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The reggie protein family consists of two homologous members, reggie-1 and reggie-2, also termed flotillin-2 and flotillin-1, respectively, that are ubiquitously expressed and evolutionarily well conserved, suggesting an important but so far ill-defined function. In various cell types, both reggies have been found to be constitutively associated with lipid rafts by means of acylation modifications and oligomerization. Lipid rafts are glycosphingolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains which have been implicated in several cellular processes including membrane transport and signal transduction through growth factor receptors. However, the molecular details of these processes are still poorly understood. With the observation that reggies colocalize with activated glycosylphosphatidylinositolanchored proteins (GPI-APs) and Fyn kinase in rafts, a role for these proteins in signaling events has been suggested. In agreement with that, we have previously shown that reggie-1 becomes multiply tyrosine phosphorylated by Src kinases in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation, pointing to a function for reggie-1 in growth factor signaling. Furthermore, overexpression of reggie-1 enhances spreading on fibronectin substrate in a tyrosine-dependent manner, thus revealing a role for reggie-1 in regulation of actin cytoskeleton through growth factor receptors. Due to the similarity shared by reggie proteins at amino acid level and to their ability to form hetero-oligomeric complexes, the first aim of this study was to analyze the putative tyrosine phosphorylation of reggie-2 in growth factor stimulated cells. Similarly to reggie-1, reggie-2 was found to be multiply tyrosine phosphorylated by Src kinase and to exist in a molecular complex with Src, with the degree of co-immunoprecipitation dependent on the activity of Src. Recent studies from us have also shown that administration of EGF results in the endocytosis of reggie-1 from the plasma membrane into endosomes, which is in line with a proposed role for reggies in membrane trafficking processes. In order to characterize in detail the endocytic mechanism that mediates the uptake of reggie-1, the dependency of reggie-1 endocytosis on clathrin and dynamin was investigated by means of overexpressing a variant form of Eps15 or a dominant negative form of dynamin-2. In either case the translocation of reggie-1 into endosomes in response to EGF was not affected, and this, together with the results that reggie-1 colocalized with cholera toxin (CTX) but not with transferrin receptor (TfnR) during EGF signaling, indicates that reggie-1 is taken up by means of a dynaminindependent, raft-mediated pathway. These findings are very well in line with recent data showing the pathway of entry into cells of reggie-2 as a raft-mediated endocytic pathway. The endocytosis of reggie-2 in response to EGF was also analyzed in this study. Similarly to reggie-1, in growth factor stimulated cells reggie-2 underwent a translocation from the plasma membrane to endosomes where the two reggies were found to colocalize with each other, suggesting that epidermal growth factor signaling might trigger the endocytosis of reggie oligomers. In addition, colocalization with both the late endosomal marker LAMP3/CD63 and epidermal growth factor receptor (EGFR) was detected, again indicating a function for reggies in signal transduction through growth factor receptors. EGFR has been reported to localize in rafts but, although this association is thought to be functional during EGF stimulation, how segregation of EGFR into rafts modulates its endocytosis and signaling is still under debate. Since reggie oligomers have recently been suggested to define a raft subtype, a further aim of this study was to investigate whether the depletion of reggies by means of small interfering RNA could interfere with the signaling and the trafficking through EGFR. Knockdown of reggie-2 resulted in an altered tyrosine phosphorylation of EGFR in response to EGF, while the degree of ubiquitination was not affected. Less efficient phosphorylation of tyrosine residues, especially of those which are docking sites for Grb2 and Shc, led in turn to an impaired activation of p38 and ERK1/2 MAPKs. Depletion of reggie-2 did not affect the early trafficking of activated EGFRs, with receptors being endocytosed and delivered to late endosomes as efficiently as in control cells. This would be in line with the normal degree of ubiquitination observed for EGFR, as ubiquitin moieties have been proposed to represent sorting tags that ensure receptor endocytosis into early endosomes and its proper intracellular trafficking. On the contrary, after prolonged EGF stimulation, depletion of reggie-2 resulted in a decreased downregulation of both receptor-bound ligand and EGFR, and in their accumulation in intracellular vesicles, thus pointing to a role for reggie-2 in the degradative pathway. Taken all together, these data ndicate that the association of EGFR with reggie-microdomains is likely to be important for proper receptor trafficking and signaling.
Das Leben aller Organismen wird grundlegend durch den tages- und jahreszeitlich bedingten Wechsel der Beleuchtungsverhältnisse geprägt. Die Anpassung der Stoffwechselprozesse und Verhaltensweisen an diese Oszillationen erfolgt nicht passiv, sondern wird durch eine innere Uhr gesteuert. Tageszeitliche Rhythmen, die auch ohne den Einfluss äußerer, periodisch verlaufender Umgebungsreize (Zeitgeber) ablaufen, werden als zirkadiane Rhythmen bezeichnet. Im Säugetier steuert ein endogener Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) zirkadiane Rhythmen, indem er periphere Oszillatoren miteinander synchronisiert. Auf molekularer Ebene besteht dieser endogener Rhythmusgenerator aus Aktivatoren (BMAL1 und CLOCK/NPAS2) und Inhibitoren (PER1/2 und Cry1/2), die in Rückkopplungsschleifen die Grundlage für die Rhythmogenese steuern. Die Synchronisation dieses molekularen Uhrwerkes an die Umgebungszeit erfolgt durch Licht, das in der Retina wahrgenommen und an das SCN weitergeleitet wird. Die Signaltransduktionskaskaden nach einem Lichtpuls in der frühen und der späten Nacht unterscheiden sich dabei wesentlich: Ein Lichtpuls während der frühen Nacht führt zu einer erhöhten Freisetzung von Ca2+-Ionen über Ryanodin Rezeptoren (RYR), während ein Lichtpuls während der späten Nacht zu einer erhöhten Guanylylcyclase Aktivität führt. Um zu untersuchen, wie der endogene Rhythmusgenerator seinen Lichteingang reguliert, wurde die Licht-vermittelte Phasenverzögerung in BMAL1+/+- (profizienten) und BMAL1-/-- (defizienten) Mäusen untersucht. Die Befunde aus den in-situ Hybridisierungsstudien, RTQ-PCR und immunhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass in BMAL1-/--Mäusen die Licht-induzierte mPer-Expression während der frühen Nacht selektiv beeinträchtigt ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass die mRNA- und Proteinmengen von RYRs in BMAL1-/--Mäusen dramatisch reduziert waren. Ryr1:: und Ryr2::Luciferase-Reportersstudien zeigten darüber hinaus, dass die Ryr-Expression durch CLOCK/BMAL1 aktiviert und durch CRY1inhibiert werden kann. Diese Ergebnisse liefern den ersten Beweis dafür, dass der endogene Rhythmusgenerator des Säugers die Signalübertragung seines eigenen Lichteingangs regulieren kann. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und in einem Melatonin-abhängigen peripheren Oszillator, der PT, untersucht und miteinander verglichen. Dazu wurden die Uhrengenproteine im fetalen (E18), postnatalen (P2 & P10) und adulten SCN und in der PT von C3H-Mäusen zu vier verschiedenen zirkadianen Zeitpunkten mittels Immunhistochemie untersucht. Die Anzahl immunreaktiver SCN-Zellen gegen alle untersuchten Uhrengenproteine (außer BMAL1) war im Fetus signifikant niedriger, als in der adulten Maus. Auch im SCN neonataler (P2) Mäuse erreichte die Anzahl immunreaktiver Zellen noch nicht das Niveau der adulten Maus. Erst 10 Tage nach der Geburt (P10) zeigen alle Uhrengenproteine im SCN ein adultes Verteilungsmuster. Offenbar reift das Uhrwerk im SCN von Mäusen graduell während der postnatalen Entwicklungsphase. Dabei besteht eine zeitliche Korrelation zwischen der Reifung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und der Ausbildung von inter-suprachiasmatischen und retino-suprachiaamatischen neuronalen Kontakten. Im Gegensatz zum SCN zeigte der Melatonin-abhängigen Oszilllator in der PT bereits im Fetus einen nahezu vollständig ausgeprägten Rhythmus der Uhrengenproteine. Da das fetale Pinealorgan noch nicht zur rhythmischen Melatonin-Synthese fähig ist, liegt es nahe, dass das mütterliche Melatonin die rhythmische Expression der Uhrengene in der fetalen PT reguliert. Wie in vitro Untersuchungen an PER2::LUCIFERASE-Mäusen zeigten, hat das mütterliche Melatonin offenbar auch einen modulierenden Einfluss auf den fetalen SCN. Bei diesen Mäusen konnte im fetalen und postnatalen SCN ein zirkadianer Rhythmus in der PER2-Synthese nachgewiesen werden, der eine relativ lange Periodenlänge aufwies und nach 3 Tagen zum Erliegen kam. Eine Stimulation mit Melatonin führte zu einer deutlichen Verkürzung der Periodenlänge im PER2-Rhythmus. Folglich scheint das mütterliche Melatonin eine wichtige Quelle für Informationen der Umgebungszeit im Fetus zu sein. Um die Uhrengenexpression während der Maus-Ontogenese in vitro auf zellulärer Ebene darzustellen, wurde in dieser Arbeit zudem ein vom murinen Per2-Promoter angetriebenes DsRed- Reportersystem etabliert und der Versuch begonnen, eine darauf basierende transgene Maus zu generieren.
Reggie-1 (flotillin-2) and reggie-2 (flotillin-1) are membrane microdomain proteins which are associated with the membrane by means of acylation. They influence different cellular signaling processes, such as neuronal, T-cell and insulin signaling. Upon stimulation of the EGF receptor, reggie-1 becomes phosphorylated and undergoes tyrosine 163 dependent translocation from the plasma membrane to endosomal compartments. In addition, reggie-1 was shown to influence actindependent processes. Reggie-2 has been demonstrated to affect caveolin- and clathrin-independent endocytosis. Both proteins form homo- and hetero-oligomers, but the function of these oligomers has remained elusive. Moreover, it has not been clarified if functions of reggie-1 are also influenced by reggie-2 and vice versa. The first aim of the study was to further investigate the interplay and the heterooligomerization of reggie proteins and their functional effects. Both reggie proteins were individually depleted by means of siRNA. In different siRNA systems and various cell lines, reggie-1 depleted cells showed reduced protein amounts of reggie-1 and reggie-2, but reggie-2 knock down cells still expressed reggie-1 protein. The decrease of reggie-2 in reggie-1 depleted cells was only detected at protein but not at mRNA level. Furthermore, reggie-2 expression could be rescued by expression of siRNA resistant wild type reggie-1-EGFP constructs, but not by the soluble myristoylation mutant G2A. This mutant was also not able to associate with endogenous reggie-1 or reggie-2, which demonstrates that membrane association of reggie-1 is necessary for hetero-oligomerization. In addition, fluorescence microscopy studies and membrane fractionations showed that correct localization of overexpressed reggie-2 was dependent on co-overexpressed reggie-1. Thus, hetero-oligomerization is crucial for membrane association of reggie-2 and for its protein stability or protein expression. Moreover, the binding of reggie-2 to reggie-1 required tyrosine 163 of reggie-1 which was previously shown to be important for endosomal translocation of reggie-1. Since reggie-2 was implicated to function in clathrin- and caveolin-independent endocytosis pathways, the effect of reggie-2 depletion on reggie-1 endocytosis was investigated. Indeed, reggie-1 was dependent on reggie-2 for endosomal localization and EGF-induced endocytosis. By FRET-FLIM analysis it could be shown that reggie heterooligomers are dynamic in size or conformation upon EGF stimulation. Thus, it can be concluded that reggie proteins are interdependent in different aspects, such as protein stability or expression, membrane association and subcellular localization. In addition, these results demonstrate that the hetero-oligomers are dynamic and reggie proteins influence each other in terms of function. A further aim was the characterization of reggie-1 and reggie-2 function in actindependent processes, where so far only reggie-1 was known to play a role. Depletion of either of the proteins reduced cell migration, cell spreading and the number of focal adhesions in steady state cells. Thus, also reggie-2 affects actin-dependent processes. Further investigation of the focal adhesions during cell spreading revealed that depletion of reggie-1 displayed different effects as compared to reggie-2 knock down. Reggie-1 depleted cells had elongated cell-matrix-adhesions and showed reduced activation of FAK and ERK2. On the other hand, depletion of reggie-2 resulted in a restricted localization of focal adhesion at the periphery of the cell and decreased ERK2 phosphorylation, but it did not affect FAK autophosphorylation. Hence, reggie proteins influence the regulation of cell-matrix-adhesions differently. A link between reggie proteins and focal adhesions is the actin cross-linking protein -actinin. The interaction of -actinin with reggie-1 could be verified by means of co-immunoprecipitations and FRET-FLIM analysis. Reggie-1 binds -actinin especially in membrane ruffles and in other locations where actin remodeling takes place. Moreover, -actinin showed a different localization pattern during cell spreading in reggie-1 depleted cells, as compared to the control cells. These results provide further insights into the function of both reggie proteins. Their interplay and hetero-oligomerization was shown to be crucial for their role in endocytosis. In addition, both reggie proteins influence actin-dependent processes and differentially affect focal adhesion regulation.
Das Volumen von tierischen Zellen ist durch äußere und innere Einflüsse Veränderungen unterworfen. Um die zelluläre Homöostase zu gewährleisten und bedrohliche Volumenänderungen zu verhindern, verfügen die meisten Zellen daher über regulatorische Mechanismen zur Verringerung (regulatory volume decrease, RVD) oder Erhöhung (regulatory volume increase, RVI) des Zellvolumens. Darüber hinaus finden diese Mechanismen auch im Rahmen physiologischer Prozesse, wie z. B. der Zellbewegung oder der Proliferation Verwendung. Der RVD erfordert einen Sensor-Mechanismus, der die Veränderung des Zellvolumens registriert. Die nachfolgende Signaltransduktion führt zur Aktivierung von Transportmechanismen, die v. a. dem Export von K+- und Cl--Ionen, aber auch organischen Osmolyten, dienen und zum Ausstrom von Wasser aus der Zelle führen, bis das Sollvolumen erreicht ist. Bisher ist noch nicht sicher, welcher Mechanismus den RVD einleitet; in verschiedenen Geweben wurden Hinweise auf mehrere mögliche Kandidaten gefunden. In dieser Arbeit wurde der RVD von HaCaT-Zellen, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie hinsichtlich der Beteiligung des Aktin-Zytoskeletts mit mikroskopischen, pharmakologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. HaCaT-Zellen schwellen in hypotonem Medium schnell an (30 s) und führen einen RVD durch, der nach ca. 5 min das Ausgangsvolumen wieder herstellt. Der RVD von HaCaT-Zellen ist vom Einstrom extrazellulärer Ca2+-Ionen abhängig. Dieser Einstrom erfolgt durch einen Kanal, der durch die Inhibitoren von stretch activated channels (SAC) Gd3+ und GsMTx-4, sowie den spezifischen Inhibitor des transient receptor potential vaniloid 4 (TRPV4), Rutheniumrot, gehemmt werden kann. TRPV4 wird in HaCaT-Zellen exprimiert. Der RVD und der damit verbundene Einstrom von Ca2+-Ionen, nicht aber das Anschwellen der Zellen werden durch den Abbau des Aktin-Zytoskeletts durch 2 μM Cytochalasin D (CD) gehemmt. Die Hemmung durch CD ist reversibel; nach dem Entfernen von CD bildet sich innerhalb von 30 min erneut ein Netzwerk von Aktinfilamenten aus. Ein zwei-stufiges Absenken der Osmolarität (jeweils ca. 20%), zunächst in Anwesenheit von CD führt zu einer Volumenzunahme, löst aber keinen RVD aus. Auch nach dem Entzug von CD bleibt das Volumen konstant erhöht. Erst das zweite Absenken löst eine Volumenregulation aus, allerdings nur bis zu dem Volumen, das nach dem Entfernen von CD etabliert war. Die mikroskopische Struktur des Aktin-Zytoskeletts von HaCaT-Zellen ändert sich während des RVD kaum. Durch die Messung der Fluoreszenz von gebundenem Rhodamin-Phalloidin konnte ein vorübergehender Anstieg der Menge von Aktinfilamenten (F-Aktin) während des RVD gezeigt werden. Ein quantitativer biochemischer Ansatz zeigt, dass die relative Menge des Triton- X-100-löslichen Anteils des Aktin-Zytoskeletts im gleichen Zeitraum zunimmt. Der RVD von HaCaT-Zellen hängt ebenfalls von der Geschwindigkeit der Osmolaritätsänderung ab; die langsame Verringerung der Osmolarität (≤ 5 mosM/min) führte zum Anschwellen, nicht aber zum RVD. Auf Basis der erzielten Ergebnisse wird ein Modell für den RVD von HaCaTZellen vorgeschlagen, bei dem der Anstieg des Zellvolumens zu einer Zunahme der mechanischen Spannung im kortikalen Zytoskelett führt. Dadurch wird – indirekt, etwa durch Phospholipase A2, oder direkt - TRPV4 aktiviert. Dies führt zu einem Einstrom von extrazellulären Ca2+-Ionen und über Ca2+-abhängige Aktin-bindende Proteine (z. B. Gelsolin) zu einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts (Gel-Sol-Übergang) und verbunden damit zu einer Abnahme der mechanischen Spannung. Ca2+-Ionen und kurze Aktinfilamente aktivieren Transportmechanismen, die zum Ausstrom von K+- und Cl-- Ionen und einer Abnahme des Zellvolumens führen.
The growth of blood vessels is crucial for organ growth in the embryo and repair of wounded tissues in the adult. An imbalance in this process contributes to numerous malignant, inflammatory, ischemic, infectious and immune disorders (Ferrara et al., 2003). Postnatal neovascularization occurs through the recruitment of progenitor cells and angiogenesis. Integrins are heterodimeric cell surface molecules and are the main receptors for extracellular matrix proteins. Regulation of integrin activation is crucial during embryonic development and during adult life. Dysregulation of integrin activity leads to severe diseases. In this study, we have demonstrated that Rap1, a small GTPase regulating integrin activity, and its GEF Epac1 are expressed in both EPC and endothelial cells. Moreover, the pharmacological activator of Epac activates the small GTPase Rap1 in progenitor cells. In parallel the angiogenic growth factors VEGF and bFGF activate Rap1 in endothelial cells. In addition, the regulation of Rap1 activity in EPC and in endothelial cells plays an important role in the regulation of migration and adhesion to matrix proteins, by regulating the activity of different integrins, a mechanism known as integrin inside‐out signaling. Furthermore, regulation of Rap1 activity affects probably indirectly through outside‐in signaling of integrins the activity of several and crucial proteins such PKB/Akt and focal adhesion kinase in endothelial cells. In line with these results, we have demonstrated that Rap1 activity affect angiogenesis, homing of EPC to ischemic tissues and thereby postnatal neovascularization. The understanding how Rap1 regulates integrin activity in endothelial cells is still not completely clear, for example we have demonstrated that the known effectors of Rap1 mediating the increase of integrin activity in T and B cells, such as RAPL and RIAM are, respectively, either not increasing integrin activity or not expressed in endothelial cells. We aim to find the effector of Rap1 promoting integrin activity in endothelial cells and how RAPL regulates integrin functions and angiogenesis. Moreover data from us and others using genetic models and generation of Rap1a or Rap1b deficient mice or deficient for Rap1a and Rap1b led to embryonic lethality suggesting that Rap1 is a key node protein during embryonic development. The development of conditionnal Rap1a/b endothelial/pericytes restricted deficient mice will help us to decipher more precisely the role of Rap1 during vascular development and angiogenesis.
CAP (c-Cbl assoziiertes Protein) ist ein Adapterprotein, welches zusammen mit ArgBP2 und Vinexin die SoHo-Protein-Familie bildet. Es besitzt in seinem N-terminalen Bereich eine SoHo-Domäne und im C-Terminus drei SH3-Domänen, über welche es mit einer Vielzahl von Proteinen interagieren kann. CAP spielt bei verschiedenen Signaltransduktionsvorgängen und der Reorganisation des Aktinzytoskelettes eine Rolle. So wurde ihm eine Funktion im PI3-Kinase-unabhängigen Insulinsignalweg zugeschrieben. In Zell-Zell-Kontakten ist CAP zusammen mit Nectin und Afadin Bestandteil des NAPSystems, welches parallel zu Cadherin-Catenin-Adhäsionen existiert. In Fokalkontakten bindet CAP an FAK, Paxillin und Vinculin, welche wichtig für die Regulation der Zell-Matrix-Adhäsionen sind. In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion von CAP bei der Assoziation mit dem Aktinzytoskelett näher untersucht werden. Es wurde gezeigt, daß die Kolokalisation von CAP mit Vinculin und Aktin dynamisch und vom Ausbreitungsgrad der Zelle und dem Expressionsniveau des Proteins abhängig ist. Ohne funktionelle SH3-Domänen lokalisiert CAP nicht mehr in Fokalkontakten, kann aber bei Überexpression noch eine Ausbildung von Streßfasern induzieren. Die Funktionalität der zweiten und der dritten SH3-Domäne von CAP ist für die Zelladhäsion von Epithelzellen von Bedeutung, da Konstrukte, die in konservierten Aminosäuren der Domänen mutiert worden sind, eine verringerte Zellausbreitung aufweisen. CAP wurde zudem als ein Interaktionspartner und Substrat der Tyrosinkinasen c-Abl und c-Src charakterisiert. Die Assoziation mit den Kinasen wird dabei vor allem über den C-Terminus von CAP vermittelt, und CAP kann direkt mit der Src-Kinase interagieren. CAP wird von c-Abl überwiegend an Tyrosin 360, und von c-Src bevorzugt an Tyrosin 326 phosphoryliert. Diese Tyrosine liegen innerhalb bekannter Konsensus-Motive der Kinasen. Phosphorylierungsdefiziente CAP-Konstrukte sind noch dazu in der Lage, mit Vinculin und Aktin zu kolokalisieren. Tyrosin 326 hat jedoch einen Einfluß auf die Zellausbreitung auf Fibronektin, da ein in dieser Aminosäure mutiertes Konstrukt einen Defekt hierbei aufweist. Den genauen Mechanismus, über welchen CAP seinen Einfluß auf die Zell-Matrix-Adhäsion ausübt, ist noch ungeklärt. Durch die hier erstmals aufgezeigte Phosphorylierung des Adapterproteins erweitern sich dessen Interaktionsmöglichkeiten durch mögliche Bindungen an SH2-Domänen-enthaltende Proteine. CAP könnte als Bindeglied zwischen c-Abl und c-Src und weiteren zytoskelettalen Komponenten dazu beitragen, die Kinasen an Fokalkontakten zu verankern und ihnen neue Substrate zuzuführen. Die Interaktion mit CAP könnte dabei die Aktivität der Kinasen erhöhen. Weiterführende Studien werden die in diesem Signalweg nachgeschalteten Komponenten untersuchen und auch eine putative Rolle der Phosphorylierung von CAP in den bereits bekannten zellulären Zusammenhängen wie dem Insulinsignalweg näher beleuchten.
I. Untersuchung der Transformationsmaschinerie in Acinetobacter baylyi ADP1 durch Analyse der subzellulären Lokalisation von Kompetenzproteinen, Mutantenstudien und In-vivo-Detektion des DNA-Translokators in der lebenden Zelle. 1. Durch Komplementationsstudien konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertionen in den Mutanten T843 (comM::nptII) und T840 (comL::nptII) keine polaren Effekte auf stromabwärts gelegene Gene des comM-Q Clusters haben. Hieraus kann geschlossen werden, dass ComM und ComL essentiell sind für die natürliche Transformation. 2. Mit Hilfe der sacB-nptII Selektionskassette wurde eine markerlose und somit nichtpolare Mutation in comN erzeugt. Diese Mutante war nicht mehr transformierbar, woraus eindeutig geschlossen werden kann, dass ComN ebenfalls essentiell ist für die natürliche Transformation. 3. Western-Blot-Analysen subzellulärer Fraktionen von A. baylyi ergaben, dass die Kompetenzproteine ComL und ComN in der inneren Membran lokalisiert sind. 4. Mutantenstudien führten zu dem Schluss, dass ComL in der comM-, der comN- und der comO-Mutante weder im Rohextrakt, noch in subzellulären Membranfraktionen nachzuweisen ist. Auch ComN ist in der comM- und der comO-Mutante weder im Rohextrakt, noch in subzellulären Membranfraktionen nachzuweisen. Daraus lässt sich folgern, dass die Proteine entweder die Expression der entsprechende Gene beeinflussen oder dass durch Interaktionen von ComM, ComN, ComL und ComO die Stabilität der Proteine erhöht wird. 5. Die Kompetenzproteine ComEA und ComP wurden translational mit GFPuv fusioniert (C-terminale Fusion). Die Expression der Gene comEA-gfp und comP-gfp, die auf dem Plasmid pRK415 unter der Kontrolle eines lac-Promotors vorlagen, führte nach Induktion mit IPTG zur Detektion der Fusionsproteine in A. baylyi. Über Komplementationsstudien konnte nachgewiesen werden, dass die ComEA-GFP- und ComP-GFP-Fusionsproteine funktionsfähig sind. 6. Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass die Verteilung von ComEA und ComP in der Zellmembran von A. baylyi abhängig ist von der Wachstumsphase und der Kompetenz: Während die Kompetenzproteine in der lag-Phase (zum Zeitpunkt maximaler Kompetenzinduktion) gleichmäßig über die gesamte Membran verteilt sind, finden sie sich im Laufe der exponentiellen Phase (mit abnehmender Kompetenz) in einer abnehmenden Zahl von separaten Foci, bis sie schließlich in der späten stationären Phase (zum Zeitpunkt minimaler Kompetenz) nur noch in 1 - 2 distinkten Foci lokalisiert sind. II. DNA-Transfer in marinen Bakterien 1. Vor der Auswahl geeigneter Selektionsmarker für DNA-Transferstudien in marinen Bakterien wurde eine Analyse der spontanen Resistenzen mariner Bakterien durchgeführt. Diese Analysen ergaben, dass 72 % von 116 marinen Isolaten sensitiv gegenüber einer Kombination von je 100 μg Kanamycin und 100 μg Streptomycin pro ml Medium sind. 2. Es wurde ein Transformationsprotokoll für das Screening mariner Bakterien auf die Fähigkeit zur DNA-Aufnahme durch natürliche Transformation etabliert. Es wurden drei Vektoren pM1, pM2 und pM3 konstruiert, die eine Übertragung und stabile Insertion von Antibiotikaresistenz-Markergenen und dem zur Detektion eingesetzten gfp-Gen durch homologe Rekombination flankierender rDNA-Bereiche mit dem rDNA-Operon des Rezipienten ermöglichten. 3. Unter Einsatz dieser Vektoren wurde die Transformierbarkeit von 83 marinen Isolaten überprüft. Diese Analysen führten zur Identifizierung von vier transformierbaren Isolaten. Bei diesen Isolaten handelt es sich um Marinobacter sp., K. rosea, P. phosphoreum und P. marincola Stämme.
In der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre Verteilung der beiden Ekto-Nukleotidasen TNAP (gewebeunspezifische Form der alkalischen Phosphatase) und NTPDase2 (Nukleosidtriphosphatdiphosphohydrolase) in den embryonalen, postnatalen und adulten neurogenen Zonen des Mäusehirns untersucht.
• Mittels enzym- und immunhistochemischer Markierungen wurde die TNAP erstmals auf den Zellen der SVZ (subventrikuläre Zone) und des RMS (rostraler Migrationsstrom) nachgewiesen.
• Immunhistochemische Doppelfärbungen von Gewebeschnitten und von akut isolierten Zellen aus der SVZ adulter und postnataler (P15) Mäuse zeigten, dass die TNAP von allen drei Typen neuronaler Vorläuferzellen (Typ B-, C- und A-Zellen) der SVZ exprimiert wird.
• Enzymatische Markierungen verschiedener Embryonal- und Postnatalstadien (ab Embryonalstadium14, E14) ergaben, dass die TNAP schon im Stadium E 14 im Bereich der Seitenventrikel exprimiert wird:
o In den frühen Embryonalstadien lag die TNAP über die gesamte Gewebedicke, von der ventrikulären bis zur pialen Oberfläche vor.
o Im Laufe der weiteren Entwicklung war eine im Kortex beginnende und sich später bis in das Striatum ausweitende Reduktion der TNAP-Aktivität zu beobachten. Mit zunehmender Reifung des Gehirns wurde die Schicht der TNAP-positiven Zellen dünner und beschränkte sich schließlich auf die SVZ.
• Die NTPDase2 war erst im Zeitraum zwischen E18 und P2 nachweisbar. Sie war im Bereich der Seitenventrikel lokalisiert und auf die an die Ventrikel angrenzenden Zellen beschränkt. Im Laufe der weiteren Entwicklung wandern die NTPDase2-positiven Zellen offensichtlich in die SVZ ein und ab P14 waren sie zu hüllartigen Strukturen angeordnet, die eine Doppelmarkierung für TNAP und NTPDase2 aufwiesen und Gruppen DCX-positiver Zellen (Typ-A Zellen, Neuroblasten) umschlossen.
• Die Markierung mit dem Neuroblastenmarker DCX war bereits zum Stadium E14 möglich. In diesem Altersstadium wurden lediglich die Zellen im Bereich des Kortex gefärbt. Im Laufe der postnatalen Entwicklung verlagerten sich die DCX-positiven Zellen ihren Schwerpunkt in den Bereich der SVZ. Bereits ab P10 lagen in der SVZ Gruppen von DCX/TNAP-doppelpositiven Zellen vor, Anzeichen für eine Konzentrierung der Neurogenese auf die SVZ.
• Die Ausschaltung des TNAP-Gens (TNAP-Knockout-Mäuse) hatte keinen offensichtlichen Einfluss auf die Ausbildung der Seitenventrikel oder die Ausbildung und zelluläre Zusammensetzung der SVZ.
• In der zweiten wesentlichen neurogenen Zone des Säugerhirns, dem Gyrus dentatus des Hippokampus, konnte die TNAP nicht nachgewiesen werden, obwohl die dortigen Vorläuferzellen NTPDase2 exprimieren.
Die vorliegenden Daten belegen erstmals eine Assoziation der TNAP mit neuronalen Vorläuferzellen und erlauben zusammen mit den Markierungen für NTPDase2 und weitere zelluläre Marker neue Einsichten in die zelluläre Entwicklung der adulten SVZ. Darüber hinaus stützen sie die Vorstellung einer Beteilung purinerger Signalwege an der Steuerung der embryonalen, postnatalen und adulten Neurogenese.
Ataxin-2 is a novel protein, within which the unstable expansion of a polyglutamine domain can cause Spinocerebellar Ataxia type 2 (SCA2), a neurodegenerative disease which belongs to the group of polyglutamine disorders. SCA2 is characterised by a progressive loss of neurons that first affects the cerebellum and brain stem and then may extend to other areas of the brain, like substantia nigra, motoneurons and thalamus. Several lines of research have attempted to determine therole of ataxin-2 in its normal and mutant version. Different animal models and cell culture approaches to study ataxin-2 function implicated ataxin-2 in RNA processing, embryonic development, apoptosis and cytoskeleton. However, the function of ataxin-2 still remains unclear. In this thesis, a protein interaction approach was chosen as an alternative to gain insights into the cellular function of ataxin-2. Full-length ataxin-2 was used as bait in a yeast two-hybrid screen of human adult brain cDNA. Among five candidate interactor proteins identified, two were the endophilins A1 and A3, proteins involved in vesicle endocytosis. Co-immunoprecipitation studies confirmed the association of these proteins in an endogenous complex of mouse brain. In vitro binding experiments narrowed the binding interfaces down to two proline-rich domains on ataxin-2, which interacted with the SH3 domain of endophilins A1/A3. Ataxin-2 and endophilins A1/A3 colocalised at the endoplasmic reticulum as determined by immunofluorescence microscopy of transfected cell lines, and by centrifugation fractionation studies of mouse brain. Importantly, the pattern observed in transfected cells was conserved in untransfected rat hippocampal neurons. In mouse brain, associations of ataxin-2 with endocytic proteins such as the adaptor CIN85, the ubiquitin ligase c-Cbl and also GRB2, in the last case by means of a SH3 domain array chip, were also demonstrated. GST pull-down assays showed ataxin-2 to interact directly with the SH3 domains A and C of CIN85, the C-terminal SH3 domain of GRB2, and the SH3 domain of Src, a kinase activated after receptor stimulation. Functional studies demonstrated that ataxin-2 affects endocytic trafficking of the epidermal growth factor receptor (EGFR) by reducing the EGFR internalisation after EGF stimulation. Taken together, these data implicate ataxin-2 to play a role in endocytic receptor cycling.