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Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Anti-PGE2-Antikörperfragment exprimiert werden, mit dem über NMR-Spektroskopie genauere Strukturdaten der Antikörperbindungsdomäne zu erhalten wären. Da Fab-, Fv- und scFv-Fragmente die Antigenbindungsstelle besitzen und sich gegenüber einem vollständigem IgG zusätzlich durch ihre geringere Größe auszeichnen, wurden die korrespondierenden Antikörperfragmente für diese Arbeiten gewählt. Ausgehend von einer etablierten Hybridom-Zelllinie konnten über cDNA-Synthese und Assembly-PCR die Gene für die Antikörperfragmente bereitgestellt werden. Zum Verifizieren von DNA-Sequenz und Bindungseigenschaften stand ein Anti-PGE2-Fab-Fragment früherer Arbeiten von Frau Dr. Ilse Zündorf zur Verfügung. Für Strukturuntersuchungen müssen relativ große Proteinmengen bereit gestellt werden, daher ist es notwendig, hohe Ausbeuteverluste durch Präzipitation, Degradierung, Aufreinigungsverluste u.a. zu vermeiden. Um zunächst eine möglichst gute Proteinexpression zu erhalten, wurde der Bakterienstamm Escherichia coli BL21DE3 und das pET-Expressionssystem gewählt. In diesem System war zu erwarten, dass die überexprimierten Antikörperfragmente unter den gewählten Bedingungen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter inclusion bodies, in den Zellen vorliegen werden. Die der Klonierung der VH-, Vk- und scFv-Gene folgende Expression der Proteine zeigte, dass es tatsächlich zur Bildung von inclusion bodies kommt. Die Vorteile dieser Aggregatbildung, wie hohe Proteinmenge, Proteaseunempfindlichkeit aufgrund der hohen Dichte sowie die hohe Homogenität, sollten für die Gewinnung nativer Antikörperfragmente genutzt werden. Hierfür konnte ein System etabliert werden, das im wesentlichen auf der Solubilisierung der Aggregate und der Reduktion falscher Disulfidbrücken mit anschließender Rückfaltung und Rekonstituierung der Disulfidbrücken beruht. Kritische Parameter, die den Rückfaltungsprozess beeinflussen, wurden untersucht. Hierunter fallen insbesondere die Zusammensetzung des Renaturierungssystems wie Pufferbedingungen, das Verhältnis von oxidierten zu reduzierten Glutathion und der Zusatz von sogenannten Faltungsenhancern, die Additiva. Für fast alle wesentlichen Punkte konnten Systemkomponenten etabliert werden, die für das scFv-Fragment eine nahezu vollständige Überführung der inclusion bodies in die lösliche Form erlauben. Auch eine Bindung an das Antigen Prostaglandin E2 konnte unter Anwendung von Radioimmunoassays gezeigt werden. Problematisch ist die Aufkonzentrierung der in niedriger Konzentration vorliegenden renaturierten scFv-Fragmente. Je stärker aufkonzentriert wird, desto stärker präzipitieren die scFv-Moleküle in der Ultrafiltrations- bzw. Zentrifugationsfiltereinheit. Antikörper und Antikörperframente sind ohne Frage eine sehr wichtige Molekülgruppe von molekularbiologischen und biochemischen Interesse, nicht nur in dieser Arbeitsgruppe. Im Rahmen einer möglichen Weiterführung dieser Arbeit müsste geklärt werden, ob das Präzipitationsverhalten der scFv-Fragmente eine inhärente Eigenschaft des Anti-PGE2 scFv ist, oder ob hier doch eine zumindest teilweise inkorrekte Faltung der Proteinkette vorliegt. Mögliche weitere Experimente könnten in der Variation des Linkers liegen oder das etablierte Verfahren an einem weiteren scFv-Fragment zu testen. Da die genannten Probleme bei der Aufkonzentrierung der Proteinlösung auftreten, sollten statt der angewandten Techniken alternative Methoden geprüft werden. Auch wäre es interessant zu sehen, ob sich ein z.B. kommerziell verfügbares scFv-Fragment, dessen Bindungseigenschaften bekannt sind, nach Denaturierung wieder in die native Form überführen lässt. Abschließend lässt sich sagen, dass die Herstellung von nativen Protein aus inclusion bodies viele Vorteile bietet, die für die Präparation größerer Proteinmengen nicht ungenutzt bleiben sollten.
Der Nucleus suprachiasmaticus (SCN) ist der übergeordnete circadiane Schrittmacher (die “Tageszeitenuhr“) der Säugetiere. Er generiert den circadianen Rhythmus und synchronisiert diesen mit den diurnalen Signalen (Zeitgebern) aus der physikalischen Umwelt. Die Generierung der circadianen Rhythmik findet innerhalb einzelner SCN-Neurone (“clock cells“), die einen Multi-Oszillatoren-Veband bilden, statt. Die asynchronen Individualrhythmen der “clock cells“ werden zu einem gemeinsamen Haupt-Rhythmus, den circadianen Rhythmus, synchronisiert. Die entscheidende Rolle bei der Synchronisation der Individual-Rhythmen wird dem inhibitorischen – in fast allen SCN-Neuronen vorkommenden – Neurotransmitter Gamma- Amino-Buttersäure (GABA) zugeschrieben. Der gemeinsame Haupt-Rhythmus wird weiterhin durch exogene Zeitgeber auf die 24-stündige Periodik der Umweltsignale getriggert. Der dafür wichtigste Zeitgeber ist das Licht. Die Licht-Informationen werden retinal perzipiert und chemisch durch den Neurotransmitter Glutamat an den SCN übermittelt. Der Schlaf – als prominente Komponente circadianer Rhythmen – scheint ebenso vom GABAergen System des SCN gesteuert zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das GABAerge System von Goldhamstern einschließlich seines glutamatergen Eingangssystems und der GABAergen Efferenzen analysiert. Diurnale Fluktuationen der untersuchten Komponenten des GABAergen Netzwerkes wurden auf ihre Beteiligung an Synchronisationsvorgängen im SCN beleuchtet. Die semiquantitative Analyse mit Hilfe von HPLC, Immuncytochemie und Immunoblot- Verfahren erbrachte eindeutige diurnale Fluktuationen aller untersuchten Komponenten des GABAergen Systems im Goldhamster-SCN. Während der Dunkelphase wurde das GABAerge-System aktiviert: die GABA-Synthese (GAD56/67), der Gesamt-GABA-Gehalt und die GABA-Wiederaufnahme (Entsorgung) aus dem synaptischen Spalt durch GABA-Transporter (GAT-1) zeigten eine nächtliche Reaktivitätssteigerung. Dies wurde durch die Erhöhung der nächtlichen GABA-Freisetzung aus SCN-Gewebekulturen (slice-Kulturen) ergänzt. In einer weiteren Untersuchung wurde die Zusammensetzung des GABAA-Rezeptors, der an den Synchronisationsvorgängen im SCN beteiligt ist, näher charakterisiert. Im SCN von Goldhamstern wurden die GABAA-Rezeptor- Untereinheiten alpha 2, alpha 3, beta 1 und beta 2/3 (schwach vertreten) nachgewiesen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das GABAerge System an der Schlafregulation beteiligt ist. Die Komponenten des GABAergen Systems (Gesamt-GABA, GAD56/67, GAT-1) im SCN von Goldhamstern wiesen während des Schlafs im Vergleich zum wachen Tier identischer photoperiodischer Phasenlage erhöhte Reaktivität auf. Die Komponenten des glutamatergen Systems, welchem die Lichtinformationsübermittlung an das GABAerge System im SCN obliegt, zeigten ebenfalls eine diurnale Fluktuation. Die Maxima der Immunreaktivität für die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten (GluR1, GluR2/3) am Tage deuten auf eine optimale Beteiligung dieser Komponenten an der Lichtvermittlung und auf einen Triggereffekt von Glutamat hin. Der Gesamt-Glutamat-Gehalt im SCN wies zwar erhöhte Werte während der Nacht auf, jedoch konnte keine Aussage über die Menge des funktionellen Neurotransmitters gemacht werden, da nur ein Bruchteil der Gesamt-Glutamat- Menge als Neurotransmitter wirkt. Die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten zeigten eine – im Vergleich zu wachen Tieren derselben photischen Phasenlage – erhöhte Reaktivität bei schlafenden Goldhamstern. Die Hochregulation der GABAergen Systems während der Nacht unterstützt die Hypothese, dass GABA-Pulse – verabreicht zu einem bestimmten Tageszeit – Rhythmen individueller SCN-Neurone (“clock cells“) synchronisieren können. Die Synchronisation der GABAAusschüttung zu bestimmten Tageszeiten aus allen SCN-Neuronen wird durch das glutamaterge System getrieben. Alle untersuchten Komponenten zeigten dabei konsensuelle Reaktivitätsmuster, die als erhebliche Kontrastverstärkung der Hell- und Dunkelphase gewertet werden müssen. Die Unterschiede in der Reaktivität des GABAergen und glutamatergen Systems zwischen schlafenden und phasengleich untersuchten wachen Tieren stellen deren große Bedeutung für die Schlafregulation heraus.
Einfluß von Rho-GTPasen und Aktin auf den cortikalen Membrantransport in Xenopus laevis-Oozyten
(2002)
Rho-Isoform-spezifische Änderungen der Zelloberfläche. Durch Bestimmung der Anzahl plasmamembranständiger Na,K-Pumpen bzw. der elektrischen Membrankapazität als Maße für die Zelloberfläche wurde der Einfluss verschiedener rekombinanter Rho-GTPasen auf den kortikalen Membranfluss an Xenopus-Oozyten untersucht. RhoA, RhoB, RhoC, RhoD und Cdc42 führten zu einer Abnahme der Zelloberfläche, wohingegen RhoE, RhoG und Rac1 eine Vergrößerung hervorriefen. Die Rho-GTPase TC10 hatte keinen Einfluss auf die Zelloberfläche. Die Veränderung der Zelloberfläche wurde durch elektronenmikroskopische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen verifiziert: Oozyten zeigten nach Überexprimierung von RhoA eine deutliche Reduktion der Mikrovilli, wohingegen die dominant-aktive Form von RhoG (V12-RhoG) zu einer Verlängerung der Mikrovilli führte. Für die Wirkstärke der Rho-GTPasen, die die Oberfläche in ihrer Wild-Typ Form reduzierten, konnte folgende Rangfolge ermittelt werden: RhoB > RhoA > RhoD > RhoC > Cdc42. In der Gruppe der Rho-Proteine, die eine Vergrößerung der Zelloberfläche bewirken, zeigte RhoE den größten Effekt, gefolgt von Xenopus-RhoG, humanem RhoG und Rac1. Aus den Untersuchungen ging ferner hervor, dass dominantaktive Formen der Rho-GTPasen nicht unbedingt stärker wirken als die Wildtypform. Auch einige dominant-negative Formen führten trotz des inhibierten GDP/GTP-Austausches zu unerwarteten Veränderungen der Zelloberfläche. GTPasen anderer Familien wie Arf1, Arf6 oder Rab5a, für die eine Rolle beim vesikulären Transport gut dokumentiert ist, hatten keinen Einfluss auf die Zelloberfläche. Für die Änderung der Zelloberfläche erwies sich das Vorhandensein eines Cterminalen Lipidankers als essentiell, da Rho-GTPase-Mutanten, die infolge des Fehlens eines kritischen Cysteinrestes nicht mehr isoprenyliert werden können, keine Änderung der Zelloberfläche bewirkten. Die Analyse von RhoB-RhoG-Chimären brachte keine eindeutigen Hinweise auf das Vorhandensein einer für die Zelloberflächenregulation entscheidenden weiterer Region. Sowohl N-terminal- als auch C-terminal-gelegene Sequenzabschnitte waren zur Ausbildung des vollen Effektes notwendig. Identifizierung möglicher RhoA-Effektoren. Die Untersuchung von RhoAEffektormutanten, bei denen die Interaktion mit spezifischen Effektormolekülen durch Mutation in der Effektorregion inhibiert war, ergab, dass die Abnahme der Zelloberfläche weder durch Rhophilin, mDia, Kinectin, Citronkinase oder ROK vermittelt wird. Auch der ROK-Inhibitors Y-27632 konnte den RhoA-Effekt nicht blockieren. Nach diesem Ausschlußverfahren konnte die Proteinkinase N (PKN, PRK) als einziger möglicher Effektor für den durch RhoA ausgelösten Internalisierungsprozeß ermittelt werden. Wechselwirkung zwischen Rho und Aktin. Rho-Proteine gelten als endscheidene Regulatorproteine des Aktinzytoskeletts. Als Reaktion auf bestimmte extrazelluläre Signale kontrollieren diese Proteine Aufbau und Zerfall des Aktins. Untersucht wurde hier der Einfluß der Aktinumstrukturierung auf den Rho-vermittelten Membrantransport. Die das Aktin-Zytoskelett gegensätzlich beeinflussenden Substanzen Cytochalasin B, Cytochalasin D und Phalloidin hatten keinen bzw. nur einen schwachen Effekt auf die Oozyten-Oberfläche. Die Rho-vermittelte Zelloberflächenänderungen wurden von diesen Substanzen nicht blockiert. Dagegen bewirkten die das Aktin-Zytoskelett depolymerisierenden Substanzen Latrunculin A und C2-Toxin eine starke Reduzierung der Zelloberfläche. Die Reduzierung unter Latrunculin A kam auch dann zustande, wenn zuvor RhoE überexprimiert wurde, welches selbst die Zelloberfläche stark vergrößert. Wurde zunächst C2-Toxin in Oozyten injiziert und anschließend RhoE überexprimiert, ergab sich keine Veränderung der Membrankapazität im Vergleich zu einer nicht injizierten Kontrolloozyte. Der Effekt von Latrunculin A wurde blockiert, wenn Rho-GTPasen durch Vorbehandlung der Oozyten mit Rho-spezifischen Toxinen (ToxB und C3- Toxin) inaktiviert wurden. Daraus folgt, dass der Effekt von Latrunculin A und C2-Toxin davon abhängt, dass aktivierbares Rho zur Verfügung steht. Jasplakinolid, eine Aktin stabilisierende Substanz, führt ebenfalls zu einer starken Verringerung der Zelloberfläche, die jedoch durch Toxin-Vorhandlung nicht blockierbar und damit RhoA-unabhängig war. Auswirkung der GAP-Wirkung von ExoS auf die Rho-Aktivität. Die Injektion von ExoS, einem Toxin, das gegenüber Rho GAP-Aktivität aufweist, führt zu einer Vergrößerung der Zelloberfläche. Die GAP-Wirkung von ExoS konnte durch das CNFToxin, daß aufgrund einer Aktivierung von Rho zu einer Verminderung der Zelloberfläche führt, nicht aufgehoben werden. Auch die dominant-aktiven Formen von RhoA (V14-RhoA, Q61-RhoA) konnten die GAP-Wirkung von ExoS nicht blockieren. ExoS kann im Gegensatz zu anderen GTPase-aktivierenden Proteinen eine Interaktion mit der deamidierten Form von Rho eingehen und somit den Aktivitätszustand durch GTPHydrolyse beenden. Wechselwirkung zwischen Bordetella Dermonekrose-Toxin (DNT) und Rho. Die biologische Wirkung von DNT resultiert aus einer Deamidierung und Transglutaminierung von Rho-GDP nach Freisetzung von GDI. Aufgrund dieser Modifikationen kommt es zum Verlust der GTP-Hydrolyse-Aktivität und somit zur Bildung einer konstitutiv-aktiven Form von Rho. In Zusammenarbeit mit Prof. Aktories (Pharmakologisches Institut, Freiburg), gelang es, die Aminosäure Lysin als ein weiteres Substrat neben Spermidin und Putrescin für den Transglutaminierunsprozeß des Toxins DNT zu identifizieren.