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In der vorgelegten Arbeit wurden 50 Mutationen von Aminosäuren im Bereich der Chinoloxidationsbindungsstelle (Qo-Site) des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans untersucht. Hierzu wurden die Mutanten erstellt, Kinetiken der Substratbindung bestimmt und EPR Spektren aufgenommen. Mit den gleichen Methoden wurden auch verschiedene Klasse I und Klasse II Inhibitoren der Qo-Site untersucht. Wenngleich der Reaktionsmechanismus auch mit Hilfe dieser Mutationen nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, so konnten doch neue Einsichten in die Funktionsweise des bc1-Komplexes gewonnen werden. Verschiedene Modelle wurden vorgeschlagen, um die energetisch günstige aber thermodynamisch unwahrscheinliche Verzweigung der beiden Elektronen des Ubichinols auf die beiden Redoxketten des bc1-Komplexes der Atmungskette zu beschreiben. Da die Redoxpotentiale der beiden primären Elektronenakzeptoren extrem unterschiedlich sind, scheint es zwingend zu sein, dass beide Elektronen den Hochpotentialzweig (Rieske, Cytochrom c1, Cytochrom c) durchlaufen. Energetisch bietet jedoch die Wiederverwendung eines der beiden Elektronen den immensen Vorteil der realen Verdopplung der Protonenpumpleistung. Die wichtigsten Mutationen der vorliegenden Arbeit betreffen die vermuteten direkten Bindungspartner des Ubichinols, bE295 und fH155. Das Histidin ist Teil der beweglichen Rieske Untereinheit des bc1-Komplexes, das Glutamat ist Teil eines hoch konservierten Abschnitts des Cytochrom b. Aufgrund der gemessenen Wirkungen der untersuchten Mutationen auf die kinetischen Kennzahlen und EPR Parameter der eingesetzten Substrate und Inhibitoren lassen sich folgende Schlüsse ziehen. Die Bindung des Chinol-Substrats in der Qo-Site benötigt die korrekte Ausrichtung und den unveränderten Bindungspartner fH155 der Rieske [2Fe-2S]-Gruppe. Das Fehlen des zweiten vermuteten Bindungspartners bE295, der ein Teil des hochkonservierten PEWY-Loops ist, wird hingegen toleriert. Die Aktivitäten bei Mutationen dieser Aminosäure liegen mit bis zu 56% im Vergleich zum Wildtyp (bE295A) relativ hoch. Auch unter Berücksichtigung von möglichen bypass Reaktionen ist es fraglich, ob das Glutamat des PEWY-Loops ein direkter Bindungspartner des Substrats ist. Der Inhibitor Stigmatellin bindet im bc1-Komplex von Paracoccus denitrificans irreversibel in der Qo-Site, auch wenn einer der beiden vermuteten Bindungspartner (bE295 bzw. fH155) nicht verfügbar oder verändert ist. Daraus kann man schließen, dass die Bindung des Stigmatellins im Wesentlichen von seiner Seitenkette im Bereich des Chinol-Eintrittskanals des bc1-Komplexes stabilisiert wird. Wechselwirkungen der bizyklischen Kopfgruppe mit Aminosäuren der Chinoloxidationsbindungstasche sind hierfür nicht zwingend notwendig. Weitere durchgeführte Mutationen lassen folgende weitere Rückschlüsse zu: Der korrekte Bindungsraum der Qo-Site ist für eine maximale Umsatzgeschwindigkeit des bc1-Komplexes erforderlich. Dies zeigen Mutationen von bG158 und bV161. Die Struktur des hochkonservierten PEWY-Loops ist mitentscheidend für die Aktivität des bc1-Komplexes. Störungen der Konfiguration in diesem Bereich führen zu einer deutlichen Abnahme der Aktivität. Dies lassen Mutationen von bY297, bP294 und bW296 erkennen. Der ef-Loop hat einen Einfluss auf die Bewegungsvorgänge der Rieske-Kopfgruppe. Er ist jedoch nicht sehr flexibel (bL286H). Veränderungen im Wasserstoffbrückennetzwerk der Rieske-Kopfgruppe führen zu einer deutlichen Verminderung der Elektronentransferraten (bY159F, bS157A und bF151H). Die Bindungsregionen von Klasse I Inhibitoren in der Qo-Site überlappen mit denen des natürlichen Substrats. Sie sind jedoch nicht identisch, was sich im unterschiedlichen Verhalten einiger Mutationen auf die Aktivität von Substrat und die Inhibitionswirkung von Klasse I Hemmstoffen ausdrückt. Die Untersuchungen der Auswirkungen von Mutationen auf einen vermuteten Wasserkanal im Bereich des Häm bL und auf eine angenommene Zinkbindungsstelle im gleichen Bereich zeigen keine eindeutig interpretierbaren Ergebnisse. Die Mutationsstudien im Bereich des Cytochrom c1 wurden begonnen. Zusätzliche Mutanten in diesem Bereich könnten weiterführende Aufschlüsse über die Wechselwirkung der Rieske-Kopfgruppe mit Cytochrom c1 bringen. Die vorgelegte Studie lässt erkennen, dass die Vorgänge in der Qo-Site des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans höchst komplex sind. Zusätzliche Untersuchungen der erzeugten Mutanten mit Hilfe weiterer Detektionsmethoden, insbesondere CD- und FTIR-Messungen, könnten in Zukunft eine noch bessere Einsicht in die Vorgänge dieses wichtigen Komplexes der Atmungskette geben.
Colorectal cancer is one of the most cause of cancer and death in Western societies. Recently, histone deacetylase inhibitors (HDIs), which regulate transcription through modification of chromatin structure, received considerable interest on the ground of they ability to stop the growth and induce cell death in colon cancer tumours, representing a promising transcriptional cancer therapy. This kind of cancer initiates with an activating mutation in the Wnt cascade, allowing the nuclear import of ß-catenin binding to LEF/TCF. This induces the overexpression of growthpromoting oncogenes affecting the cell cycle arrest, lineage-specific cell differentiation and apoptosis processes. In addition, ß-catenin also participates in cell-cell adhesion via interactions with E-cadherin, which can be repressed by families of transcription factors Snail and ZEB. This, and gain of vimentin has been closely correlated with local invasion and metastasis since they avoid the induction of apoptosis through the loss of cell anchorage, a phenomenon called anoikis. In this process the inactivation of the kinases Src an FAK provoking disruption of focal adhesion complexes through is involved. LAQ824 is a HDAC inhibitor derivative of hydroxamic acid, which present antitumor effect in colon and other cancer cells. The aim of this study is to analyse the effect of LAQ824 in cell proliferation, apoptosis, motility and tumour invasion in a colon carcinoma model based on the adenoma-carcinoma sequence descrying trough which pathways LAQ824 is able to cause these effects. Here I demonstrate for the first time that a HDAC inhibitor, LAQ824, induces detachmentinduced cell death of colon cancer cell lines HCT116 and HT-29, a phenomenon called anoikis, in a caspase-dependent and p53-independent manner. In this process the component of the Wnt signalling pathway ß-catenin is involved. Furthermore LAQ824 upregulates the adhesion molecule E-cadherin expression in these cell lines independently of its repressor Snail, but probably mediated by the repressor ZEB. In addition LAQ824-induced anoikis is caused by disruption of focal adhesion complexes through inhibition of the activity of the kinases FAK and Src inhibiting cell motility indicating a strong antimetastatic potential for LAQ824.
The chemiosmotic theory suggested by Peter Mitchell (Mitchell, 1961, Nature 191:144-148; see Mitchell, 1979, Science 206:1148-1159 for review) postulated that the energy released upon the oxidation of electron donor substrates is transiently stored as electrochemical proton potential, delta-p across energy-transducing membranes, which acts then as the driving force for the ATP synthesis. Membrane protein complexes can both generate and utilise a transmembrane electrochemical proton potential, either by transmembrane proton transfer or by transmembrane electron transfer coupled to protolytic reactions on opposite sides of the membrane. The dihaem-containing membrane protein complex quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic epsilon-proteobacterium Wolinella succinogenes apparently combines both of these mechanisms (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961; Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865; Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728; Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970). QFR is the terminal enzyme of anaerobic fumarate respiration that allows bacteria to use fumarate as the terminal electron acceptor (Kröger, 1978, Biochim Biophys Acta 505:129-45; Lancaster, 2004, In: Respiration in Archaea and Bacteria Volume 1:57-85). QFR couples the two-electron reduction of fumarate to succinate to the two-electron oxidation of quinol to quinone. QFR contains two haem b groups bound by the transmembrane subunit C, which are termed the ‘proximal haem’, bP, and the ‘distal haem’, bD, according to the relative proximity to the hydrophilic subunits A and B (Lancaster et al, 1999, Nature 402:377-85). The two-electron transfer via the two haem groups has been proposed (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1565:215-231) and demonstrated (Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970) to be coupled to a compensatory, parallel transfer of two protons via a transmembrane proton transfer pathway. The two most prominent constituents of the proposed pathway were suggested to be the haem bD ring C propionate and the side chain of amino-acid residue Glu C180, after which the proton transfer pathway was named the ‘E-pathway’ (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 565:215-231). The essential role of Glu C180 was supported by site-directed mutagenesis and structural and functional characterization of the enzyme E180Q, where the Glu C180 was replaced with a Gln residue (Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865). Moreover, multiconformer continuum electrostatics (MCCE) calculations (Haas and Lancaster 2004, Biophys J 87:4298-4315) and Fouriertransformed infrared (FTIR) spectroscopy experiments (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961) indicated the Glu C180 side chain to undergo a combination of a conformational change and protonation upon haem reduction. The contribution of haem bD propionate is less clear, however, a combination of 13C labelling of the haem propionates with redox-induced FTIR experiments (Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728) and MCCE calculations (Haas and Lancaster, 2004, Biophys J 87:4298-4315) support a change in protonation, possibly accompanied by a change in environment upon haem reduction. These experiments and their results strongly support the existence of the ‘E-pathway’ which is transiently open during the reduction of the haem groups and blocked in the oxidized state of the enzyme (Lancaster, 2002b, Biochim Biophys Acta 1565:215-231). All available crystal structures of the QFR, however, are those of the oxidized enzyme. Therefore, it is advantageous to perform simulations of various redox states of the enzyme to determine for instance, how the side-chain of Glu C180 and haem bD ring C propionate behave upon changes of the redox states of the haem groups and why is the ‘E-pathway’ blocked in the oxidized state of the enzyme. Although the distal haem ring C propionate and Glu C180 were identified as the most prominent components of the proton transfer pathway, it was not clear, on the basis of the structure, how proton transfer could occur between them. In addition, two constituents are not enough to span the membrane region and the additional participants in the proton transfer pathway must be identified. Since an atomistic investigation of proton transfer in this system is not yet possible experimentally, I used available theoretical methods such as classical molecular dynamics (MD) simulation (Alder and Wainwright, 1959, J Phys Chem 31:459-466; McCammon et al, 1977, Nature 267:585-590) and Q-HOP molecular dynamics (Q-HOP MD) simulation (Lill and Helms, 2001, J Chem Phys 115:7993-8005) to investigate the postulated mechanism of electron coupled proton transfer in QFR. MD simulations allowed us to move away from static difference pictures obtained from FTIR experiments and MCCE calculations. The advantage of the MD simulations over the experiments and the simulations performed so far is that the time-dependent properties could now be analyzed. The behaviour of various residues and their side-chains and any environmental changes may be directly observed during MD simulations. Although classical MD simulations cannot be used to study proton transfer reactions, they can provide information on formation of configurations that would allow either direct proton transfer between donor and acceptor residues or indirect proton transfer mediated by water molecules. To avoid the static protonation of residues which is inherent in classical MD simulations, Q-HOP MD simulations were performed which explicitly describe proton transfer reactions by allowing the change of the protonation state of residues ‘on the fly’. The structures obtained after classical molecular dynamics simulations ....
Die Replikation und Pathogenese von HIV ist in hohem Maße von zellulären Faktoren abhängig. Das Virus muss einerseits die protektiven und antiviralen Abwehrmechanismen der Wirtszelle umgehen können und gleichzeitig ist seine Replikation an die Nutzung zellulärer Faktoren adaptiert. Neben der Interaktion mit konstitutionell exprimierten zellulären Proteinen bewirkt das HI-Virus auch eine transkriptionelle Regulation zellulärer Gene, um sich einen für seine Replikation vorteilhaften Funktionszustand der Wirtszelle zu schaffen. Durch eine HIV-Infektion differentiell exprimierte Gene stellen daher potentielle Kandidatengene zur Identifizierung essentieller Wirtsfaktoren oder zellulärer Restriktionsfaktoren der HIV-Replikation dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die durch HIV-Infektion differentiell regulierten Gene LEREPO4, GLiPR, SCC-112 und Moesin auf eine mögliche Funktion bei der HIV-Replikation analysiert. Dabei wurden diese durch RNA Interferenz (RNAi) im Kontext einer HIV-Infektion reprimiert. Als zelluläres Modellsystem wurden P4-CCR5-Zellen verwendet, bei denen eine Infektion mit dem Virusstamm HIV-1Bru eine Induktion der Gene LEREPO4, GLiPR und Moesin sowie eine Repression von SCC-112 bewirkte. Die RNA-Interferenz vermittelte Suppression dieser Gene erfolgte durch Applikation von synthetischen siRNA Oligonukleotiden oder durch intrazelluläre Expression von short hairpin RNAs (shRNA). Durch den Einsatz von shRNAs konnte jedoch unter den vorliegenden Versuchsbedingungen nur eine unzureichende Gensuppression erreicht werden. Aus diesem Grund wurden synthetische siRNA Oligonukleotide verwendet. Es konnte eine deutliche Reduktion der jeweiligen Zielgene bewirkt werden, ohne dass nennenswerte Effekte auf den Phänotyp und die Viabilität der Zellen beobachtet wurden. Der Einfluss der siRNA-vermittelten Gensuppression auf die HIV-Replikation wurde durch Infektion der Zellen ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass die Depletion von GLiPR und LEREPO4 eine deutliche Inhibition der HIV-Replikation bewirkte. Das Ausmaß der Inhibition war ähnlich ausgeprägt, wie durch Verwendung einer bereits publizierten, gegen das virale Gen p24 gerichteten siRNA. Die Depletion von SCC-112 hatte im Gegensatz hierzu keine eindeutige Wirkung auf die HIV-Replikation, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass seine Repression während einer HIV-Infektion ein unspezifischer bzw. sekundärer Effekt ist. Die siRNA-vermittelte Suppression von Moesin führte zu einem unerwarteten Ergebnis, da eine deutliche Steigerung der HIV-Replikation im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wurde. Damit konnte erstmals belegt werden, dass Moesin nicht für die HIV-Replikation benötigt wird, wie es durch andere Arbeiten postuliert wurde. Diese Annahme begründete sich auf der Beobachtung, dass Moesin in Viruspartikel inkorporiert wird. Daher wurde eine Beteiligung an der Zusammenlagerung oder Abschnürung viraler Partikel vermutet. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse lassen vermuten, dass LEREPO4 und GLiPR notwendige Faktoren der HIV-Replikation sind, wohingegen Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln scheint. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Wirkung auf die HIVReplikation sind jedoch weitgehend unklar. Da die Proteine LEREPO4, SCC-112 und GLiPR nicht oder nur unzureichend charakterisiert sind, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit zelluläre Funktionen dieser Proteine zu ermitteln, um Rückschlüsse auf ihre Funktion bei der HIV-Replikation zu gewinnen. Es konnten polyklonale Antikörper gegen LEREPO4 generiert werden, mit denen eine Bestimmung der zellulären Lokalisation möglich war. Mittels Co-Immunopräzipitation wurde die Interaktion von LEREPO4 und TRAF-2 nachgewiesen. Die Bestimmung des Einflusses von LEREPO4 auf die NF-κB-Aktivierung lässt vermuten, dass LEREPO4 an der TRAF-vermittelten Signaltransduktion beteiligt ist. Untersuchungen zur Funktion von GLiPR zeigten, dass es sich möglicherweise um ein sekretorisches Protein handeln könnte, wie durch den fluoreszenzmikroskopischen Nachweis eines GLiPR-EGFP-Fusionsproteins in HeLa-Zellen ermittelt wurde. Weiterhin konnte mittels Annexin-V-Färbung und TUNEL-Assay belegt werden, dass eine exogene Expression des GLiPRs in HeLa Zellen zu einem deutlichen Anstieg der Apoptoserate führte. Zusätzlich wurden für jedes Protein Genexpressionsprofile nach siRNA vermittelter Repression mittels Microarray-Analyse erstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LEREPO4 und GLiPR mögliche Kofaktoren der HIV-Replikation darstellen. Im Gegensatz hierzu scheint Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln. Auf Grundlage der in dieser Arbeit ermittelten Daten können weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden, um die genaue Funktion der oben genannten Proteine bei der HIV-Replikation zu klären.
Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.
The ABC protein ABCE1, also called HP68 or RNase L inhibitor (RLI), is one of the most conserved proteins in evolution. It is universally expressed in eukaryotes and archaea, where ABCE1 is essential for life. ABCE1 plays a crucial role in translation initiation and ribosome biogenesis, however, the molecular mechanism of ABCE1 remains unclear. In addition to two ABC ATPase domains, ABCE1 contains a unique N-terminal region with eight conserved cysteines predicted to coordinate iron-sulfur (Fe-S) clusters. To analyze the function of ABCE1, the hyperthermophilic crenarchaeote Sulfolobus solfataricus was chosen as a model system. S. solfataricus ABCE1 was overexpressed homologously in S. solfataricus and heterologously in E. coli. Noteworthy, for tagged-protein production in S. solfataricus a novel expression system based on a virus shuttle vector was established. This is the first example for a successful overexpression and purification of isolated full-length ABCE1. For the first time it was shown that ABCE1 indeed bears biochemical properties of an ABC protein even though it has unique features. Remarkably, the nucleotide binding domains (NBDs) of ABCE1 bound ATP and AMP, but were functionally non-equivalent in ATP hydrolysis. Mutations of conserved residues in the second NBD led to a hyperactive ATPase, which implies an intramolecular mechanism of dimer formation. Truncation of the Fe-S cluster domains did not influence ATPase activity. The Fe-S clusters of ABCE1 were analyzed by biophysical and biochemical methods. As presented in this study, ABCE1 harbors two essential diamagnetic [4Fe-4S]2+ clusters, one ferredoxin-like cluster formed by cysteines at position 4/5/6/7 and one unique ABCE1 cluster formed by cysteines at position 1/2/3/8. ABCE1 was found to be associated with RNA after purification from S. solfataricus and bound ribosomal RNA in vitro. In addition, ABCE1 showed homo-oligomerization and appeared to form a hexameric complex of ~440 kDa, which was RNase sensitive. Archaeal ABCE1 associated with ribosomes, however, the unique Fe-S clusters of ABCE1 were not required for this interaction. Although archaeal ABCE1 assembled with ribosomes and ribosomal RNA, ABCE1 proved not to be essential for translation in S. solfataricus and did not interact with archaeal initiation factors. Nevertheless, the ABCE1 gene is one of the few genes conserved between archaea and eukaryotes and fulfills a universal task, which needs further characterization.
Two distinct mechanisms contribute to the development of blood vessels: vasculogenesis, which is the de novo formation of vascular structures from progenitor cells, and angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones.
Angiogenesis is a highly ordered and carefully regulated multi-step process, during which the precise spatio-temporal interaction between endothelial and mural cells, i.e. smooth muscle cells and pericytes, is prerequisite for the formation of a functional blood vessel. The crosstalk between these two latter cell ty pes is mediated indirectly by various
secreted growth factors, and directly through cell-cell and cell-matrix interactions. The secretory epidermal growth factor-like protein 7 (EGFL7) has been implicated to
play an important role in the regulation of smooth muscle and endothelial cell recruitment and vascular tube formation. However, in-depth investigation of the underlying molecular mechanism has so far been hampered by the lack of functional recombinant EGFL7. In this study for the first time full length EGFL7 was successfully expressed as a His 6- tagged fusion protein from insect cells using the Baculovirus expression vector system. Recombinant EGFL7 was purified in a two-step protocol involving ion metal affinity chromatography and gel filtration. Furthermore, recombinant EGFL7 was
purified from human embryonic kidney EBN A 293 cells using a similar approach, allowing the production of high amounts of recombinant EGFL7 protein in its native state, with proper post-translational processing and full biological activity. Detailed analysis of the post-translational processing of recombinant EGFL7 and EGFL7-mutants revealed extensive proteolytic processing by protein convertases both at the N- and the C-terminus, the latter being prerequisite for EGFL7 secretion. Furthermore, secreted EGFL7 protein was shown to bind to the extracellular matrix and the responsible heparin-binding domain of EGFL7 was mapped to its N-terminal
portion. Purified recombinant EGFL7 protein was tested for its functionality using cell migration assays, cell proliferation studies and in vivo matrigel studies in mice. In the
modified Boyden chamber migration assay, recombinant EGFL7 proteins inhibited PDGF-BB-induced smooth muscle cell migration. Moreover, recombinant EGLF7 proteins strongly inhibited PDGF-BB-induced proliferation of smooth muscle cells, while it did not affect VEGF induced proliferation of endothelial cells. When applied in the in vivo matrigel plug assay, EGFL7 proteins induced a strong pro-angiogenic response, comparable with that of VEGF on an equimolar basis. Moreover, EGFL7 expression was strongly induced in endothelial cells in response to VEGF stimulation. These novel findings demonstrate the important function of EGFL7 in angiogenesis and are well in line with previous results. They demonstrate a cell specific action of EGFL7 on the different cell types involved in vessel formation, which is a prerequisite for a regulatory function in cell-to-cell crosstalk. Based on the results described here, the following model can be proposed: VEGF, a known strong initiator of angiogenesis, induces endothelial cell proliferation and migration, allowing the
escape from the comparatively rigid structure of a functional vessel to form an angiogenic sprout. At the same time VEGF induces the expression of EGFL7 in endothelial cells. EGFL7 is expressed, proc essed and secreted from these cells. While EGFL7 has no known effect on endothelial cells, it inhibits smooth muscle cell proliferation and migration, providing a mechanism to prevent pre-mature stabilization of the forming vessel. The availability of purified recombinant EGFL7 will be helpful in the detailed characterization of the underlying molecular mechanism of EGFL7 action, including the identification of the putative EGFL7 receptor, and will allow - together with knock-out experiments in mice - the exploration of the additional biological functions of EGFL7. Moreover, considering the strong pro-angiogenic effect of EGFL7 in vivo, it would be also of a great therapeutic interest to investigate its role in the development of tumor vasculature. The insights into these molecular mechanisms might provide a novel approach for the development of anti tumor therapies.