocultures similar to the HIF-2α k/d phenotype. PAI-1 as the potent inhibitor of tPA and uPA, both inducing the conversion of plasminogen to plasmin, also inhibits plasmin directly. Therefore, I assumed an increase of plasmin in HIF-2α k/d and PAI-1 k/d cocultures as a result of the reduced PAI-1 levels. Blocking plasmin with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored angioge nesis, suggesting that HIF-2α increases PAI-1 to lower concentrations of active plasmin, thereby supporting angiogenesis. In further experiments I could exclude PAI-1 to reduce angiogenesis by inducing plasmin-mediated apoptosis of differentiating stem cells in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, but demonstrated an increase of VEGFA165 degradation in these cocultures, suggesting plasmin-catalyzed proteolysis of VEGF as an additional layer of regulation required to explain the angiogenic phenotype. Besides the pivotal role of PAI-1 in angiogenesis I also investigated its potentialinfluence in lymphangiogenesis. Indeed, the knockdown of PAI-1 reduced lymphaticstructures and implied an important but opposing role in lymphangiogenesis comparedto induced lymphangiogenesis in HIF-2α k/d cocultures. However, blocking plasmin again with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored lymphangiogenesis to the level of control virus, which indicates a divergent lymphangiogenic role of plasmin in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, possibly because of other essential pathways masking the lymphangiogenic effects of PAI-1 in HIF-2α k/d cocultures.
HIF-2α resulting in reduced IGFBP1 expression induced the differentiation of stem cells toward a lymphatic cell type and significantly enhanced the assembly of human dermal lymphatic endothelial cells into tubes. These data point the first time to an important impact of HIF-2 in the regulatin of lymphangiogenesis in vitro by inducing IGFBP1 and thus, scavenging IGF-1. Furthermore, matrigel plug assays to investigate the in vivorelevance of these observations confirmed HIF-2α as a crucial factor in the regulation of lymphangiogenesis in vivo
In conclusion, this work provides evidence that HIF-2α is a key regulator of angiogenesis and lymphangiogenesis in HCC by regulating PAI-1 and IGFBP1. HIF-2α positively influences the angiogenic switch via PAI-1 and negatively affects lymphangiogenesis via IGFBP1 expression. Targeting HIF-2α in HCC to reduce tumor angiogenesis should be approached carefully, as it might be overcome by induced lymphangiogenesis and metastasis.
The human endothelin receptors, ETA and ETB, are two members of the G-protein coupled receptors family (GPCRs) and they are key players in cardiovascular regulation. The characterization of their functionality in vitro has been limited by the possibility to obtain high quality samples using conventional expression systems. The Cell-Free expression system is an alternative technique for the production of membrane protein as well as GPCRs and can overcome some of the limitations that are commonly encountered using an in vivo approach. Cell-Free expression protocols for the two receptors ETA and ETB have been optimized by implementing post- and co-translational association to lipid bilayers. The efficiency of the reconstitution or association to liposomes and nanodiscs has systematically been studied and the ligand binding properties of the two receptors have been analyzed using a set of different complementary techniques. In several different conditions a high affinity binding of the peptide ligand ET-1 to both endothelin receptors could be obtained and the highest activity values were detected in sample prepared using a co-translational approach in presence of nanodiscs. Furthermore, the characteristic differential binding pattern of selected agonists and antagonists to the two receptors was confirmed. In samples obtained from several Cell-Free expression conditions, two intrinsic properties of the functionally folded ETB receptor, such as the proteolytic processing based on conformational recognition as well as the formation of SDS-resistant complexes with the peptide ligand ET-1, were detected. ETA and ETB are able to induce in vivo the activation of hetrotrimeric G proteins upon stimulation with an agonist, leading to the dissociation of the heterotrimeric complex and the exchange of GDP to GTP in the Galpha subunit. The Cell-Free expression system was chosen for the production of two G alpha subunit, Galpha s and Galpha q. Soluble expression of the two proteins was achieved and the production of active Galpha s was confirmed using fluorescent as well as radioactive assays. In conclusion, the obtained results document a new process for the production of ligand binding competent endothelin receptors, as well as Galpha proteins, using a Cell-Free expression system. The combination of this expression system and the nanodiscs technology appears to be a promising tool for the further characterization of membrane proteins as well as GPCRs.