Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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In the first part of this work, the development of a novel two-dimensional native gel electrophoretic system (2-D BN/hrCNE) is described. This new system simplifies proteomics and biochemical analysis of mega protein complexes that are dissociated into the constituent complexes during 2-D electrophoresis, thereby reducing the complexity of the system considerably. This technique is exceptionally well suited for the in-gel detection of fluorescence-labeled proteins and the identification of individual enzymes and protein complexes by specific in-gel assays on native gels.
In the second part, a new technique for the native immunoblotting of blue native gels (NIBN) was developed. This new technique allows for the identification of conformation-specific antibodies and the discrimination of antibodies recognizing linear epitopes of denatured proteins. Identification of conformation-specific antibodies is becoming increasingly important not only for the electron microscopic identification of native proteins but also for structural investigations in general. For this purpose, a commonly used protocol for Western blotting of blue native gels was modified in such a way that the native state of proteins and protein complexes was retained throughout the complete protocol. Instead of using the denaturing methanol in Western blotting protocols, mild detergents such as Tween 20, digitonin and Brij 35 were used for the obligatory removal of protein bound Coomassie-dye.
The detection of respiratory complex I by activity staining on the blot membrane demonstrated that all three non-ionic detergents preserved the native state of complex I. The native state of the enzyme on the blot membrane was also monitored and confirmed with the help of a set of conformation-specific antibodies. NIBN can be used as a simple alternative method to the demanding native ELISA to screen for conformation-specific antibodies for structural studies. Unlike the time consuming native ELISA, NIBN does not require introduction of appropriate affinity tags and purification of the target protein by chromatography. Thus, the NIBN technique is especially useful for microscale projects and for proteins not easily accessible to genetic manipulation.
The third part aimed at identification of the immediate protein interaction partners of Cox26, a hydrophobic protein that has been identified by our group as a novel component of yeast respiratory supercomplex. Multi-dimensional electrophoretic techniques were applied to identify non-covalent and covalent protein-protein interactions of Cox26. Three-dimensional electrophoresis (BNE/BNE/SDS-PAGE) gave both qualitative and quantitative information on covalent and non-covalent interactions of Cox26 and subunits of cytochrome c oxidase (complex IV), and showed that most of the Cox26 protein was non-covalently bound to the complex IV moiety of the respirasomes. Four-dimensional electrophoresis (BNE/BNE/SDS/SDS-PAGE) applying reducing and non-reducing conditions revealed that a minor fraction of Cox26 used a single cysteine residue in the center of a predicted transmembrane helix to form a disulfide bond with the Cox2 subunit of complex IV. A structural role of Cox26 protein in the assembly/stability of respiratory strings or patches has been suggested.
The last part of this work focused on the isolation and characterization of native and morphologically intact nucleoids from bovine heart mitochondria, since only a few studies on nucleoid organization and composition have been carried out on mammalian tissues. The nucleoids appeared as distinct bands (apparent mass around 30-36 MDa) in blue native-PAGE on large pore gels. The moderate variation in particle size seems to reflect variations in the binding of loosely nucleoid-associated components like respiratory chain complexes. The estimated 30-36 MDa mass of nucleoids on native gels suggested that each nucleoid contains one mtDNA molecule provided that nucleoids contains equal amounts of DNA, protein and RNA (Miyakawa et al., 1987).
Electron microscopic analysis of native nucleoids, which was performed by Dr. Karen Davies from the Max-Planck-Institute of Biophysics, Department of Structural Biology, Frankfurt, showed homogenous pool of particles with dimensions in 85x100 nm (in negative stain) and 100x150 nm (in cryo-tomography). Some of the nucleoids showed dumbbell-shape indicating dimerization of nucleoids. Recent EM and high-resolution light microscopy analysis of mammalian nucleoids have reported that nucleoids have a size of 70 nm in average. We also observed the same size of 70 nm in cryo-tomogramms when we applied harsher treatment of the native nucleoid particles with dimensions 100x150 nm. This observation is in agreement with published nucleoid sizes from both EM and high-resolution light microscopy, if we assume that native nucleoids have been dissociated under harsher treatment.
The protein composition of bovine heart mt-nucleoids was analyzed by a number of complementary approaches to identify low and highly abundant, easily dissociating and tightly bound proteins, and to rank the 90 most abundant mt-nucleoid proteins. Native and denaturing gel electrophoresis techniques were coupled to LC-MS/MS to achieve a comprehensive protein component analysis. Qualitative MS analysis of highly purified nucleoids identified more than 400 proteins, including well known nucleoid proteins such as mitochondrial transcription factor and mtDNA-binding protein (TFAM), mitochondrial single-stranded DNA-binding protein (mtSSB), mitochondrial DNA polymerase subunit gamma-2 (POLG2) and mitochondrial helicase C26H10ORF2 protein (Twinkle). These proteins were ranked according to Mascot scores, and sorted according to presumed functional properties. A large group of proteins involved in protein synthesis comprised an almost complete set of subunits of mitochondrial ribosomes suggesting that the nucleoids contained significant amounts of mitochondrial ribosomes. Identification of sixty six proteins from the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system comprising around 100 proteins in total suggested that OXPHOS proteins are also associated with mt-nucleoids.
Interestingly, TFAM, described as a main mtDNA packaging factor in human and other mammalian cells, was not confirmed here as a major nucleoid component from bovine heart mitochondria. Fluorescence staining of protein spots on 2-D IEF/SDS gels clearly identified TFAM, but according to the stain intensity, this protein did not rank in the list of the 90 most abundant nucleoid proteins. Western blot analysis of sucrose gradient fractions revealed an enrichment of putative TFAM isoform in nucleoid fractions. Unexpectedly, the uncharacterized mitochondrial protein Es1 was identified as the most abundant nucleoid protein in bovine heart nucleoids instead. This implicates that nucleoid organization may differ between species and tissues. A functional characterization of Es1 is required to clarify its role in mammalian nucleoids.
Pulsed electron–electron double resonance (PELDOR) spectroscopy is a powerful tool for measuring nanometer distances in spin-labeled systems and recently is increasingly applied to membrane proteins. However, after reconstitution of labeled proteins into liposomes, spin labels often exhibit a much faster transversal relaxation (Tm) than in detergent micelles, thus limiting application of the method in lipid bilayers. In the first part of the thesis, optimization of transversal relaxation in phospholipid membranes was systematically investigated by use of spin-labeled derivatives of stearic acid and phosphatidylcholine as well as spin-labeled derivatives of the channel-forming peptide gramicidin A under the conditions typically employed for PELDOR distance measurements. Our results clearly show that dephasing due to instantaneous diffusion that depends on dipolar interaction among electron spins is an important contributor to the fast echo decay in cases of high local concentrations of spin labels in membranes. The main difference between spin labels in detergent micelles and membranes is their local concentration. Consequently, avoiding spin aggregation and suppressing instantaneous diffusion is the key step for maximizing PELDOR sensitivity in lipid membranes. Even though proton spin diffusion is an important relaxation mechanism, only in samples with low local concentrations does deuteration of acyl chains and buffer significantly prolong Tm. In these cases, values of up to 7 μs have been achieved. Furthermore, our study revealed that membrane composition and labeling position in the membrane can also affect Tm, either by promoting the segregation of spin-labeled species or by altering their exposure to matrix protons. Effects of other experimental parameters including temperature (<50 K), presence of oxygen, and cryoprotectant type are negligible under our experimental conditions.
In the second part of the thesis, inhomogeneous distribution of spin-labels in detergent micelles has been studied. A common approach in PELDOR is measuring the distance between two covalently attached spin labels in a macromolecule or singly-labeled components of an oligomer. This situation has been described as a spin-cluster. The PELDOR signal, however, does not only contain the desired dipolar coupling between the spin-labels of the molecule or cluster under study. In samples of finite concentration the dipolar coupling between the spin-labels of the randomly distributed molecules or spin-clusters also contributes significantly. In homogeneous frozen solutions or lipid vesicle membranes this second contribution can be considered to be an exponential or stretched exponential decay, respectively. In this study, it is shown that this assumption is not valid in detergent micelles. Spin-labeled fatty acids that are randomly partitioned into different detergent micelles give rise to PELDOR time traces which clearly deviate from stretched exponential decays. As a main conclusion a PELDOR signal deviating from a stretched exponential decay does not necessarily prove the observation of specific distance information on the molecule or cluster. These results are important for the interpretation of PELDOR experiments on membrane proteins or lipophilic peptides solubilized in detergent micelles or small vesicles, which often do not show pronounced dipolar oscillations in their time traces.
In the third part, PELDOR has been utilized to study the structural flexibility of the Toc34 GTPase homodimer, a preprotein receptor of the translocon of the outer envelope of chloroplasts (TOC). Toc34 belongs to GAD subfamily of G-proteins that are regulated and activated by nucleotide-dependent dimerization. However, the function of Toc34 dimerization is not yet fully understood. Previous structural investigations of the Toc34 dimer yielded only marginal structural changes in response to different nucleotide loads. PELDOR revealed a nucleotide-dependent transition of the dimer flexibility from a tight GDP to a flexible GTP-loaded state. Substrate-binding stabilizes the dimer in the transition state mimicked by GDP-AlFx, but induces an opening in the GDP or GTP-loaded state. Thus, the structural dynamics of bona fide GTPases induced by GTP hydrolysis is replaced by substrate-dependent dimer flexibility, which represents the regulatory mode for dimerizing GTPases.
In the fourth part of the thesis, conformational flexibility and relative orientation of the N-terminal POTRA domains of a cyanobacterial Omp85 from Anabaena sp. PCC 7120, a key component of the outer membrane protein assembly machinery, were investigated by PELDOR spectroscopy. Membrane proteins of the Omp85-TpsB superfamily are composed of a C-terminal β-barrel and a different number of N-terminal POTRA domains, three in the case of cyanobacterial Omp85. It has been suggested that the N-terminal POTRA domains (P1 and P2) might have functions in substrate recognition. Molecular dynamics (MD) simulations predicted a fixed orientation for P2 and P3 and a flexible hinge between P1 and P2. The PELDOR distances measured between the P2 and P3 POTRA domains are in good agreement with the structure determined by X-ray, and compatible with the MD simulations suggesting a fixed orientation between these domains. PELDOR constraints between the P1 and P2 POTRA domains imply a rather rigid structure with a slightly different relative orientation of these domains compared with the X-ray structure. Moreover, the large mobility predicted from MD is not observed in the frozen solution. The PELDOR results further highlight the restricted relative orientation of the POTRA domains of the Omp85-TpsB proteins as a conserved characteristic feature that might be important for the processive sliding of the unfolded substrate towards the membrane.
Ziel dieser Arbeit war es erstmals durch eine Kombination aus chemischer Mutagenese und gezielter genetischer Modifikation (hier: „metabolic engineering“) einen Phaffia-Stamm herzustellen, welcher über die Mutagenese hinaus über eine weiter verstärkte Astaxanthin-Synthese verfügt.
Die von „DSM Nutritional Products“ bereitgestellten chemischen Mutanten wurden analysiert und über einen Selektionsprozess auf Pigmentstabilität und Wachstum hin optimiert, da die Stämme aus cryogenisierter Dauerkultur starke Pigmentinstabilitäten und ein verzögertes Wachstum aufwiesen.
Über eine exploratorische Phase wurde die Carotinoidsynthese analysiert und festgestellt, dass in den Mutanten keine Einzelreaktionen betroffen sind, welche für die Heraufregulierung der Carotinoidsynthese in den Mutanten verantwortlich sind. Hierbei wurden Limitierungen identifiziert und diese durch Transformation von Expressionsplasmiden mit geeigneten Genen aufgehoben, um damit eine noch effizientere Metabolisierung von Astaxanthin-Vorstufen hin zu Astaxanthin zu erreichen. Eine Überexpression der Phytoensynthase/Lycopinzyklase crtYB resultierte in einem gesteigerten Carotinoidgehalt bei gleichbleibendem Astaxanthin- Anteil. Durch eine zweite Transformation mit einer Expressionskassette für die Astaxanthin-Synthase asy konnte der Carotinoidgehalt weiter gesteigert und zusätzlich eine Limitierung der Metabolisierung von Astaxanthin-Vorstufen behoben werden, sodass die Transformante nahezu alle Intermediate der Astaxanthinsynthese zu Astaxanthin metabolisieren konnte (Gassel et al. 2013). Es konnte gezeigt werden, dass auch in den Mutanten, aus Experimenten mit dem Wildtyp bekannte, Limitierungen identifiziert und ausgeglichen werden konnten.
Savanna regions in West Africa are valuable cultural landscapes and provide a wide range of ecosystem services for human well-being and are frequently affected by human-induced disturbances. Aside from agricultural activities (crop production and animal husbandry), the harvesting of timber and non-timber forest products is crucial for household income, alimentation and medicinal purposes. Most indigenous woody species have undergone increasing anthropogenic pressure as social and economic conditions have changed dramatically during recent decades, resulting in further habitat fragmentation and increased disturbance severity. Human land use activities influence growth conditions for plants by altering various abiotic factors, such as light, nutrient availability and water supply. They are found to alter demographic parameters (e.g., germination, seedling and sapling growth, survival and mortality rates) of woody plant individuals and alter the structure and stability of populations. The degree of anthropogenic disturbance varies between land-cover types, distance to settlements, and protection status. In the context of land-use change, there is an urgent need to better understand and evaluate the impact of land-use on savanna vegetation, particularly on the population biology of common savanna woody species. A major conclusion to be drawn from this thesis is that land use influences savanna vegetation in a complex way and does not necessarily lead to a decline or loss of tree populations and species. It is rather that in a constantly changing landscape, as a result of human-induced disturbances, populations of ubiquitous and some common species can be stable over time. The abundance of some species tends to decline consistently, whereas others benefit from human disturbance. Moreover, the study provides an insight into the structure and dynamics of common, dominant and less dominant savanna woody plants in a communal and a protected area. There is a need for further basic studies to assess the impact of land use and ecological preferences of all species, including repeated density studies that look at survivorship and transition probabilities over a number of seasons as well as longterm in-situ experiments in settlement areas in order to better understand woody plant populations in settlement areas as the few remaining semi-natural sites are likely to decrease in the future. A challenge will be the development of strategies to protect species within a landscape under cultivation.
Die vorliegende, publikationsbasierte Dissertation, bestehend aus den drei Einzelpublikationen Bayer (2011, 2012) und Bayer und Schönhofer (2012), verfolgte das Ziel, die Spinnenfamilie Psechridae zu revidieren. Weiterhin sollten die phylogenetische Position dieser Familie im System der höheren Webspinnen (Araneomorphae) sowie die phylogenetischen Beziehungen der einzelnen Arten innerhalb der beiden Gattungen der Psechridae untersucht werden. In Form von morphologisch-taxonomischen Bearbeitungen wurden die beiden die Psechridae bildenden Gattungen Psechrus und Fecenia revidiert, wobei sämtliches Typus-Material sowie reichhaltiges, weiteres Material eingehend beschrieben, illustriert und diagnostiziert wurde. Hierbei wurden auch intraspezifische Variabilität sowie die Prä-Epigynen subadulter Weibchen, die in taxonomischen Arbeiten bislang nur eine unwesentliche Rolle gespielt haben, beschrieben, illustriert und taxonomisch ausgewertet. Zudem wurden im Rahmen dieser Untersuchungen bereits Überlegungen über mögliche Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der beiden Gattungen angestellt. ...
Paradoxer Schlaf als Parameter zur Messung der Stressbelastung bei Giraffen (Giraffa camelopardalis)
(2012)
Das Wohlbefinden von Tieren zu schützen ist im Grundgesetz der Bundesrepublik Deutschland festgeschrieben. Das Wohlbefinden eines Tieres wissenschaftlich zu bewerten ist jedoch eine bislang ungelöste Herausforderung. Die Biologie nähert sich dem Problem, subjektive Empfindungen eines Tieres objektiv darzustellen, vorrangig über die Messung der Stressbelastung.
Die Stressantwort eines Organismus setzt sich allgemein aus einer Kombination von vier Systemen zusammen: einer Verhaltensreaktion, einer Antwort des vegetativen Nervensystems, einer neuroendokrinen Antwort und einer Immunantwort. Der in Zoos am häufigsten untersuchte Parameter zur Messung der Stressbelastung ist die Analyse der Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot der Tiere. Da jedoch nicht in jeder Stresssituation das „Stresshormon“ Cortisol ausgeschüttet wird, ist es für eine exakte Bewertung der Stressbelastung notwendig, weitere Systeme der Stressantwort wie beispielsweise das Verhalten zu erfassen. Die Chronoethologie verfolgt diesen Ansatz, indem sie Änderungen des Zeitmusters im Verhalten eines Tieres als Antwort auf Veränderungen in der Umwelt oder eines endogenen Faktors erfasst und diese nach Kriterien der Befindlichkeit bewertet. Hier könnte zukünftig das Schlafverhalten eine herausragende Stellung einnehmen, da es von allen vier Stressantwortsystemen beeinflusst wird. Zudem wird aus der medizinischen Schlafforschung berichtet, dass sich insbesondere die Dauer, die ein Organismus im Paradoxen Schlaf (PS) verbringt, durch Stress verändert. Dennoch fand das Schlafverhalten zur Messung der Stressbelastung bei Zoo- und Wildtieren bislang kaum Beachtung. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Anwendbarkeit des PS als Parameter zur Messung der Stressbelastung bei Zoo- und Wildtieren zu erforschen, um letztlich die Beurteilung des Wohlbefindens von Tieren weiter zu objektivieren. Aufgrund ihrer einzigartigen Schlafstellung während des PS sowie ihrer hohen Sensibilität gegenüber Umweltveränderungen wurde die Giraffe (Giraffa camelopardalis) als Modelltier für diesen non-invasiven Forschungsansatz gewählt.
Im Rahmen der Arbeit wurde in 645 Nächten das Schlafverhalten von 17 Giraffen unterschiedlichen Alters und Geschlechts beobachtet und analysiert. Um stressbedingte Veränderungen im PS-Muster erkennen zu können, wurden die Giraffen zunächst unter „Normalbedingungen“ beobachtet, um hieraus Referenzwerte zu generieren. Anschließend wurden unterschiedliche als stressintensiv einzustufende Situationen wie Nahrungsmangel, Transport, Veränderungen in der Herdenstruktur, Auswirkungen einer Geburt auf das Muttertier sowie verschiedene singuläre Ereignisse hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf das PS-Muster der Giraffen untersucht und den Referenzwerten gegenübergestellt. Um die Methode der Schlafbeobachtung als Parameter der Stressbelastung zu validieren, wurde zusätzlich ein bei Wiederkäuern etablierter, bereits genannter Stress-Parameter eingesetzt: die Messung der Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot mit Hilfe eines Enzymimmunoassays. Diese Methode wurde hier erstmalig an Giraffen angewendet.
Durchschnittlich hielt eine Giraffe unter Normalbedingungen 27 Minuten pro Nacht paradoxen Schlaf. Dabei war die nächtliche PS-Dauer in hohem Maße vom Alter abhängig. Während juvenile Giraffen im Mittel 63 Minuten PS pro Nacht aufwiesen, verbrachten gealterte Giraffen nur 4,5 Minuten pro Nacht in der PS-Stellung. Infolge eines Stressors veränderte sich die PS-Dauer der Tiere: So zeigten alle vier transportierten Giraffen in den ersten Nächten nach ihrem Transport keinen PS oder stark reduzierte PS-Zeiten. Parallel erhöhte sich nach dem Transport die Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot aller Giraffen für mehrere Tage. Auch die untersuchten Veränderungen in der Herdenstruktur hatten in den meisten Fällen signifikante Veränderungen der PS-Dauer zur Folge. Die stärkste im Rahmen dieser Arbeit beobachtete Veränderung des Schlafverhaltens bewirkte der Tod eines Giraffenbullen: Die adulte Giraffenkuh hielt in der Folge für eine Dauer von 21 Tagen keinen paradoxen Schlaf mehr. Ihre Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot stieg nach dem Tod des Bullen hingegen nicht an. Die beobachteten Giraffenmütter zeigten nach der Geburt ihrer jeweiligen Jungtiere ebenfalls eine reduzierte PS-Dauer. Hingegen hatten neugeborene Giraffen, die an Nahrungsmangel litten und innerhalb weniger Tage verstarben, eine höchst signifikant längere PS-Dauer als gleichalte Jungtiere, die überlebten.
Während bei Nahrungsknappheit eine erhöhte PS-Dauer helfen kann Energie zu sparen, ist eine Reduktion der PS-Dauer als Resultat erhöhter Aufmerksamkeit zu interpretieren, wie sie im Zuge der Feindvermeidung in Stress-Situationen sinnvoll ist.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die PS-Dauer im Gegensatz zur Cortisolmetaboliten-Konzentration von allen beobachteten Stressoren beeinflusst wurde. Dabei veränderte sich die PS-Dauer in Abhängigkeit des jeweiligen Stressors graduell unterschiedlich, was Rückschlüsse auf die Intensität des Stressors ermöglicht.
Der PS ist infolge dieser Ergebnisse hervorragend als Parameter zur Messung der Stressbelastung bei Giraffen geeignet. Die Analyse des PS kann dabei helfen, die Auswirkungen von subjektiv als stressintensiv oder stressarm eingestuften Situationen auf das Wohlbefinden eines Tieres objektiv zu bewerten. Darüber hinaus ermöglicht die kontinuierliche Überwachung des PS-Musters, z.B. mit Hilfe moderner Videosoftware, Beeinträchtigungen des Wohlbefindens, wie sie beispielsweise durch Unterernährung, Verletzung oder Krankheit hervorgerufen werden, frühzeitig zu erkennen, was ein zeitnahes Eingreifen zum Wohle des Tieres möglich macht.
The ongoing debate on deforestation in the tropics usually points out agriculture and logging as the main causes. The two activities are often linked and the trails created by logging com-panies with their heavy machines are afterwards used by farmers to penetrate deep into the forest and cultivate. Shifting cultivation is a widespread agricultural practice in the tropics and its sustainability is often a matter of controversy. It is necessary to investigate forest recovery after shifting cultivation, analyze its succession stages for comparison with regeneration after natural disturbance, and evaluate its role for discussing the hazards of deforestation.
There is increasing evidence that climate change will have a severe impact on species’ distributions by altering the climatic conditions within their present ranges. Especially species inhabiting stream ecosystems are expected to be strongly affected due to warming temperatures and changes in precipitation patterns. The aim of this thesis was to
investigate how distributions of aquatic insects, i.e., benthic stream macroinvertebrates would be impacted by warming climates. The methods comprised of an ensemble forecasting technique based on species distribution models (SDMs) and climate change scenarios of the Intergovernmental Panel on Climate Change of the year 2080. Future model projections were generated for a wide variety of species from a number of taxonomic orders for two spatial scales: a stream network within the lower mountain ranges of Germany, and the entire territory across Europe. In addition, the effect of the modelling technique on habitat suitability projections was investigated by modifying the choice of study area (continuous area vs. stream network) and the choice of predictors (standard vs. corrected set).
Projections of future habitat suitability showed that potential climate-change impacts would be dependent on species’ thermal preferences, and with a similar pattern for both spatial scales. Future habitat suitability was projected to remain for most or all of the modelled species, and species were projected to track their climatically suitable conditions by shifting uphill along the river continuum within the lower mountain ranges, and into a north-easterly direction across Europe. Cold-adapted headwater and high-latitude species were projected to lose suitable habitats, whereas gains would be expected for warm-adapted river and low-latitude species along the river continuum and across Europe, respectively. Additionally, habitat specialist species in terms of endemics of the Iberian Peninsula were identified as potential climate-change losers, highlighting their restricted habitat availability and therefore vulnerability to warming climates.
The main findings of this thesis underline the high susceptibility of stream macroinvertebrates to ongoing climate change, and give insights into patterns of possible consequences due to changes in species’ habitat suitability. Concerning the methodology, a clear recommendation can be given for future modelling approaches of stream macroinvertebrates by building models within a stream network and with a careful choice of environmental predictors, to reduce uncertainties and thus to improve model projections.
Zelluläre Immuntherapien mit hochaufgereinigten allogenen NK-Zellen sind eine mögliche Therapieoption um den GvL/T-Effekt nach haploidenter SZT bei pädiatrischen Hochrisikopatienten mit malignen Erkrankungen zu verstärken. Im Rahmen der in Frankfurt a. M. laufenden klinischen Phase I/II NK-Zell-Studie wurden 16 pädiatrische Patienten sowohl mit unstimulierten (NK-DLI(unstim), 9 Patienten) als auch mit zehn Tage ex vivo IL-2 (1000 U/ml) stimulierten Spender-NK-Zellen (NK DLI(IL-2 stim), 9 Patienten) an den Tagen (+3), +40 und +100 nach haploidenter SZT behandelt. Bisher gibt es kaum Daten über den Verbleib der transfundierten Zellen und den Einfluss der NK-DLI Immuntherapie auf sowohl zelluläre als auch humorale Komponenten des Immunsystems der Patienten. Da die Patienten zudem nach haploidenter SZT zur GvHD-Prophylaxe das immunsuppressive Medikament Mycophenolat-Mofetil (MMF) erhalten, sind Untersuchungen zum Einfluss von MMF auf die Funktionalität der Spender-NK-Zellen von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe eines studienbegleitenden, nichtinvasiven in vivo Immunmonitorings erstmalig ein unterschiedlicher Einfluss von NK-DLI(unstim) im Vergleich zu NK-DLI(IL-2 stim) auf zelluläre Bestandteile und auf die Zytokin/Chemokin-Spiegel des peripheren Blutes der Patienten vor und 10 min, 1 h, 4 h und 24 h nach der Zelltherapie beschrieben. Mittels durchflusszytometrischen single platform Analysen konnten sowohl Spender-NK-Zellen als auch patienteneigene NK-Zellen phänotypisch und funktionell charakterisiert und unterschieden werden. So wurden neben einer gesteigerten zytotoxischen Aktivität IL-2 stimulierter NK-Zellen auch Unterschiede hinsichtlich der Expression des Oberflächenmoleküls CD56, des Aktivierungsmarkers CD69, des Natürlichen Zytotoxizitäts-Rezeptors (NCR) NKp44 und des Lymphknoten Homing Moleküls CD62L beobachtet. Des Weiteren führte die Applikation von NK-DLI(IL-2 stim) zu einer signifikanten Zellmigration in der peripheren Blutzirkulation der Patienten. Während sich die Zahl der neutrophilen Granulozyten innerhalb von 4 h im peripheren Blut vervierfachte wurde unmittelbar 10 min nach NK-DLI(IL-2 stim) ein massiver Zellverlust von eosinophilen Granulozyten, Monozyten, dendritischen Zellen und vor allem der NK-Zellen beobachtet. Eine ausgeprägtere Reduktion der immunregulatorischen CD56(bright)CD16(dim/-) NK-Zellen hatte zudem eine Verschiebung in der prozentualen Verteilung der NK-Zell-Subpopulationen zur Folge. In den folgenden 24 h normalisierten sich alle Zellzahlen wieder zu den Werten vor NK-DLI. Anhand der beschriebenen phänotypischen Unterscheidungsmerkmale konnte gezeigt werden, dass dabei nur patienteneigene NK-Zellen in die periphere Blutbahn zurückkehrten. Die Zellmigration war zudem in vivo von einem signifikanten Anstieg der proinflammatorisch- und chemotaktisch-wirkenden Zytokine/Chemokine IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ, MCP-1 und MIP-1β im peripheren Blut der Patienten 10 min nach NK-DLI(IL-2 stim) Applikation begleitet. Die Applikationen von NK-DLI(unstim) zeigten im Gegensatz dazu keine vergleichbaren Effekte. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob eine Therapie mit dem Immunsuppressivum MMF nach haploidenter SZT die Funktionalität dieser hochaktivierten Spender-NK-Zellen beeinträchtigt und somit die Effektivität der Immuntherapie gefährdet. Es konnten Einschränkungen in der ex vivo Funktionalität der NK-Zellen durch therapeutisch relevante Konzentrationen (1 bis 10 µM) des aktiven Metaboliten Mycophenolsäure (MPA) gezeigt werden. Die MPA-Inkubation führte zu einer dosisabhängigen aber reversiblen Inhibition der IL-2 bedingten ex vivo NK-Zell-Proliferation. Auch die während des ex vivo Expansionsprozesses induzierte Zytokin/Chemokin-Sekretion wurde signifikant gehemmt. Eine 24-stündige MPA-Inkubation der IL-2 stimulierten NK-Zellen führte zudem zu einer eingeschränkten Mobilität der NK-Zellen. Dies korrelierte mit einer signifikant reduzierten zytotoxischen Aktivität gegen K-562 Tumorzellen, was jedoch nicht mit einer Oberflächenreduktion der NCRs und des NKG2D Rezeptors assoziiert war. Auch die durch die IL-2 Stimulation verursachte Hochregulierung der in Aktivierung und Migration involvierten Oberflächenmoleküle CD25, LFA-1, ICAM-1, CCR5, CXCR7, DNAM-1 und CD62L wurde durch MPA inhibiert. Im Gegensatz dazu hatte eine 24-stündige oder 4-tägige MPA-Behandlung bereits vorstimulierter NK-Zellen keinen Einfluss. Zudem konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass die IL-2 induzierte intrazelluläre Signaltransduktion durch MPA beeinflusst wird. Dies äußerte sich in einer partiell bis vollständig inhibierten Phosphorylierung zentraler Signalmoleküle wie STAT-3, -4 und -5, der MAP-Kinase ERK1/2 und der Proteinkinase AKT. Dadurch wurden die durch IL-2 geförderten Zellprozesse wie das Überleben, die Proliferation und die zytotoxische Aktivität der NK-Zellen drastisch gehemmt. Dies steht vermutlich im Zusammenhang mit einer reduzierten Expression der IL-2R Untereinheit (CD25), wodurch die Ausbildung des hochaffinen IL-2-Rezeptors auf der Zelloberfläche verhindert wurde. Demzufolge scheint die eingeschränkte NK-Zell-Effektorfunktion Ursache einer durch MPA gestörten IL-2 Signaltransduktion zu sein. Zusammenfassend scheinen NK-DLI(IL-2 stim) durch die gesteigerte Zytotoxizität, die geringere Sensitivität gegenüber der MPA-Exposition sowie durch die mutmaßliche Extravasation der stimulierten NK-Zellen aus der peripheren Blutbahn einen Vorteil gegenüber NK-DLI(unstim) zu haben. Ob dies auch in einer Steigerung der Effektivität der Immuntherapie resultiert und damit die Prognose der Patienten verbessert werden kann, werden jedoch erst zukünftige Studien mit größeren Patientenkohorten abschließend zeigen können.
Um der Erkennung durch das körpereigene Immunsystem entkommen, weisen Tumore Modifikationen in ihrer Mikroumgebung auf. Zu diesen gehören u. a. veränderte Sauerstoffkonzentrationen im Tumorkern und die Freisetzung biochemischer Faktoren aus Tumorzellen, welche die Funktion von Tumor-assoziierten Phagozyten, wie z.B. Dendritischen Zellen (DC) beeinflussen. DC sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die eine Spezialisierung in verschiedene funktionale Subtypen aufweisen. Myeloische DC (mDC) sind besonders effizient in Hinsicht auf die Präsentation von Antigenen, wohingegen plasmazytoide DC (pDC) regulatorisch auf das Immunsystem einwirken. Beide Subtypen spielen eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese.
Während humane mDC, zur therapeutischen Verwendung, ex vivo aus Monozyten hergestellt werden können, war dies für humane pDC bisher nicht möglich. Ein war deshalb ein erstes Ziel dieser Arbeit, ein Protokoll zur Generierung humaner pDC aus humanen Monozyten zu entwickeln. Diese wurden mittels des Wachstumsfaktors Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt3-L) zu pDC-Äquivalenten differenziert, welche als monocyte-derived pDC (mo-pDC) bezeichnet wurden. In der Tat zeigten mo-pDC ein für humane pDC charakteristisches Oberflächenmarkerprofil und wiesen, im Vergleich zu mDC, eine geringe Kapazität zur Induktion der Proliferation autologer T Zellen und zur Phagozytose apoptotischer Zellen auf. Mo-pDC erwarben im Verlauf ihrer Differenzierung aus Monozyten eine kontinuierlich erhöhte Expression des pDC-spezifischen Transkriptionfaktors E2-2 und seiner spezifischen Zielgene. Der wichtigste funktionale Parameter von pDC ist die Produktion großer Mengen von Interferon-α (IFN-α). Mo-pDC sezernierten, nach vorheriger Aktivierung mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) oder wenn zu ihrer Differenzierung neben Flt3-L auch Vitamin D3 oder all-trans-Retinolsäure verwendet wurde, ebenfalls große Mengen IFN-α. Wurden mo-pDC unter Hypoxie, einem prominenten Faktor der Tumormikroumgebung, generiert, so waren die Expression des spezifischen Transkriptionsfaktors E2-2 und die Freisetzung von IFN-α stark vermindert. Diese Daten zeigten zunächst, dass mo-pDC für das Studium von Differenzierung und Funktion humaner pDC eingesetzt werden können.
Weiterhin lieferten sie Hinweise auf eine veränderte Differenzierung humaner pDC unter Hypoxie. In einem nächsten Schritt wurde folglich untersucht, ob Hypoxie auch die Differenzierung von pDC aus deren physiologischen Vorläufern beeinflusst. Wurden Knochenmarkszellen der Maus mit Flt3-L unter Normoxie oder Hypoxie kultiviert, so war die Differenzierung zu pDC unter Hypoxie in der Tat unterdrückt. Dies war abhängig von der Hypoxie-induzierten Aktivität des Hypoxie-induzierten Faktors 1 (HIF-1), da die Flt3-Linduzierte Differenzierung von murinen Knochenmarkszellen, in denen die Expression von HIF-1 in pDC-Vorläuferzellen ausgeschaltet war, unter Hypoxie normal verlief.
Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass Hypoxie, durch Aktivierung von HIF-1, Differenzierung und Funktion von pDC unterdrückt. Dieser Mechanismus könnte zu ihrer beschriebenen Dysfunktion in humanen Tumoren beitragen.
Neben Hypoxie sind viele andere Faktoren an der Immunsuppression in Tumoren beteiligt.
Eine Komponente der Mikroumgebung in Tumoren ist das Vorhandensein apoptotischer Tumorzellen. Apoptose von Tumorzellen findet, im Kontrast zur generellen Sicht von Tumoren als Apoptose-resistente Entitäten, auch in unbehandelten Tumoren im Überfluss statt. Apoptotische körpereigene Zellen unterdrücken unter physiologischen Bedingungen das Immunsystem. Deshalb könnte das Freisetzen von apoptotischem Material oder die Sekretion von Faktoren aus sterbenden Tumorzellen einen starken Einfluss auf die Funktion von Tumor-assoziierten DC und die damit verbundene Aktivierung von tumoriziden Lymphozyten haben. Eine diesbezügliche Studie war das zweite Ziel der vorliegenden Arbeit. Humane mDC wurden zu diesem Zweck mit Überständen lebender, apoptotischer oder nekrotischer humaner Brustkrebszellen aktiviert und anschließend mit autologen T Zellen ko-kultiviert. Danach wurde das zytotoxische Potential der ko-kultivierten T Zellen analysiert. Interessanterweise unterdrückte die Aktivierung mit Überständen apoptotischer Tumorzellen die DC-vermittelte Generierung tumorizider T Zellen durch die Ausprägung einer Population von regulatorischen T Zellen (Treg), die durch die gleichzeitige Expression der Oberflächenmoleküle CD39 und CD69 charakterisiert war. Die Ausprägung der CD39-und CD69-exprimierenden Treg Zell-Population war abhängig von der Freisetzung des bioaktiven Lipids Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aus apoptotischen Zellen, welches durch den S1P-Rezeptor 4 zur Freisetzung des immunregulatorischen Zytokins IL-27 aus mDC führte.
Neutralisierung von IL-27 in AC-aktivierten Ko-Kulturen von mDC und T Zellen blockierte die Generierung von CD39- und CD69-exprimierenden Treg Zellen und resultierte folglich in der Aktivierung zytotoxischer T Zellen. Weiterhin war die Bildung von Adenosin in den Ko-Kulturen für die Unterdrückung zytotoxischer T Zellen vonnöten. Erste Experimente lieferten Hinweise auf eine direkte Interaktion von CD69- und CD39-exprimierenden Treg Zellen mit CD73-exprimierenden zytotoxischen T Zellen. CD39 und CD73 werden für die Bildung von Adenosin aus ATP benötigt, weswegen die Interaktion von Treg Zellen und zytotoxischen T Zellen die Adenosin-Produktion fördern könnte.
Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Befunde wie Faktoren der
Tumormikroumgebung die Funktion von humanen DC Subtypen beeinflussen können. Ein Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen kann wertvolle Informationen für die Wahl effektiver Immuntherapien oder Chemotherapien liefern und so die Therapie humaner Tumore unterstützen.