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This review lists Agama smithii Boulenger 1896 as a synonym of Agama agama (Linnaeus 1758), Agama trachypleura Peters 1982 as a synonym of Acanthocercus phillipsii (Boulenger 1895) and describes for the first time Acanthocercus guentherpetersi n. sp. Without more convincing evidence, Chamaeleon ruspolii Boettger 1893 cannot be accepted as specifically distinct from Chamaeleo dilepis Leach 1819, nor Chamaeleo calcaricarens Böhme 1985 from C. africanus Laurenti 1768. Consequently, 101 species of lizard are currently recognised in Ethiopia, of which some 40% appear to be denizens of the Somali-arid zone. This significant proportion is attributable in part to the importance of the Horn of Africa as a centre for reptilian diversification and endemicity, in part to the fact that this lowland fauna was rather extensively sampled during the 1930s, but also to the conspicuous neglect of lizards in other regions of the country. Mountain and forested habitats are widespread in Ethiopia, so it seems extraordinary to record only five saurian species which are believed to be endemic in such environments. The inference that there are many more still to be discovered has important implications for conservation, because montane forest is known to be among the most threatened of Ethiopian biomes and there is clearly an urgent need for its herpetofauna to be more thoroughly researched and documented.
Molekulare Regulation der UDP-Zucker-Biosynthese Untersuchungen anhand der myo-Inositoxygenase
(2006)
Der Nukleotidzucker UDP-Glucuronsäure ist die prinzipielle Zuckervorstufe für UDP-Galacturonsäure, -Xylose, -Arabinose und –Apiose, welche alle in die Zellwandpolymere der pflanzlichen Zellwand einfließen. UDP-Glucuronsäure kann in Arabidopsis über zwei alternative, funktionelle Synthesewege gebildet werden, wobei entweder die UDP-Glucose-Dehydrogenase oder die myo-Inositoxygenase als Schlüsselenzym, welche den Kohlehydratfluss in Richtung Zellwandbiosynthese katalysiert, involviert ist. In dieser Arbeit wurden die Gene für die Enzymisoformen der Inositoxygenase (MIOX) aus Arabidopsis thaliana analysiert. Sie repräsentieren eine kleine Genfamilie bestehend aus vier Isoformen. Studien mittels Promotor::GUS-Konstrukten und RT-PCR zeigten, dass die Transkription der MIOX-Gene eine sehr transiente und organspezifische Genexpression ist. Die Isoformen MIOX1 und MIOX2 ließen sich in nahezu allen Geweben nachweisen wogegen die Isoformen MIOX4/5 nur in den generativen Geweben aufzufinden waren. Es konnte eine deutliche Präsenz aller vier MIOX-Isoformen in den generativen Geweben nachgewiesen werden und die Nukleotidzucker, die während der Samenentwicklung benötigt werden, scheinen überwiegend über die MIOX zur Verfügung gestellt zu werden. So zeigen T-DNA-Insertionslinien von ΔMIOX1 & 2 eine reduzierte Schleimhülle um die Samen und eine erhöhte Ausfallrate bei der Samenentwicklung auf. Ansonsten zeigen die untersuchten T-DNA-Insertionslinien einen ähnlichen Wuchs wie der Wildtyp auf. Auch konnten keine Unterschiede über die durchgeführten Zellwandanalysen, mittels GC-MS, MALDI und Dionex-HPLC verifiziert werden, was durch die Redundanz der MIOX- und UGD-Isoformen erklärt werden könnte. Nichtsdestotrotz konnte bei den Isoformen ΔMIOX1 & 2 eine dramatische Reduktion beim Einbau von 3H-Inosit in Zellwandpolymere von Keimlingen verzeichnet werden, was einen klaren Beweis für eine funktionelle MIOX liefert, da in diesem Gewebe diese beiden Isoformen die einzig aktiven sind. Außerdem konnten über Promotor-Deletions-Analysen potentielle cis-Elemente für die Promotoren von MIOX2 und MIOX4 aufgedeckt werden.
Im Jahr 1991 trat das Abkommen zur Erhaltung der in Europa und den außereuropäischen Arealstaaten vorkommenden Populationen der Arten der Säugerordnung Chiroptera in Kraft (EUROBATS: The Agreement on the Conservation of Populations of European Bats). Zuvor waren die Säuger allgemein schon in dem „Übereinkommen zur Erhaltung der wandernden wildlebenden Tierarten“ in Anhang II (Oktober 1985) aufgelistet. Auch in der Liste der in Deutschland vorkommenden Arten der Anhänge II, IV und V der FFH-Richtlinie (92/43/EWG) sind alle einheimischen Fledermausarten (Anhang II und IV) erwähnt. Für die Erhaltung der Fledermäuse ist der Schutz wichtiger „Stätten“ (z. B. Zwischenquartiere, Winterschlafquartiere, Wochenstubenquartiere) unumgänglich. Die Erhaltung und der Schutz, sowohl der Quartiere als auch der Futterplätze, vor Beschädigung oder Beunruhigung sind nach diesem Abkommen sicherzustellen. Diese Arbeit über die Stoffwechseldaten soll klarstellen, wie wichtig der Schutz der Fledermausquartiere - vor allem im Winter – ist. Der Energieverbrauch und die Anpassung der einheimischen Arten an Umgebungstemperaturen (Ta) soll mit Messwerten untermauert und mit der tropischen Art Carollia perspicillata verglichen werden. Weiterhin ist es Ziel dieser Arbeit, einen alternativen Versuchsaufbau zu entwickeln, der die Berechnung der Stoffwechselrate (SWR) ohne das Fangen der Tiere ermöglichen soll. Mit Hilfe einer IR-Kamera sollen Bilder von der Körperoberflächentemperaturverteilung und gleichzeitig Stoffwechselmessungen gemacht werden. Da die Körpertemperatur (Tb) und die SWR bei den einheimischen Fledermausarten direkt voneinander abhängig sind (HANUS 1959), könnte diese Methode hier angewandt werden. Nach der Erstellung einer Datenbank (SWR/IR-Bild) kann dann nur durch die IR-Bilder Rückschlüsse auf die SWR gezogen werden. Bei nordamerikanischen Arten konnte bestimmt werden, dass mindestens 75 % der Energiereserven, die eine Fledermaus für den Winterschlaf zur Verfügung hat, während der Aufwachphasen verbraucht werden (THOMAS et al. 1990). Eine Störung im Winterquartier führt zum Erwachen der Tiere. Nach einem Aufwachvorgang sind die Abstände des Wiedererwachens zunächst kürzer. Je kürzer die Fledermäuse im Torpor sind, desto schneller wachen sie auf. Dies verstärkt die Aufwachwahrscheinlichkeit und die damit verbundene Kettenreaktion, je öfter die Störungen auftreten (THOMAS et al. l.c.). Dies führt zu einem zusätzlichen Energieverbrauch. Der Einfluss einer Störung ist noch bis zu 8 h später in einem Winterquartier durch erhöhte Flugaktivität zu bemerken (THOMAS 1995). Dies lässt sich daraus erklären, dass die Tiere, die aufgewacht sind und aktiv sind, andere Fledermäuse durch ihre Aktivität aufwecken (Berührung, Wärme, Reproduktionsverhalten etc.). Dies soll nun auch für einheimische Arten überprüft werden. Aus den vorliegenden Erkenntnissen und den eigenen Messergebnissen sollen dann folgende weitere Fragen beantwortet werden: - Warum besteht die Notwendigkeit die Winterquartiere vor Störungen zu schützen? Welche tatsächliche Bedeutung haben Störungen im Winterquartier auf die Energetik der Fledermäuse? - Wie viel Energie verbrauchen die Fledermäuse im Sommer in Abhängigkeit von der Ta? - Gibt es Unterschiede zwischen der SWR der tropischen Art Carollia perspicillata und den einheimischen Arten? Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist durch identische Messbedingungen gewährleistet. - Lassen sich aus den SWR unterschiedliche Abhängigkeiten (Körpermasse (bm), Ta etc.) ableiten? - Hat die Nahrung den erwarteten Einfluss auf den RQ-Wert? Die Stoffwechseldaten sind deshalb so wichtig, da man damit zeigen könnte, welch extremer Ressourcenverlust für die Fledermaus mit einer Störung verbunden ist. Die Notwendigkeit des Schutzes der Fledermäuse vor Störungen im Quartier, sowohl der Sommer-, als auch die Winterquartiere, wäre dann mit Messdaten belegt. Die Unterschiede in der Abhängigkeit der SWR von der Ta, der bm, der Ernährungsform und der Tb sowohl im Wachzustand als auch im Torpor, soll für verschiedene Arten geklärt werden.
Ein gen-interner Transkriptionsstart koinzidiert mit einem Rekombinations-Hotspot imhumanen MLL-Gen
(2006)
Chromosomale Veränderungen des humanen MLL-Gens sind für 5-10% der akuten Leu-kämien im Säuglings- und Erwachsenenalter verantwortlich. Davon entstehen wiederum 5-10% der MLL-Aberrationen therapiebedingt. Das auf Bande 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homo-log of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Mittlerweile sind fast 90 cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40%), AF9 (27%), sowie ENL (7%), AF6 (6%), ELL (~5%) und AF10 (4%). Die Bruchpunkte von MLL-Translokationen sind nicht einheitlich über das 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in einer ca. 8.3 kb großen Bruchpunkts-clusterregion (bcr). Innerhalb dieser Region sind die Bruchpunkte nicht homogen verteilt. Bruchpunkte von Patienten mit de novo-Leukämien und einem Alter von über einem Jahr sind überwiegend in der 5’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster I (SCI), lokalisiert. Die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien sowie Säuglingen (<1 Jahr) liegen dagegen vornehmlich in der 3’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster II (SCII). Da DNA-Doppelstrangbrüche (DNA-DSB) auf zwei unterschiedlichen Chromosomen eine aus-reichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind, stellte sich die Frage, ob aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte innerhalb der MLL bcr, bestimmte Bereiche dieser Region für DNA-DSB besonders anfällig sind. Bisher konnte aufgeklärt werden, dass in SCII, durch Apoptose-auslösende Ereignisse oder cytotoxische Agenzien DNA-DSB sehr leicht induziert werden können. Durch Arbeiten in unserer Gruppe konnte im SCII ein ca. 200 bp großer Bereich um die MLL Intron 11/Exon 12-Grenze lokalisiert werden, in dem sich der größte Teil aller Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche konzentrierte. Dies galt jedoch nicht für eine perfekte TopoisomeraseII Konsensussequenz im Exon 12, die bisher mit einer Vielzahl Therapie-assoziierter Translokationsbruchpunkte in Verbindung gebracht wurde. Dieser Hotspot kolokalisiert außerdem mit einer scaffold/matrix attachment region (S/MAR), sowie einer DNaseI-hypersensitiven Stelle. Des Weiteren fanden sich in der Literatur Hinweise, dass SCII im Gegensatz zu SCI eine verstärkte Histonacetylierung besitzt. Die potentielle Anwesenheit eines Promotors wurde durch Computeranalysen bestätigt. In einer murinen embryonalen Fibroblasten-Zelllinie, die durch die Insertion einer LacZ/Neo-Kassette in Exon 4 des Mll-Gens einen Transkriptionsstop trug, wurden in anschließenden RT-PCR Experimenten sowohl alle Möglichkeiten des alternativen Spleißens ausge-schlossen, als auch der Start eines Transkripts unmittelbar vor Exon 12 detektiert. Zusätzlich durchgeführte Affymetrix-Chip-Experimente bestätigten die Anwesenheit von Mll-Transkript-signalen in der verwendeten Mll k.o.-Zelllinie. In nachfolgenden Versuchen konnte durch eine weitere Kartierung der Transkriptionsstart auf bis zu +/- 15 bp an der Intron 11/Exon12-Grenze festgelegt werden. Um nun die im Mausmodell gewonnenen Resultate auch im humanen System zu überprüfen, wurden die homologen Regionen des murinen und humanen Mll/MLL-Gens vor ein Luci-ferasereportergen kloniert. Durch RT-PCR konnte der gen-interne Transkriptionsstart im SCII des humanen MLL-Gens ebenfalls lokalisiert werden. Damit wurde gezeigt, dass genetische Instabilität und Transkriptionsinitiation im SCII des humanen MLL-Gens kolokalisieren. Durch die anfangs durchgeführten in silico-Analysen in Maus und Mensch, wurden Deletions-mutanten generiert, mit deren Hilfe die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotor-region ermittelt wurde. Hierbei zeigte sich, dass die Anwesenheit von zwei Retroelementen in der menschlichen Sequenz eine Enhancer-Funktion vermittelt. Dagegen zeigte die homologe murine Sequenz, für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-DSB bekannt ist, nur schwache Promotoraktivität. Da Histon Modifikationen beim Prozess der Transkription eine entscheidende Rolle spielen, wurde auch die nähere Umgebung des gen-internen Promotors in den murinen k.o.-Zellen untersucht. In der k.o.-Linie zeigte die Region stromaufwärts der putativen Transkriptionsinitiation die Signatur von inaktivem Chromatin (di-methyliertes H3 K9), wohingegen stromabwärts von Mll Exon 12 Chromatinstrukturen nachgewiesen wurden, die aktiv transkribiert werden (tri-methyliertes H3K4), und damit einen weiteren Beweis für die besondere Chromatinstruktur dieser Region lieferten. Durch Western-Blot Experimente wurde das Protein, das durch das Transkript des gen-internen Promotors kodiert wird, nachgewiesen. Das verkürzte murine Mll-Protein wird also, wie sein humanes Pendant, proteolytisch durch die Taspase1 gespalten, so dass sich ein MLL-Mini-Komplex ausbilden kann.
Anhand einer osmotischen Auffschlussmethode für B. subtilis konnte ohne Zugabe von Detergenzien erreicht werden, dass die beiden Modifikationsproteine SpaB und SpaC in löslicher Form vorliegen. Demzufolge handelt es sich bei dem Subtilin-Synthetase-Komplex nicht um einen starren membranständigen Komplex, sondern um eine transiente Assoziation der SpaB/C-Proteine mit dem Transportprotein SpaT während der Modifikationsreaktion. Durch Interaktionsstudien mit heterolog produzierten Subtilinpräpropeptid (SubHAHis) konnte eine spezifische Interaktion mit dem löslichen SpaC-Protein gezeigt werden. Komplementationsversuche zeigten, dass der DspaC amyE::spaS-Stamm durch das SpaCsowie das EriC-, jedoch nicht durch das NisC-Protein komplementiert wird. Ebenfalls ist ein C-terminal verkürztes bzw. verlängertes SpaC-Protein nicht in der Lage ist, Subtilin richtig zu modifizieren. Mit Hilfe einer in vitro Mutagenese der ligandierenden Aminosäuren Cystein 303, Cystein 349 und Histidin 350 konnte gezeigt werden, dass das Zink-Ion des SpaC-Proteins an der katalytischen Reaktion beteiligt ist. Beim Ausschalten der Aminosäuren Histidin 212 und Tyrosin 304 konnte ebenfalls ein Ausfall der Subtilinproduktion beobachtet werden. Es wäre denkbar, dass beide Aminosäuren in einer Säure/Base-Reaktion bei der Subtilinmodifikation involviert sein könnten. Die Aminosäure Tryptophan 302 hingegen bildet mit dem C-terminalen ALL-Motiv des Proteins ein hydrophobes Cluster, was eine Rolle beider Elemente in Stabilisation des Reaktionszentrums und Substratbindung nahe legt. Für das SubHAHis konnte gezeigt werden, dass es von der Modifikationsmaschinerie akzeptiert und auch produziert wird, jedoch entsteht ebenfalls ein Heterodimer zwischen dem SubHAHis und den Modifikationsproteinen SpaB und SpaC, an dessen Formation der Hexa-Histidin-Tag maßgeblich beteiligt ist. Eine mögliche Heterodimerformation im Subtilinproduzenten ATCC 6633 konnte unter bestimmten Bedingungen ebenfalls nachgewiesen werden, was auf eine mögliche kovalente Zwischenstufe bei der Lanthioninbrückenbildung hinweist. Des Weiteren konnte durch in vitro Mutagenese-Studien gezeigt werden, dass die katalytische Reaktion des SpaC-Proteins an der Heterodimerformation beteiligt ist. Das SpaC-SubHAHis Heterodimer konnte erfolgreich angereichert und mittels Peptidmassenkartierung eindeutig als kovalentes Heterodimer zwischen den beiden Proteinen identifiziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass bei der Modifikation des Subtilinpräpropeptids durch das SpaC-Protein eine transiente kovalente Bindung zwischen dem Präpropeptid und dem SpaCProtein ausgebildet wird. Die Bildung eines möglichen Heterodimers zwischen SpaC und dem Subtilinpräpropeptid konnte ebenfalls unter bestimmten Bedingungen beim Wildtyp nachgewiesen werden. Dieser Befund legt nahe, dass es sich bei der Heterodimerbildung um eine katalytische Zwischenstufe bei der Modifikation des Präpropeptids durch das SpaC handeln könnte, welches durch die Anwesenheit des Hexa-Hisitidin-Tags arretiert wird. Neben dem bekannten Subtilinproduzenten B. subtilis ATCC 6633 konnten weitere Stämme der W23-Untergruppe der Spezies B. subtilis als Subtilinproduzenten identifiziert werden, was impliziert, dass ein Merkmal der W23-Gruppe die Produktion von Subtilin ist und diese als Biomarker dienen könnte. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass ein um die Aminosäuren Glycin und Serin C-terminal verlängertes Subtilin (Subtilin-GS) eine gesteigerte Subtilin-Autoinduktion hervorruft. Durch die Zugabe von Mangan zu einer Subtilin-Produzierenden Kultur konnte ebenfalls gezeigt werden, dass das Mangan alleine einen steigernden Einfluss auf die Induktion des PspaB-Promotors besitzt, während eine gesteigerte Aktivität des PspaS-Promotors nur bei der gleichzeitigen Anwesenheit von Subtilin beobachtet werden konnte. Durch die gezielte Zugabe von Mangan und Subtilin-GS ist es dementsprechend möglich, eine erhöhte Autoinduktion und somit eine erhöhte Produktion an Subtilin zu erreichen.
Traditionell-morphologisch begründete Hypothesen zur Großphylogenie der Metazoa sind im Verlauf der letzten Jahre durch molekularbiologische Untersuchungen grundsätzlich in Frage gestellt worden. Die molekularbiologisch begründete Metazoen-Großphylogenie wird seit einem Übersichtsartikel von ADOUTTE et al. (2000) meist als „New Animal Phylogeny“ bezeichnet (kurz: NAP); sie beinhaltet eine Restrukturierung des Stammbaumes (kladogenetischer Aspekt) und die Infragestellung einer morphologischen Komplexitätssteigerung nach dem Schema acoelomat-pseudocoelomat-coelomat (anagenetischer Aspekt). Hinsichtlich der Kladogenese steht die Neueinteilung der Bilateria in drei Superphyla Deuterostomia, Ecdysozoa und Lophotrochozoa im Vordergrund; die Genealogie innerhalb dieser drei Großgruppen ist aber z.Z. relativ schlecht aufgelöst, so daß sich Vergleichsmöglichkeiten mit morphologischen Vorgängermodellen schnell erschöpfen. Aus diesem Grunde wird in vorliegender Arbeit der anagenetische Aspekt als Ausgangspunkt für eine umfassende morphologische Interpretation der molekularbiologischen Resultate gewählt. Momentan wird auf molekularsystematischer und vergleichend-entwicklungsgenetischer Basis davon ausgegangen, daß die frühesten Bilaterier eine acoelomate Organisation aufwiesen, von hier aus eine relativ komplexe, polymer-coelomate Organisation erwarben, welche dann aber in zahlreichen Bilaterierlinien sekundär reduziert wurde. Die ursprünglich acoelomate Organisation wird rezent nur durch eine sehr isolierte Linie, die Acoela (ggf. auch Nemertodermatida) vertreten, während alle anderen Bilaterier von einem polymer-coelomaten „Urbilaterier“ abstammen sollen. In vorliegender Arbeit wird die Auffassung vertreten, daß die morphologische Deutung eines solchen anagenetischen Szenarios am ehesten anhand der Hydroskelett-Theorie von W. F. GUTMANN (1972 et mult.), sowie späteren auf diesem Entwurf aufbauenden Arbeiten (insbesondere der Gallertoid-Hypothese, BONIK et al. 1976) möglich ist, d.h. auf konstruktionsmorphologischer Grundlage. Um den Nachweis einer weitgehenden Übereinstimmung von NAP und Gallertoid-Hydroskelett-Theorie zu führen, werden für 36 Metazoenbaupläne (4 Nonbilaterier, 32 Bilaterier) aktuelle molekularphylogenetische Befunde den jeweiligen konstruktionsmorphologischen Interpretationen gegenübergestellt. Für die vier Nonbilateria-Linien ergibt sich eine Vereinbarkeit auf kladogenetischer Ebene insbesondere dann, wenn die Placozoa vor den Porifera abzweigen (z.Z. aufgrund von mtDNADaten anzunehmen); auf anagenetischer Ebene aufgrund von Studien, welche die „Diploblastica/ Triploblastica“-Unterteilung in Frage stellen (Mesoderm-Problem). Für die Bilateria ist u.a. festzuhalten, daß im Rahmen der Hydroskelett-Theorie kein Schwestergruppenverhältnis Annelida + Arthropoda angenommen wurde, so daß die umstrittene neue Großgruppe Ecdysozoa unproblematisch ist: Ecdysozoa werden durch Ableitung der „Aschelminthen“ von polymeren Vorformen einer Deutung zugänglich. Die Molekularsystematik der Annelida, aber auch der Deuterostomia ist mit konstruktionsmorphologischen Interpretationen vereinbar, bei den Deuterostomia v.a. der hochderivierte Status der Pterobranchia und Tunicata. Als kennzeichnendste Übereinstimmung ist die Einordnung der Tentaculata als hochabgeleitete Protostomier hervorzuheben, was sowohl als „Grundstein“ der NAP gilt (HALANYCH et al. 1995) als auch eine sehr spezifische Position der Hydroskelett-Theorie darstellt. Es wird gefolgert, daß die Gallertoid- Hydroskelett-Theorie zentrale Resultate der NAP besser zu integrieren vermag als andere Entwürfe. Konsequenzen für merkmalsmorphologische Deutungen werden aufgezeigt.
The Japanese micropterigid moths are revised. Seventeen species in five genera are recognized from Japan, described or redescribed with the male and female genital figures. Of these, two genera, Issikiomartyria HASHIMOTO and Kurolkopteryx HASHIMOTO, and seven species, Issikiomartyria akemiae HASHIMOTO, Issikiomartylia plicata HASHIMOTO, Issihiomartyria distincta HASHIMOTO, Issihiomartyria bisegmentata HASHIMOTO, Kurokopteryx dolichocerata HASHIMOTO, Neomicropteryx hiwana HASHIMOTO, and Neomicropteryx redacta HASHIMOTO, are new to science. A new combination is given: Issikiomartyria nudata (Issuu). Biology and immature structures of the Japanese species are also described together with the keys to genera and to species provided on the basis of the adult characters. Phylogenetic relationships among the Northern Hemisphere genera are analyzed by the cladistic analysis using PAUP* (SWOFFORD, 2002) based on the morphological characters of adults. A monophyly of the Northern Hemisphere genera except for Micropterix is supported by nine apomorphies, but their immediate sister taxon remains unresolved.
Die sekretorischen Phospholipasen A2 (sPLA2) sind eine Familie von Enzymen, die die Fähigkeit besitzen, die Hydrolyse der mittleren (sn-2) Esterbindung aus Phospholipiden zu katalysieren. Die Produkte dieser Hydrolyse, freie Fettsäuren und Lysophospholipide, sind nicht nur Bausteine für die Synthese von Lipiden, sondern sie haben wichtige Funktionen als Lipid „second-messenger“ in zellulären Signaltransduktionsprozessen. In der Klasse der sekretorischen PLA2 wurden in Säugern bisher 10 Isoenzyme identifiziert, wobei die sPLA2-IIC beim Menschen nur als Pseudogen vorkommt. In der murinen Epidermis scheinen eines oder mehrere dieser Enzyme eine Rolle bei der Bildung der epidermalen Permeabilitätsbarriere zu spielen. Darüber hinaus kontrollieren sie die Freisetzung von Arachidonsäure für die Produktion von Eicosanoiden, die sowohl für die Proliferation der Keratinozyten als auch für inflammatorische Prozesse und die Entstehung von Tumoren in der Haut von entscheidender Bedeutung sind. Da bislang weder das detaillierte Expressionsmuster der einzelnen sPLA2-Enzyme noch deren spezifische Funktionen in muriner Epidermis bekannt war, wurde in der vorliegenden Arbeit eine umfassende Analyse an Schnitten von neonataler Maushaut und an murinen Papillomschnitten durchgeführt. Zusätzlich zum Nachweis der sPLA2-Expression in vivo wurden primäre murine Keratinozyten in vitro verwendet, um die Auswirkungen der Differenzierung der Keratinozyten auf die Expression der verschiedenen sPLA2-Enzyme zu untersuchen. Die Tumorzellinie HEL30 wurde zur Durchführung funktioneller Studien und für Kolokalisationsstudien verwendet. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut in vivo sowie in isolierten primären murinen Keratinozyten alle bisher bekannten sPLA2 Enzyme exprimiert sind. Für die sPLA2-IB, -IIE, -IIF, -V und -XII konnte sowohl in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut als auch in den primären Keratinozyten eine Expression vor allem in den differenzierten Zellen nachgewiesen werden. Dass diese Enzyme somit wahrscheinlich mit Differenzierungsprozessen gekoppelt sind, zeigte sich am Beispiel der sPLA2-V, die im murinen Papillom, welches vorwiegend aus proliferierenden Keratinozyten steht, nicht exprimiert war. Hingegen waren sPLA2 -IIA, -IID, und -X fast ausschließlich in Keratinozyten der Basalzellschicht der Epidermis und in den proliferierenden primären Keratinozyten exprimiert. Dies läßt vermuten, dass diese Enzyme eventuell eine Rolle bei der (Hyper-)Proliferation von Keratinozyten spielen. Darüber hinaus sind diese Enzyme auch in der Lage, Arachidonsäure freizusetzen, und sind somit eventuell an der Eicosanois-Homöostase beteiligt. Um eine eventuelle Beteiligung der basal exprimierten sPLA2 Enzyme an der Eicosanoidbiosynthese nachzuweisen, wurden Immunfluoreszenzstudien an neonataler Maushaut und an murinen Hautpapillomen des 2-Stufen-Tumorpromotionsmodells durchgeführt. Wie zuvor beschrieben waren alle drei Enzyme in der Basalzellschicht der neonatalen Maushaut exprimiert. Im Gegensatz dazu war die sPLA2-IIA im murinen Papillom nur am äußersten, nicht mehr hochproliferativen, Papillomrand zu detektieren. Die sPLA2-X dagegen zeigte eine starke Expression in den hochproliferativen basalen Keratinozyten dieses Gewebes. Für die sPLA2-IID konnte im Papillom ein Expressionsmuster festgestellt werden, das bis in die suprabasalen Schichten reicht. Betrachtet man die Expression der phospho-cPLA2, so konnte dieses Enzym in der neonatalen Maushaut vor allem in der Basalzellschicht, aber auch suprabasal im Stratum spinosum detektiert werden. Im Papillom zeigt dieses Enzym dagegen eine sehr starke Expression im gesamten Gewebe. Wie erwartet konnte COX-2 in der neonatalen Maushaut nicht detektiert werden, während das Expressionsmuster dieses Enzymes im Papillom mit dem der sPLA2-IID und phospho-cPLA2 korreliert Um Hinweise über die Expression und Funktion von sPLA2 –IID, -X und cP LA2 im Karzinom zu bekommen, wurde als Modellsystem die murine Karzinomzelllinie HEL30 verwendet. Diese Zellen produzieren bereits konstitutiv eine hohe Menge an PGE2. Eine TPA Stimulation dieser Zellen induziert eine zusätzlich stark erhöhte PGE2 Produktion. Anhand der Ergebnisse aus den Western Blot Analysen konnte gezeigt werden , dass sPLA2-IID und -X in den HEL30-Zellen auf Proteinebene exprimiert sind, jedoch konnte keine Veränderung der Proteinexpression dieser beiden Enzyme nach TPA-Behandlung der HEL30 Zellen detektiert werden. Dies führte zu der Annahme, dass diese Enzyme eventuell, wie die cPLA2, über ihre Enzymaktivität oder eine zelluläre Translokation reguliert werden. Durch den Einsatz des sPLA2-Inhibitors Me-Indoxam konnte jedoch weder die konstitutive noch die TPA-stimulierte PGE2 Produktion gehemmt werden, was vermutlich, wie die anschließenden siRNA Studien zeigen, auch an der Eigenschaft dieses Inhibitors liegen könnte nicht membrangängig zu sein. Weiterhin konnte durch den Einsatz des COX-2-spezifische Inhibitors Celecoxib und des COX-1-präferierende Inhibitor Indomethazin gezeigt werden, dass COX-2 vor allem an der TPA induzierte PGE2-Freisetzung, und COX-1 sowohl an der konstitutiven als auch an der der TPA induzierten PGE2-Freisetzung aus HEL30 Zellen beteiligt sind. Die Ergebnisse der Untersuchungen mit dem cPLA2-Inhibitor Pyrrolidin-1 lassen vermuten, dass in diesen Zellen die cPLA2 vor allem an der TPA induzierten PGEs-Synthese beteiligt ist, aber nicht an der konstitutiven Freisetzung. Während in unbehandelten HEL30 Zellen die sPLA2-IID im Cytosol exprimiert ist und eine schwache Kolokalisation mit COX-2 zeigt, verlagert sich dieses Enzym nach 20 minütiger TPA Stimulation, in Richtung Kernmembran und zeigt nun eine sehr starke Kolokalisation mit COX-2. Nach Inkubation der HEL30 Zellen mit einer siRNA, die die Expression der sPLA2-IID ausschalten sollte, war sowohl die konstitutive als auch die TPA-induzierte PGE2-Biosynthese signifikant reduziert. Gleichzeitig konnte durch den Einsatz der siRNA eine Reduktion des sPLA2-IID-Proteins beobachtet werden. Dies deutet an, dass die sPLA2-IID mit beiden Cyclooxygenasen gekoppelt sein könnte und ihr Substrat je nach Stimulation und Änderung der Lokalisation dem einen oder dem anderen Enzym zur Verfügung stellt. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die sPLA2-IID intrazellulär katalytisch aktiv ist und signifikant zur PGE2-Biosynthese beiträgt. Um genauere Aussagen über die Bedeutung dieser sehr interressanten Ergebnisse machen zu können, sind weitere Untersuchungen nötig, um herrauszufinden, ob die Herunterregulierung der sPLA2-IID - z.B. in Form einer sPLA2-IID-knockout-Maus - Konsequenzen für die Hyperproliferation derKeratinozyten hat, und somit einen Einfluß auf die Progression der Tumorpromotion ausüben könnte. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein spezifisches Expressionsmuster für die Gruppen I, II, V, X und XII sPLA2 in der murinen Haut beschrieben werden, welches mit der Regulation von Wachstum und Differenzierung verbunden ist. Hieraus läßt sich schließen, dass die einzelnen sPLA2 Enzyme unterschiedliche Funktionen in der epidermalen Homöostase sowohl unter normalen als auch pathologischen Bedingungen ausüben.
In allen bislang durchgeführten Experimenten zur Mutagenese von embryonalen Stammzellen war auffällig, dass Gene, die für sekretierte oder membranständige Proteine kodieren, stark unterrepräsentiert waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Genfallen untersucht, die speziell diese Gene mutieren sollten. Als Selektionskassetten tragen beide Genfallen den 5' Bereich des humanen CD2, der eine kryptische Spleißakzeptorsequenz enthält und für eine Transmembrandomäne kodiert, als Fusion mit der bakteriellen Neomycinphosphotransferase. U3Ceo trägt diese Kassette als klassische retrovirale Genfalle im LTR des Mouse Molony Leukemia Virus, wogegen die ebenfalls retrovirale FlipRosaCeo Genfalle die Selektionskassette im Viruskörper enthält. Diese wird von Rekombinaseerkennungssequenzen flankiert, welche eine konditionale Aktivierung der Mutation für die spätere Analyse in einem Mausmodell ermöglichen. Beide Genfallen zeigten mit ca. 80% aller Integrationen eine hohe Spezifität für Gene, die für sezernierte und membranständige Proteine kodieren. Allerdings war die Frequenz für Insertionen in sogenannte „hot spots“ bei beiden Genfallen aufgrund der geringeren Zahl an Zielgenen höher als bei anderen im GGTC verwendeten Genfallen (z.B. FlipRosabetageo). Innerhalb dieser „hot spots“ zeigte sich die bekannte Präferenz retroviraler Genfallenvektoren, in das 5’ Ende von Genen zu integrieren, wobei hier meist die größten Introns zu finden sind. Ebenso zeigte sich für die in dieser Arbeit untersuchten sekretorischen Genfallen genau wie bei anderen bekannten Genfallen eine bevorzugte Integration in Chromosomen mit einer hohen Gendichte. Die Funktionalität der konditionalen Genfalle konnte in vitro sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten durch Einbringen der Genfalle und der jeweiligen Rekombinasen bestätigt werden. In ES Zellen, die eine X-chomosomale Integration aufwiesen, wurde der Mechanismus durch transiente Expression der Rekombinasen in Klonen überprüft. Hierbei stellte sich heraus, dass das Wildtyptranskript eines mutierten Gens nach der einmaligen Rekombination der FlipRosaCeo wieder exprimiert wird und nicht durch die auf dem Gegenstrang befindliche Genfalle beeinflusst wird. Nach einer weiteren Rekombination mittels FLPe konnte der mutagene Ausgangszustand der Genfalle wieder hergestellt werden. Die Mutagenität der beiden Genfallen wurde durch Überprüfung der Konzentration der restlichen endogenen Transkripts der mutierten Gene per quantitativer PCR an X-chromosomalen Klonen analysiert. Hier konnte bei etwa 80% der untersuchten Klone eine sehr starke Mutation des jeweils getroffenen Gens festgestellt werden. Zur in vivo Überprüfung der U3Ceo Genfalle wurde ein Mausmodell durch Blastozysteninjektion des ES Zellklons M076C04 generiert. Die Integration der Genfalle in das erste Intron des Gens C030019F02Rik sollte eine deutliche Verkürzung des membranständigen Genproduktes bewirken. In Gehirnen von homozygoten Mäusen konnte die Expression des Wildtyptranskripts nicht mehr festgestellt werden, so dass diese Mauslinie eine Nullmutation des Gens trägt. Die in dieser Arbeit untersuchte KO Maus zeigte bisher keinen feststellbaren Phänotyp, obwohl das Genprodukt in vielen Spezies hoch konserviert vorliegt und auch nur in bestimmten Bereichen im Organismus nachweisbar ist, so dass eine wichtige Funktion des Proteins anzunehmen ist. Eine weitere Analyse dieser Mauslinie wird sich dieser Arbeit anschließen.