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Glutamat ist der häufigste Neurotransmitter im menschlichen Hirn. Die Konzentration des Glutamats in der extrazellulären Flüssigkeit wird durch Glutamat-Transporter (Sekundärtransporter) kontrolliert. Liegt es in zu hoher Konzentration im synaptischen Spalt vor, kommt es zur Schädigung von Nervenzellen, ein Prozess, der als Exzitotoxizität bezeichnet wird. Eine Fehlfunktion oder fehlerhafte Produktion der Glutamat-Transporter im zentralen Nervensystem wird bei verschiedenen Krankheiten, wie der amyotrophen Lateralsklerose, der Ischämie, der Epilepsie, der Schizophrenie und der Alzheimer-Krankheit vermutet. Ziel dieser Arbeit war die Funktions- und Strukturanalyse der Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus und GltP aus E. coli, um die Familie der Glutamat-Transporter und die Entstehung der mit diesen Transportern in Verbindung gebrachten Krankheiten besser zu verstehen. Um die für diese Analysen gebrauchten Mengen an Protein herzustellen, mussten die Proteine heterolog produziert werden, da sie in natürlichen Geweben nicht in ausreichender Menge vorkommen. In dieser Arbeit wurde Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus funktional mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem überproduziert. Dazu wurden verschiedene Vektorkonstrukte hergestellt. Die routinemäßige Überproduktion des Transporters wurde im 8 l - Maßstab durchgeführt. In Zellen, die für die Produktion von GLT-1 mit rekombinanten, aktiven SF-Viren infiziert wurden, konnte eine sehr hohe Aktivität des Glutamat-Transporters nachgewiesen werden. Die Menge des hergestellten GLT-1 wurde in Bindungsexperimenten mit (2S,4R)-4-Methylglutamat quantifiziert: jede Zelle enthielt 3,5 x 106 Transporter: 61,04 pmol GLT-1/mg Gesamtprotein. Das entspricht einer Ausbeute von etwa 2-3 mg/8 l Zellkultur. Die hier durchgeführte Überproduktion des GLT-1-Glutamat-Transporters ist die erste Überproduktion eines eukaryotischen Sekundärtransporters mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem, bei dem große Mengen an aktivem Protein hergestellt werden konnten. Zudem ist die Ausbeute an funktionalem GLT-1 mit 61 pmol/mg Gesamtprotein verglichen mit den in der Literatur vorliegenden Daten zur Überproduktion eukaryotischer sekundärer Transporter mit anderen Expressionssystemen die höchste, die bis dato erreicht werden konnte. Der größte Anteil des heterolog produzierten GLT-1 war glykosyliert. Die gelelektrophoretische Analyse des aufgereinigten Transporters ergab zwei Banden, die ein apparentes Molekulargewicht von etwa 70-75 kDa und etwa 53-58 kDa hatten. In einer Western-Blot-Analyse konnten beide Banden des GLT-1-Transporters mit einem anti-His-Antikörper und einem anti-GLT-1-Antikörper nachgewiesen werden. Durch Deglykosylierung mit PNGase F und einer Trennung beider Banden durch Lektin-Affinitätschromatographie konnte gezeigt werden, dass es sich bei der 70-75 kDa-Bande um die glykosylierte Form und bei der 53-58 kDa-Bande um die nicht glykosylierte Form des Glutamat-Transporters handelte. Es wurde gezeigt, dass zwischen der Aktivität des GLT-1 und dessen Glykosylierung kein Zusammenhang besteht. Denn beide Formen lagen als vollständige, funktionale Transporter vor und transportierten nach Rekonstitution in Liposomen Glutamat. Der prokaryotische Glutamat-Transporter GltP aus E. coli wurde in dem E. coli-Stamm C43 (DE3) überproduziert. Die Ausbeute war etwa 2 mg pro Liter Kultur. Die Funktionalität des Transporters nach Rekonstitution in Lipidvesikel wurde durch spezifische Aufnahme von Glutamat gezeigt. Für die Solubilisierung beider Transporter aus den Zellmembranen wurden verschiedene Detergentien getestet. GltP ließ sich am besten mit DM oder DDM aus der Membran extrahieren, für die Solubilisierung des GLT-1 wurde mit großer Effizienz DDM oder CYMAL-7 eingesetzt. GltP und GLT-1 wurden mit einer Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie in großer Menge und hoher Reinheit angereichert werden. Die Aufreinigungsprozedur beeinträchtigte nicht die Funktionalität des prokaryotischen GltP. Bei dem eukaryotischen Transporter GLT-1 war nach der Ni2+-NTA-Säule keine Transportaktivität mehr messbar. Durch Zusatz von Asolectin in den Wasch- und Elutionspuffern während der Aufreinigung konnte die Funktionalität des Transporters jedoch erhalten werden. Aufreinigungen mit anderen Lipiden unter anderem in Kombination mit Cholesterin lieferten einen Glutamat-Transporter, der in seiner Konformation stabilisiert, jedoch nach Rekonstitution nicht aktiv war. Eine weitere Steigerung der Ausbeute an aktivem GLT-1 konnte durch den Einsatz von Reduktionsmitteln, wie DTT oder b-Mercaptoethanol, die die Aggregation des Transporters verhinderten, erreicht werden. GltP katalysiert den elektrogenen Transport von Glutamat bzw. Aspartat unter Symport von mindestens zwei Protonen. GLT-1 transportiert ein Molekül Glutamat zusammen mit drei Na+-Ionen und einem Proton im Austausch gegen ein K+-Ion. Durch Transportmessungen konnte der hochspezifische Glutamat-Transport der aufgereinigten Transporter belegt werden. Der Glutamat-Transport des in Liposomen rekonstituierten GltP zeigte eine klare Abhängigkeit von einem anliegenden Protonengradienten. Aufgereinigtes und rekonstituiertes GLT-1 transportierte nur Aspartat bzw. Glutamat, wenn ein Na+ und ein K+-Gradient vorhanden waren. Die Aspartat- bzw. Glutamat-Aufnahme konnte bei beiden Transportern durch den kompetitiven nichttransportablen Inhibitor (2S,4R)-4-Methylglutamat blockiert werden. Der Assoziationsgrad der Glutamat-Transporter GltP und GLT-1 und das Gleichwicht zwischen den verschiedenen oligomeren Zuständen wurde in dieser Arbeit eingehend mit biochemischen Methoden untersucht: 1. „Cross-linking“-Studien, 2. Blaue Nativgelelektrophorese, 3. Analytische Ultrazentrifugation, 4. Laserlichtstreuung, 5. Gelfiltrationschromatographie. Die dabei erhaltenen Ergebnisse bewiesen eine tetramere Assoziierung beider Proteine. Die Gelfiltrationsexperimente zeigten, dass die Transporter in Detergenzlösung in unterschiedlichen Assoziationsgraden vorliegen. Das Gleichgewicht zwischen den oligomeren Formen war reversibel und abhängig von der Art und Konzentration des Detergenz, der Proteinkonzentration und der Temperatur. Zur Untersuchung der Struktur der Glutamat-Transporter wurden vor allem mit GltP zahlreiche 2D-Kristallisationsexperimente durchgeführt. Trotz Variation aller denkbar möglichen Parameter konnten keine Kristalle erhalten werden. Das beste Ergebnis war ein guter Einbau des Proteins in Lipidvesikel (etwa 80%). Da keine Kristalle erhalten wurden, wurde für beide Proteine eine Einzelpartikelanalyse durchgeführt. Dabei wurde nach zweidimensionaler Alignierung und Klassifizierung die „random conical tilt“-Methode angewendet. Die daraus resultierenden dreidimensionalen Dichtekarten des GltP und GLT-1 waren sehr ähnlich und wiesen vier nicht exakt symmetrische Massen in annähernd quadratischer Anordnung auf. Die Auflösung war 26 Å bzw. 36 Å. Die Größe der Einzelpartikel (für GltP: Höhe 37 Å, Breite 75 Å bzw. 86 Å, Länge 100 Å). ihre annähernd quadratische Anordnung und ihre Symmetrie lassen vermuten, dass es sich dabei um Tetramere der Glutamat-Transporter handelt, die aus zwei nicht symmetrischen Dimeren zusammengesetzt sind. Die hier präsentierten Daten sind die ersten zur dreidimensionalen Struktur von Glutamat-Transportern. Schließlich wurde nachgewiesen, dass der in BHK-Zellen heterolog exprimierte Glutamat-Transporter GLT-1 vorwiegend in „lipid rafts“ lokalisiert ist. Die Größe der „rafts“, die anhand der Größe der „Proteininseln“ in Gefrierbrüchen bestimmt wurde, war etwa 200 nm im Durchmesser. Die „GLT-1-Inseln“ bzw. „lipid rafts“ konnten durch das teilweise Entfernen von Cholesterin aus der Membran zerstört werden. Damit ging eine Reduktion der Glutamat-Transporter-Aktivität von etwa 20% einher. Es ist das erste Mal, dass „lipid rafts“ durch die natürliche Assemblierung von Proteinen mit Hilfe von Gefrierbruchanalysen und Elektronenmikroskopie beobachtet wurden.
1. Die beiden Spargelkäfer sind über die Spargelkulturen fast der ganzen Erde verbreitet. 2. Morphologische Unterschiede zwischen den zwei Arten: Körperform, Färbung, Zeichnung. Insbesondere Cr. asparagi zeigt eine außerordentlich starke Variation des Flügeldeckenmusters. Das Material aus unserem hessischen Beobachtungsgebiet wurde daraufhin an anderer Stelle von mir vergleichend untersucht. Beide Käfer besitzen ein Stridulationsorgan (daher "Zirpkäfer"), dessen Bau und Wirkungsweise beschrieben werden. Vasa Malpighi bei Cr. 12punctata schwarzbraun, bei Cr. asparagi weiß. Weibliche Genitalorgane: Ovarien mit durchschnittlich je 12 telotrophen Ovariolen, Receptaculum seminis, keine Anhangsdrüsen; Unterschiede bei beiden Arten in der Form des Receptaculums und vor allem im Bau des Ohitingerüstes. Ein Weibchen bringt etwa 70-100 Eier hervor. Männliche Genitalorgane : Lebhaft dunkelgelb gefärbte, annähernd kugelige Hoden, Vasa deferentia mit je zwei verschieden geformten Drüsen, unpaarer Ductus innerhalb des Penisgerüstes zur Ampulle erweitert. 3. Biologische Unterschiede der beiden Arten: "Hähnchen" mehr eurytherm, größere Neigung zum "Totstellen", Antennen in der Ruhe parallel nach vorne gerichtet, geringere Thigmotaxis, früherer Beginn der Eiablage; die bräunlich schwarzen Eier werden mit dem einen Pol an die Pflanze geklebt. Larve im allgemeinen dunkel grünlichgrau, Kopf schwarz. "Zwölfpunkt" lebhafter, neigt mehr zum Abfliegen, Antennen in der Ruhe in spitzem Winkel nach vorne gerichtet; die helleren, bräunlich grünen Eier werden der Länge nach an die Zweige geklebt. Larve (ob durchwegs?) schmutziggelb mit gelber Kopfkapsel. Wenigstens in der zweiten Generation in den Spargelbeeren lebend. Beide Arten haben höchstwahrscheinlich doppelte Generation. Überwinterung als Käfer am Boden, unter Pflanzenresten, in Spargelstrünken usw. 4. Die Käfer und besonders ihre Larven skelettieren durch ihren Fraß die grünen Spargeltriebe, indem sie sie ihres Chlorophylls berauben. Die dadurch am meisten gefährdete Altersstufe ist die einjährige Pflanze.
Über ein cretaceisches Geschiebe mit Rhizocorallium Gläseli n. sp. aus dem Diluvium bei Leipzig
(1913)
Die vorliegende Arbeit soll einen Beitrag zur Biologie der Honigbiene darstellen. Sie ist zunächst eine biologisch-deskriptive Arbeit. Ich habe die Biene bei ihrer mannigfachen Tätigkeit in freier Natur wie auch in ihrem Stocke beobachtet und habe festzustellen versucht, wie sie sich verhält, wenn ihr Körper mit irgendeinem Schmutzstoff in Berührung kommt. ...
1. Die Feldbeobachtungen der vorliegenden Untersuchung sind in der Zeit vom 10. VII. bis 9. VIII. 1964 in Westspitzbergen in den Gebieten von Isfjorden und Hornsund (Abb. 2) gemacht worden. Die Fjeldheidevegetation wurde auf 58 Probeflächen von je 25 m2 untersucht. 2. Bei der Besprechung der Fjeldheidevegetation wird zunächst der Begriff »Fjeldheide» definiert und mit dem Begriff »Tundra» verglichen. Zugleich wird die Zonität der (oro)arktischen Vegetation erörtert und mit den in Grönland, Fennoskandien und Nowaja Semlja vorgenommen Zoneneinteilungen verglichen. Im Rahmen der Dreizoneneinteilung der (oro)arktischen Vegetationszone werden in Spitzbergen die mittel- und die oberoroarktische Stufe angetroffen. 3. In der untersuchten Fjeldheidevegetation wurden 5 Artengruppen und entsprechend 5 Heidetypen herausgearbeitet: 1. Deflations-, 2. Flechten-, 3. trockene und 4. frische Moosheide sowie 5.Schneebodenstellen. Die Grenze zwischen den Typen und auch zwischen den innerhalb eines jeden Typs anzutreffenden Westküsten- und Binnengebietvarianten sind fliessend. Das Westküstengebiet umfasst die Untersuchungsstellen 1-6, das Binnengebiet (=Innenfjord- und Binnenlandgebiet) die Punkte 7-20. 4. Das Westküstengebiet gehört vorwiegend ins Bereich der metamorphierten, das Binnengebiet wiederum ins Gebiet der nicht metamorphierten Gesteine. Für die Entstehung der die obigen Gebiete charakterisierenden Varianten wird jedoch nach meiner Meinung dem Grossklima die ausschlaggebende Bedeutung beigemessen. Die Westküste ist hygrisch und thermisch ozeanischer als das Binnengebiet (Abb. 6). Dieser Umstand macht sich in der Vegetation auch in den Mangenverhältnissen der Typen geltend: an der Westküste viele Deflationsheiden und SchneebodensteIlen (siehe S. 43). Ferner ist die Höhengrenze der mittelarktischen Stufe an der Westküste tiefer (siehe S. 43). Die Phänologie der Pflanzen lässt an der Westküste Verspätung der Entwicklung erkennen (siehe Tab. 9 und 10). An der Westküste steht die Fjeldheidevegetation auf gröberem Untergrund (siehe Tab. 8), und das Eis reicht weiter herunter als im Binnengebiet. 5. Beim Vergleich der Fjeldheidetypen miteinander wurden Unterschiede in der Dicke des Auftaubodens und in der Phänologie der Pflanzen beobachtet, welche Umstände mit der Dicke der Schneedecke zusammenhängen dürften. Die Dicke des Auftaubodens wird zu den frischen Moosheiden hin geringer und nimmt dann an den SchneebodensteIlen wieder zu (Tab. 8). Die Entwicklung der Pflanzen setzt umso zeitiger ein, je trockener der Typ ist (Tab. 9 und 10). 6. Mit Hilfe der Literatur wird der Versuch gemacht, Vegetationen ausfindig zu machen, die sich mit den Fjeldheidetypen Spitzbergens identifizieren (= Horistisch gleichartig sind; vgL Abb. 11) oder vergleichen lassen (= floristisch andersartig, aber an mehr oder minder gleichartigen Standorten). Zusammenfassend wird hauptsächlich anhand der Literatur ein vorläufiger Vorschlag für die Vegetations gebiete Spitzbergens gemacht (Abb. 10).
Die Wege, die zur Erreichung homozygoter Bestände führen, sind die Inzucht und die Selektion. In der bisher über das Inzuchtgeschehen vorliegenden Literatur ist der stets gleichzeitig wirksame Einfluß der Selektion mit einer Ausnahme (Robbins 21) unberücksichtigt gelassen. Um zu einem möglichst exakten Vergleichsmaßstab zwischen Erwartung und Beobachtung bei Inzuchtversuchen zu kommen, muß die Selektion mit einbezogen werden. Es wurde sowohl für 1 als auch 2 Anlagenpaare unter jeweiliger Aufstellung eines Systems von Differenzengleichungen die prozentuale Zunahme der reinerbigen Individuen bei Geschwisterpaarung + Selektion nach dem Dominantphänotyp ermittelt. Zum Vergleich der anteiligen Häufigkeit der reinerbigen Individuen in den einzelnen Generationen wurde bei 1 Anlagenpaar die Selektion und die Geschwisterpaarung, bei 2 Anlagenpaaren nur die Selektion herangezogen. Der Prozentsatz der homozygoten Individuen liegt bei Geschwisterpaarung + Selektion jeweils über dem bei ausschließlicher Selektion oder Geschwisterpaarung. Um einen zu 99 % homozygoten Bestand zu erhalten, sind im Falle der Monohybridspaltung bei Selektion 198 Generationen, bei Geschwisterpaarung 20 Generationen und bei Geschwisterpaarung + Selektion 12 Generationen notwendig; im Falle der Dihybridspaltung benötigt die Selektion 396 Generationen, die Geschwisterpaarung + Selektion 14 Generationen. Bei Selektion nach dem Dominantphänotyp ist die zur Erreichung eines bestimmten Homozygotenprozentsatzes notwendige Generationenzahl eine lineare Funktion der Zahl der Anlagenpaare. Zum Beispiel gilt y = 19S x; dabei bedeutet x die Zahl der Anlagenpaare und y die Anzahl der Generationen, die notwendig ist, damit der Bestand zu 99% aus Homozygoten besteht. Die Schaffung erbreiner Bestände würde wesentlich b!=günstigt sein, wenn man einige erbreine Tiere kennen würde. Zur Prüfung eines Tieres auf seine Erbveranlagung werden in der Literatur 1. Paarung an die rezessive Form, 2. Paarung an sichere Heterozygote und 3, Paarung an eigene Nachkommen angegeben. Für diese 3 Verfahren ist die notwendige Mindestzahl von Nachkommen von nur dominante Phänotyp bei Monohybridspaltung bereits berechnet. Es wurden die entsprechenden Werte für Dihybridspaltung errechnet und gleichzeitig die Geschwisterpaarung mit einbezogen. Die sich für 2 Anlagenpaareergebendcn Werte liegen nur um ein Geringes höher als die entsprechenden bei einem Anlagenpaar. Bei Geschwisterpaarung werden weniger Anpaarungen benötigt als bei Eltern-Nachkommenpaarung; die erstere Form der Prüfung ist bei uniparen Tieren nicht durchführbar. Abschließend kann man sagen, daß es durchaus möglich ist auch bei den Haustieren erbreine Stämme in zum mindesten 2 Anlagenpaaren planmäßig herauszüchten. Gelingt es nicht, nach einem der entwickelten Genotypprüfungsverfahren einzelne in den gewünschten Erbanlagen erbreine Individnen festzustellen, so ist immer durch Inzucht und planmäßige Selektion - allerdings erst in durchschnittlich längerer Zeit - die Möglichkeit gegeben, solche in größerer Zahl zu erhalten. Für polyhybrid geartete ZüchtuDgsaufgaben kann man eine Aufgabe nach der anderen lösen. Hat man z. B. einen Bestand von der genetischen Konstitution AaBbCcDdEe, dann faßt man zunächst nur 2 Anlagenpaare ins Auge - etwa AaBb - und schafft sich die Tiere, welche in diesen beiden Faktorenpaaren homozygot sind - alle anderon merzt man. Nun geht man zu den nächsten 2 Faktorenpaarcn - CcDd - über und züchtet auf die gleiche Weise AABBOCDD-Tiere. Der Zufall könnte es wollen, daß man gleichzeitig in dem Faktorenpaar EE .homozygote Tiere erhält. Ist dies aber nicht der Fall, so kann man nun in höchstens 2 Schritten auch in dem Anlagenpaar EE homozygote Individuen herauszüchten. Also auch in dem Fall des Polyhybridismus kann man nach und nach erbreine Stämme erhalten. Wünschenswert wäre es allerdings, wenn man auch für den Fall der Mehranlagigkeit möglichst exakte Vergleichsmaßstäbe für die Beurteilung der Inzucht- und Auslesevorgänge haben würde. Es wird eine spätere Aufgabe sein die prozentuale Zunahme der Homozygotie bei Geschwisterpaarung für 2 Anlagenpaare zu ermitteln und dieselben Untersuchungen auf 3 Anlagenpaare auszudehnen. Dann läßt sich vielleicht schon eine Abhängigkeit von der Anzahl der Anlagenpaare erkennen und der Prozentsatz der Homozygoten in einem Bestand bei Inzucht- und Selektionsversuchen als Funktion der Anzahl der Anlagenpaare und der Generationenzahl darstellen. Ferner wird es notwendig sein, die gleichen Untersuchungen unter verschiedenen Selektionsvoraussetzungen und auch für verschiedene Arten der Verwandtschaftspaarung durchzuführen. Schließlich ist bei all diesen Untersuchungen noch ein Moment unerwähnt geblieben: Es kann der Fall eintreten, daß mehrere Genpaare miteinander gekoppelt sind; folglich bleibt auch noch die Abhängigkeit vom Koppelungsgrad zu ermitteln. Aus diesen kurzen Hinweisen geht schon hervor, daß die Mathematik noch viel Arbeit zu leisten hat, damit der Biologie das Rüstzeug erhält, welches er für eine exakte Beurteilung der überall wirksamen Inzucht- und Auslesevorgänge benötigt.