Institutes
Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (299) (remove)
Language
- English (202)
- German (96)
- Multiple languages (1)
Has Fulltext
- yes (299)
Is part of the Bibliography
- no (299)
Keywords
- Arzneimittel (2)
- C. elegans (2)
- DNA (2)
- EPR (2)
- G-Quadruplex (2)
- GPCR (2)
- Metabolism (2)
- NMR (2)
- Pharmazeutische Technologie (2)
- Pharmazie (2)
Institute
- Biochemie, Chemie und Pharmazie (299)
- MPI für Biophysik (1)
- Medizin (1)
- Pharmazie (1)
Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von molekularen Systemen, die aus mehreren Chromophoren bestehen und über einen Zweiphotonen-Prozess aktiviert werden können.
Die Zweiphotonen-Absorption (2PA) beschreibt die nahezu simultane Absorption zweier Photonen, deren Summe die Energie ergibt, die für den entsprechenden elektronischen Übergang nötig ist. Da für die Anregung somit zwei niederenergetische Photonen benötigt werden, kann für die 2PA Nahinfrarot-Licht (NIR-Licht) verwendet werden, welches eine geringe Phototoxizität aufweist und eine tiefe Gewebedurchdringung ermöglicht. Weiterhin wird durch die intrinsische dreidimensionale Auflösung der 2PA eine hohe Ortsauflösung der Photoaktivierung erzielt.
Photolabile Schutzgruppen (PPGs) bzw. Photocages sind chemische Verbindungen, die der vorübergehenden Maskierung der biologischen Funktion eines (Makro-)Moleküls dienen. Sie können durch Licht geeigneter Wellenlängen abgespalten werden (uncaging), wodurch die Aktivität des geschützten Substrats wiederhergestellt wird. Leider weisen viele der etablierten PPGs schlechte Zweiphotonen-Eigenschaften auf. Um die 2P-Aktivität einer PPG zu erhöhen, kann sie kovalent mit einem guten Zweiphotonen-Absorber verknüpft werden, der bei Bestrahlung das Licht über einen Zweiphotonen-Prozess absorbiert und anschließend mittels Energietransfer auf die photolabile Schutzgruppe überträgt. Dies führt schließlich zur Uncaging-Reaktion.
Im Zuge von Projekt I dieser Dissertation wurde eine solche molekulare Dyade für verbessertes Zweiphotonen-Uncaging bestehend aus einem Rhodamin-Fluorophor als Zweiphotonen-Absorber und einem Rotlicht-absorbierenden BODIPY als photolabile Schutzgruppe hergestellt und charakterisiert. Die Zweiphotonen-Aktivität des Fluorophors wurde mittels TPEF-Messungen (two-photon excited fluorescence) untersucht. Anschließend wurde das Rhodamin an einen 3,5-Distyryl-substituierten BODIPY-Photocage gekuppelt. Der Energietransfer innerhalb dieser Dyade wurde mithilfe von transienter Ultrakurzzeit-Spektroskopie und quantenmechanischen Berechnungen untersucht. Die Freisetzung der Abgangsgruppe para-Nitroanilin (PNA) bei Belichtung der Dyade konnte sowohl nach Einphotonen-Anregung des Rhodamins als auch des BODIPYs mithilfe von UV/vis-Absorptionsmessungen qualitativ nachgewiesen werden.
Da die Uncaging-Reaktion allerdings nicht besonders effektiv war, wurde für die Weiterführung des Projekts ein neuer BODIPY Photocage, der eine verbesserte Photolyse-Effizienz und eine höhere Photostabilität aufwies, verwendet und erneut an einen Rhodamin-Fluorophor geknüpft. Anhand dieser optimierten Dyade konnte die Einphotonen-Photolyse quantifiziert, d.h. eine Uncaging-Quantenausbeute für die Freisetzung von PNA bestimmt werden. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Photolyse der Dyade mit einer deutlichen Änderung ihrer Fluoreszenzeigenschaften einherging. Dies ermöglichte einen Nachweis des Zweiphotonen-Uncagings mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops. Die Dyaden-Moleküle wurden zur Immobilisierung in Liposomen eingeschlossen und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop belichtet. Sowohl nach Einphotonen- als auch nach Zweiphotonen-Anregung der Rhodamin-Einheit konnte die gewünschte Fluoreszenzänderung beobachtet und somit das Uncaging bestätigt werden.
In Projekt II der Dissertation wurde ein photoaktivierbarer Fluorophor (PAF) hergestellt. PAFs liegen in ihrer geschützten Form dunkel vor. Durch die Aktivierung mit Licht können sie Fluoreszenzsignale emittieren. Sie liefern somit ein direktes Feedback über die Lichtverteilung und –intensität innerhalb einer Probe und werden somit unter anderem für die Charakterisierung und Optimierung von Belichtungsapparaturen verwendet. Besonders wünschenswert ist hierbei eine Fluoreszenzaktivierung mit sichtbarem Licht bzw. mit NIR-Licht über einen Zweiphotonen-Prozess.
Im Zuge der Arbeit wurde ein Rhodamin-Derivat synthetisiert, das durch die Anbringung eines DEACM450-Photocages in seine nichtemittierende Form gezwungen wurde. Bei Bestrahlung mit 455 nm konnte die Abspaltung der Cumarin-Schutzgruppe und der damit verbundene Anstieg der Rhodamin-Fluoreszenz beobachtet und eine Uncaging-Quantenausbeute bestimmt werden. Für die Untersuchung der Zweiphotonen-Photolyse wurde der geschützte Fluorophor in einem Hydrogel immobilisiert und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Anschließend wurden Fluoreszenzbilder vor und nach Photoanregung von bestimmten Regionen des Hydrogels aufgenommen. Durch das Uncaging der Probe konnten helle, definierte Muster geschrieben und ausgelesen werden. Die Photoaktivierung führte dabei sowohl über die Einphotonen-Anregung mit blauem Licht (488 nm) als auch über die Zweiphotonen-Anregung mit NIR-Licht (920 nm) zur Generierung von stabilen, gleichmäßigen Fluoreszenzmustern mit hohem Kontrast.
Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Reaktivität zweifach reduzierter 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracene [A]2– erweitern das Einsatzspektrum von Hauptgruppenverbindungen im Hinblick auf die Aktivierung kleiner Moleküle. Komplementär zu Übergangsmetallkomplexen und FLPs ermöglichen die Salze M2[A] (M+ = Li+, Na+, K+) die Entwicklung neuartiger Synthesestrategien. Als besondere Herausforderung gilt die Aktivierung des stabilen H2-Moleküls, dessen Bindung die Dianionen [A]2– homolytisch in einer konzertierten Reaktion spalten.
Untersuchungen zur Kinetik der H2-Addition an M2[A] stellten die Abhängigkeit dieses Reaktionsschritts vom borgebundenen Substituenten und vom Kation heraus. Eine geringe sterische Abschirmung der Boratome durch kleine borgebundene Substituenten (C≡CtBu, Me, H) begünstigt die H2-Aufnahme gegenüber großen Substituenten (pTol, Xyl, Et). Die maximale Ausbeute an M2[A-H2] wird für M+ = Li+ erst nach mehreren Tagen bei 100 °C erhalten, während einige Stunden bei nur 50 °C für die quantitative Bildung von K2[A-H2] ausreichen.
Unter den Salzen M2[A] eignet sich Li2[68] mit borgebundenen Me-Substituenten besonders gut für den Einsatz als Hydrierungskatalysator. Mit Li2[68] konnten das Imin Ph(H)C=NtBu, das terminale Alken Ph2C=CH2 und Anthracen erfolgreich im NMR-Maßstab hydriert werden (Katalysatorladung 37 mol%, THF-d8, 1 atm H2-Initialdruck, 100 °C, 16 h). Im Reaktionsautoklaven war für die Hydrierung von Ph(H)C=NtBu eine Verringerung der Katalysatorladung auf 10 mol% Li2[68] möglich (THF, 7 atm H2-Initialdruck, 100 °C, 18 h). Konkurrenzreaktionen begründen Einschränkungen in Bezug auf die Substratpalette, da M2[68] (M+ = Li+, Na+) mit elektronenarmen ungesättigten Verbindungen, die C=C-, C≡C-, C=O- oder C=N-Bindungen enthalten, [4+2]-Cycloadditionsprodukte bilden können. Die Reversibilität dieser Reaktion entscheidet, ob Li2[68] als Katalysator fungiert oder irreversibel in den Strukturen gebunden bleibt.
Vielseitiger sind die H2-Aktivierungsprodukte M2[A-H2] als H–-Donoren geeignet: Na2[68-H2] ersetzt Halogenid- durch H–-Substituenten in Bromethan, sowie in Chlorsilanen und PCl3; CO2 wird in Natriumformiat überführt. Unabhängig von der Anzahl der Chlorliganden werden die Produkte immer vollständig hydriert. Eine erneute Reduktion von 68 kann wieder Na2[68] bereitstellen, das H2 aufnimmt und Na2[68-H2] regeneriert, welches für neue H–-Abgaben zur Verfügung steht. Bei der experimentellen Umsetzung des Kreislaufs ist es wichtig, die beschriebenen Reaktionsschritte nacheinander auszuführen und jeweils nur stöchiometrische Mengen des Elektrophils zuzugeben. Bei Abweichungen vom schrittweisen Syntheseprotokoll finden formale nukleophile Substitutionen mit M2[68] statt und monoanionische Spezies entstehen, z. B. wenn Et3SiBr als Elektrophil anwesend ist.
Gegenüber CO2 zeigt Li2[68] eine hohe Reaktivität, durch die selektiv CO und [CO3]2– gebildet werden. Wie zuvor bei den H–-Transferreaktionen ermöglicht die Reduktion der Neutralverbindung 68 die Regeneration von Li2[68].
Die Dianionen [A]2– stechen unter anderen cyclischen Borverbindungen in niedrigen Oxidationsstufen heraus, da mit [A]2– nicht nur die Aktivierung von H2 oder CO2 gelang, sondern erstmalig über die Einbindung der Additionsprodukte in zum Teil katalytische Folgereaktionen berichtet werden konnte.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die Untersuchungen lichtgesteuerter Reaktionen der zwei Retinalproteine Channelrhodopsin-2 (ChR-2) und Proteorhodopsin (PR) mit Hilfe zeitaufgelöster Laserspektroskopie.
Da der Mechanismus der Kanalöffnung des ChR-2 bis heute nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, beschäftigt sich diese Arbeit insbesondere mit den Prozessen, die direkt nach der Photoanregung des Retinals stattfinden und die Kanalöffnung vorbereiten. Es wurde dabei gezielt auf für die Funktion des Proteins wichtige Faktoren wie strukturelle Besonderheiten des Chromophors und seiner Umgebung eingegangen und deren Auswirkung auf die Dynamik der Photoreaktionen sowie die Veränderungen im Protein nach der Anregung untersucht.
Zunächst wurden die Ergebnisse der vis-pump-IR-probe-Experimente an ChR-2 im Bereich der Carbonylschwingungsbanden protonierter Glutamat- und Aspartat-Reste dargestellt. Dabei wurde insbesondere die Bildungsdynamik der Differenzbanden in diesem Spektralbereich untersucht und in Anlehnung an die vorhandene Literatur eine Bandenzuordnung der für die Funktion des Proteins wichtigen Aminosäurereste vorgenommen. Aus den Messergebnissen konnte geschlossen werden, dass die mit der Kanalöffnung einhergehenden Konformationsänderungen in ChR-2 durch eine effektive Aufnahme der Überschussenergie durch das Protein auf einer sub-Pikosekunden-Zeitskala vorbereitet werden.
Des Weiteren wurden spektroskopische Untersuchungen an der R120H-Mutante des ChR-2 vorgestellt. Da diese Mutante bei elektrophysiologischen Messungen keine Kanalaktivität zeigte, sollte zunächst geklärt werden, ob die Mutation einen Einfluss auf die Retinalisomerisierung und den nachfolgenden Photozyklus hat. Dabei stellte sich heraus, dass die Retinalisomerisierung bei der R120H-Mutante zwar im Vergleich zum Wildtyp etwas verzögert stattfindet, der Einfluss der Punktmutation auf den weiteren Photozyklus jedoch insgesamt gering ist. Mit Hilfe der Kurzzeit-IR-Spektroskopie im Bereich der Amid I-Schwingung des Proteinrückgrats konnten für die Mutante allerdings signifikante Veränderungen der Bildungsdynamik sowie eine deutliche Abnahme der Amplitude des Amid I-Signals detektiert werden. Anhand weiterer Experimente an den Mutanten E123T und D253N in diesem Spektralbereich konnte anschließend ein Zusammenhang zwischen der Intensität der Amid I-Bande und der Kanalaktivität von ChR-2 festgestellt werden. Diese Ergebnisse ließen somit die Schlussfolgerung zu, dass die Aminosäurereste R120 und D253 eine entscheidende Rolle beim schnellen Transfer der Überschussenergie an das Protein nach der Retinalanregung und der so initiierten Kanalöffnung spielen.
Zusätzlich wurde der Frage nachgegangen, inwieweit Veränderungen am Chromophor die Isomerisierungsreaktion, den nachfolgenden Photozyklus sowie die Funktion des ChR-2 als Ionenkanal beeinflussen können. Zu diesem Zweck wurden spektroskopische Untersuchungen an einem mit 9-12-Phenylretinal (PheRet) rekonstituierten ChR-2 vorgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung des PheRet zu seiner 13-cis-Form in ChR-2 stark verlangsamt ist und verglichen mit dem nicht modifizierten Chromophor deutlich ineffizienter abläuft. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Veränderungen am Retinal zu deutlichen Beeinträchtigungen des Photozyklus führen. Zum einen wurde ein sehr schneller Zerfall des ersten Photoprodukts sowie die Bildung eines zusätzlichen, blauverschobenen Px-Zustands detektiert. Außerdem wurde festgestellt, dass nach der Deprotonierung des isomerisierten PheRet der Großteil der modifizierten Retinale in den Ausgangszustand zurückkehrt und der P3-Zustand nur in geringen Mengen gebildet wird. Die Messergebnisse führten somit zu der Schlussfolgerung, dass die all-trans-Konformation des PheRet in ChR-2 deutlich bevorzugt wird. Da elektrophysiologische Untersuchungen des Retinal-Analogons jodach keine signifikanten Verminderungen der Photoströme im Vergleich zum ATR in ChR-2 zeigten, ließ sich schließlich festhalten, dass die vorgenommenen Veränderungen am Chromophor, die zu einer deutlichen Hemmung der Isomerisierungsreaktion führen und einen starken Einfluss auf den nachfolgenden Photozyklus haben, nicht ausreichend sind, um die Kanalaktivität von ChR-2 komplett zu blockieren, solange noch ein kleiner Anteil der Retinale isomerisieren kann.
Der abschließende Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Absorption des UV-Lichts durch das Retinal mit deprotonierter Schiff-Base im grünabsorbierenden Proteorhodopsin, welches in einem alkalischen Medium im Dunkelzustand akkumuliert werden kann. Die Untersuchungen der Primärreaktion zeigten einen langsamen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands der UV-absorbierenden Spezies mit anschließender Bildung des 13-cis-Photoprodukts. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte ein Reaktionsmodell für die ersten Prozesse nach der UV-Anregung des Retinals im GPR aufgestellt werden, welches möglicherweise für weitere UV-Rezeptoren genutzt werden kann.
Ribonukleinsäure (ribonucleic acid, RNA) wirkt bei der Proteinbiosynthese nicht nur als Informationsüberträger, sondern kann auch beispielsweise durch sogenannten Riboschalter (auch Riboswitches) regulatorische Funktionen übernehmen. Riboschalter sind komplett aus RNA aufgebaut und man kann sie sich als molekulare Schalter vorstellen, die die Genexpression kontrollieren. Konzeptionell besteht ein Riboswitch aus zwei Untereinheiten, dem Aptamer und der Expressionsplattform. Das Aptamer bindet, üblicherweise sehr spezifisch, kleine organische Moleküle, aber auch Ionen. Diese Ligandenbindung induziert Änderungen in der Struktur des Riboswitches, welche wiederum die Expressionsplattform beeinflussen. Je nach Riboswitch ermöglicht oder verhindert dies schließlich die Genexpression. Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Etablierung von Methoden der optischen Spektroskopie zur Aufklärung von RNA-Dynamiken und -Strukturen im Allgemeinen und der Erforschung von Aptamerbindungsmechanismen im Besonderen.
Eine der dazu verwendetet Methoden ist die FTIR-Spektroskopie. Hierfür wurden zunächst kritische Parameter wie verschiedenste Messeinstellungen oder die Probenpräparation ausgiebig an RNA-Modellsträngen getestet. Dabei war es möglich, eine kleine Spektrenbibliothek als internen Standard aufzubauen. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass kleinere RNA-Oligonukleotide (< ca. 20 Nukleobasen) gut mittels FTIR-Methoden untersucht werden können. Anschließend wurde eine statische Bindungsstudie am adenosin- sowie am guanosinbindenden Aptamer vorgenommen.
Die zweite hier vorgestellte Methode zur Untersuchung von RNA-Molekülen ist die Fluoreszenzspektroskopie. Im Gegensatz zur FTIR-Spektroskopie ist dazu allerdings eine Modifizierung der RNA durch ein Fluoreszenzlabel nötig. Deshalb beschäftigt sich der Hauptteil dieser Doktorarbeit mit der Charakterisierung und der Anwendung des quasi bifunktionellen RNA-Markers (auch RNA-Labels) Çmf. So wurden zunächst die photophysikalischen und photochemischen Eigenschaften des Markers untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Çmf sich als lokale Sonde eignet, da es empfindlich auf Änderungen der Mikroumgebung in Lösung reagiert. Durch direkten Vergleich der optischen Eigenschaften von Çmf mit den entsprechenden Eigenschaften des Spinlabels Çm war es möglich, den starken Fluoreszenzlöschungseffekt (sog. quenching) des Çm aufzuklären. So kann davon ausgegangen werden, dass die Fluoreszenz des Çm durch eine sehr schnelle interne Konversion (IC) in einen dunklen Dublettzustand (D1) gelöscht wird.
Im nächsten Schritt wurde Çmf in RNA-Modellstränge eingebaut, um den Einfluss der RNA auf die Photochemie des Markers zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich dessen Fluoreszenzsignal abhängig von den direkten Nachbarbasen sowie abhängig vom Hybridisierungszustand signifikant ändert. Gleichzeitig konnte keine deutliche Veränderung der Stabilität der Modellstränge festgestellt werden. So konnte also nachgewiesen werden, dass sich Çmf sehr gut als lokale Sonde in RNA eignet. Im Speziellen wurde aus den Ergebnissen geschlossen, dass der Fluorophor für Ligandenbindungsstudien herangezogen werden kann.
Deshalb wurde Çmf schließlich an mehreren verschiedenen Stellen in das neomycinbindende Aptamer (N1) eingebaut, um dessen Bindungskinetik zu untersuchen. Mittels Stopped-Flow-Messungen war es möglich, die Bindungsdynamik des Aptamers zu beobachten. Anhand dieser transienten Daten konnte ein Zweischrittbindungsmodell abgeleitet werden. Dabei bindet Neomycin zunächst unspezifisch an das weitgehend vorgeformte Aptamer. Anschließend kommt es durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu einer spezifischen Bindung des Liganden am Aptamer.
Im dritten Teil dieser Arbeit geht es ebenfalls um die Entwicklung und Etablierung eines spektroskopischen Werkzeuges. Dabei stehen allerdings Rhodopsine im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit. Hierbei handelt es sich um Membrantransportproteine, die nach optischer Anregung einen sehr schnellen Photozyklus mit mehreren Intermediaten durchlaufen. Es ist möglich, diese Intermediate dank transienter Absorptionsmessungen mit sehr guter zeitlicher und spektraler Auflösung zu beobachten. Allerdings besteht der Bedarf, diese Intermediate statisch zu präparieren, um sie näher charakterisieren und mit anderen Methoden, wie z.B. der Festkörper-NMR, vergleichen zu können.
Ein spektroskopisches Werkzeug zum Präparieren von frühen Photointermediaten ist kryogenes Einfangen (sog. Cryotrapping) dieser Intermediate. Im Rahmen dieser Arbeit wurden das Cryotrapping und die anschließende statische UV/vis-Absorptionsspektroskopie der fixierten (getrappten) Zustände optimiert und an einer Reihe von Rhodopsinen (ChR2, GPR) demonstriert.
Die Aufdeckung krankheitsbedingter Unterschiede und die Identifizierung neuer Biomarker sind essenziell für Diagnose und Behandlung verschiedener Erkrankungen. Unterschiede zwischen Erkrankungen können u.a. durch Analyse des Lipidprofils aufgedeckt werden, da dieses eng mit dem Phänotyp verknüpft ist. Ein unvoreingenommenes Screening gewährt einen umfassenderen Einblick in den metabolischen Zustand als eine gezielte Untersuchung weniger Analyten und kann neue Hypothesen generieren. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Screening-Methode zur untargeted Untersuchung des Lipidoms in biologischen Proben entwickelt. Durch die Kombination aus Umkehrphasenchromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie mit datenabhängiger Aufnahme von MS/MS-Spektren konnten in Humanplasma 440 Lipide aus mehr als 15 Lipidklassen identifiziert werden. Die mehrstufige Identifizierung der Analyten, basierend auf der exakten Masse ±5 ppm, der Isotopenverteilung, der MS/MS-Fragmentierungsmuster in beiden Ionisationsmodi sowie der chromatographischen Auftrennung von Isomeren und Isobaren, erfolgte mit hoher Selektivität. Mit der vorgestellten Methode können sowohl Lipidklassen als auch einzelne Lipide relativ zu den internen Standards quantifiziert werden.
Der Probendurchsatz wurde erhöht, um den Einsatz der Methode im Rahmen größerer klinischer Studien zu ermöglichen und vorhandene Ressourcen effizient einzusetzen. Dabei wurden die Inkubationszeiten während der Flüssig-Flüssig-Extraktion mit MTBE:Methanol deutlich reduziert und die Handhabung vereinfacht bei gleichbleibend hoher Wiederfindung. Der hohe Probendurchsatz wird weiter unterstützt durch die kurze chromatographische Laufzeit von 17 min pro Ionisationsmodus. Die Auswertung der Ergebnisse ist der heikelste und zeitintensivste Schritt bei der Entwicklung und Anwendung von Screening-Methoden, deshalb wurde der Arbeitsablauf zur univariaten Analyse durch Entwicklung von R Skripten vereinfacht und beschleunigt.
Die Qualität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sind essenziell. Aus diesem Grund wurde die Qualität der entwickelten Methode, angelehnt an den strikten Vorgaben der FDA und EMA zur Validierung von quantitativen Methoden, sichergestellt, obwohl eine Methodenüberprüfung im Bereich von untargeted Methoden nicht verbreitet ist. Die Reproduzierbarkeit der relativen Lipidkonzentrationen konnte z.B. durch die Messung von Kontrollplasmaproben über einen Zeitraum von 10 Monaten gezeigt werden. Außerdem wurde die Linearität der Verdünnung von Plasmaproben bestätigt und eine Verschleppung in darauffolgende Proben ausgeschlossen. Die Stabilität der Proben muss in jeder Messphase inklusive der Präanalytik durch geeignete Untersuchungen und Maßnahmen sichergestellt werden. Anhand einer Studie zur präanalytischen Stabilität humaner Blutproben konnte ein Protokoll zur Probennahme und -vorbereitung für weitere klinische Studien erarbeitet werden. Die Stabilität des Lipidoms in Vollblut und Plasma konnte durch den Einsatz von Natriumfluorid/Citrat als Antikoagulans verbessert werden. Auch die Stabilität der Proben während der Lipidextraktion und Messung konnte gezeigt werden. Es wurden 16 verschiedene Probenarten analysiert, darunter Plasmaproben, verschiedene Mausgewebe und Zellpellets.
Mit der entwickelten Methode wurden die Unterschiede im Lipidprofil im Plasma und Gewebe von Mäusen mit einer akuten Entzündung durch LPS bzw. Zymosan-Injektion aufgedeckt. Dabei wurden die Ether-Phosphatidylcholine als potenzielle Entzündungsmarker identifiziert. Die entwickelte Methode wurde außerdem erfolgreich im Rahmen anderer Arbeiten für die Untersuchung verschiedener Erkrankungen angewendet.
In der vorliegenden Arbeit wird demnach eine schnelle, reproduzierbare und vor allem selektive LC-MS-Screening-Methode vorgestellt, die Veränderungen des Lipidstoffwechsels aufdecken und potenzielle Biomarker identifizieren kann.
Nanoarzneimittel haben in den letzten Jahren in der Therapie verschiedener Erkrankungen immer mehr an Bedeutung gewonnen. Dadurch hat auch die Anzahl zugelassener Arzneimittel mit an Arzneistoffträgern wie Liposomen gebundenen Wirkstoffen zugenommen. Weil für die Zulassung, neben der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit, auch die Qualität der neuen Arzneimittel gewährleistet sein muss, spielen die verschiedenen Eigenschaften der Arzneistoffträger eine wichtige Rolle in der Qualitätskontrolle. Neben der Partikelgröße, der Partikelgrößenverteilung und der Oberflächenladung spielt die (Rest-)Kristallinität des Wirkstoffs und die Wirkstofffreisetzung eine wesentliche Rolle für die erfolgreiche in vivo-Performance von Nanoarzneimitteln. Zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Arzneistoffträgern wie Liposomen, Nanopartikeln oder Mizellen gibt es bis heute keine Standardmethoden. In der Forschung und der pharmazeutischen Industrie werden folglich verschiedene Methoden wie Filtration, Zentrifugation oder Dialyse verwendet, um den freigesetzten Wirkstoff zu bestimmen. Dabei ist die Wahl der Separationsmethode auf die Eigenschaften der Arzneistoffträger abzustimmen.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine dialysebasierte Apparatur, der Dispersion Releaser (DR), zur Untersuchung der in vitro Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Trägersystemen eingesetzt. Diese kann direkt mit den Apparaturen I/II der Arzneibücher der Europäischen Union (Ph. Eur.) und der Vereinigten Staaten (USP) gekoppelt werden. Zur Untersuchung der Wirkstofffreisetzung wird die Formulierung in das Donorkompartiment gegeben, sodass der freigesetzte Wirkstoff infolge über die Dialysemembran in das Akzeptorkompartiment permeiert. Dort kann dieser mittels HPLC analysiert werden. Besonders hervorzuheben ist das synchrone Rühren in beiden Kompartimenten des DR, worüber andere dialysebasierte Apparaturen nicht verfügen.
Die Entwicklung und Patentierung eines funktionsfähigen Prototyps des DR erfolgte an der Goethe Universität, Frankfurt am Main und wurde im Rahmen dieser Arbeit gemeinsam mit der Pharma Test Apparatebau AG (Hainburg, Deutschland) zu einer kommerziell erwerbbaren Apparatur (Pharma Test Dispersion Releaser, PTDR) weiterentwickelt. Innerhalb dieser Kollaboration wurde der Prototyp des DR unter Einbezug der Anforderungen der pharmazeutischen Industrie rekonstruiert. Eine erleichterte Anwendung für den Nutzer wurde dabei mitberücksichtigt.
Die finale Apparatur wurde zuletzt einer ausgiebigen Validierung unterzogen, bei der Diclofenac und Hydrocortison als Modellarzneistoffe dienten. Neben Untersuchungen zur Hydrodynamik und dem Einfluss der Umdrehungszahl auf die Membranpermeationsrate kM wurde eine Methode mit Gold-Nanopartikeln zur Bestimmung der Dichtigkeit des Systems entwickelt. Hierbei wurden Messungen mit einer UV/Vis-Methode und mit dynamischer Lichtstreuung durchgeführt, um die Abwesenheit der Goldpartikel im Akzeptorkompartiment nachzuweisen. Der Einfluss von Proteinen im Freisetzungsmedium auf die Membran-permeation wurde ebenfalls untersucht.
Der DR wurde ursprünglich zur Untersuchung von parenteralen Nanoformulierungen entwickelt. Aufgrund der bisher noch nicht erfolgten Untersuchung von halbfesten Zubereitungen im DR, wurde die Apparatur im Rahmen dieser Forschungsarbeit für zwei verschiedene Diclofenac-Gele (Voltaren® Emulgel, Olfen® Gel) unter verschiedenen Bedingungen evaluiert. Dabei konnte unter non-sink-Bedingungen der Einfluss der lipophilen Phase des Voltaren® Emulgels (GlaxoSmithKline Consumer Healthcare GmbH & Co. KG, München, Deutschland) gezeigt werden. Im Vergleich zum fettfreien Olfen® Gel (Mepha Pharma AG, Basel, Schweiz) zeigte Voltaren® Emulgel eine vollständige Freisetzung unter den erschwerten Löslichkeitsbedingungen.
Mit Hydrocortison als Modellsubstanz wurden vier verschiedene Proliposomen zur vaginalen An¬wendung formuliert. Neben der Charakterisierung der Partikelgröße und der Verkapselungs¬effizienz wurden Messungen mit dynamischer Differenzkalorimetrie durch-geführt und Aufnahmen zur morphologischen Charakterisierung mittels Transmissions-elektronen¬mikroskopie der Liposomen erstellt. Die Wirkstofffreisetzung des Hydrocortisons aus dem rekonstituierten liposomalen Gel sowie die Permeabilität über eine Zellmonoschicht wurde vergleichend untersucht. Dabei wurden Zelllinien aus humanem Cervixkarzinom beziehungsweise Endometriumkarzinom eingesetzt. Die Unterschiede der Formulierungen konnten vom DR sensitiver erfasst werden und die Verkapselungseffizienz als relevanter Faktor für die in vivo-Performance festgelegt werden.
Weil die tatsächliche Wirkstofffreisetzung durch die Permeation über die Dialysemembran überlagert werden kann, wurde neben der Standardisierung der Konstruktion die Auswertung mit Hilfe eines neuen mathematischen Modells, das auf dem Fick’schen Diffusionsgesetz basiert, verbessert. Das Normalisieren des Freisetzungsprofils mit Hilfe des mathematischen Modells dient dazu, die tatsächliche Wirkstofffreisetzung zu berechnen und den Vergleich verschiedener Freisetzungen ohne den Einfluss der Membranpermeation zu ermöglichen. Im Zuge der Validierung des DR wurde das mathematische Modell ebenfalls erfolgreich validiert.
In der vorliegenden Forschungsarbeit wurde eine neue Konstruktion des DR für die kommerzielle Anwendung entwickelt und validiert. Nebenbei wurde der Auswerteprozess zur Berechnung der diffusionsbereinigten Wirkstofffreisetzung vereinheitlicht und validiert. Zuletzt wurde das Anwendungsgebiet des DR von parenteralen Nanoformulierungen auf halbfeste Arzneiformen erweitert.
Guanosine triphosphate (GTP) cyclohydrolase I (GCH1) catalyzes the conversion of GTP to dihydroneopterin triphosphate (H2NTP), the initiating step in the biosynthesis of tetrahydrobiopterin (BH4). Besides other roles, BH4 functions as cofactor in neurotransmitter biosynthesis. The BH4 biosynthetic pathway and GCH1 have been identified as promising targets to treat pain disorders in patients. The function of mammalian GCH1s is regulated by a metabolic sensing mechanism involving a regulator protein, GCH1 feedback regulatory protein (GFRP). GFRP binds to GCH1 to form inhibited or activated complexes dependent on availability of cofactor ligands, BH4 and phenylalanine, respectively. We determined high-resolution structures of human GCH1−GFRP complexes by cryoelectron microscopy (cryo-EM). Cryo-EM revealed structural flexibility of specific and relevant surface lining loops, which previously was not detected by X-ray crystallography due to crystal packing effects. Further, we studied allosteric regulation of isolated GCH1 by X-ray crystallography. Using the combined structural information, we are able to obtain a comprehensive picture of the mechanism of allosteric regulation. Local rearrangements in the allosteric pocket upon BH4 binding result in drastic changes in the quaternary structure of the enzyme, leading to a more compact, tense form of the inhibited protein, and translocate to the active site, leading to an open, more flexible structure of its surroundings. Inhibition of the enzymatic activity is not a result of hindrance of substrate binding, but rather a consequence of accelerated substrate binding kinetics as shown by saturation transfer difference NMR (STD-NMR) and site-directed mutagenesis. We propose a dissociation rate controlled mechanism of allosteric, noncompetitive inhibition.
Die Entstehung von Leukämien steht meist im Zusammenhang mit chromosomalen Translokationsereignissen, bei denen vor allem das MLL (Mixed Lineage Leukemia)-Gen auf Chromosom 11q23 involviert ist. Die häufigste Translokation, die eine Akute Lymphatische Leukämie (ALL) bei Kleinkindern auslöst, stellt die t(4;11)-Translokation dar. Die Rekombination der Chromosomen 11 und 4 führt hierbei zur Entstehung der beiden Fusionsproteine MLL-AF4 und AF4-MLL. Bisherige Studien, die den Krankheitsmechanismus hinter dieser ALL-Form untersuchten, identifizierten eine charakteristische Überexpression der HOXA-Gene als einen besonderen Treiber dieser Krankheitsentstehung. Durch die Deregulierung des HOX-Clusters durch das chimäre MLL-AF4-Protein wird ein Differenzierungs- und Apoptoseblock induziert und eine stetige Proliferation der Zellen gefördert. Arbeiten von Trentin et al. (2009) klassifizierten eine Subgruppe von t(4;11)-Patienten, die, im Gegensatz zu den bisher charakterisierten ALL-Leukämien, eine Reprimierung ihrer HOXA-Cluster aufwiesen und mit einer schlechteren Prognose assoziiert waren. Das Genexpressionsprofil dieser HOXAlow-Patienten sprach für einen neuen Krankheitsmechanismus. Allen HOXAlow-Patienten war zudem gemein, dass sie eine Überexpression des Transkriptionsfaktors IRX1 aufwiesen. Die Relevanz dieses Transkriptionsfaktors im Kontext einer t(4;11)-Leukämie wurde durch diese Doktorarbeit genauer untersucht. Durch Vorarbeiten mit transient exprimiertem IRX1 in HEK293T-Zellen wurde eine DNA-Microarray-Analyse durchgeführt, durch die ein Genexpressionsprofil (GEP) dieser Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (mit dem Leervektor transfiziert) erstellt wurde. Dies schuf die Grundlage für die Durchführung weiterer Experimente, die mit Hilfe von RT-PCR-, Chromatin-Immunpräzipitations-, Co-Immunpräzipitations- und Western Blot-Versuchen den Effekt und das Verhalten des IRX1-Proteins im Zusammenhang mit MLL-AF4, bzw. die Funktion von IRX1 alleine, charakterisieren sollten. Es zeigte sich, dass IRX1 eine Reprimierung der HOXA-Gene induziert und dieser Effekt über den aktivierenden Effekt des chimären MLL-AF4-Proteins dominiert. Dies geschah jedoch auf zwei unterschiedliche Wege, da zum einen das IRX1 in der Abwesenheit von MLL-AF4 nicht direkt an die HOXA-Gene binden kann und zum anderen durch MLL-AF4 eine Inkorporation des IRX1 in den Multiproteinkomplex des chimären Onkoproteins stattfindet und IRX1 dadurch direkt an die HOXA-Promotoren gelangt. Zudem wurden weitere direkte und indirekte Zielgene des IRX1 identifiziert. Zu ihnen zählen MEIS1, HOXB4 und EGR1-3. Durch die Erweiterung der Versuche durch Behandlungen mit dem pan-HDAC-Inhibitor Trichostatin A konnte belegt werden, dass MLL-AF4 vom Promotor seiner Zielgene dissoziiert und durch das endogene wt-MLL ersetzt werden kann. Trotz der inhibitorischen Wirkung des IRX1 auf das MLL-AF4 verursacht es eine Stabilisierung des MLL-AF4 an den Promotoren seiner Zielgene, was eine Dissoziation des Komplexes durch TSA verhindert. Die Applikation von TSA führt unabhängig von der vorherigen Konstitution (±IRX1) aber auch zu einer Normalisierung der HOXA-Expression. Die vorgelegten Daten verdeutlichen, dass IRX1 kausal für das GEP der HOXAlow-Patienten verantwortlich ist und durch seine Anwesenheit wichtige Regulatoren der Differenzierung und der Zellzyklusregulierung gestört werden. Zudem wurde der Benefit einer Histondeacetylaseinhibitor (HDACi)-Behandlung bei dieser Patientenkohorte hervorgehoben, da der inhibierende Effekt des IRX1 auf die HOXA-Gene aufgehoben und das wt-MLL in seiner Funktionsfähigkeit nicht beeinträchtigt wurde. Die Relevanz des IRX1 im Kontext einer t(4;11)-Leukämie wurde somit aufgeklärt und ein neuer Krankheits-mechanismus der HOXAlow-Patientenkohorte definiert. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Etablierung eines Transfektionsprotokolls, um eine stabile Integrationen der Sleeping Beauty-Konstrukte in t(4;11)-Suspensionszellen zu ermöglichen. Bisher war es nur über lentivirale Methoden möglich, diese Zellen genetisch zu manipulieren. Durch die hier vorgestellte Methode können nun SEM-Zellen (B-Zell-Vorläuferzellen einer ALL mit t(4;11)) über Elektroporation stabil transfiziert und anschließend über Selektion zu einer homogenen Zellpopulation positiv transfizierter Zellen herangezogen werden. Hierdurch wird eine Übertragung bisheriger Methoden in ein leukämisches Zellsystem möglich, wodurch genetische Manipulationen in einer physiologischen Umgebung getestet werden können, ohne in S2-Laboratorien arbeiten zu müssen.
Die Bande q23 auf Chromosom 11 ist in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen verwickelt. Diese sind dominant mit dem Krankheitsphänotyp einer AML, ALL und seltener mit malignen Lymphomen und myelodysplastischen Syndromen assoziiert. Mittlerweile sind fünfundachtzig cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Das auf 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homolog of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40 %), AF9 (27 %), sowie ENL, AF6, ELL und AF10 (4-7 %).
Die Bruchpunkte von t(11;V) Translokationen sind nicht gleichmäßig über das gesamte, 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in der 8,3 kb großen Bruchpunktsregion Bpr. Auch innerhalb der Bpr ist die Verteilung der Translokationsbruchpunkte nicht homogen. Die Bruchpunkte von Patienten mit de novo Leukämien und einem Alter über einem Jahr liegen mehrheitlich in der 5’-Hälfte der Bpr, dem Subcluster I. Dagegen liegen die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien und einem Alter unter einem Jahr überwiegend in der 3’-Hälfte der Bpr, dem Subcluster II.
Neuere Forschungsergebnisse zeigten, daß DNA-Doppelstrangbrüche auf zwei verschiedenen Chromosomen eine hinreichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind. Aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte im MLL-Gen stellte sich die Frage, ob bestimmte Regionen dieses Gens für DNA-Doppelstrangbrüche prädisponiert sind. Interessanterweise ist Subcluster II extrem sensitiv gegenüber DNA-Doppelstrangbrüchen, die durch cytotoxische Agenzien oder Apoptose-auslösende Ereignisse induziert werden können. In unserer Arbeitsgruppe konnte eine etwa 200 bp große Region lokalisiert werden, über die sich nahezu alle Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche verteilten.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen in dieser Region durch die Gabe eines Caspase-Inhibitors gehemmt werden kann. Eine Etoposid-induzierte Protein-DNA-Wechselwirkung konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. In der Literatur fanden sich Hinweise darauf, daß Subcluster II im Gegensatz zu Subcluster I eine verstärkte Histonacetylierung aufweist. Basierend auf diesen Hinweisen sollte die Arbeitshypothese untersucht werden, ob Subcluster II einen geninternen Promotor des MLL-Gens darstellt.
Die potentielle Promotorregion wurde zunächst durch Computeranalysen eingegrenzt. Mit RT-PCR Experimenten wurde anschließend der potentielle geninterne Promotor des murinen Mll-Gens in einer murinen Fibroblastenzellinie lokalisiert, die einen Transkriptionsstop und eine Polyadenylierungssequenz in Exon 4 des Mll-Gens trug. Um die am Mausmodell gewonnenen Erkenntnisse auch im humanen System zu überprüfen, wurde die geninterne Promotorregion des humanen MLL Gens vor ein Luciferasereportergen kloniert. Durch RTPCR konnte der geninterne Transkriptionsstart im Subcluster II des humanen MLL-Gens lokalisiert werden. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß Transkriptionsinitiation und genetische Instabilität im Subcluster II des humanen MLL-Gens kolokalisieren.
Durch Deletionsmutanten wurde die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotorregion ermittelt. Dabei zeigte sich, daß die Anwesenheit von zwei retromobilen Elementen eine Enhancer-Funktion haben. Demgegenüber zeigte die homologe murine Sequenz, die in unserer Arbeitsgruppe gleichzeitig von S. Scharf untersucht wurde und für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-Doppelstrangbrüche bekannt ist, nur eine schwache Promotoraktivität. Dies weist auf einen Zusammenhang zwischen der genetischen Instabilität von Subcluster II und der Rate geninterner Transkriptionsinitiationsprozesse hin.
Das Protein, für das das Transkript des geninternen murinen Promotors kodiert, wurde mittels immunhistologischer und Western Blot Experimente nachgewiesen. Dabei konnte gezeigt werden, daß dieses Protein, wie auch das MLL-Protein, proteolytisch durch Taspase1 und daß sich ein Mini-MLL-Komplex bildet.
Ubiquitination is regarded as one of the key post-translational modifications in nearly all biological processes, endowed with numerous layers of complexity. Deubiquitinating enzymes (DUBs) dynamically counterbalance ubiquitination events by deconjugating ubiquitin signals from substrates. Dysregulation of the ubiquitin code and its negative regulators drive various pathologies, such as neurological disorders and cancer.
The DUB ubiquitin-specific peptidase 22 (USP22) is well-known for its essential role in the human Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase (SAGA) complex, mediating the removal of monoubiquitination events from Histone 2A and 2B (H2A and -B), thereby regulating gene transcription. In cancer, USP22 was initially described as a part of an 11-gene expression signature profile, predicting tumor metastasis, reoccurrence and death after therapy in a wide range of tumor cells. However, novel roles for USP22 have emerged recently, accrediting USP22 essential roles in regulating tumor development as well as apoptotic cell death signaling.
One of the hallmarks of cancer is the evasion of cell death, especially apoptosis, a form of programmed cell death (PCD). Necroptosis, a regulated form of necrosis, is regarded as an attractive therapeutic strategy to overcome apoptosis-resistance in tumor cells, although a profound understanding of the exact signaling cascade still remains elusive. Nevertheless, several ubiquitination and deubiquitination events are described in fine-tuning necroptotic signaling.
In this study, we describe a novel role for USP22 in regulating necroptotic cell death signaling in human tumor cell lines. USP22 depletion significantly delayed TNFa/Smac mimetic/zVAD.fmk (TBZ)-induced necroptosis, without affecting TNFa-induced nuclear factor-kappa B (NF-KB) signaling or TNFa-mediated extrinsic apoptosis. Intriguingly, re-expression of USP22 wildtype in the USP22 knockout background could re-sensitize HT-29 cells to TBZ-induced necroptosis, whereas re-constitution with the catalytic inactive mutant USP22 Cys185Ser did not rescue susceptibility to TBZ-induced necroptosis, confirming the USP22 DUB-function a pivotal role in regulating necroptotic cell death. USP22 depletion facilitated ubiquitination and unexpectedly also phosphorylation of Receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) during necroptosis induction, as shown by Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBE) pulldowns and in vivo (de)ubiquitination immunoprecipitations. To substantiate our findings, we performed mass-spectrometric ubiquitin remnant profiling and identified the three novel USP22-regulated RIPK3 ubiquitination sites Lysine (K) 42, K351 and K518 upon TBZ-induced necroptosis. Further assessment of these ubiquitination sites unraveled, that mutation of K518 in RIPK3 reduced necroptosis-associated RIPK3 ubiquitination and additionally affected RIPK3 phosphorylation upon necroptosis induction. At the same time, genetic knock-in of RIPK3 K518R sensitizes tumor cells to TNFa-induced necroptotic cell death and amplified necrosome formation.
In summary we identified USP22 as a new regulator of TBZ-induced necroptosis in various human tumor cell lines and further unraveled the distinctive role of DUBs and (de)ubiquitination events in controlling programmed cell death signaling.
Uncaging approach, native membrane dynamics and lipidic cubic phases in biomolecular solid-state NMR
(2019)
It was previously shown for the Escherichia coli diacylglycerol kinase (DgkA) that enzyme-reactions at the membrane interface can be monitored by solid-state NMR. However, such studies can face problems due to limited accessibility of the active sites: Natural substrates for membrane enzymes, but also ligands for membrane proteins or lipid mediators, are either partitioning into the membrane and cannot be added easily, or if soluble exhibit accessibility restrictions, as they cannot freely pass through lipid bilayers. This situation complicates quantitative kinetic analysis of biochemical processes such as enzyme activity, ligand binding, but also oligomerization or folding reactions in the membrane or at its interface under MAS NMR conditions.
To overcome these limitations the feasibility and possible advantages of the uncaging approach as a new tool for biomolecular solid-state NMR to trigger reactions by light have been explored. DgkA’s enzymatic activity, exemplary of a biochemical process on the membrane interface, was thereby triggered in situ during MAS by light-induced release of its substrates that were rendered inactive with photolabile protecting groups. To be capable of uncaging sufficient amounts of substrate during MAS to follow the enzymatic reaction via 31P real-time NMR measurements, several illumination variants including an existing illumination setup to study retinal proteins under cryogenic conditions via DNP enhanced NMR were tested. As uncaging of micromole amounts of substrates requires a higher flux compared to initiation of a photocycle in retinal proteins, a new illumination setup was built with Bruker Biospin and Leoni Fibertech. It consists of a modified MAS probe and a suitable fiber bundle, allowing to efficiently couple light from high power LEDs into a sapphire rotor containing the sample, without disturbing the magnetic field homogeneity or sample rotation. By reducing the sample volume to the illuminated area up to 60 mM ATP were released by uncaging NPE ATP to initiate DgkA’s activity in several tested membrane mimetics. These mimetics included liposomes and bicelles, which are well established in the field of biomolecular solid state NMR as well as the optically transparent lipidic cubic phase of monoolein, widely used in membrane protein crystallography, but not yet well characterized as membrane mimetic under MAS conditions. A unique and powerful but compared to time and spatial resolution often underrepresented advantage of the uncaging approach for biophysical studies has been demonstrated by successful uncaging of a non-miscible lipid substrate to trigger DgkA’s kinase reaction: Initiation of processes that cannot easily be triggered by mixing. Examples of these are reactions involving highly hydrophobic, membrane partitioning compounds including lipid substrates, ligands or interaction partners, but also oligomerization or folding of biomacromolecules. The herein performed experiments therefore serve as a first demonstration of the uncaging approach’s feasibility and compatibility with a wide variety of membrane mimetics and give a first indication of its potential for a variety of biomolecular solid state NMR experiments.
As high accessibility for solutes has been a second focus for the choice of membrane mimetics, DgkA’s activity in the lipidic cubic phases of monoacylglycerols with its two continuous networks of water channels has been further characterized. Kinetic parameters obtained from 31P real time solid state NMR experiments revealed that DgkA’s activity is similar to activities obtained in swollen cubic phases in a bath solution with wider water channels. Diffusion of ATP in a non swollen cubic phase was however strongly reduced compared to ATP in solution as diffusion measurements showed. Therefore, saturation of the enzyme required distinctly higher ATP concentrations. These results thereby underline the advantage of a non invasive and label free method like NMR to directly gain information about enzymatic reactions of immobilized enzymes in porous materials. The obtained wealth of information from 31P real time NMR experiments and biochemical assays in different membrane mimetics in presence and absence of lipid substrates and activators also provided further insight into DgkA’s enzymatic activity. It confirms ATP binding and hydrolysis in the absence of a lipid substrate, in agreement with the proposed mode of substrate binding, and allowed to estimate the in vivo relevance of previously observed ATPase activity in liposomes.
Further exploration of the cubic phase as membrane mimetic for protein solid state NMR revealed its high stability under MAS at elevated temperatures and capacity to reconstitute sufficient amounts of DgkA. Unlike monoolein, DgkA was cross-polarizable in a cubic phase and exhibited similar dynamics compared to DgkA reconstituted into liposomes, allowing to acquire the herein shown dipolar coupling based 2D protein spectra. As lipidic cubic phases are not containing phospholipids, monoacylglycerols could be especially useful as membrane mimetics for 31P correlation spectra. Initial experiments under DNP conditions, where in liposomes line broadening causes severe overlap of phospholipid signals and unspecific cross polarization highlight this aspect.
In summary, herein reported results of the experiments performed with lipidic cubic phases demonstrate that they are robust and versatile membrane mimetics. They could be of advantage for a variety of solid-state NMR experiments where either optical transparency for efficient illumination is desired, accessibility for solutes and membrane components under MAS is required, or interference of phosphorous signals of other membrane mimetics must be avoided.
In the second chapter of this thesis 1H solid-state NMR as a label free method to probe membrane order and dynamics directly within a cellular and disease relevant context was used to observe the effects of soluble epoxide hydrolase (sEH) encoding gene knock-outs on membrane dynamics. Knock-out of the sEH encoding gene changed the overall membrane dynamics in the physiological temperature range of native membranes derived from mouse brains, making the bulk membrane more dynamic. To confirm that these effects are related to the enzymatic activity of sEH, substrates and products of sEH were added to evaluate their effects on membrane dynamics. 19,20 dihydroxydocosapentaenoic acid (DHDP), a product of sEH, partially reversed the knock out phenotype in a concentration dependent manner whereas the substrate 19,20 epoxydocosapentaenoic acid did not cause any effects. As both polyunsaturated fatty acids did not show differences in phase behavior in a simple phospholipid bilayer these results provide evidence that the previously observed concentration dependent DHDP induced relocation of cholesterol away from detergent resistant lipid raft fractions is associated with alteration of membrane dynamics. Therefore, also the effect of cholesterol removal via cyclodextrin on membrane dynamics was analyzed. Removal of cholesterol led to a similar temperature profile of wild type and knock out membranes thereby supporting the hypothesis that DHDP induced relocation of cholesterol is causing altered membrane dynamics. These alterations have been shown by the lead authors of the collaborative research project to induce relocation of various membrane proteins and are involved in the development of diabetic retinopathy. Furthermore, in this context inhibition of sEH has been shown to inhibit diabetic retinopathy and proposed as target for prevention of one of the leading causes of blindness in the developed world.
In the last twenty years, there has been splendid progress in energy conversion technologies to have sustainable energy sources. For example, solar cells contribute significantly to energy production as the sun is an enormous source for renewable energy. Currently, the most common commercialized photovoltaic devices are silicon-based. The scientists' main targets are high efficiency, low cost, environmentally friendly, and easy to synthesize new semiconductor materials to replace silicon. Furthermore, understanding the photophysical properties of these materials is very important for designing high efficient photoconversion systems.
This thesis investigates the photophysics of lead-based wide-bandgap perovskites with different dimensionality (2D, 3D) and how they can be optimized for optoelectronic applications. In chapter 1, we present the background and progress in perovskite research. The basic concepts of semiconductor and spectroscopic methods of the applied techniques in this work are discussed in chapter 2.
In the first project (chapter 3.1), we used our time-resolved techniques to study the ultrafast dynamics of energy transfer from the inorganic to the organic layer in a series of three lead-based mixed-halide 2D perovskites containing benzyl ammonium (BA), 1-naphthyl methyl ammonium (NMA), and 1-pyrene methyl ammonium (PMA) thin films.
In the second project (chapter 3.2), we used time-resolved spectroscopic techniques to study the effect of adding 5% of Cs on the dynamics of a mixed-cation wide bandgap bromide-based 3D perovskite.
In another side project (chapter 4), we present the photophysics properties of newly synthesized new Schiff bases containing indole moieties using piperidine as an organic base catalyst and Au@TiO2 as a heterogeneous catalyst. Finally, the results of this work are summarized in Chapter 5 with an outlook and a discussion of open questions for further research.
Protein quality control (PQC) machinery is in charge of ensuring protein homeostasis in the cell, i.e. proteostasis. Chaperones assist polypeptides throughout their maturation until functionality is achieved. This process might be disrupted in the presence of mutations or external damaging agents that affect the folding and stability of proteins. In this case, proteins can be efficiently recognized and targeted for degradation in a controlled manner. Ubiquitylation refers to the covalent attachment of one or more ubiquitin moieties to faulty proteins, thus triggering their degradation by the 26S proteasome.
More than 30% of proteins need cofactor molecules. Lack of cofactors renders proteins non-functional. We wanted to understand how the PQC deals with wild-type proteins in the absence of their cofactors. Several studies have indicated the importance of the riboflavin-derived cofactor FAD in the stability of individual flavoproteins, and hence we assumed that loss of flavin should mediate a targeted degradation of this group of proteins. Indeed, our mass spectrometry experiments showed that flavoproteome levels decreased under riboflavin starvation. The oxidoreductase NQO1 was used as a model enzyme to further investigate the mechanism of flavoproteome targeting by the PQC. We showed that cofactor loading determines ubiquitylation of NQO1 by the co-chaperone CHIP, both in vivo and in vitro. Furthermore, subtle changes in the C-terminus of NQO1 in the absence of FAD seemed to be crucial for this recognition event. ApoNQO1 interactome differed from holoNQO1. Chaperones and degradation factors were enriched on NQO1 upon cofactor withdrawal, probably to support maturation and prevent aggregation of the enzyme.
Loss of protein folding and stability, even to a small extent, can enhance the aggregating behavior of proteins. Proper loading with FAD reduced the co-aggregation of NQO1 with Aβ1-42 peptide. We assumed that the flavoproteome might represent aggregating-prone species under riboflavin deprivation. Supportingly, reversible apoNQO1 aggregates were observed in vivo in the absence of cofactor. General amyloidogenesis in vivo also increased under these conditions, apparently as a result of flavoproteome destabilization. In this context, we think that our data might have important implications considering the onset and development of conformational diseases.
This work has shed some light on the therapeutic implications of riboflavin deficiency as well. The sensitivity of melanoma cells towards the alkylating agent methyl methanesulfonate (MMS) increased under riboflavin starvation. Subsequent analyses indicated that a complex metabolic reorganization, mostly affecting proliferation and energy metabolism, occurs in response to starvation. What we suggest to call “flavoaddiction” can be understood as the dependence of melanoma cells on the flavoproteome structural and functional intactness to survive chemotherapy. Understanding this cellular reprogramming in detail might reveal new possibilities for future therapies.
Transport mechanism of a multidrug resistance protein investigated by pulsed EPR spectroscopy
(2019)
In human several diseases result from malfunctions of ATP-binding cassette (ABC) systems, which form one of the largest transport system superfamily. Many ABC exporters contain asymmetric nucleotide-binding sites (NBSs) and some of them are inhibited by the transported substrate.1 For the active transport of diverse chemically substrates across biological membranes, ABC transport complexes use the energy of ATP binding and subsequent hydrolysis. In this thesis, the heterodimeric ABC exporter TmrAB2,3 from Thermus thermophilus, a functional homolog of the human antigen translocation complex TAP, was investigated by using pulsed electron-electron double resonance (PELDOR/DEER) spectroscopy. In the presence of ATP, TmrAB exists in an equilibrium between inward- and outward-facing conformations. This equilibrium can be modulated by changing the ATP concentration, showing asymmetric behaviour in the open-to-close equilibrium between the consensus and the degenerate NBSs. At the degenerate NBS the closed conformation is more preferred and closure of one of the NBSs is sufficient to open the periplasmic gate at the transmembrane domain (TMD).3 By determining the temperature dependence of this conformational equilibrium, the thermodynamics of the energy coupling during ATP-induced conformational changes in TmrAB were investigated. The results demonstrate that ATP-binding alone drives the global conformational switching to the outward-facing state and allows the determination of the entropy and enthalpy changes for this step. With this knowledge, the Gibbs free energy of this ATP induced transition was calculated. Furthermore, an excess of substrate, meaning trans-inhibition of the transporter is resulting mechanistically in a reverse transition from the outward-facing state to an occluded conformation predominantly.3 This work unravels the central role of the reversible conformational equilibrium in the function and regulation of an ABC exporter. For the first time it is shown that the conformational thermodynamics of a large membrane protein complex can be investigated. The presented experiments give new possibilities to investigate other related medically important transporters with asymmetric NBSs or other similar protein complexes.
Multidomain enzymes, such as fatty acid synthases (FASs) or polyketide synthases (PKSs), play a crucial role in the biosynthesis of important natural products. They have a high significance in the development of new pharmaceuticals and various research approaches focus on the engineering of these proteins. For example, human type I FAS is an interesting therapeutic target. Owing to its importance in lipogenesis, upregulation of human type I FAS expression has been observed in numerous cancers. Type I FAS is also regarded as important target in antiobesity treatment. Both multidomain enzyme classes - FASs and PKSs - show high structural and functional similarities. Particularly animal type I FAS is most relevant as evolutionary precursor of the PKS family. Therefore, the well characterized FASs are suitable model proteins for the poorly characterized PKSs, to gain deeper understanding in these megasynthases.
Furthermore, fatty acids are considered to be strategically important platform chemicals accessible through sustainable microbial approaches. The recently acquired structural information on FASs provides an excellent understanding of the molecular basis of fatty acid synthesis. The specific understanding of chain-length control, the characterization of a multitude of substrate-specific thioesterases, and the emerging tools and means for metabolic engineering have fostered targeted approaches for modulating chain length. There is large interest in short-chain fatty acids, since these compounds are biotechnologically valuable platform chemicals and biofuel precursors, and attempts on the synthesis of short-chain fatty acids have been reported during the last years.
Primary focus of this thesis lies on the animal type I FASs, which exhibit large conformational variety, as seen in electron microscopy and high-speed atomic force microscopy. Conformational dynamics facilitate productive protein-protein interactions between catalytic domains within the enzyme and aid acyl carrier protein (ACP)-mediated substrate shuttling during the catalytic cycle of fatty acid biosynthesis. To gain deeper insight into the fundamental processes of ACP-mediated substrate shuttling and the underlying conformational dynamics, spectroscopic methods like Förster resonance energy transfer and electron paramagnetic resonance spectroscopy shall be employed. These spectroscopic methods demand site-specific labeling of proteins with fluorophore or spin labels, which can be accomplished with the amber codon suppression technology. Through amber codon suppression, a non-canonical amino acid (ncAA) with an orthogonal functional group is incorporated site-specifically into the protein sequence, which can be used in chemoselective reactions for protein labeling.
This thesis is at the forefront of employing the technology of amber codon suppression for addressing complex biological questions on megasynthases. The successful production of ncAA-modified FASs is challenging. With the aim of incorporating ncAAs into the multidomain 540 kDa large murine FAS, we by far exceed boundaries of documented application of amber codon suppression. Most of the proteins that are reported by Liu & Schultz in applications of amber codon suppression are in the range of 30kDa - for example the TE domain of human FAS. In the same review, the largest protein amber codon suppression was applied to is a potassium channel with roughly 80 kDa. Thus, to the best of my knowledge no protein exceeding 100 kDa has been used in amber codon suppression so far.
In this thesis a low-complex, well-plate based reporter assay is presented, based on an ACP-GFP fusion protein for fast and efficient screening of ncAA incorporation. Reliability and applicability of the reporter assay is demonstrated by successful upscaling to larger protein constructs and increased expression scale.
As outlined in this thesis, we have carefully set up methods for the modification of murine FAS and made several achievements:
(i) We have created our own toolbox with a multitude of suppressor plasmids and various orthogonal pairs. pACU and pACE plasmids are compatible for fast exchange of cassettes, and cloning procedures are optimized for modification of synthetases by site-directed mutagenesis. (ii) We have organic synthesis of several ncAAs stably running in the lab and synthesis of other ncAAs can be established when required. Therefore, extensive screening at moderate costs is possible. (iii) We have established a reporter assay for screening our own library of vectors for amber codon suppression and for optimizing incorporation of ncAAs. (iv) We successfully incorporated ncAAs into subconstructs and full-length murine FAS, and collected initial promising results for the application of these proteins in spectroscopic methods. Thus, laying the foundation for future studies to address fundamental questions of the ACP-mediated substrate shuttling and other conformational dynamics of these enzymes.
Die vorliegende Arbeit Zeitaufgelöste NMR-spektroskopische Untersuchung konformationeller Dynamiken in DNA G-Quadruplexen befasst sich mit der detaillierten biophysikalischen Untersuchung wichtiger strukturdynamischer Eigenschaften von nicht-kanonischen Nukleinsäure Sekundärstrukturelementen.
Im Genom aller eukaryotischer Lebewesen, insbesondere dem menschlichen Genom finden sich DNA-Sequenzabschnitte, die überdurchschnittlich Guanosin (G)-reich sind. Diese poly-G Abschnitte sind nicht zufällig im Genom verteilt, sondern häufen sich vermehrt in Genabschnitten, die besonders wichtig für die Regulation der Genexpression sind. G-reiche DNA-Sequenzen können unter geeigneten Umständen alternative Sekundärstrukturen ausbilden, die von der doppelsträngigen, kanonischen Watson-Crick Konformation abweichen. In Anwesenheit monovalenter Kationen können sich G-Nukleotide in einer Tetrade über Hoogsteen Interaktionen anlagern. Diese Tetraden können sich stapeln und dadurch sogenannte G-Quadruplexe (G4) ausbilden. Das menschliche cMYC Gen wird typischerweise als proto-Onkogen bezeichnet. Es kodiert für einen unspezifischen Transkriptionsfaktor, der bei einer Vielzahl von systematischen und soliden Tumorerkrankungen stark überexprimiert wird. Die zelluläre Konzentration des Genprodukts kann zu 90% über ein G4 cis-Element in der Promotorregion reguliert werden. Der cMYC G4 hat die Möglichkeit verschiedene Konformationen einzunehmen. Im Falle des cMYC G4 kann man zusätzliche, nicht-konventionelle Formen der konformationellen Isomerie finden. Zum einen gibt es die Möglichkeit, dass bei einem G4, der aus drei Tetraden und vier intramolekularen Strangabschnitten (dreistöckiger G4) besteht, einzelne Strangabschnitte mehr als drei konsekutive G-Nukleotide besitzen. Dadurch können sich Faltungs-Isomere bilden, die sich durch Verschieben des Strangs relativ zum verbleibenden dreistöckigen Tetradengerüst ergeben. Man spricht von G-Register Isomeren. Eine zweite Möglichkeit der Strukturisomerie ergibt sich, wenn in einer Nukleotidsequenz mehr als vier G-reiche Strangabschnitte aufeinander folgen. Jeweils vier dieser Strangabschnitte können in unterschiedlicher Weise kombiniert werden, um ein G4 Isomer auszubilden. In jedem dieser so zustande gekommenen G4 verbleibt ein (oder mehrere) G-reicher Strangabschnitt, der im konkreten Isomer nicht zur Faltung verwendet wird. Diese zusätzlichen G-Stränge werden daher auch Ersatzräder (engl. spare-tires) genannt; man erhält spare-tire Isomere.
Obwohl diese Formen des Polymorphismus, deren biologischer Kontext und die biophysikalischen Konsequenzen in Arbeiten von C. Burrows (2015) und A. Mittermaier (2016) erstmals umfassend beschrieben wurden, gab es bis zum Ausgangspunkt dieser Arbeit keine Kenntnisse über deren strukturelle Dynamik, den Faltungswegen und den zugrundeliegenden molekularen Mechanismen. Zeitaufgelöste Kernspinresonanz (engl. nuclear magnetic resonance, NMR) Spektroskopie ist eine bestens geeignete Methode, um die Dynamik von Biomakromolekülen mit atomarer Auflösung zu studieren. Um solche Experimente durchführen zu können, braucht es geeignete Herangehensweisen für die Präparation eines Nicht-Gleichgewichtszustands. In dieser Arbeit wird eine neu erarbeitete Strategie vorgestellt, die es erlaubt, Einblick in die Faltungs- und Umfaltungskinetiken eines dynamischen Konformations-Ensembles nicht-konventioneller Strukturisomere der cMYC G4 DNA-Sequenz zu erhalten.
Hierzu wurden photolabile Schutzgruppen (engl. Photocages) positionsspezifisch an bestimmten G-Nukleobasen (O6-(R)-NPE) angebracht. Die Schutzgruppen blockieren die Basenpaar-Interaktionen des Nukleotids, wodurch dieses sich nicht mehr an einer Tetradenbildung beteiligen kann. Die Photocages wurden jeweils an den Nukleotiden eingeführt, die nur in jeweils einem der G-Register Isomere an der Tetradenbildung beteiligt sind. Durch diese gezielte Destabilisierung konnten die Isomere getrennt und im gefalteten Zustand isoliert werden. Die so erhaltenen Konformationen wurden umfassend spektroskopisch charakterisiert. Der Ansatz, das konformationelle Gleichgewicht durch Photocages transient zu stören, wurde daraufhin weiterentwickelt. Mehrere Photocages wurden an Nukleobasen in zentraler Position einzelner G-Strangabschnitte angebracht. Dadurch konnte eine ausreichende Destabilisierung erreicht werden, die die Faltung jedweder G4 Strukturen unterbindet. Somit wurde ein ungefalteter Zustand erzeugt, der unter ansonsten frei wählbaren, physiologischen Bedingungen besteht. Durch in situ Photolyse der Schutzgruppen konnte so die Licht-induzierte G4 Faltung unter konstanten Puffer- und Temperaturbedingungen untersucht werden. Dieser Ansatz wurde auf die Untersuchung der Faltungswege, die zu verschiedenen spare-tire Isomeren führen, fokussiert.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass es insgesamt erstmalig gelungen ist, die Kinetiken der wesentlichen Faltungs- und Umfaltungswege entlang der konformationellen Energielandschaft des cMYC G4 Elements zu untersuchen. Das komplexe, dynamische Zusammenspiel aller relevanten, nicht-konventionellen isomeren G4 Strukturen konnte entworren und umfassend experimentell beschrieben werden. Der dafür weiterentwickelte Ansatz über konformationelle Selektion mit Hilfe photolabiler Schutzgruppen hat dabei experimentelle Einblicke erlaubt, die bislang nicht zugänglich waren. Die Strukturen und Faltungszustämde, die mit den chemisch modifizierten Oligonukleotiden erhalten und isoliert wurden, sind umfassend spektroskopisch untersucht worden. Die Anwendung verschiedener spektroskopischer Ansätze und deren Kombination mit weiteren biophysikalischen Methoden hat eine Methoden-unabhängige Validierung der erhaltenen kinetischen und thermodynamischen Daten ermöglicht.
Many processes in living cells involve interaction and cooperation of multiple proteins to fulfill a specific function. To understand biological processes in their full complexity, it is not sufficient to only identify the molecules being involved but also to understand the kinetic aspects of a reaction. Mass spectrometry (MS) is a very powerful tool which allows to precisely identify the molecules of a reaction. Usually this is done with tandem-MS experiments for purpose of de-novo peptide sequencing. However, since this involves protein digestion, a statement of the in-vivo constitution of non-covalently bound protein complexes is not possible. In order to detect an intact protein complex it is necessary to analyze the biological system softly and in a near-native environment with native MS. Native MS allows the non-destructive analysis of these non-covalent protein complexes as well as to detect their components. However, up to now native MS does not offer a possibility to resolve the timing of the constitution of protein complexes on a fast time-scale. Therefore, the progress of reactions on fast time-scales is invisible. However, a method which delivers both types of information - identification of the components of a protein complex, as well as time-resolving their interaction - would be of high interest.
A suitable ionization technique for native MS is laser-induced liquid-bead ion desorption (LILBID). LILBID employs well-defined droplets which are irradiated by IR laser pulses to generate gas phase ions. The not-continuous, repetitive nature of ion generation offers itself to the development of a time-resolved (TR) native MS system which is able to investigate protein complexes on a fast time scale. The LILBID-droplets can serve as reaction vessels if they are levitated in an electrodynamic Paul-trap. This new setup would allow sample manipulation and MS analysis on precise and fast reaction time-scales. The first part of this dissertation presents the construction and characterization of a setup for TR-LILBID-MS.
An example for a complex biological system is the self-assembly of beta-amyloid (Aβ). This small peptide is the major component in plaques related to Alzheimer’s disease. Clinically relevant is especially the 42 amino acid peptide Aβ42 which aggregates from monomers to oligomers through to fibrils. The oligomers are the neurotoxic species in this process and thus of high interest. Nevertheless, standard analytical techniques are unable to detect those oligomers which makes MS an optimal tool to study the oligomerization process of Aβ with the focus on disease relevant oligomers. TR-LILBID-MS allows to follow the oligomerization of Aβ enabling to study molecules which influence this kinetic. Combining MS with ion-mobility spectrometry adds an additional dimension - the collision cross section - to the mass-to-charge ratio obtained from MS. Therewith structural alterations induced by ligands can be correlated to differences in the aggregation kinetic. This allows to draw a picture of the aggregation process of Aβ for the development of disease-relevant small oligomers on a molecular level.
Die Wechselwirkungen von flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) mit Eis in der Atmosphäre sind für viele umweltrelevante Aspekte von Interesse, dennoch gibt es bisher erst wenige Untersuchungen zu dieser Thematik.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen verschiedener VOCs mit Eis durch Kraftfeldrechnungen simuliert. Als Substanzen wurden das Keton Aceton, die Kohlenwasserstoffe Isopren und Mesitylen, die Alkohole Ethanol, tert-Butanol, 2-Methyl-3-buten-2-ol (MBO) und Perillylalkohol, die Ether Methyl-tert-butylether und Ethyl-tert-butylether (ETBE) sowie die Aldehyde Nonanal und Methacrolein ausgewählt.
Hierbei wurden sowohl die Adsorption an verschiedenen Oberflächen von hexagonalen Eis (Eis Ih) und von kubischem Eis (Eis Ic) als auch die Absorption in Eiskristallen und an den darin enthaltenen Linien- und Flächendefekten betrachtet. Für jedes VOC wurden die resultierenden Strukturen sowie die dazu gehörigen Enthalpien ermittelt und mittels Boltzmann-Statistik ausgewertet.
Für die Berechnung der Wechselwirkungen von VOC mit Eis wurde ein Kraftfeld entwickelt, das sowohl die Strukturen von Eis Ih und Eis Ic als auch die Strukturen der organischen Moleküle und ebenso die Wechselwirkungen zwischen Eis und organischem Molekül gut wiedergibt. Es basiert auf dem für organische Moleküle verwendeten DREIDING-Kraftfeld und wurde modifiziert mit Parametern für Wasser aus dem TIP5P-E-Kraftfeld. Das Kraftfeld wurde an Ab-initio-Rechnungen und experimentellen Daten validiert.
Die Simulationen erbrachten folgende Ergebnisse:
– Unpolare Kohlenwasserstoffe werden nur in geringem Maße an den Eisoberflächen adsorbiert; eine Absorption in die Eiskristalle ist energetisch noch wesentlich ungünstiger. Für diese Verbindungen ist der Austrag aus der Atmosphäre durch Wechselwirkungen mit der Eisphase daher nicht relevant.
– Sauerstoffhaltige Verbindungen werden an der Eisoberfläche gut adsorbiert. Zwischen dem VOC-Molekül und der Eisoberfläche bilden sich Wasserstoffbrückenbindungen aus. Ihre Anzahl ist abhängig von der Art des Moleküls (Keton, Aldehyd, Ether oder Alkohol). Die Simulationen zeigen, dass die nasse Deposition durch Wechselwirkungen mit der Eisphase für diese Stoffe ein Austragsweg aus der Atmosphäre ist, der nicht vernachlässigt werden darf.
– Bei einem Einbau von VOC-Molekülen in den Eiskristall wird die Eisstruktur teilweise erheblich verzerrt. Je kleiner die VOC-Moleküle sind, desto geeigneter sind sie für einen Einbau in den Eiskristall; bei größeren Molekülen ist der Einbau aufgrund des sterischen Anspruchs behindert. Zunehmende Größe des Moleküls begünstigt andererseits die Adsorption.
Parallel zu den theoretischen Untersuchungen wurde eine Apparatur entwickelt, mit der sich die Ad- und die Absorption von VOCs beim Wachsen der Eiskristalle experimentell untersuchen lässt. Die Eiskristalle entstehen dabei unter kontrollierten Bedingungen und wachsen, wie in der Atmosphäre, durch Anlagerung von Wasserdampf. Gleichzeitig wird dem Wasserdampf eine definierte Menge an VOC zugegeben. Das entstehende Eis wurde mittels GC analysiert. Als alternatives Analyseverfahren zur Bestimmung von VOCs in Wasser wurde ein NMR-Verfahren entwickelt, das quantitative Messungen im dreistelligen ppm-Bereich erlaubt. Erste Untersuchungen an Eiskristallen, die in Gegenwart von ETBE erzeugt wurden, zeigten, dass dieses VOC − wie auch in den Simulationen vorhergesagt − überwiegend an der Oberfläche von Eis adsorbiert, und nicht in den Eiskristall eingebaut wird.
Für ETBE wurde im Rahmen dieser Arbeit zusätzlich die Kristallstruktur der alpha-Phase aus Röntgenpulverdaten durch Kristallstrukturvorhersage und Realraummethoden bestimmt. ETBE kristallisiert in der für organische Verbindungen sehr seltenen Raumgruppe C 2/m. Die experimentelle Kristallstruktur entspricht der von der Dichte her günstigsten, von der Gitterenergie her zweitgünstigsten vorhergesagten Kristallstruktur. Die Kristallstruktur eines zweiten VOCs, MBO, konnte ebenfalls aus Röntgenpulverdaten bestimmt werden, obwohl die Kristallstruktur drei symmetrieunabhängige Moleküle pro asymmetrischer Einheit enthält. Da sowohl ETBE als auch MBO bei Raumtemperatur flüssig sind, wurden beide für die Messungen bei tiefer Temperatur kristallisiert.
Die Kristallstrukturen dieser beiden VOCs können wiederum zur Simulation von sekundären organischen Aerosolen in der Atmosphäre genutzt werden.
Auch die Kristallstrukturen zweier weiterer Verbindungen konnten aus Röntgenpulverdaten bestimmt werden: zum einen die Strukturen des Trihydrates, des Monohydrates und des Anhydrates von Pigment Red 57:1 (C18H12CaN2O6S), dem wichtigsten industriellen Rotpigment, mit dem weltweit die Mehrheit aller Zeitungen und Zeitschriften gedruckt werden, zum anderen die Struktur des 2-Butanol-Hemisolvats von Methyl-(2R,3R)-2-{3-[amino(imino)methyl]benzyl}-3-{[4-(1-oxido-4-pyridinyl)benzoyl]¬amino}butanoat-hydrochlorid. Mit diesen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Kristallstrukturen organischer Verbindungen aus Röntgenpulverdaten auch dann bestimmt werden können, wenn verschiedene Probleme kombiniert auftreten, z. B. schlecht kristalline Pulver, Textur, Solvate, Hydrate, Fehlordnung, funktionelle Gruppen mit vergleichbarer Streukraft, mehrere symmetrieunabhängige Moleküle, hohe Anzahl von Parametern bei der Strukturlösung etc.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass die Wechselwirkungen zwischen sauerstoffhaltigen VOC-Molekülen und der Eisphase nicht vernachlässigt werden dürfen. Sie sollten in Simulationen der Atmosphäre berücksichtigt werden, um so Aussagen über Auswirkungen auf das Klima und andere umweltrelevante Aspekte zu verbessern.
Oxidative stress is thought to be a driver for several diseases. However, many data to support this concept were obtained by the addition of extracellular H2O2 to cells. This does not reflect the dynamics of intracellular redox modifications. Cells actively control their redox-state, and increased formation of ROS is a response to cellular stress situations such as chronic inflammation.
In this study, it was shown that different types of ROS lead to different metabolic and transcriptomic responses of HUVECs. While 300 μM extracellular H2O2 led to substantial metabolic and transcriptomic changes, the effects of DAO-derived H2O2 and menadione were low to moderate, indicating that the source and the concentration of ROS are important in eliciting changes in metabolism and gene expression.
Specifically, it was identified that acute increases in ROS transiently inactivate the enzyme ω-amidase/NIT2 of the glutaminase II pathway, which supplies cells with anaplerotic α-ketoglutarate. The pathway has not been studied systematically because, as noted above, the major intermediate, KGM, is not commercially available. In the present study, an internal standard for targeted detection of KGM in cells and blood plasma/serum was used. Deletion of NIT2 by CRISPR/Cas9 significantly reduced α-ketoglutarate levels in HUVECs and elevated KGM levels. It appears that in cell culture conditions, hydrolysis of KGM to α-ketoglutarate is very efficient. Knockout of the glutamine transaminases significantly reduced methionine, suggesting that the glutaminase II pathway is an important source of amino acid replenishment.
Similar to genetic silencing of GLS1 [91,92], HUVECs lacking NIT2 showed reduced proliferation and angiogenic sprouting. Furthermore, our results indicate that, at least in HUVECs, the enzyme also locates in the mitochondria where it interacts with key enzymes of glutamine/glutamate/α-ketoglutarate metabolism.
The data of the present work indicate that the glutaminase II pathway is an underappreciated, redox-sensitive pathway for glutamine utilization in HUVECs. Genetic deletion of NIT2 has considerable physiological effects highlighting the importance of glutamine for ECs.
The endosteal bone marrow niche and vascular endothelial cells provide sanctuaries to leukemic cells. In murine chronic myeloid leukemia (CML) CD44 on leukemia cells and E-selectin on bone marrow endothelium are essential mediators for the engraftment of leukemic stem cells (LSC). We hypothesized that non-adhesion of CML-initiating cells to E-selectin on the bone marrow endothelium may lead to superior eradication of LSC in CML after treatment with imatinib than imatinib alone. Indeed, here we show that treatment with the E-selectin inhibitor GMI-1271 in combination with imatinib prolongs survival of mice with CML via decreased contact time of leukemia cells with bone marrow endothelium. Non-adhesion of BCR-ABL1+ cells leads to an increase of cell cycle progression and an increase of expression of the hematopoietic transcription factor and protooncogene Scl/Tal1 in leukemia-initiating cells (LIC). We implicate SCL/TAL1 as indirect phosphorylation target of BCR-ABL1 and as a negative transcriptional regulator of CD44 expression. We show that increased SCL/TAL1 expression is associated with improved outcome in human CML. These data demonstrate the BCR-ABL1-specific, cell-intrinsic pathways leading to altered interactions with the vascular niche via the modulation of adhesion molecules - a strategy therapeutically exploitable in future.
Currently, due to the misuse of antibiotics, we are facing a major public health problem. The resistance to antibiotics of certain bacterial strains makes the treatment of infections very complex.
In this context, the present thesis project concerns the study of a bacterial efflux complex capable of transporting antibiotics from the cytoplasm to the outside of the cell. This complex is composed of an inner-membrane Major Facilitator Superfamily (MFS) transporter (EmrB, E. coli multidrug resistance), a channel of the outer membrane TolC (Tolerance to Colicin E1) and a periplasmic adapter (EmrA, E. coli multidrug resistance). Unlike RND-type efflux systems (such as AcrAB-TolC), little is known about the MFS-type EmrAB-TolC system. It is therefore important to study the entire complex on a structural and functional level, to analyse the marked differences between these two types of transport systems. The goal of my thesis project was to study at least one EmrAB-TolC complex from a structural point of view. For my studies the aim was to isolate the complex directly from bacteria overexpressing the three protein partners. In a first step, 15 homologous EmrAB-TolC systems were identified and their corresponding genes amplified from genomic DNA of different Gram-negative bacteria. Among the genes of the 15 systems, the genes coding for the E. coli and V. cholerae systems were further studied. The expression vectors encoded fluorescent markers for the monitoring of the expression levels of different proteins and for studying the formation of complexes. In a first step, the different protein expression levels (EmrB-mRFP1 and EmrA-sfGFP) were studied for several expression strains of E. coli by measuring the red and green fluorescence levels and by Western blot (anti-His, Myc, and Strep for EmrB, EmrA, and TolC). The E. coli strain C41(DE3) was best suited for co-expression of EmrAB-TolC. In a second step, the FSEC (Fluorescence detection Size Exclusion Chromatography) methodology was used to identify a complex suitable for structural study. Thus this method enabled the observation that the EmrAB-TolC complex of E. coli was produced in higher amount than that of V. cholerae. The final co-purification protocol consists in perfoming a gentle lysis of the bacteria using lysozyme, then after solubilization with DDM, the purification is started by a Ni2+-NTA affinity chromatography step followed by a size exclusion chromatography step. Finally, the fractions containing the three protein partners are used for the detergent-exchange by amphipol A8-35 before the structural study by electron microscopy. Negative stain EM-micrographs displayed elongated objects with a length of 33 nm in side view. An average image of EmrAB-TolC shows similarities to that of the AcrAB-TolC complex observed under similar conditions. Similarities included the characteristic densities of TolC. Whereas differences were found in the lower part of EmrAB which is thinner than the lower part of AcrAB. The densities visible above the amphipol-ring correspond to EmrA, which displays a channel-like structure as in AcrA. The channel however seems to extend further towards the amphipol belt. Since EmrB does not have an extended periplasmic domain as the RND proteins have, these densities are therefore solely assigned to EmrA. EmrA, on the other side, contacts TolC akin to the interaction of AcrA/MexA to their cognate outer membrane channels (TolC/OprM) in a ‘tip-to-tip’ fashion.
The role of USP22 in nucleic acid sensing pathways and interferon-induced necroptotic cell death
(2023)
Every day, living organisms are challenged by internal and external factors that threaten to bring imbalance to their tightly regulated systems and disrupt homeostasis, leading to degeneration, and ultimately death. More than ever, we face the challenge of combating diseases such as COVID-19 caused by infection with the SARS-CoV-2 coronavirus. It is therefore crucial to identify host factors that control antiviral defense mechanisms. In addition, in the fight against cancer, it is becoming increasingly important to identify markers that could be used for targeted therapy to influence cellular processes and determine cell fate.
As a deubiquitylating enzyme, ubiquitin specific peptidase 22 (USP22) mediates the removal of the small molecule ubiquitin, which is post-translationally added to target proteins, thereby regulating several important processes such as protein degradation, activation or localization. Through its deubiquitylating function, USP22 controls several biological processes such as cell cycle regulation, proliferation and cancer immunoresistance by modulating key proteins involved in these pathways. Lately, USP22 was reported to positively regulate TNFα-mediated necroptosis, an inflammatory type of programmed cell death, in various human tumor cell lines by affecting RIPK3 phosphorylation. In addition, USP22 as a part of the Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase (SAGA) transcription complex is known to regulate gene expression by removing ubiquitin from histones H2A and H2B. However, little is known about the role of USP22 in global gene expression.
In this study, we performed a genome-wide screen in the human colon carcinoma cell line HT-29 and identified USP22 as a key negative regulator of basal interferon (IFN) expression. We further demonstrated that the absence of USP22 results in increased STING activity and ubiquitylation, both basally and in response to stimulation with the STING agonist 2'3'-cGAMP, thereby affecting IFNλ1 expression and basal expression of antiviral ISGs. In addition, we were able to establish USP22 as a critical host factor in controlling SARS-CoV-2 infection by regulating infection, replication, and the generation of infectious virus particles, which we attribute in part to its role in regulating STING signaling.
In the second part of the study, we connected the findings of USP22-dependent regulation of IFN signaling and TNFα-induced necroptosis and investigated the role of USP22 during necroptosis induced by the synergistic action of IFN and the Smac mimetic BV6 in caspase-deficient settings. We identified USP22 as a negative regulator of IFN-induced necroptosis, which does not depend on STING expression, but relies on a yet unknown mechanism.
In summary, we identify USP22 as an important regulator of IFN signaling with important implications for the defense against viral infections and regulation of the necroptotic pathway that could be exploited for devising targeted therapeutic strategies against viral infections and related diseases like COVID-19, and advancing precision medicine in cancer treatment.
The majority of B-cell precursor acute leukemias in infants are associated with the chromosomal translocation t(4;11)(q21;q23), resulting in the fusion of the mixed-lineage leukemia (MLL) and ALL1-fused gene of chromosome 4 (AF4) genes. While the fusion protein MLL-AF4 is expressed in all t(4;11) patients and essential for leukemia progression, the distinct role of the reciprocal fusion protein AF4-MLL, that is expressed in only 50-80% of t(4;11) leukemia patients (Meyer et al., 2018), remains unclear. In addition, t(4;11) leukemia could so far exclusively be generated in vivo in the presence of AF4-MLL and independent of the co-expression of MLL-AF4 (Bursen et al., 2010).
In a multifactorial approach inhibiting histone deacetylases (HDACs) and expressing the dominant negative mutation of Taspase1 (dnTASP1), both MLL fusion proteins were targeted simultaneously to evaluate a possible cooperative effect between MLL-AF4 and AF4-MLL during the progression of leukemia. Of note, neither HDACi nor dnTASP1 expression negatively affect endogenous MLL, but rather endorse its function hampered by the MLL fusion proteins (Ahmad et al., 2014; Bursen et al., 2004; Zhao et al., 2019). The mere expression of dnTASP1 failed to induce apoptosis, whereas dnTASP1 could elevate apoptosis levels significantly in HDACi-treated t(4;11) cells underlining the therapeutic potential of co-inhibiting both MLL fusion proteins.
Next, the impact of inhibiting either MLL-AF4 or AF4-MLL in vivo was resolved using whole transcriptome analysis. In PDX cells obtained by the Jeremias Laboratory (Völse, 2020) that co-expressed both t(4;11) fusion proteins, the knock-down of MLL-AF4 revealed the down-regulation of pivotal hemato-malignant factors. The expression of dnTASP1 led to massive deregulation of cell-cycle genes in vivo. Considering that the inhibition of particularly MLL-AF4 but not AF4-MLL impaired leukemic cell growth in vivo (Völse, 2020), the results of this work suggest a cooperative effect between both fusion proteins, while the loss of AF4-MLL during leukemia progression appears not essential.
Thereafter, a possible short-term role of AF4-MLL during the establishment of t(4;11) leukemia was analyzed. For this purpose, an in vitro t(4;11) model was constructed to investigate the transforming potential of transiently expressed AF4-MLL in cells constitutively expressing MLL-AF4, putatively reflecting the situation in vivo. Due to the lack of a leukemic background of the applied cell line, the aim was to investigate the long-term potential of AF4-MLL to significantly alter the epigenome rather than mimicking the development of leukemia. Strikingly, short-term-expressed AF4-MLL in cooperation with MLL-AF4 exerted durable epigenetic effects on gene transcription and chromatin accessibility. The here obtained in vitro data suggest a clonal evolutionary process initiated by AF4-MLL in a cooperative manner with MLL-AF4. Importantly, no long-term changes in chromatin accessibility could be observed by the transient expression of either MLL-AF4 or AF4-MLL alone.
All in all, considering endogenous MLL, MLL-AF4 and AF4-MLL in a targeted treatment is a promising approach for a more tailored therapy against t(4;11) leukemia, and AF4-MLL is suggested to act in a cooperative manner with MLL-AF4 especially during the development of a t(4;11) leukemia.
Metabolites such as lactate and free fatty acids (FFAs) abundantly occur in high concentrations in tumor and stromal cells of solid malignancies. Their known functions comprise the allocation of nutrients and intermediates for the generation of cell components, the evasion of immune destruction, the induction of vessel formation and the stimulation of cell migration in order to promote tumor growth, progression and metastasis. However, the role of metabolites as signaling molecules and the downstream mechanisms of metabolite receptor mediated signaling in tumor and stromal cells is poorly understood. Our study confirms the expression of Hydroxycarboxylic acid receptor 1 (HCA1) in solid human breast tumors and the expression of Free fatty acid receptor 4 (FFA4) in solid human colorectal tumors. In addition, the expression of HCA1 in human breast cancer cell lines as well as the expression of FFA4 in human colorectal cancer cell lines was proved. Moreover, our research reveals the expression HCA2, FFA2 and FFA4 in tumor associated macrophages (TAMs).
To test whether the loss of any of the metabolite receptors affects tumor growth and progression we utilized a syngeneic Lewis lung cancer (LLC1) tumor model, an azoxymethane (AOM) – dextran sulfate (DSS) colorectal cancer model and a Mouse mammary tumor virus Polyoma Virus middle T antigen (MMTV-PyMT) breast cancer model. The loss of HCA2 did not lead to a changed outcome compared to wild type littermates in any of the models. Likewise, the deletion of FFA4 had no influence on the LLC1 model and, surprisingly, tumor number and area in the AOM-DSS model also remained unaltered. The impact of HCA1 deficiency was investigated utilizing the MMTV-PyMT model and revealed a moderately improved tumor growth. The absence of FFA2 did not affect tumor growth in the LLC1 model but led to an increased number of colorectal tumors in the AOM-DSS model while the tumor area remained unchanged. The most compelling results were obtained upon the deletion of FFA2 in the MMTV-PyMT model. Here, we demonstrate that the loss of FFA2 significantly reduces tumor latency and also significantly improves tumor growth. Nevertheless, the formation of metastases in the LLC1 model and the MMTV-PyMT model did not show any changes upon the loss of any of the metabolite receptors.
Together, our results describe a tumor-protective effect of FFA2 with an unclear impact on metastatic processes. Considerations about putative mechanisms of short chain fatty acid (SCFA) mediated FFA2 signaling suggest potential targets for pharmacological interventions to treat mammary tumors.
Krebs ist und wird voraussichtlich auch in näherer Zukunft eine der häufigsten Todesursachen weltweit bleiben. Trotz vielversprechenden Fortschritten in Therapeutik und Diagnostik bedarf es noch weiterer Forschung, um die vielfältigen molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, welche dem Verlauf von malignen Tumorerkrankungen bestimmen und zu beeinflussen vermögen. Das RNA-Bindeprotein Hu antigen R (HuR) reguliert Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene, indem es durch Bindung an Ziel mRNAs Einfluss auf deren Abbau, Lokalisation oder Translationseffizienz nimmt. Darüber hinaus zeigte sich in den letzten Jahren, dass HuR diese Prozesse auch indirekt durch Interaktion mit regulatorischen RNAs beeinflusst. In Krebszellen lässt sich häufig eine erhöhte Aktivität von HuR beobachten, welche in Verbindung mit verschiedenen tumorigenen Prozessen gebracht wird. Unter anderem trägt HuR zur Deregulation des Zellzyklus bei, indem es die Expression der Cycline A2, B1, D1 und E1 erhöht. Weiterhin unterstützt HuR das Tumorwachstum durch Regulation von proangiogenen Faktoren wie VEGF, IL8 und COX2. Da HuR generell eine prominente Rolle bei der Regulation von Immunantworten, sowohl in Immunzellen selbst als auch in solidem Gewebe einnimmt, wurde HuR in der Vergangenheit häufig auch mit der Ausbildung des inflammatorischen Tumormikromilieus in Verbindung gebracht, jedoch ist die Datenlage in dieser Hinsicht bis heute uneindeutig. Obwohl eine Großzahl an Zytokinen und inflammatorischen Faktoren prinzipiell als HuR Zielgene beschrieben sind, gibt es nur für die wenigsten dieser Proteine entsprechende Untersuchungen in Tumorzellen.
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von HuR in Tumoren auf die Rekrutierung von Makrophagen zu evaluieren. Hierfür bot sich als in vitro Modell die Brustkrebszelllinie MCF-7 an, da diese unter entsprechenden Kultivierungsbedingungen dreidimensionale Sphäroide bildet. Solch ein Sphäroidmodell bietet sich als Kompromiss zwischen der klassischen zweidimensionalen Zellkultur an, welche zwar höchst artifiziell, jedoch leicht zu handhaben und zu kontrollieren ist, und den physiologischeren, aber gleichzeitig experimentell unzugänglicheren und speziesfremden Tiermodellen. Mittels lentiviraler Transduktion wurde ein small hairpin RNA (shRNA) vermittelter stabiler Knockdown von HuR in MCF-7 erzielt, welcher zu vermindertem Zellwachstum führte, jedoch keinen weiteren Einfluss auf die Bildung von Sphäroiden hatte. Um die initiale Suche nach HuR-regulierten, potenziell relevanten Faktoren möglichst breit und unvoreingenommen zu halten, wurde die Expression von 174 Zytokinen in Wildtyp- und HuR-knockdown Sphäroiden mittels eines Protein Arrays untersucht. Überraschenderweise zeigte der Großteil der veränderten Proteins einen negativen Zusammenhang mit HuR, welches eigentlich eher als positiv regulierendes Protein beschrieben ist. Bemerkenswerterweise befand sich unter den mit am stärksten regulierten Faktoren das Chemokin CCL5 (auch RANTES genannt), welches einerseits als einer der beiden zentralen Faktoren für die Makrophageninfiltration in Brustkrebs gilt, andererseits bisher noch nicht in Verbindung mit HuR gebracht wurde.
Im Folgenden untersuchte ich zuerst den mechanistischen Hintergrund dieser Regulation. Da diese sich auch in adhärenten Zellrasen zeigte, wechselte ich für die entsprechenden Experimente zu zweidimensionaler Zellkultur. Eine negative regulatorische Funktion von HuR wird meist in Verbindung mit verminderter Translation von Zielfaktoren gebracht. Da die mRNA Level von CCL5 dem Effekt auf Proteinebene entsprachen, konnten entsprechende Mechanismen als Grund für die veränderten CCL5 Level ausgeschlossen werden. Desweiteren blieb die mRNA Stabilität ungeachtet der HuR Level konstant; dabei zeigte sich zudem, dass mRNA Abbau generell keinen relevanten Einfluss auf die Expression von CCL5 in MCF-7 hatte. Da diese Ergebnisse auf eine transkriptionelle Regulation hindeuteten, untersuchte ich im Folgenden den Einfluss von HuR auf die Promoteraktivität von CCL5. Hierfür isolierte ich zunächst die CCL5-Promoterregion aus genomischer DNA von MCF-7 Zellen und inserierte diese dann in einen zuvor promoterlosen Luciferase-Expressionsvektor. In den folgenden Reporteranalysen zeigte sich, dass HuR tatsächlich einen negativen Einfluss auf die Promoteraktivität von CCL5 ausübt. Durch sukzessive Verkürzung ließ sich der entscheidende DNA-Bereich auf die letzten 140 Nukleotide vor dem Transkriptionsstartpunkt eingrenzen. Dieser Bereich enthält vier prominente und sehr gut charakterisierte regulatorische Abschnitte: zwei benachbarte NF-κB Bindestellen sowie je ein Interferon-stimulated Response Element (ISRE) und ein C/EBPβ Erkennungsmotiv. Während das C/EBP Element keine funktionelle Relevanz in den Reporteranalysen hatte, reduzierte sich durch Deletion sowohl der ISRE als auch der NF-κB Elemente die Promoteraktivität um mehr als 50%, allerdings nur im ISRE-Deletionskonstrukt unter Nivellierung des HuR-abhängigen Unterschiedes. Somit ließ sich der Einfluss von HuR auf die CCL5 Promoteraktivität vollständig und ausschließlich auf das ISRE zurückführen. Im Gegensatz zu dem in Tumorzellen häufig basal überaktiven NF-κB Signalweg sind die kanonischen, ISRE-assoziierten Typ I Interferon Signalkaskaden und ihre vermittelnden Transkriptionsfaktoren, die sogenannten Interferon Regulatory Factors (IRFs) nicht konstitutiv überaktiviert. Eine Sonderstellung nehmen dabei die Faktoren IRF1 und IRF2 ein, da sie, für Proteine abseits der Stimulus-getriebenen ISRE-Interferon Achse, auch als konstitutive Transkriptionsfaktoren beschrieben sind, wobei IRF2 in diesem Kontext als IRF1-Antagonist und somit Transkriptionsrepressor fungiert. Überraschenderweise ließ sich mittels Chromatin Immunopräzipitation eine Assoziation von IRF1 mit dem CCL5 Promoter nur in Wildtyp-, jedoch nicht in HuR-knockdown Zellen nachweisen. Im Gegensatz dazu ergaben mRNA Expressionsanalysen der Tumor-relevanten IRFs, dass die CCL5 Induktion in HuR-depletierten Zellen mit einer allgemeinen, jedoch niedrigschwelligen Erhöhung von Typ I Interferon-assoziierten Signalen einhergeht. Interessanterweise korrelierte Interferon β zwar mit CCL5 auf mRNA Ebene, jedoch hatte eine Blockade des Interferon-α/β Rezeptors in HuR-depletierten Zellen keinen akuten Effekt auf CCL5. Umgekehrt zeigte sich auch keine erhöhten CCL5 Level in Wildtypzellen unter Kokultur mit HuR-knockdown Zellen, wie es bei parakriner Induktion durch Interferon β zu erwarten wäre. Ebenso konnte alternatives ISRE Signaling durch einen Komplex aus unphosphoryliertem Stat1 und IRF9, wie es in vitro unter länger anhaltender Niedriglevel Exposition mit Interferon β beobachtet wurde, ausgeschlossen werden. Um sicher zu stellen, dass diese Erhöhung kein sequenzabhängiges off-target Artefakt ist, wie es in der Vergangenheit für einzelne small hairpin RNAs (shRNAs) beobachtet wurde, wurde eine entsprechende Aktivierung von IRF3 und damit des IRF3/IRF7 Aktivierungsweges untersucht und ausgeschlossen. Zusätzlich konnte durch Tests unterschiedlicher shRNA Sequenzen sowie Zellsysteme demonstriert werden, dass die CCL5 Aktivierung tatsächlich ein spezifischer und in einer größeren Bandbreite an Krebszelllinien unterschiedlicher Herkunft, darunter Brust- und Lungenkarzinom, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien, reproduzierbarer Effekt von HuR-Defizienz ist.
Da CCL5 als eines der zentralen Chemokine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen in Tumore beschrieben ist, stellte sich die Frage, ob HuR mit diesem Vorgang in Verbindung zu bringen ist. Brusttumore weisen oft eine hohe Zahl von Tumor-assoziierten Makrophagen auf, welche von eingewanderten Blutmonozyten abstammen. Ein Einfluss von HuR auf diesen Vorgang in vitro konnte mittels einer Kokultur von Sphäroiden mit zuvor frisch aus Humanblut isolierten Primärmonozyten nachgewiesen werden. Hierbei wiesen HuR-knockdown Sphäroide trotz ihres geringeren Durchmessers eine erhöhte Anzahl von Monozyten/Makrophagen auf. Da sich in diesen Zellen weder Proliferation noch relevante Apoptose zeigte, ließ sich die erhöhte Anzahl auf verstärkte Einwanderung in das Sphäroid zurückführen. Hierbei erwies sich der direkte Zellkontakt zwischen Monozyten und Tumorzellen als erforderlich, da Monozyten keine unterschiedliche Chemotaxis gegenüber entsprechenden Sphäroidüberständen zeigten. Dass die erhöhte Infiltration in HuR-defizienten Sphäroiden tatsächlich auf CCL5 zurückzuführen ist, konnte in Kokulturexperimenten durch Inhibierung von CCL5 gezeigt werden. Unterstütztend wurde ein Zusammenhang zwischen HuR, CCL5 und Tumor assoziierten Makrophagen in silico unter Zuhilfenahme des TCGA Datensets für Estrogenrezeptor-positive Brusttumore untersucht. Im Einklang mit meinen Ergebnissen zeigte sich eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5. Außerdem ließ sich ein negativer Zusammenhang zwischen HuR und einer Makrophagensignatur feststellen, während CCL5 wie erwartet mit dieser Signatur positiv korrelierte.
Zusammenfassend zeigte sich in dieser Arbeit, dass HuR eine Rolle bei der zellulären Zusammensetzung des inflammatorischen Tumor-Mikromilieus spielt. Der Verlust von HuR in Tumorzellen führte zu einer erhöhten Expression des Chemokins CCL5. Dies ließ sich in Brust- und Lungenkarzinom-, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien beobachten. In Brustkrebszellen zeigte sich, dass diese Regulation auf verstärkte Transkription, vermittelt durch ein ISRE innerhalb des CCL5 Promoters, zurückzuführen ist. Funktionell konnte die erhöhte CCL5 Produktion in HuR-defizienten Tumorsphäroiden in Verbindung mit verstärkter Infiltration von Monozyten/Makrophagen gebracht werden. Unterstützend zeigte sich auch bei einer in silico Analyse von Estrogenrezeptor-positiven Brusttumoren eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5, was mit einer entsprechend veränderten Makrophagensignatur einherging. Im Hinblick auf derzeit diskutierte Ansätze, das Wachstum von Tumoren mittels HuR Blockade zu inhibieren, sind meine Ergebnisse potenziell von therapeutischer Relevanz. Basierend auf meiner Arbeit sollte dabei in zukünftigen Studien näher untersucht werden, wie sich Inhibierung von HuR in Tumoren auf die Zusammensetzung und Funktion des Tumormikromilieus auswirkt und daraus resultierende Effekte auf das Tumorwachstum in Relation zu der allgemein wachstumsfördernden Rolle von HuR in Tumorzellen gesetzt werden.
Leukemia is a cancer of the blood and bone marrow characterized by an uncontrolled proliferation and accumulation of abnormal white blood cells. Leukemia can be classified based on the course of the disease (acute or chronic) and the blood cell type involved (myeloid or lymphocytic), leading to four main subtypes: acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), chronic lymphocytic leukemia (CLL) and chronic myeloid leukemia (CML). Leukemia represents 2.5% of all new cancer cases per year, and survival rates in some leukemias remain low at 40%.
The bone marrow microenvironment (BMM) is a system within the bone marrow comprising cellular and acellular components, all of which play a major role in hematopoiesis, providing the physical space where hematopoietic stem cells (HSCs) reside. The BMM interacts with HSCs, offering a “niche” for those cells and in case of leukemia, the BMM has a supportive role in disease maintenance and progression by supporting Leukemia stem cells (LSCs). One of the components of the BMM are calcium ions. Calcium is the most abundant mineral in the body, a key component of bones and is released by parathyroid hormone (PTH) induced bone remodeling. Calcium ions play a role in the localization, engraftment and adhesion of normal HSC to extracellular matrix (ECM) proteins in the BMM via the calcium sensing receptor (CaSR), thereby maintaining normal hematopoiesis. In addition of a major regulator of calcium homeostasis, CaSR contribute to the development of different cancers, functioning as either tumor suppressor or oncogene, depending on the involved tissue. However, the role of CaSR and its associated pathways in the local BMM for the development of leukemia is poorly understood. We hypothesized that calcium ions released from bone, subject to a fine balance between osteoblasts and osteoclasts, and/or CaSR, contribute to development, progression and response to therapy.
We have shown that the local calcium concentration forms a gradient in the bone marrow niche and in mice with CML is similarly low as in control mice, but significantly higher in mice suffering from BCR ABL1 driven B ALL or MLL AF9 driven AML. Similarly, the calcium concentration in the human BMM was found to be higher in AML than in other leukemias. Regarding the function of calcium in leukemia cells, we found that AML and CML cells respond differently to calcium exposure, with AML cells exhibiting regulation of cellular processes such as adhesion to the ECM protein fibronectin and migration toward CXCL 12, whereas CML cells remained mostly unaltered. Using genetic deletion or overexpression of CaSR in murine models of leukemia, we observed that CaSR acts as tumor suppressor in BCR-ABL1 driven CML and B ALL and as oncogene in AML.
Focusing on AML, our data shows that deficiency of CaSR on LICs leads, on one hand to increased apoptosis, and on the other hand to reduced cell cycle, reactive oxygen species (ROS) production and DNA damage in vivo, which may explain the observed prolongation of survival of mice. Complementary, in vitro experiments demonstrated that cells overexpressing CaSR have a distinct, cancer promoting phenotype compared to wildtype cells. Overexpression of CaSR led to an increase in proliferation, cell cycle, ROS production, DNA damage and reduced apoptosis. We have identified CaSR mediated pathways in AML and shown that CaSR enhances leukemia progression by activating MAPK/ERK and Wnt β catenin signaling. In addition, the CaSR interacting protein filamin A (FLNA) was shown to contribute to aggressive disease in vitro and in vivo. Furthermore, the mechanism underlying the role of CaSR in AML pathogenesis and possible regulation of LSCs was studied. Our findings demonstrated that CaSR ablation reduces myeloid progenitor function and proved that CaSR is required for maintenance of LSC pool by regulating its frequency and function. Further supporting the role of CaSR in LSC maintenance, genes associated with AML stemness and self renewal capacity were upregulated when CaSR was overexpressed and downregulated when CaSR was depleted. Given the role of CaSR in AML, the CaSR antagonist NPS 2143 was tested in vivo. The combination treatment of NPS 2143 with the standard of care, ara C, significantly reduced the tumor burden and prolonged the survival of mice with AML in syngeneic and xenotransplantation experiments. Based on the finding that CaSR functions as a tumor suppressor in CML, treatment of mice with the CaSR agonist cinacalcet in combination with imatinib prolonged survival of mice with CML compared to treatment with the mice given vehicle.
Our results suggest that calcium ions stemming from the calcium-rich BMM via CaSR strongly and differentially influence leukemia progression. As an adjunct to existing treatment therapies, targeting of CaSR with specific pharmacologic antagonists may prolong survival of patients with AML.
Bei ca. 95% der chronisch myeloischen Leukämie (CML) und 20-30% der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) des Erwachsenen liegt eine reziproke Chromosomentranslokation t(9;22)(q34;q11) vor, in deren Rahmen das BCR (Breakpoint Cluster Region) Gen auf Chromosom 22 mit dem ABL (Abelson-Leukämie-Virus) Gen auf Chromosom 9 fusioniert. Auf Chromosom 22 gibt es zwei verschiedene Bruchpunkte, die somit zur Bildung von unterschiedlichen Fusionsgenen führen. Bei der CML findet man den sogenannten „großen“ Bruchpunkt (M-bcr), während bei der Ph+ ALL der sogenannte „kleine“ Bruchpunkt (m-bcr) vorkommt. Das hybride Fusionsgen auf Chromosom 22q+ (Philadelphia-Chromosom) kodiert für das jeweilige BCR/ABL Protein, während das Fusionsgen auf Chromosom 9q+ für das reziproke ABL/BCR Protein kodiert. Das ABL-Protein ist eine Nicht-Rezeptor Tyrosinkinase, die eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion und der Regulation des Zellwachstums spielt. Im BCR/ABL Fusionsprotein wird die Kinase-Aktivität von ABL, die im Normalfall streng reguliert ist, durch die Fusion mit BCR konstitutiv aktiv. Dadurch kommt es zur Deregulierung intrazellulärer Signalwege, welche die maligne Transformation hämatopoetischer Zellen verursacht. Eine zielgerichtete Inhibierung von BCR/ABL mittels ABL-Kinase-Inhibitoren induziert Apoptose in BCR/ABL transformierten Zellen, was eine komplette Remission im größten Teil Ph+ Leukämie Patienten zur Folge hat.
Endocannabinoids (eCB) are signaling lipids and became known for their importance in the central nervous system as well as in immune defense. Beneficial effects of eCB are shown in processes of excitotoxic lesion, secondary damage and neuronal plasticity throughout the last years. Two canabinoid receptors, type 1 (CB1) and type 2 (CB2) as the respective endogenous ligands belong to the endocannabinoid system (eCBS). In 1990, the CB1 could be cloned and was localised mainly on neurons. Shortly thereafter in 1993, the CB2 was characterised and found primarily on cells belonging to the immune system. N-arachidonoylethanolamide (AEA), often called anandamide, and 2-arachidonoylglycerol (2-AG) are the best characterised eCB. N-palmitylethanolamide (PEA) and N-oleoylethanolamide (OEA) have no or only low affinity to CB1 but enhance the affinity of AEA significantly. This group is therefore often summarized as N-ethanolamides (NEA). ECB are derivates of arachidonic acid and are stored in membranes where they become hydrolysed on demand by specific enzymes. Traumatic brain injury altered the levels of eCB in the blood in vivo and when applied in vitro after neuronal damage, eCB could reduce the damaging burden. Further studies demonstrated that eCB are potent to down-regulate pro-inflammatory cytokines and most important to decrease neuronal excitation.
In the present study, the intrinsic regulation of the endocannabinoid system after neuronal damage over time was investigated in rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures (OHSC). Temporal and spatial dynamics of eCB levels were analysed after transection of the perforant pathway (PPT) in originating neurons (enthorhinal cortex, EC), areas of deafferentiation/anterograde axonal degeneration (dentate gyrus, DG) and of the synaptically linked cornu ammonis region 1 (CA1) as well as after excitotoxic lesion in the respective regions.
A strong increase of all eCB was observed only in the denervation zone of the DG 24 hours post PPT. In excitotoxic lesioned OHSC all eCB were elevated, in the investigated regions up to 72 hours post lesion (hpl). The responsible enzyme for biosynthesis of the NEA, NAPE-PLD protein, was increased during the early timepoints of measurement (1-6 hpl). The responsible catabolizing enzyme, FAAH, and the CB1 receptor were up-regulated at a later timepoint, 48 hpl, explaining the eCB levels. In the present model, the inhibition of the enzyme responsible for 2-AG hydrolysis (MAGL) was neuroprotective as previously shown and a re-distribution within neurons and astrocytes during neuronal damage could be observed. In primary cell cultures microglia expressed the regulating enzymes of 2-AG and the enzyme responsible for NEA down-regulation, FAAH. Astrocytes expressed mainly the catalyzing enzymes, indicating the role for eCB break-down. All these findings together demonstrate the great capacity of the eCBS to control inflammatory processes and consequently neuronal cell death.
All effects of the known eCB could not be clarified by CB1/CB2 deficient mice. Several G-protein coupled receptors (GPR) are recently in discussion whether they might and should belong to the endocannabinoid system. The GPR55, the not yet cloned abnormal cannabidiol receptor and further GPRs are candidates as potential endocannabinoid receptors. Recently GPR55 has been discussed as a putative cannabinoid receptor type 3 (CB3). Quantitative PCR revealed that Gpr55 is present in primary microglia and the brain, but the exact regional and cellular distribution and the physiological/pathological effects downstream of GPR55 activation in the CNS still remain open. Therefore, the excitotoxic rat OHSC model, previously used to investigate the neuroprotective potency of eCB, was now used to investigate the neuroprotective potency of GPR55. Activation of GPR55 protected dentate gyrus granule cells in vitro after excitotoxic lesion, induced by NMDA. In parallel, GPR55 activation was able to reduce the number of microglia in the dentate gyrus. These neuroprotective effects vanished however in microglia depleted OHSCs as well as in OHSC transfected with Gpr55 siRNA, indicating a strong involvement of microglia in GPR55 mediated neuroprotection.
In summary, the present study found a strong time-dependent and anterograde mechanism of action of eCB after long-range projection damage and provided further evidence for the neuroprotective properties of eCB. The potential cannabinoid receptor 3 (GPR55) mediates neuronal protection on behalf of microglia.
Chromosomal translocations (CTs) are a genetic hallmark of cancer. They could be identified as recurrent genetic aberrations in hemato-malignancies and solid tumors. More than 40% of all "cancer genes" were identified in recurrent CTs. Most of these CTs result in the production of oncofusion proteins of which many have been studied over the past decades. They influence signaling pathways and/or alter gene expression. However, a precise mechanism for how these CTs arise and occur in a nearly identical fashion in individuals remains to be elucidated. Here, we performed experiments that explain the onset of CTs: proximity of genes able to produce prematurely terminated transcripts, which leads to the production of transspliced fusion RNAs, and finally, the induction of DNA double-strand breaks which are subsequently repaired via EJ repair pathways. Under these conditions, balanced chromosomal translocations could be specifically induced.
Aim: Long noncoding RNAs (lncRNAs) belong to the interface of epigenetics and exhibit diverse functions. Their features depend on their sequence, genomic location and tertiary structure. The aim was to identify novel lncRNAs and characterise their physiological functions and mechanisms in endothelial cells. Three different approaches were performed:
The hypothesis that pseudogene-annotated lncRNA NONHSAT073641 regulates the expression of their parental gene platelet activating factor acetylhydrolase 1b regulatory subunit 1 (PAFAH1B1) was examined.
The physiological functions and in vivo relevance of most lncRNAs are still unknown, therefore a part of this work aimed to identify lncRNAs in response to a pathophysiological stimulus (high amplitude stretch) in endothelial cells.
The long intergenic noncoding RNA antisense to S1PR1 (LISPR1) gene, is located within the promotor of sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1PR1) and shares a part of the promotor region. This study examined additionally the hypothesis that LISPR1 controls the S1PR1 expression in endothelial cells.
Methods: The angiogenic functions of NONHSAT073641 and LISPR1 were examined with spheroid-outgrowth and scratch wound assays. Furthermore, stretch experiments were performed in order to identify differently expressed lncRNAs in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). In addition, the in vivo relevance of both lncRNAs was examined in samples from pulmonary arterial hypertension patients. Knockdown (e.g. LNA GapmeRs), knockout (CRISPR/ Cas9) and overexpression experiments (e.g. CRISPR activation) were performed to analyse target genes. The molecular mechanism of LISPR1 was investigated with RNA and Chromatin immunoprecipitation.
Results: NONHSAT073641 and PAFAH1B1 exhibited angiogenic function in endothelial cells. It could be observed that NONHSAT073641 is not regulating the expression of PAFAH1B1. The pro-angiogenic feature of PAFAH1B1 might be attributed to the target gene matrix Gla protein (MGP). NONHSAT073641 and PAFAH1B1 were significantly induced in CTEPH samples and might be important in the development of this disease. It could be speculated that NONHSAT073641 is regulating the expression of the cell-cycle regulator BCL2L11 as has been investigated in mice.
LISPR1 is a cis-acting lncRNA which maintains S1PR1 gene transcription by intercepting the transcriptional repressor ZNF354C and enabling Polymerase II (PolII) to bind. ZNF354C regulates S1PR1 expression in HUVECs. However, the role of ZNF354C in pulmonary arterial hypertension (PAH) is unknown. LISPR1 and S1P1 receptor were both significantly depleted in COPD samples. It can be assumed that due to higher S1P production, the signalling is attenuated through reduction of the lncRNA LIPSR1 and thus the receptor S1P1.
The stretch experiments present a possible in vitro model in order to mimic the condition of endothelial cells during high blood pressure, such as in PAH. Referring to published data, it could be confirmed that stretching of endothelial cells alters the gene expression, which is on the other hand linked to cardiovascular disease. In cardiovascular disease mechanical stretch altered genes, which are participating in the vascular remodelling process. The role of differently expressed lncRNAs (TGFβ2-AS1, CTD-2033D15.2, INHBA-AS1, RP11-393I2.4, TAPT1-AS1, TPM1-AS1, CFLAR-AS1 and HIF1α-AS2) upon mechanical stretch is yet not clarified.
Conclusion: NONHSAT073641 and LISPR1 are important for the endothelial angiogenic function. Both lncRNAs were deregulated in PAH samples. The pathophysiological stimulus had an impact on the expression of different lncRNAs (e.g. TGFβ2-AS1) and pathways (e.g. TGF-β) in endothelial cells.
At the beginning of the 1980s, an increased frequency of immune deficiency was discovered in a population of homosexual men, which is nowadays known as the Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). A few years later, the retro virus Human Immunodeficiency Virus 1(HIV-1) has been discovered as the cause of AIDS. Since the beginning of the pandemic, more that 74 million people have become infected and more than 32 million people died. In 2018, it was estimated that 38 million people where living with HIV-1 of which 24.5 million had access to Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART), which blocks viral replication and prevents the progression towards AIDS. In the most cases an HIV-1 infection leads to the patient’s death within a few years Without HAART.
Taken together, this thesis shows that hematopoietic stem and progenitor cells harbor the prerequisites and characteristics to form an HIV-1 reservoir in vivo. The subsets of HSCs, MPPs and CD34+CD38+ progenitors harbor CD4 & CXCR4 double-positive cells as well as a lower amount of CD4 & CCR5 doublepositive cells. In addition, the susceptibility to X4-tropic HIV-1 is shown in vitro. Susceptibility to R5-tropic HIV-1 is only seen to a very low amount for CD34+CD38+ progenitors. The results also show that transduced HSPCs are capable to pass on integrated viral genomes via proliferation and differentiation during in vitro colony formation. More over the experiments provide evidence that this can take place for long time span as the outcome of the replating assays shows. Ex vivo analysis of HSPCs isolated from PLHIV also suggests that these cells are susceptible to HIV-1. Proviral DNA detection using a nested PCR showed infection of Lin- cells of a single donor with an R5-tropic subtype B HIV-1 clone. However, the assay could not detect infection of CD34+ cells. The
received results of this thesis are in agreement with previously published results. Albeit the obvious susceptibility to HIV-1 and existing reports of viral survival within HSPCs for several years, the low frequency of detected in vivo infected HSPCs could be related to the cytopathic effects of HIV-1 during replication resulting in cell death of potentially infected CD34+ cells. Other reasons could be associated with assay sensitivity or the small number of available patient samples. This makes hematopoietic stem and progenitor cells a target, which can be infected by HIV-1. The role and the clinical relevance of hematopoietic stem and progenitor cells in contribution to the latent viral HIV-1 reservoir within an HIV-1 infected patient needs to be further analyzed.
Zika virus (ZIKV) is a member of the Flaviviridae family that received public attention and scientific interest after the outbreak in French Polynesia (2013-2014) and the epidemic in the Americas (2015-2016). Even though only 20% of infected people exhibit clinical manifestations and they are predominantly flu-like symptoms, these events unveiled neurological complications associated with ZIKV infection, such as the Guillain-Barré syndrome in adults and microcephaly in newborns. Lacking a preventive vaccine and a specific antiviral therapy against ZIKV allied to the fact that this pathogen is a re-emerging virus, uncovering and comprehending novel virus-host interactions is crucial to the identification of new antiviral targets and the development of innovative antiviral approaches. Previous research work uncovered that the Chinese hamster ovary (CHO) cells do not support ZIKV infection.459 As this cell line does not express endogenous epidermal growth factor receptor (EGFR), this study aimed to investigate whether EGFR and EGFR-dependent signaling are relevant for the ZIKV life cycle in vitro.
In the first part of the study, viral infection was investigated in CHO cells and compared to A549 cells, a highly ZIKV permissive cell line. After performing binding and entry assays, ZIKV entry, but not the attachment, was significantly decreased in CHO cells in comparison to A549 cells. Additionally, in A549-EGFR KO cells, ZIKV entry was diminished relatively to the off-target control. These results show the clear impact that the absence of EGFR has on viral entry, implicating EGFR during this process. Even though EGFR overexpression in CHO cells could not render these cells permissive to ZIKV infection, as demonstrated by the lack of viral infection after electroporation with in vitro transcribed capped ZIKV-Renilla luciferase RNA, it was possible to rescue ZIKV entry. These findings suggest that there are additional elements, which are not expressed in CHO cells, required for viral replication.
Furthermore, the impact of ZIKV infection on EGFR mRNA and protein levels as well as on the EGFR subcellular localization and distribution was evaluated. The relative number of EGFR specific transcripts continuously increased with ZIKV infection, whereas the EGFR protein level diminished at later times of infection. Moreover, changes in the subcellular localization of EGFR and its colocalization with the early endosomal marker EEA1 in ZIKV-infected cells revealed that ZIKV triggers EGFR internalization. The relevance of EGFR in the ZIKV entry process was further corroborated by the observation of EGFR internalization at 30 min post-infection (mpi) and to less extent at 60 mpi, which concurs with the expected time of ZIKV entry into the host cells.
In the remaining part of the study, the influence of ZIKV infection in EGFR-dependent signaling as well as the contribution of EGFR and EGFR signaling for viral infection were studied. Activation of EGFR and the MAPK/ERK signaling cascade was detected as early as 5 mpi and ceased within 30 mpi in ZIKV-infected cells. Taking into account that EGFR internalization was observed at 30 mpi in infected cells, the activation of EGFR and ERK and subsequent dephosphorylation within this period go along with this previous observation. Vice-versa, inhibition of the activation of EGFR and the MAPK/ERK pathway declines ZIKV infection. On the one hand, inhibition of EGFR activation by Erlotinib affected ZIKV entry, as a consequence of impaired EGFR internalization. On the other hand, Raf and MEK inhibitors reduced ZIKV infection without disturbing viral replication or viral entry. These data suggest that the activation of the MAPK/ERK signaling cascade is necessary for a step of the viral life cycle before the onset of genome replication and morphogenesis and after viral entry. The importance of EGFR signaling was additionally investigated by the determination of EGFR half-life in ZIKV-infected cells upon EGF stimulation. While the EGFR half-life was similar in uninfected and Uganda-infected cells, a delay in EGFR degradation was observed in French Polynesia-infected cells. This observation might indicate an extended usurpation of the EGFR signaling since EGFR seems to still be active in the endosomes. Moreover, disruption of lipid rafts by MβCD, a cholesterol-depleting agent, hampered ZIKV entry. In uninfected cells, MβCD treatment led to the activation of EGFR, but at the same time prevented EGFR internalization, indicating that EGFR activation exclusively is not sufficient for an efficient ZIKV entry and further supporting the importance of EGFR internalization during the ZIKV entry process.
Taken together, this study uncovers EGFR as a relevant host factor in the early stages of ZIKV infection, providing novel insights into the ZIKV entry process. Since numerous monoclonal antibodies and substances that target EGFR are licensed, repurposing these compounds might be a helpful tool for the establishment of an antiviral therapy in case of ZIKV re-emergence.
The role of lncRNAs in the CVS and the endothelium is highly diverse and has been subject to a substantial amount of research over the last decade. The identification of lncRNAs as clinically relevant biomarkers and as co-regulatory molecules let to the appreciation of the functional relevance of lncRNAs.
In the present study, LINC00607 was identified as an endothelial-enriched, human-specific lncRNA. With its distinct functions, LINC00607 maintains and supports the endothelial homeostasis especially in response to VEGF-A signalling.
In the first part of this study, LINC00607 was functionally characterized in human endothelial cells. LINC00607 is highly and specifically expressed in endothelial cells and is differentially regulated in CVDs. Depletion of LINC00607 resulted in decreased angiogenic sprouting, reduced integration of ECs in a newly formed vascular network in vivo, enhanced endothelial migration and differential expression of many important genes for endothelial cell homeostasis. Functionally, LINC00607 maintains ERG-driven endothelial gene expression programs through BRG1. BRG1 secures stably accessible enhancer regions as well as TSS of ERG target genes, thus enabling transcription of endothelial gene programs.
The second part of this study proposes an additional mode of action for LINC00607. The strongly impaired response to VEGF-A after LINC00607 KO can only be partially explained by its’ expression control of ERG target genes. It rather appears that LINC00607 is involved in the control of alternative splicing of VEGF receptor FLT1. The differential splicing of FLT1 produces the anti-angiogenic soluble isoform of FLT1. Even though further validation is needed to uncover the underlying mechanism, there is the potential of a more general role of LINC00607 in splicing control through BRG1. As AS of FLT1 is a clinical marker in preeclampsia, LINC00607 might qualify to be an additional marker for the onset and manifestation of the pregnancy disorder.
Taken together, LINC00607 is a target in future for molecular therapy in CVD to restore a healthy endothelial phenotype and has the potential to serve as a biomarker in preeclampsia.
An overexpression of the E3 ubiquitin ligase TRIM25 is implicated in several human cancers and frequently correlates with a poor prognosis and occurrence of therapy resistance in patients. Previous studies of our group have identified the mRNA encoding the pro-apoptotic caspase-2 as a direct target of the ubiquitous RNA binding protein human antigen R (HuR). The constitutive HuR binding observed in colon carcinoma cells negatively interferes with the translation of caspase-2 mainly through binding to the 5' untranslated region (UTR) of caspase-2 and thereby confers an increased survival of tumor cells. The main objective of this thesis was to unravel novel regulatory proteins critically involved in the control of caspase-2 translation and their impact on therapeutic drug resistance of human colon carcinoma cells. By employing RNA affinity chromatography in combination with mass-spectrometry, among several putative caspase-2 mRNA binding proteins, we have identified the tripartite motif-containing protein 25 (TRIM25) as novel caspase-2 translation regulatory protein in colon carcinoma cells. The constitutive TRIM25 binding to caspase-2 mRNA in two different human colorectal carcinoma cell lines was validated by ribonucleoprotein (RNP)-immunoprecipitation (RIP)-RT-PCR assay and by means of biotin-labeled RNA-pull-down assay. Since caspase-2 is a caspase which is particularly involved in the DNA-damage-induced apoptosis, I tested the functional relevance of negative caspase-2 regulation by TRIM25 for chemotherapeutic drug-induced cell death of different adenocarcinoma cells by RNA interference (RNAi)- mediated loss-of-function and gain-of-function approaches. In the first part of the thesis, I could demonstrate that transient silencing of TRIM25 caused a significant increase in caspase-2 protein levels without affecting the amount of corresponding mRNAs. Mechanistically, the TRIM25 silencing-triggered increase in caspase-2 was totally impaired by cycloheximide, indicating that the stimulatory effects on caspase-2 levels depend on protein synthesis. This finding was corroborated by RNP/polysomal fractionation, which revealed that the transient knockdown of TRIM25 caused a significant redistribution of caspase-2 transcripts from the fraction of RNP particles to that from translationally active polyribosomes.
The second part of my thesis aimed at the elucidation of the functional consequences of the negative caspase-2 regulation by TRIM25 for enhanced tumor cell survival. Thereby, I found that the siRNA-mediated knockdown of TRIM25 caused a significant increase in the chemotherapeutic drug-induced cleavage of caspase-3 and to elevations in cytoplasmic cytochrome c levels implicating that TRIM25 depletion did mainly affect the intrinsic apoptotic pathway. Concordantly, the ectopic expression of TRIM25 caused a reduction in caspase-2 protein levels, concomitant with an attenuated sensitivity of tumor cells to doxorubicin.
To test the functional impact of caspase-2 in the TRIM25 depletion-dependent sensitization to drug-induced apoptosis, I employed a siRNA-mediated knockdown of caspase-2. Interestingly, the strong induction of caspase-3 and -7 cleavage after doxorubicin treatment was fully impaired after the additional knockdown of caspase-2, indicating the sensitizing effects by TRIM25 knockdown depend on caspase-2.
Data from this thesis identified the TRIM25 as a novel RNA-binding protein of caspase-2 mRNA, which negatively interferes with the translation of caspase-2 and which functionally contributes to chemotherapeutic drug resistance of colon carcinoma cells. Interfering with the negative TRIM25-caspase-2 axis may represent a promising therapeutic avenue for sensitizing colorectal cancers to conventional anti-tumor therapies.
All lifeforms have to sense changes in their environment and adapt to possibly detrimental conditions. On a cellular level, the highly elaborate proteostasis network (PN) consisting of housekeeping and stress-induced proteins, confers this tolerance against stress and maintains cellular protein homoestasis. This is essential for survival, as an accumulation of stress-induced protein aggregation will eventually affect the functionality of crucial cellular components and ultimately lead to cell death. The guardians of this balance are the molecular chaperones and their activity-regulating co-haperones. They are engaged in all aspects of protein biogenesis, maintenance and degradation, especially during stress.
The heat shock proteins (HSPs) are the major chaperones in mammals and encompass constitutive and stress-induced isoforms. Among them, the HSP70 and the HSP90 family are the most abundant HSPs and their activity is involved in a great variety of homoestasis and stress-induced tasks.
As part of the protein triage the E3 ligase CHIP (C-terminal HSC70-interacting protein) is an essential activity regulating co-chaperone of HSP70 and HSP90 which provides a link between chaperone mediated protein-folding and various degradation pathways. Due to its decisive function, CHIP is involved in a wide array of cellular processes, especially in clearing misfolded HSP70 client proteins that are prone to aggregate. As a consequence, CHIP was reported to confer protection against many aggregation-induced pathologies of the neuronal system. Additionally, CHIP has been identified as a critical factor in various types of cancer and is implied to affect the development and the longevity of mammals.
Despite the significant progress in the understanding of CHIP’s structure and function, many aspects surrounding its chaperone dependency and its substrate recognition remain unclear. Moreover, due to the variety of substrates in diverse cellular pathways, there are yet many connections to elucidate between CHIP and components of the cellular proteostasis network.
The work of this thesis was focused on the role of CHIP in acute stress response and the corresponding status of chaperone association. Moreover, it was investigated if CHIP, as the connecting ligase of folding and degradation systems, might also provide a link between the PN and the reorganisation of the cellular architecture upon stress exposure.
This has become of increasing interest as recent reports highlight the importance of spatial sequestration in protein quality control.
To this end, subcellular distribution of CHIP was analysed by live-cell microscopy during heat stress. It became obvious that during the heat-induced challenge of the chaperone system, CHIP migrated to new cellular sites. Further experiments suggested that the observed migration to the plasma membrane is a chaperone-independent process and in vitro reconstitution of membrane association confirmed the competitive nature of membranes and chaperones for CHIP binding. A detailed in vivo and in vitro analysis of the newly observed membrane association of CHIP revealed a distinct lipid specificity and a novel direct association with lipids. Binding experiments with recombinantly purified deletion mutants of CHIP identified the TPR domain and a positive patch in the coiled-coil domain as main determinants for the lipid association. Through biochemical and biophysical approaches, the structural integrity and functionality of CHIP upon membrane binding was confirmed and further characterised.
Moreover, mass spectrometry analysis provided a high confidence identification of chaperone-free interactors of CHIP at the plasma membrane and other membranous compartments.
In accordance with the lipid specificity, the Golgi apparatus was one of these sites. Only chaperone-free CHIP had a significant effect on the morphology of the organelle, again confirming the competitive role of chaperones and lipids. With respect to the physiological consequences of the changed localisation of CHIP, preliminary results indicated increased cell death when the ligase localises to cellular membranes. The results lead to the conclusion that CHIP acts as an initiator of early stress adaptation and as a sensor for the severity and strength of the stress reaction.
The dodecin of Mycobacterium tuberculosis : biological function and biotechnical applications
(2020)
Biological Function of Bacterial Dodecins
In this thesis, the dodecins of Mycobacterium tuberculosis (MtDod), Streptomyces coelicolor (ScDod) and Streptomyces davaonensis (SdDod) were studied. Kinetic measurements of the flavin binding of MtDod revealed that the dodecin binding pocket is filled in two distinct steps, for which a kinetic model then was established and verified by experimental data. The analysis with the two-step model showed that the unique binding pocket of dodecins allows them to bind excessive amounts of flavins, while at low flavin concentrations, flavin is released and only weakly bound. This function of flavin buffering prevents accumulation of free oxidised flavins and therefore helps to keep the redox balance of the cell and prevents potential cell damage caused by excessive free flavins. To further gain insights into the role of bacterial dodecins, the effect of knocking out the dodecin encoding gene in S. davaonensis was analysed. The knockout strain showed increased concentrations of various stress related metabolites, indicating that without dodecin the cellular balance is disrupted, which supports the role of dodecins as a flavin homeostasis factor.
With a self-designed affinity measurement method based on the temperature dependent dissociation of the dodecin:flavin complex, which allowed parallel screening of multiple conditions, it was shown that MtDod, ScDod and SdDod have much higher affinities towards FMN and FAD under acidic conditions. Under these conditions, the three dodecins might function as a FMN storage. M. tuberculosis encounters multiple acidic environments during its infection cycle of humans and can adopt a state of dormancy. During recovery from the dormant state, a flavin storage might be beneficial. For some Streptomyces species it was reported that the formed spores are slightly acidic and therefore ScDod and SdDod could function as flavin storages for the spores. Further details on the flavin binding mechanism of MtDod were revealed by a mutagenesis study, identifying the importance of a histidine residue at the fourth position of the protein sequence for flavin binding, but contrary to expectations, this residue seems only to be partly involved in the pH related affinity shift.
The data, reported in this thesis, demonstrates that bacterial dodecins likely function as flavin homeostasis factors, which allow overall higher flavin pools in the cell without disrupting the cellular balance. Further, the reported acid-dependent increase in binding affinity suggests that under certain conditions bacterial dodecins can also function as a flavin storage system.
Application of the Dodecin of M. tuberculosis
In this thesis, the stability of MtDod, ScDod SdDod and HsDod was analysed to find a suitable dodecin for the use as a carrier/scaffold. Therefore, a method to easily measure the stability of dodecins was designed, which measures the ability of the dodecamer to rebind flavins after a heating phase with stepwise increasing temperatures. Using this assay and testing the stability against detergents by SDS PAGE, showed that the dodecamer of MtDod possesses an excellent stability against a vast array of conditions, like temperatures above 95 °C, low pH and about 2% SDS. By solving the crystal structure of ScDod and SdDod, the latter forming a less stable dodecamer, combined with a mutagenesis study, the importance of a specific salt bridge for dodecamer stability was revealed and might be helpful to find further highly stable dodecins.
In addition to the intrinsic high stability of the MtDod dodecamer, also the robustness of the fold was tested by creating diverse MtDod fusion constructs and producing them in Escherichia coli. Here it was shown that MtDod easily tolerates the attachment of proteins up to 4-times of its own size and that both termini can be modified without affecting the dodecamer noticeably. Further, it was shown that MtDod and many MtDod fusion constructs could be purified in high yields via a protocol based on the removal of E. coli proteins through heat denaturation and subsequent centrifugation. In a case study, by fusing diverse antigens from mostly human proteins to MtDod and using these constructs to produce antibodies in rabbits, it was demonstrated that MtDod is immunogenic and presents the attached antigens to the immune system.
The here reported properties of MtDod and to a lesser degree of other bacterial dodecins, show that bacterial dodecins are a valuable addition to the pool of scaffold and carrier proteins and have great potential as antigen carriers.
The deubiquitinase USP32 regulates non-proteolytic ubiquitination in the endosomal-lysosomal system
(2021)
The regulation of essential cellular processes requires tightly controlled and directed transport of proteins and membranes. The highly dynamic endosomal and lysosomal system forms the key network for exchange and trafficking of molecules with its early endosomes, recycling endosomes, late endosomes, lysosomes, and additionally autophagosomes.
In this system, the small GTPase Rab7 has an essential role at the late endosomal stage regulating vesicle transport, tethering, and fusion, and retromer mediated receptor recycling back to the trans-Golgi network (TGN). Thus, Rab7 is also important for autophagosomes and lysosomes.
Lysosomes do not only represent the end point of the degradation pathway with several feeder pathways. But these organelles are also a dynamic signaling hub for a variety of metabolic processes. The ever-important regulator of cellular biosynthetic pathways mTORC1 dynamically associates with lysosomes where it is activated. mTORC1 activation is a complex multi-step process where a series of signaling events converge in dependence of amino acid levels thereby enabling interactions between the lysosomal v-ATPase, Ragulator complex (consisting of LAMTOR1-5), and Rag GTPases.
Ubiquitin signals are involved in almost all cellular processes. With this, their regulatory mechanism is also described for the endosomal-lysosomal system as well as mTORC1 signaling. Deubiquitinases (DUBs) release conjugated ubiquitin from proteins and thereby maintain the dynamic state of the cellular ubiquitinome.
The ubiquitin-specific protease 32 (USP32) is a poorly characterized DUB with only emerging cellular function. However, its predicted domain structure includes two unique domains within the entire DUB family. It has been linked to the development of breast cancer and small cell lung cancer. Furthermore, overexpressed GFP-USP32 was localized at the TGN, and a global mass spectrometry-based DUB interactome study suggested an interaction with the retromer complex. Based on these data, USP32 was a very interesting candidate to study its cellular function in this PhD project.
To investigate the function without disease background, a polyclonal USP32 knockout (USP32KO) RPE1 cell line was generated using the CRISPR/Cas9 technology. First experiments revealed different protein expression levels in various cell lines, and a subcellular localization of USP32 at membranes of the Golgi and lysosomal compartments. In a subsequent SILAC-based ubiquitinome analysis potential substrates of USP32 were identified. Interestingly, various proteins of the endosomal-lysosomal system were detected with enriched non-proteolytic ubiquitination upon USP32 depletion.
The further characterization of Rab7 as USP32 substrate confirmed the USP32-sensitive ubiquitination of Rab7 at lysine (K) residues 191 and 194. The ubiquitination in USP32KO cells did not change the subcellular localization of Rab7, but enhanced the interaction with the effector protein RILP. This implied that Rab7 was either more active or RILP had higher affinity to ubiquitinated Rab7. The subsequent results verified this theory. The retromer mediated recycling of CI-M6PR back to the TGN was faster or more efficient in USP32-depleted cells.
Accompanying this, levels of hydrolases were enriched in lysosomes isolated from USP32KO cells. Notably, USP32 had no direct effect on expression level or assembly of the retromer complex itself.
The observed lysosomal phenotypes connected another identified substrate to the function of USP32 in the endosomal-lysosomal system: LAMTOR1. LAMTOR1 is a component of the Ragulator complex and thus involved in the activation of mTORC1 at the lysosomal surface. Similar as for Rab7, the first experiments to characterize LAMTOR1 as USP32 substrate confirmed the USP32-sensitive ubiquitination at K20 independent of amino acid availability. However, ubiquitination of LAMTOR1 decreased its lysosomal localization in untreated and amino acid starved USP32KO cells. The following label-free interactome study detected a reduced interaction of LAMTOR1 and subunits of the lysosomal v-ATPase upon loss of USP32. This resulted in a shifted subcellular localization of mTOR (subunit of mTORC1) away from lysosomes. Furthermore, direct substrates of mTORC1 were less or slower re-phosphorylated after long amino acid starvation and re-activation of mTORC1 in USP32KO cells indicating a reduced mTORC1 activity.
Both USP32-dependent regulations of Rab7 and LAMTOR1/Ragulator converged in enhanced autophagic processes analyzed by increased LC3 levels upon amino acid starvation and USP32 depletion.
In summary, the presented thesis described the diverse role of USP32 in the endosomal and lysosomal system, and contributes to the understanding of novel ubiquitin signals in this context.
Cytochrome P450 enzymes are a large superfamily of membrane-bound heme-containing monooxygenases. They are essential for the oxidative metabolism of endogenous substrates such as steroids and fatty acids, and biotransformation of xenobiotic substrates such as pollutants and drugs. Although the highest expression of CYPs is found in the liver, their cardiovascular expression is not negligible with CYP450 subfamilies being responsible for the production of vasoactive lipids. Of importance, the enzymatic activity of all microsomal CYP450 isoenzymes is dependent on the cytochrome P450 reductase (POR), an electron donor.
In the first part of this work, the role of cytochrome P450 monooxygenases on the biotransformation of organic nitrates was investigated. Recombinant SupersomesTM were selected and incubated with NTG and PETN, where nitrite release was measured as a nitric oxide (NO) footprint. The capacity of the recombinant POR/CYP450 system to release nitrite from NO prodrugs was shown to be CYP-specific and dose-dependent. To study the involvement of CYP450 enzymes in the vascular biotransformation of organic nitrates in vivo, a smooth muscle-cell specific, inducible knockout model of POR (smcPOR-/-) was generated. Organ chamber experiments revealed that the vascular POR/CYP450 system had no impact on the dilator response of NTG and PETN. In line with previous publications, inhibition of ALDH2, known as the main enzyme responsible for the activation of NTG and PETN, and/or abolishment of the endogenous NO production did not reveal a contribution of the POR/CYP450 system to the dilator response of NTG and PETN. To better understand these results, we looked at the expression of the hepatic and vascular expression of the POR/CYP450 system where the hepatic was increased by 10- to 40-fold as shown by Western blot analysis. We concluded that due to insufficient vascular expression of CYP450 enzymes their contribution to the bioactivation of NTG and PETN is only minor.
The second part of this work focused on the cardiac relevance of endothelial isoenzymes. For that purpose, an endothelial cell-specific, tamoxifen-inducible knockout model of POR was generated and characterized in the present study. RNA-sequencing of the heart of healthy mice revealed that the CYP450 expression is cell-specific with cardiac endothelial cells (ECs) exhibiting an enrichment in the expression of the Cyp4 family (ω-oxidation of fatty acids) and of the Cyp2 family (production of EETs). Under non-stredded conditions (i.e. 30 days after inducing the knockout by tamoxifen feeding), endothelial deletion of POR was associated with cardiac remodelling as observed by an increase in the ratio of heart weight to body weight and an increase in the cardiomyocyte area. RNA-sequencing of cardiac ECs suggested that loss of POR might alter ribosomal biogenesis and protein synthesis, which could potentially affect the cardiac contractility in ecPOR-/- mice. Metabolomics from cardiac tissue of CTL and ecPOR-/- mice were not indicative for an important metabolic function of the endothelial POR/CYP450 system in the heart. The combination of transverse aortic constriction (TAC) with endothelial deletion of POR accelerates the development of heart failure in mice as detected by a reduction in cardiac output and stroke volume. These effects were mediated most likely by a reduction in vascular EETs production, which increases vascular stiffness, resulting in cardiac remodeling.
Schätzungen zufolge sind weltweit etwa 71 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-C-Virus (HCV) infiziert. Im Jahre 2016 sind rund 400.000 Menschen an einer HCV-bedingten Lebererkrankung gestorben, insbesondere aufgrund der Entwicklung von Leberzirrhose und Lebertumoren. Trotz der großen Unterschiede in den Prävalenzschätzungen und der Qualität der epidemiologischen Daten zeigt die jüngste weltweite Bewertung, dass die virämische Ausbreitung der HCV-Infektion (Prävalenz der HCV-RNA) in den meisten Industrieländern, einschließlich der USA, weniger als 1,0% beträgt (www .cdc.gov / Hepatitis / HCV). In einigen osteuropäischen Ländern wie Lettland (2,2%) oder Russland (3,3%) und bestimmten Ländern in Afrika, Ägypten (6,3%) und Gabun (7,0%) oder im Nahen Osten Syriens (3,0%) ist die Prävalenz bemerkenswert höher. In den USA und den am weitesten entwickelten Ländern gilt die gemeinsame Nutzung von Werkzeugezur Herstellung von Arzneimitteln und zur Injektion von Medikamenten (Nadeln) als die häufigste derzeitige Übertragungsart. Die vorherrschende Übertragungsart in Ländern, in denen die Ausbreitung von HCV-Infektionen im Vergleich zu den Industrieländern höher ist, beruht jedoch auf schlechten Methoden zur Infektionskontrolle und unsicherer Handhabung von Injektionsnadeln.
Wenn die chronische Infektion unbehandelt bleibt, kann sich im fortschreitenden Verlauf eine Zirrhose oder ein hepatozelluläres Karzinom bilden (Alter H. J. und Seef L. B. 2000). Die Doppeltherapie, bei der es sich um eine Kombination aus pegyliertem Interferon-α (PEG IFNα) und Ribavirin (riba) handelt, war in einigen Ländern der Dritten Welt bis vor kurzem der goldene Standard für die Behandlung von Patienten mit chronischer Hepatitis C und hat eine anhaltende virologische Reaktion erzielt. Mit nur 50% der mit HCV-Genotyp 1 infizierten Patienten (der häufigere) im Vergleich zu 80% mit Genotyp 2 oder 3, obwohl sie kostspielig und langwierig sind (z. B. 24-48 Wochen) und zahlreiche harte Nebenwirkungen aufweisen, die schwer zu bekämpfen sind tolerieren (Erklärung der National Institutes of Health Consensus Development Conference: Management von Hepatitis C: 2002 - 10.-12. Juni 2002 2002). Die Identifizierung des JFH1 (japanische fulminante Hepatitis Typ 1) -Isolats wurde in einigen in vitro-Studien zu HCV als wichtiger Durchbruch bei der HCV-Behandlung angesehen. Die Verwendung dieses Isolats führte nachfolgend zu einem besseren Verständnis des HCV-Lebenszyklus und der 3D-Strukturen der viralen Proteine. Basierend auf dieser Erkenntnis konnten die ersten direkt wirkenden antiviralen Mittel (DAAs) entwickelt werden, die spezifisch virale Proteine beeinflussen. Die beiden Proteasehemmer (PI) Telaprevir und Boceprevir hemmen die virale NS3-4A-Protease und wurden 2011 als Kombinationstherapie mit PEG IFNα und Ribavirin zugelassen, was die anhaltende virologische Reaktion auf 67-75% erhöhte (Pawlotsky et al. 2015).
Die Optimierung der gegenwärtigen Arzneimittelregime, die Einschränkung des Problems der Mutationsresistenz, die Gestaltung einer individualisierten Therapie, der Zugang zu diesen therapeutischen antiviralen Arzneimitteln und ihr hoher Preis bleiben weiterhin eine Herausforderung (Pawlotsky 2016; Pawlotsky et al. 2015; Sarrazin 2016). Die Entwicklung eines Impfstoffs wird jedoch als größte Herausforderung für die weltweite Kontrolle von HCV angesehen (Bukh 2016). Aus diesem Grund ist es wichtig, weiterhin mehr über den HCV-Lebenszyklus und die Faktoren zu erfahren, die sich auf die Replikation und den gesamten Lebenszyklus auswirken können, um effiziente, qualitativ hochwertige und vor allem leicht zugängliche Behandlungen für alle Menschen weltweit zu entwickeln.
Der Lipidstoffwechsel und insbesondere das Cholesteringleichgewicht werden durch die HCV-Infektion beeinflusst. Die Korrelation zwischen Lipidstoffwechsel und HCV wurde klinisch seit langem beobachtet. In den Leberbiopsien von mit HCV infizierten Patienten wurde ein Anstieg der in den Lipidtröpfchen im Cytosol akkumulierten neutralen Lipide festgestellt (Dienes et al. 1982). Das Hepatitis-C-Virus wurde auch von Hypobetalipoproteinämie, Hypocholesterinämie und Lebersteatose begleitet (Schaefer und Chung 2013). Die Leber ist der primäre Ort für die Synthese, Speicherung und Oxidation von Lipiden und anderen Makromolekülen. Daher ist der Fettstoffwechsel in der Leber für die Aufrechterhaltung der systemischen Nährstoffhomöostase von wesentlicher Bedeutung. Eine Dysregulation des Leberlipidstoffwechsels ist ein Kennzeichen mehrerer Krankheiten wie Diabetes, alkoholische und nichtalkoholische Fettlebererkrankungen sowie parasitäre und virale Infektionen, einschließlich einer HCV-Infektion. (Erklärung der National Institutes of Health Consensus Development Conference: Management von Hepatitis C: 2002 - 10.-12. Juni 2002 2002; Fon Tacer und Rozman 2011; Chen et al. 2013; Reddy und Rao 2006; Visser et al. 2013; Wu und Parhofer 2014)
...
Chronic inflammation is considered to be a cause of the autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, Alzheimer’s disease, multiple sclerosis, etc. The search for effective compounds with anti-inflammatory properties to combat these diseases is still ongoing. Natural compound narciclasine, derived from plants of Narcissus species, demonstrated its anti-inflammatory activity in in vivo arthritis models. Further investigation of narciclasine’s anti-inflammatory activity together with its impact on the interaction between leukocytes and endothelial cells was the main focus of this PhD thesis.
Narciclasine reduced the infiltration of monocytes and neutrophils to the abdomen and the concentration of the pro-inflammatory cytokines TNF, IL-6 and IL-1β. Together with this, it reduced acute visceral pain caused by zymosan injection. Narciclasine interfered with leukocyte-endothelial cell interaction in both in vivo and in vitro models. In vivo microscopy revealed that the compound reduced rolling, adhesion and transmigration of leukocytes in the vessels of an injured murine cremaster muscle. This observation was confirmed in the in vitro models for adhesion and transmigration where narciclasine reduced the level of leukocyte’s interaction with HUVECs. Narciclasine demonstrated profound anti-inflammatory properties based on its interference with leukocyte-endothelium interaction by downregulation of endothelial cell adhesion molecules expression (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin, CX3CL1) and shutdown of NF-κB pathway. All these effects were a result of the TNF receptor 1 protein translation blocking by narciclasine.
In this work the ability of the compound to reduce visceral pain, downregulate the expression of the endothelial cell adhesion molecules and to interfere with the interaction between leukocytes and endothelial cells was demonstrated for narciclasine for the first time. Obtained results open a promising insight into the understanding of narciclasine’s anti-inflammatory properties and justify further investigation of its potential for treatment of inflammatory diseases.
B-cell acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) is characterized by the overproduction of lymphoblasts in the bone marrow (BM), and it is the most common cancer in children while being comparatively uncommon in adults. On the other hand, in chronic myeloid leukaemia (CML), 70% of cases are found in patients older than 50 years, making it uncommon in children. All CML cases and up to 3% of paediatric B- ALL (and 25% of adult B-ALL) cases are due to fusion gene BCR-ABL1, which gives rise to the cytoplasmatic, constitutively active oncoprotein, tyrosine kinase BCR-ABL1 through a reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22. The constitutively active BCR-ABL tyrosine kinase leads to deregulation of different signal transduction pathways such as cell growth, proliferation and cell survival. The role of the bone marrow microenvironment (BMM) can mediate disease initiation (only in mice), progression, therapy resistance, and relapse, as has been increasingly recognized over the last two decades. In general, the BMM is a very complex arrangement of various cell types such as osteoblasts, osteoclasts, endothelial cells, adipocytes, mesenchymal stromal cells, macrophages and several others. In addition, the BMM is composed of multiple chemical and mechanical factors and extra cellular matrix (ECM) proteins which contribute to the BMM’s features influencing leukaemia behaviour. Considering the incidence of B-ALL and CML in children and in adults respectively, we hypothesized that the young and/or an aged BMM might also play a previously unrecognized role in the aggressiveness of B-ALL and CML. We proposed that BM, transduced with BCR-ABL1-expressing retrovirus in the murine transduction/transplantation model of B-ALL, transplanted into young versus old recipient mice would lead to a more aggressive disease in young mice, and similarly CML would be more aggressive in old recipient mice. In close recapitulation with the human incidence, induction of CML led to a significantly shorted survival in old recipient mice. On the other hand, induction of B-ALL showed a shortened survival in young compared to old syngeneic mice, as well as in a xenotransplantation model. Among the highly heterogenous composition of the BMM, we implicate young BM macrophages as a supportive niche for B-ALL cells. The results were found to be mostly due to potential soluble factors differentially secreted from young and old macrophages. Therefore, we hypothesized that the chemokine CXCL13, which has been demonstrated to play a role in B cell migration and act as a diagnostic marker in the cerebrospinal fluid of patients with neuroborreliosis, might be responsible for the observed phenotype. CXCL13 was found to be more highly expressed in healthy and leukaemic young mice as well as in conditioned medium of young macrophages. Using a variety of in vitro experiments, CXCL13 showed to significantly increase the proliferation and the migration of leukaemia cells when exposed to young macrophages, and the phenotype was rescued while using a CXCL13 neutralizing antibody. The CXCL13 role was also confirmed in vivo, since macrophage ablation led to a prolongation of survival in young mice and a reduction of CXCL13 levels. The use of an additional mouse model, leukaemia cells with CXCR5 deficiency, led to a significant prolongation of survival of young mice, confirming the importance of the CXCL13-CXCR5 axis in B-ALL. In line with our murine results, we found that human macrophages and CXCL13 levels were higher in pediatric B-ALL patients than in adults. Consistent with our murine data, the expression level of CXCR5 may act as a prognostic marker in B-ALL, as well as a predictive marker for central nervous system relapse in human B-ALL. The overall findings show that a young BMM, and in particular macrophages, influences B-ALL progression. We specifically identified CXCL13, secreted by young macrophages, as a promoter of proliferation of B-ALL cells, influencing survival in B-ALL via CXCR5. The CXCR5-CXCL13 axis may be relevant in human B-ALL, and higher CXCR5 expression in human B-ALL may act as a predictive marker.
The simultaneous inhibition of HDACs and BET proteins has shown promising anti-proliferative effects against different cancer types, including the difficult to treat pancreatic cancer. In this work, the strategy of concurrently targeting HDACs and BET proteins was pursued by developing different types of dual inhibitors.
By developing a novel scaffold that selectively inhibits HDAC1/2 together with BET proteins in cells, an effective tool for the investigation of pancreatic cancer, and other diseases which are sensitive to epigenetic processes, was created. The compound’s small size further gives the opportunity to further develop the inhibitor towards optimized pharmacokinetic properties, potentially resulting in a drug for cancer treatment.
A second novel approach that was pursued, was the development of a small-molecule degrader, targeting HDACs and BET proteins. Through synthesizing a variety of different molecules, a compound that was capable of lowering BRD4 levels and, at the same time, increasing histone acetylation was developed. While additional mechanistic investigations are needed to verify the degradation, the potent antiproliferative effects in pancreatic cancer cells encourage further studies following this alternative new strategy.
This thesis comprises the usage of two commonly known hinge-binding moieties in drug discovery. First, the quinazoline scaffold of gefitinib (5) was utilized in a macrocyclization strategy to introduce selectivity. In general, the quinazoline hinge-binding moiety is a commonly used scaffold which can be found in 14% of approved kinase inhibitors. The most familiar applications are EGFR inhibitors such as gefitinib (5), erlotinib (6), afatinib, or dacomitinib for the treatment of NSCLC. But other kinases like CDK2, CDK4, or p38 are reported targets as well.
The N-phenylquinazolin-4-amine moiety of gefitinib (5) was conserved however, the residues at the aromatic ring in the linker were modified, the residue targeting the solvent-exposed region was varied, and the linker at the C6 position of the quinazoline was adjusted to enable the macrocyclization. An overview of the structural modifications is shown in Figure 35A.
Kinome-wide screening of gefitinib (5) revealed several off-targets besides EGFR (Figure 35B), making it an excellent starting point for a macrocyclization strategy. Introducing a linker to the N phenylquinazoline-4-amine scaffold and retaining the residues on the aromatic ring as well as the methoxy group targeting the solvent-exposed region improved the selectivity profile and the efficacy towards EGFR WT and its mutants. Truncation of the linker moiety led to the mutant selective macrocycle 26f with an excellent kinome-wide selectivity profile (Figure 35B). An inhibitor that is effective on EGFR mutations while ineffective on the EGFR WT could represent an enhancement of patient treatment, as it potentially causes less side effects. Further studies could determine the effect of the most promising macrocycles in lung cancer cell lines. Additionally, the pharmacokinetic properties could be optimized, e.g. by introducing solubilizing groups, targeting the solvent-exposed region.
The second scaffold comprises the 3-aminopyrazole-based hinge-binding moiety. It is a privileged scaffold in medicinal chemistry for the development of kinase inhibitors. Previous publications report the anti-proliferative and anti-cancer potential of pyrazole-based molecules. They play a crucial role in the treatment of various diseases and cancer types like inflammation disorders, lymphoma, or breast cancer. This scaffold can be found e.g. in the aurora kinase inhibitor tozasertib or in the promiscuous kinase inhibitor 23, published by Statsuk et. al. Rescreening compound 23 in a comprehensive kinase panel against 468 human protein kinases confirmed the unselective behavior with a selectivity score of S35 = 0.56 (Figure 36B), making it a great starting point for further optimizations. The N-(1H-pyrazol-3-yl)pyrimidin-4-amine scaffold was conserved however, the residues targeting the solvent-exposed region were varied and different linkers were attached.
The introduction of different residues at the pyrazole dramatically influenced the selectivity profile of the desired kinases. Ester moieties caused to a favorable combination of selectivity and potency towards the kinase of interest CDK16. The removal of additional residues at the pyrimidine, targeting the solvent-exposed region, increased the efficiency towards CDK16. Further optimization led to the highly potent and selective CDK16 inhibitor 98d (IC50 = 33 nM). NanoBRETTM screening against the complete CDK family revealed a preferred inhibition of the PCTAIRE and PFTAIRE subfamily with cellular IC50 values of 20 nM – 120 nM and 50 nM – 180 nM, respectively. A FUCCI cell cycle assay and viability assessment of 98d confirmed previously published results, reporting a G2/M cell cycle arrest followed by apoptosis and accumulation of p27 through knockout of CDK16 in SCC cells. Consequently, further studies could evaluate the anti-tumor activity of 98d in SCC and NSCLC or elucidate the effect of 98d in AMPK-related macroautophagy. 98d represents a novel tool compound to investigate the understudied kinases of the PCTAIRE family and enable to enlighten the biological role of those kinases.
Macrocyclization of the N-(1H-pyrazol-3-yl)pyrimidin-4-amine core resulted in the selective BMPR2 inhibitor 110a. It showed a good binding affinity towards BMPR2 with a KD value of 205 nM as well as a good potency with an IC50 value of 506 nM. A comprehensive selectivity screen against 468 kinases revealed an excellent selectivity profile with S35 = 0.01. As no BMPR2 inhibitors have been published so far, 110a represents a novel compound that may provide further insights into the canonical BMP pathway, noncanonical signaling, or its impact on BMPR2-associated diseases like PAH.
The introduction of additional residues targeting the solvent-exposed region shifted the selectivity towards the MST kinases. The exchange from the pyrimidine to a quinazoline moiety resulted in the highly potent and selective macrocyclic MST3 inhibitor 113c. NanoBRETTM measurements demonstrated the preferred inhibition of MST3 with IC50 values of 210 nM and 30 nM for intact and lysed cells, respectively. A weaker activity could be seen for MST4 with 1.8 µM and 510 nM, while MST1 and MST2 were not affected. To date, no selective MST3 inhibitors have been published, making 113c a valuable tool compound for further functional studies. As MST3 is influencing the cell cycle progression, 113c could be tested in a further cell cycle assay to elucidate the inhibitory effect of 113c on MST3 and consequently on the cell cycle. Furthermore, the anti-tumor activity of 113c in breast cancer could be determined, as Madsen et. al. reported a high MST3 and MST4 activity triggered by FAM40B mutations.
The p38α mitogen-activated protein kinase (MAPK) is activated through stress stimuli such as heat shock or hypoxia. In the nucleus, p38α modulates the activity of other kinases and transcription factors, a process that regulates the expression of specific target genes, most importantly pro-inflammatory cytokines. Dysregulation of p38α therefore plays a major role in the development of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis. Despite many years of intensive research, no p38 small-molecule inhibitors have been approved yet. Several inhibitor design strategies have been reported, leading to >100-fold selective compounds for α/β over the γ and δ isoforms. Achieving such a selectivity among the two structurally most related α and β isoforms, however, remains a challenging task. Targeting an inactive DFG-out conformation offers another strategy for the development of potent kinase inhibitors (type-II), exemplified by the BCR/ABL-inhibitor Imatinib. Achieving selectivity with type-II binders is challenging, because many kinases can adopt an inactive DFG-out conformation. This is exemplified by the p38 type-II inhibitor BIRB-796, which exhibits picomolar on-target affinity but only a poor kinome-wide selectivity. A potent and selective type-II chemical probe for p38α/β was still lacking at the start of this thesis.
The promising hit VPC-00628, was chosen for a combinatorial synthetic approach to develop a type-II chemical probe. The studies covered the optimization of the hinge-binding head group, the hydrophobic region I and the DFG-out deep pocket of the lead compound VPC-00628. Selectivity for the p38α and p38β isoforms was monitored during the optimization process, which identified several inhibitors with favorable isoform selectivity, providing valuable insights into the potential of isoform-selective inhibitor design for p38. A potent and highly selective p38 MAPK probe (SR-318) was discovered, which showed IC50 values in the low nanomolar range in HEK293T cells. An unusual P-loop conformation induced upon binding of SR-318 to p38α contributed most likely to the impressive selectivity profile within the kinome that surpassed both the parent compound and BIRB-796. A negative control compound, SR-321, was developed, to distinguish between on-target effects and non-specific effects due to cross-reactivity with other cellular proteins. Studies of the metabolic stability in human liver microsomes revealed a high stability of the compounds, with only a small amount of metabolites formed over several hours. Compound SR-318 also exhibited a good in vitro efficacy, quantitatively reducing the LPS-stimulated TNF-α release in whole blood. Taken together, SR-318 is a highly potent and selective type-II p38α/β chemical probe, which will help to gain a better understanding of the catalytic and non-catalytic functions of these key signaling kinases in physiology and pathology.
The next studies focused on the exploration of the highly dynamic allosteric back pocket of p38 MAPK, and allosteric BIRB-796 derived compounds for targeting the αC- and DFG-out pockets were synthesized. Kinase activities of allosteric pyrazole-urea fragments were analyzed against a comprehensive set of 47 diverse kinases by differential scanning fluorimetry (DSF), revealing that BIRB-796 off-targets remain a problem when targeting this back-pocket binding motif. Revisiting the recently published compound MCP-081, which combines the allosteric part of BIRB-796 with the active-site directed part of VPC-00628, showed that it displays a clean selectivity profile in our kinase panel. Because the potency of MCP-081 was slightly reduced compared with VPC-00628 and the allosteric tert-butyl pyrazole moiety seemed suboptimal, a set of VPC-00628 derivatives for targeting the αC-out pocket region was synthesized. Through structure-guided extension of the terminal amide of VPC-00628 toward this allosteric site, the potent and selective compound SR-43 was developed, which showed excellent cellular activity on p38 MAPK in NanoBRETTM assays (IC50 [p38α/β] = 14.0 ± 0.1/ 16.8 ± 0.1 nM). SR-43 showed a dose-dependent inhibition of activating phosphorylation of p38 in HCT-15 cells as well as inhibition of phosphorylation of p38 downstream substrates MK2 and Hsp27. In addition, SR-43 induced an anti-inflammatory response by blocking TNF-α release in whole blood and displayed a high metabolic stability. Selectivity profiling of SR-43 revealed a narrow selectivity for additional targets such as the discoidin domain receptor kinases (DDR1/2). DDR kinases play a central role in fibrotic disorders, such as renal and pulmonale fibrosis, atherosclerosis and different forms of cancer. Since selective and potent inhibitors for these important therapeutic targets are largely lacking and the existing inhibitors are of low scaffold diversity, the next study focused on the optimization of SR-43 toward DDR1/2 kinase inhibition. The synthetic work covered the optimization of the hinge-binding head group and the allosteric part of SR-43 toward DDR1/2 kinase inhibition. These studies provided novel insights into the P-loop folding process of p38 MAPK and how targeting of non-conserved amino acids affects inhibitor selectivity. Importantly, they led to the development of a selective dual DDR/p38 inhibitor probe, SR-302, with picomolar affinity for DDR2. SR-302 was efficient in vitro and showed a destabilizing effect on the surface adhesion protein E-cadherin in epithelial cells. In summary, SR-302 and its negative control SR-301 provide a valuable tool set for studying the phenotypic effects of DDR1/2 signaling, e.g., in cancer cell lines.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung von codierten Peptidbibliotheken durch kombinatorische Synthese, sowie deren Selektion auf Wechselwirkung mit einer verkürzten Sequenz der TAR-RNA des HI-Viruses.
Die zur Selektion benötigte RNA wurde dazu auf chemischem Wege hergestellt und mit einem Fluoreszensfarbstoff für eine optische Selektion markiert. Ausgehend von dieser RNA wurde ein Anfärbeassay entwickelt. Bei der Anwendung des Assays auf Tri- und Pentapeptide, die auf einem Polymerträger immobilisiert waren, zeigten sich einige intensiv leuchtende Polymerkügelchen. Die hellsten unter ihnen wurden selektiert. Die Synthese der Trimeren und Pentamerenbibliothek erfolgte zuvor an wasserquellbarem, polymerem Trägermaterial. Die Identifizierung der polymergebundenen Verbindungen erfolgte über die Codierung nach W.C. Still, welche im Rahmen dieser Dissertation in der Arbeitsgruppe von Hr. Prof. Göbel erfolgreich etabliert wurde und die einfache Unterscheidung zwischen Enantiomeren ermöglicht. Drei der am häufigsten auftretenden Trimerensequenzen wurden im Nachhinein erneut synthetisiert und Experimenten an Zellen zugeführt. Unabhängig davon, wurde ihre Wechselwirkung mit RNA als auch mit RNA-Peptid Komplexen direkt getestet.
Weiterhin wurde exemplarisch anhand von Aminopyridinen die Möglichkeit getestet, neuartige Synthesemonomere für die automatische Synthese polymergebundener Verbindungen darzustellen.
Die vorliegende Arbeit macht deutlich, dass man durch kombinatorische Synthese im Verbund mit gerichteter Selektion, die Entwicklung von in vitro RNA-Liganden für RNA mit bekannter Struktur vorantreiben kann. Umgekehrt müsste dies auch bald die Selektion von Liganden für strukturell nicht charakterisierte RNA ermöglichen.
Das nächste Ziel sollte, die Entwicklung weiterer Selektionstests sein und die Etablierung von NMR-Methoden, welche die genauen Bindungsmodi der selektierten Verbindungen an RNA aufklären, um somit die gezielte Synthese neuartiger Liganden vorantreiben zu können, da letztendlich das "Wie", für die Weiterentwicklung einer Leitstruktur ausschlaggebend ist.
Weiterhin sollten die Transportmechanismen von körperfremden Substanzen zu dem gewünschten Wirkort studiert werden, damit die vorab in vitro getestete Substanz auch im späteren Entwicklungsstadium in vivo die gewünschten Eigenschaften zeigen kann.
Photolabile Schutzgruppen haben sich im Laufe der letzten Jahre als wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung und Regulation biologischer Prozesse etabliert. Dabei wird die photolabile Schutzgruppe auf geeignete Weise mit Biomolekülen verknüpft, sodass deren Funktion temporär deaktiviert wird. Durch Bestrahlen mit Licht geeigneter Wellenlängen wird die photolabile Schutzgruppe entfernt und die Aktivität des Biomoleküls bzw. des zu beobachtenden Prozesses wiederhergestellt. Die Grundlagen der Verwendung photolabiler Schutzgruppen im biologischen Kontext wurden in zwei Pionierarbeiten 1977 von J.W. ENGELS und 1978 von J.F. HOFFMAN gelegt. Davon ausgehend haben sich zahlreiche Anwendungen photolabiler Schutzgruppen für biologisch interessante Molekülklassen entwickelt. Auf dem speziellen Gebiet der Nukleinsäuren wurden in den letzten Jahren einige fundamentale Mechanismen entdeckt und aufgeklärt, die nicht zuletzt auch therapeutisch interessante Anwendungsmöglichkeiten für photolabile Schutzgruppen bieten. Hierbei stellt das An-/Aus-Schaltverhalten von Nukleinsäuren jedoch ein nicht-triviales Problem dar. Selbst der gezielte Einbau einer einzelnen photolabilen Schutzgruppe in ein multifunktionales Oligonukleotid führt in der Regel nämlich nicht zu einer vollständigen Deaktivierung dessen. Ein multipler Einbau photolabiler Schutzgruppen entlang der Sequenz eines funktionellen Oligonukleotids schaltet die Hintergrundaktivität im deaktivierten Zustand zwar vollständig aus, allerdings müssen in diesem Fall hohe Bestrahlungsintensitäten bzw. –dauern für das Entfernen aller photolabilen Modifikationen angewendet werden. Dadurch geht zum einen die Zeitauflösung der lichtgeschalteten Prozesse verloren, nicht zuletzt erhöht sich dabei aber auch das Risiko von lichtinduzierten Schäden am biologischen System. Das Kernthema der vorliegenden Dissertation war es daher, neue Architekturen für den Aufbau photoaktivierbarer Oligonukleotide zu entwickeln.
Das erste große Projekt basierte auf der Annahme, dass sich Duplexstrukturen, die für die Funktion vieler Nukleinsäuremechanismen fundamental sind, durch Zyklisierung von Oligonukleotiden global destabilisieren und damit effizienter photoaktivieren lassen, als durch lokalen Einbau einzelner photolabiler Schutzgruppen in Oligonukleotide. Hierzu wurden geeignete Alkin-Modifikationen an photolabile Nitrobenzyl- und Cumarin-Schutzgruppen angebracht und diese an die Nukleobasen verschiedener DNA-Bausteine geknüpft. Es ist daraufhin gelungen, Oligonukleotide mit je zwei photolabilen Alkin-Modifikationen herzustellen und diese intrasequentiell über eine Cu(I)-katalysierte Click-Reaktion mit einem Bisazid-Linker zu zyklisieren. Die so erhaltenen Oligonukleotide wiesen dramatisch erniedrigte Schmelzpunkte gegenüber den nativen Duplexen, sowie gegenüber den zweifach photolabil geschützten Oligonukleotiden auf. Dabei wurde außerdem festgestellt, dass Zyklisierungsparameter wie die Linkerlänge, -polarität und –flexibilität und die Wahl der photolabilen Schutzgruppe keinen signifikanten Einfluss auf die Duplexstabilität hat. Über einen Bereich von Ringgrößen zwischen ca. 11-21 Nukleotiden wurden die niedrigsten Duplexstabilitäten beobachtet. Sehr kleine, sowie große Ringe ab 30 Nukleotiden wiesen dagegen höhere Stabilität auf.
Da mit dem entwickelten Zyklisierungskonzept auch mehrere Ringstrukturen innerhalb einer Oligonukleotidsequenz aufgebaut werden können, wurde im nächsten Schritt eine photoaktivierbare Variante des C10-Aptamers hergestellt, welches selektiv gegen Burkitt’s Lymphomzellen bindet. Dieses 90-mer DNA-Oligonukleotid wurde an drei Stellen photolabil Alkin-modifiziert und infolge mit einem Trisazid-Linker zu einer bizyklisierten Struktur verknotet. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten konnte demonstriert werden, dass das durch eine solche „Photo-Klammer“ deaktivierte C10-Aptamer keine Bindungsaffinität gegenüber Burkitt’s Lymphomzellen aufweist, die Bindungsaktivität jedoch nach Belichten wiederhergestellt werden kann. Mit Atomkraftmikroskopie-Experimenten ist es darüber hinaus gelungen, die Photoaktivierung des verknäuelten C10-Aptamers mit molekularer Auflösung abzubilden. Mit diesem Ergebnis können nun lange funktionelle Oligonukleotide auf definierte Weise photoaktivierbar gestaltet werden, insbesondere auch dann, wenn keine (Informationen über) funktionelle Sekundärstrukturen existieren.
...
Synthese und Struktur-Wirkungsbeziehungen neuer rezeptorselektiver Dopamin-D 2- und -D 3-Liganden
(2003)
Dopaminrezeptoren gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, der bisher größten Rezeptorklasse. Seit der Identifizierung der zuvor unbekannten Rezeptorsubtypen D3-D5 in den Jahren 1990 und 1991 hat die Erforschung des dopaminergen Systems neuen Anschub erhalten, der maßgeblich auf das spezifische Vorkommen jeweiliger Subrezeptoren in diskreten Hirnarealen zurückzuführen ist. Während dopaminerge Neuronen an neurologischen und psychiatrischen Störungen wie Morbus Parkinson, Schizophrenie und Drogenmißbrauch bzw. -abhängigkeit seit geraumer Zeit in einen ursächlichen Zusammenhang gebracht werden, begründen die unterschiedlichen Charakteristika der Rezeptorsubtypen hinsichtlich Lokalisation, Aminosäuresequenz und pharmakologischem Verhalten die Hoffnung, mit subrezeptorselektiven Wirkstoffen neue therapeutische Ansätze verwirklichen zu können, die eine Reduktion der gravierenden, mit bisherigen Therapiekonzepten korrelierten Nebenwirkungen erlauben. In der vorliegenden Arbeit wurden, ausgehend von den D2- und D3-rezeptorbevorzugenden Wirkstoffen ST 177, L-741,626, ST 314, NAN190, ST 198 und BP 897, gezielte Modifikationen an unterschiedlichen Molekülteilen unternommen, um ihre jeweils charakteristischen pharmakologischen Eigenschaften stärker zu profilieren.
Zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen besteht nach wie vor ein dringendes medizinisches Bedürfnis, da die bisher eingesetzten Medikamente gerade in der Langzeittherapie zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können. Um chronisch entzündliche Erkrankungen in Zukunft adäquat therapieren zu können, sind bereits verschiedene neuartige Ansätze in klinischer bzw. präklinischer Entwicklung. Ein möglicher Ansatz besteht in einer dualen Hemmung der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) von zwei verschiedenen Leitstrukturen an der 5 LO und der mPGES 1 untersucht. Die erste Leitstruktur entstammt aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Sulfonamidstruktur. In dieser Arbeit ist es gelungen, durch eine gezielte Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen, die Leitstruktur I an der 5 LO und der mPGES-1 in ihrer Potenz zu optimieren. Die Leitstruktur (IC50: 5-LO (zellfrei) = 5.7 µM, IC50: 5 LO (PMNL) = 3.7 µM, IC50: mPGES-1 = 4.5 µM) konnte durch Variation in allen drei Positionen modifiziert werden, so dass die optimierte Struktur 170 (IC50: 5-LO (zellfrei) = 2.3 µM, IC50: 5-LO (PMNL) = 0.4 µM, IC50: mPGES-1 = 0.7 µM) entstanden ist. Für die Verbindung 170 wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften, wie Löslichkeit und metabolische Stabilität, sowie der Wirkmechanismus auf molekularer Ebene bestimmt. Ebenso konnte für Verbindung 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden.
Die zweite Leitstruktur stammt ebenfalls aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Mercaptobenzothiazol-Grundstruktur. Aufgrund der Ähnlichkeit zu den bekannten Pirinixinsäurederivaten wurde auch hier für die Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zunächst eine Kettenverlängerung an der Alkylkette vorgenommen. Es ließ sich auch hier durch eine gezielte SAR, die Leitstruktur bis hin zum submikromolaren Bereich in Verbindung 219 optimieren. Gleichzeitig ist es gelungen in Verbindung 219 einer der am potentesten dual ausgeglichensten dualen 5 LO/mPGES-1 Inhibitoren zu identifizieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit es gelungen ist durch gezielte Untersuchungen der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei verschiedene Substanzklassen zu dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren zu optimieren. Ebenso konnte für Substanz 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden. Diese Arbeit soll dazu beitragen, das therapeutische Potential von dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren als anti-entzündliche Wirkstoffe in Zukunft besser einschätzen zu können.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Inhibitoren der bakteriellen Resistenzproteine New Delhi Metallo-β-Lactamase 1 (NDM-1), die beiden Mutanten der Verona-Integron Encoded Metallo-β-Lactamase 1 und 2 (VIM-1, bzw. -2), sowie die Imipenemase 7 (IMP-7) entwickelt.
Auf Grund natürlicher Selektion, aber vor allem auch bedingt durch den unüberlegten und verschwenderischen Einsatz von β-Lactam-Antibiotika, ist eine weltweite Zunahme an multiresistenten Erregern zu beobachten. Einer der Hauptgründe dieser Resistenzen sind die Metallo- β-Lactamsen (MBL), welche vor allem in Gramnegativen Bakterien vertreten sind und für die Hydrolyse und damit der Desaktivierung der β-Lactam-Wirkstoffe verantwortlich sind. Neben der Suche nach anderweitig wirkenden Antibiotika, ist die Entwicklung von Inhibitoren der MBLs von vordringlicher Bedeutung.
Basierend auf der Grundstruktur des ACE-Hemmers Captopril, wurden trotz synthetischer Herausforderungen erfolgreich mehrere Strukturen mit inhibitorischer Aktivität gegenüber den MBLs synthetisiert. Der Prolinring von Captopril wurde in einer neuen Variante der Captopril-Synthese durch verschiedene Ring- und nicht cyclische Teilstrukturen ersetzt. Durch die Entwicklung einer Schutzgruppenstrategie, konnte die Ringstruktur durch einen Piperazin-Rest ersetzt werden. Dies erlaubt es, die Molekülstruktur auf dieser Seite zu erweitern. Des Weiteren wurde eine neue Syntheseroute etabliert, welche es auf elegante Weise ermöglicht, weitere Derivatisierungen an der Methylgruppe des Captoprils durchzuführen.
In einem proteinbasierten Testsystem wurden die synthetisierten Substanzen auf ihr inhibitorisches Potential hin untersucht. Dabei wurden IC50-Werte im niedrig einstelligen mikromolaren, für drei Verbindungen sogar im sub-mikromolaren Bereich ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden für die drei aktivsten Inhibitoren durch eine Erhöhung des Schmelzpunktes in einem TSA-Testsystem erfolgreich verifiziert. Mittels ITC-Untersuchungen konnte die unterschiedlichen Gewichtungen der entropischen und enthalpischen Beiträge zur Bindung der Inhibitoren an die untersuchten MBLs aufgezeigt werden. Hierdurch konnten die scheinbar widersprüchlichen Ergebnisse der ermittelten IC50-Werte und Schmelzpunktverschiebungen für die Verbindung DBDK48 bezüglich der NDM-1 aufgeklärt werden.
Die Strukturen DB320 konnte erfolgreich mit VIM-2 co-kristallisiert werden. Dies ermöglicht eine genauere Untersuchung und qualifizierte Aussagen über die Bindungsverhältnisse zwischen Protein und Ligand.
Für zwei der synthetisierten Inhibitoren sollte untersucht werden, ob deren Aktivität in vitro auch in Bakterien erhalten bleibt. Dazu wurden pathogene klinische Isolate und Laborstämme, welche mit dem Resistenzplasmid transfiziert wurden, und gegen Imipenem resistent sind, herangezogen. Durch die Zugabe der Inhibitoren konnte die Wirksamkeit von Imipenem wiederhergestellt werden.
Es konnte eine HPLC-Methode etabliert werden, welche eine Abschätzung der Polaritäten in Abhängigkeit der Retentionszeiten erlaubt. Dadurch konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Polarität der Verbindungen und dem Grad der Wirksamkeit im MIC-Testsystem aufgezeigt werden.
Durch die Untersuchung der Inhibitoren auf die Proteine ACE und LTA4H, konnten zwei Ziel-Proteine der Captopril-Grundstruktur als unerwünschte Nebenziele ausgeschlossen werden. Des Weiteren führte die Behandlung von U937-Zellen, selbst bei einer hohen Konzentration von 100 µM, weder zu Auffälligkeiten in einem WST-1 Assay, noch zu einer erhöhten Freisetzung von LDH. Daher kann davon ausgegangen werden, dass die Verbindungen über keine zytotoxischen Eigenschaften verfügen.
Die Autophagie ist ein in Eukaryonten evolutionär konservierter Prozess, bei dem es zu einem lysosomalen Abbau von cytosolischen Bestandteilen kommt. Die dabei entstehenden biochemischen Bausteine stehen anschließend erneut zum Aufbau benötigter Strukturen zur Verfügung. Verschiedene Stimuli, wie beispielsweise Nährstoffmangel, können die Aktivität der Autophagie erhöhen und ermöglicht Zellen dadurch die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase, selbst unter Stressbedingungen. Im Verlauf der Autophagie bildet sich eine tassenförmige Doppelmembran-Struktur, das sogenannte Phagophor. Dieses wächst, um das abzubauende Material zu umschließen und wird dabei von sogenannten Atg-Proteinen (autophagy-related genes) prozessiert. Nach der Schließung spricht man vom Autophagosom, welches letztlich mit einem Lysosom verschmilzt und das Autophagolysosom bildet, welches wiederum die eingeschlossenen Bestandteile zerlegt und die recycelten Bausteine freigibt. Die einzelnen Schritte während der Autophagie sind hochgradig durch die Atg-Proteine reguliert. Eines dieser Atg-Proteine, das Atg8, ist an einigen entscheidenden Schritten wie dem Phagophor-Wachstum, der Autophagosom-Reifung sowie der Schließung beteiligt. Während es in Hefen nur ein einziges Atg8-Protein gibt, so zeigt sich in höheren Eukaryonten meist eine gewisse Diversität. So codiert beispielsweise das humane Genom mindestens sechs Atg8-Homologe. Neben den drei Proteinen der LC3-Familie (A, B, C) zählen auch GABARAP, GABARAPL1 und GABARAPL2 dazu. Die Gründe für diese Diversität sind noch nicht vollständig aufgeklärt, weshalb es wichtig ist, möglichst selektive Modulatoren zu entwickeln, um so die Aufgaben der einzelnen Homologen entschlüsseln zu können. Eine weitere wichtige Aufgabe übernimmt Atg8 beim Binden des abzubauenden Materials über sogenannte Autophagie-Rezeptoren, wie beispielsweise p62. Der Bindevorgang beruht dabei auf der Interaktion von p62 mit ubiquitinierten Zellbestandteilen auf der einen Seite und der Interaktion zwischen p62 und LC3 auf der anderen Seite. Letztgenannte beruht auf dem Binden des LIR-Motivs (LC3-interagierende Region) von p62 an die LDS (LIR-docking site) des LC3-Proteins. Das LIR-Motiv zeichnet sich durch Aminosäure-Sequenz D-D-D-W/F/Y-X1-X2-L/I/V aus. Währende die aromatische Seitenkette (W/F/Y) die hydrophobe Tasche 1 (HP1) der LDS besetzt, ragt die aliphatische Seitenkette (L/I/V) in die HP2 hinein. Damit sollte es möglich sein, die LIR-LC3-Interaktion, durch das Besetzen der LDS zu stören bzw. zu inhibieren. Solche Inhibitoren könnten zum einen der weiteren Aufklärung der Prozesse, an denen die Autophagie beteiligt ist, dienen, zum anderen jedoch auch die Untersuchung fehlerhafter Autophagie ermöglichen. Ausgangspunkt für diese Arbeit stellt die Verbindung Novobiocin dar, die im Rahmen eines Mitteldurchsatz-Screenings als potenzieller Inhibitor der LIR-LC3-Interaktion identifiziert und mittels ITC, TSA und 1H-15N-HSQC verifiziert werden konnte. Die Struktur des Novobiocins setzt sich aus dem 3-Amino-4-hydroxy-8-methylcoumarin-Kern, der über eine Amidbindung an 3-iso-Prenyl-4-Hydroxybenzoesäure gebunden ist, sowie einer O-glykosidischen Bindung in Position C7 des Coumarins mit L-Noviose zusammen. Da es sich bei Novobiocin (XL6) um ein verhältnismäßig komplexes Molekül handelt, wurde der Einfluss einzelner funktionellen Gruppen des Moleküls auf die Bindungsaffinität hin untersucht. Hierfür wurden Synthesestrategien sowohl für die Coumarin-Gerüste als auch verschiedene Benzoesäuren entwickelt. Die erhaltenen Verbindungen wurden mittels ITC und TSA untersucht. Dabei wurde die Verbindung MH507 als geeigneter Ausgangspunkt für die Untersuchung der Struktur-Aktivitätsbeziehungen (SAR) bezüglich der Benzamid-Seite identifiziert. Im Rahmen einer ersten SAR-Untersuchung wurden neben verschiedenen 3-Alkyl-benzoesäuren, auch verschiedene divalente Isostere (-O-, -S-, -NHSO2-) der benzylischen Methylengruppe synthetisiert. Diese, sowie kommerzielle Aminosäuren, wurden mit 3-Amino-4,7-dihydroxycoumarin zu den entsprechenden Endverbindungen gekuppelt. Ergänzend dazu wurden auch eine Verbindung mit umgekehrter Konstitution der Amidbindung dargestellt, um den Einfluss der Reihenfolge zu verifizieren. In einer weiteren SAR-Studie wurden Derivate synthetisiert, die zusätzlich eine Funktionalisierung am C7 des Coumarin-Gerüstes über Amidkupplung, Sulfonamid-Bildung bzw. Suzuki-Reaktion erlauben und somit eine Interaktion mit der HP1 ermöglichen könnten. Dafür wurde eine weitere Synthesestrategie zur Darstellung von 7-Nitro- bzw. 7-Brom-3-amino-4-hydroxycoumarinen ausgearbeitet und eine Reihe von Endverbindungen dargestellt. Neben den Coumarin-Derivaten wurden auch vier Peptidomimetika synthetisierten. Hierfür wurde, basierend auf den Interaktionen zwischen dem LIR-Motiv und der LC3 Proteinoberfläche, ein Pharmakophor-Modell erstellt. Neben einem Pentapeptid wurden auch drei Verbindungen dargestellt, die ein 5-Amino 2-methoxybenzohydrazid-Gerüst besitzen. Um die synthetisierten Verbindungen auf ihre inhibitorische Aktivität auf LC3A bzw. LC3B gegenüber dem LIR-Motiv von p62 hin untersuchen zu können, wurde ein HTRF-basierter Verdrängungsassay entwickelt. Dabei diente ein mit dem LIR-Motiv modifiziertes sGFP als FRET-Akzeptor, während das jeweilige Terbium-Kryptat-gelabelte SNAP-LC3-Fusionsprotein als FRET-Donor fungierte. Neben den Titrationsexperimenten zur Bestimmung der IC50-Werte wurden auch die jeweiligen Dissoziationskonstanten (Kd) von LC3A und LC3B gegenüber dem LIR-sGFP-Fusionsprotein bestimmt, um die IC50-Werte in inhibitorische Konstanten (Ki) zu überführen, da diese untereinander besser vergleichbar sind.
Die Verbindung MH209 zeigte die höchste Aktivität auf LC3A bzw. LC3B und besitzt aufgrund der Noviose-Einheit eine gute Wasserlöslichkeit, weshalb sie für die weiteren Untersuchungen ausgewählt wurde. Im Zuge von Kristallisationsexperimenten gelang die Isolierung und Vermessung eines Co-Kristalls von LC3A mit Verbindung MH209. Durch die Kristallstruktur wurden wichtige Einblicke in die intermolekularen Wechselwirkungen der 4-Hydroxycoumarine mit der LC3A- bzw. LC3B-Proteinoberfläche gewonnen und die Bindungsmode aufgeklärt. Diese Erkenntnisse passen gut zu den Ergebnissen aus den durchgeführten TSA-, ITC- und HTRF-Assays, wie beispielsweise der korrekten Konstitution der Amidbindung am C3 des Coumarin-Gerüstes. Mittels ITC wurde die Verbindung MH209 auf ihre Bindungsaffinität gegenüber den anderen humanen Homologen der Atg8-Proteinfamilie hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass MH209 abgesehen von LC3A und LC3B keinerlei Aktivität auf den humanen Atg8-Homologen besitzt. Diese Selektivität ist nützlich, um die biologische Bedeutung der Diversität von Atg8-Homologen in höheren Eukaryonten zu untersuchen und Prozesse, in die diese involviert sind, aufzuklären.
In dieser Arbeit konnte 1,8-Diborylnaphthalin (11) präparativ in einer Stufe und 65% Ausbeute aus dem literaturbekannten Boronsäureanhydrid 9 dargestellt werden. 11 ist das zweite bekannte, aromatisch verbrückte Derivat des Diborans B2H6. 11 kann als Startverbindung für eine Reihe strukturverwandter BNB-dotierter Phenalenderivate verwendet werden. Dazu werden zwei der vier Bor-gebundenen Protonen durch die Umsetzung mit einem Mesitylgrignard und Trimethylsilylchlorid substituiert. Die Umsetzung mit Wasser bzw. Aminen liefert BOB- bzw. BNB-Phenalene unter Freisetzung von elementarem Wasserstoff. Alle, auf diese Weise dargestellten Verbindungen, zeigen reversible Redoxeigenschaften und Photolumineszenz mit zum Teil besonders scharfen Emissionssignalen mit Halbhöhenbreiten von bis zu 31 nm. Zusätzlich wurden drei analoge Vertreter einer NBN-Phenalen Spezies dargestellt und charakterisiert. Die entgegengesetzte Dotierung äußert sich in einem grundlegend verschiedenem Redoxverhalten. Abschließend wurde die Reduktion des BNB-Phenalens 22 untersucht. Dabei gelang es das Radikal K[32] zu charakterisieren und seine Abbaureaktion in THF aufzuklären.
Nukleinsäuren und Proteine bilden zusammen mit den Kohlenhydraten und Lipiden die vier großen Gruppen der Biomoleküle. Dabei setzen sich Nukleinsäuren aus einer variierenden Abfolge von Nukleotiden zusammen. Gleiches trifft auf die Proteine zu, wobei deren Bausteine als Aminosäuren bezeichnet werden. Die Reihenfolge der Bausteine bestimmt zusammen mit der Interaktion, die die einzelnen Bestandteile untereinander eingehen, deren Funktion. Um deren Wirkungsweise verstehen und nachverfolgen zu können, wurden unterschiedliche Methoden entwickelt, zu welchen auch die EPR-Spektroskopie gehört.
Durch den Einbau modifizierter Nukleotide oder Aminosäuren lassen sich Spinlabel in die sonst EPR-inaktiven Nukleinsäuren und Proteine einführen. Diese Marker lassen sich grundsätzlich in drei Klassen unterteilen (Metallionen, Nitroxidradikale und TAMs), weisen aber immer mindestens ein ungepaartes Elektronenpaar auf. Die Festphasensynthese ist eine Standardprozedur zur Herstellung von markierten Nukleinsäuren und Proteinen. Allerdings führen die Bedingungen dieser Methode zumindest teilweise zur Zersetzung der Nitroxidradikale, die dieser Arbeit zugrunde liegen, wenn sie direkt während der Synthese eingebaut werden. Der direkte Einbau ist aber in vielen Fällen essenziell, um bestimmte Eigenschaften zu erzielen.
Um den Abbau des Nitroxidradikals während der Festphasensynthese zu verhindern, kann dieses vorübergehend mit einer Schutzgruppe versehen werden, welche sich anschließend wieder abspalten lässt.
Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt hierbei auf der Darstellung neuer photolabil geschützter Spinlabel zur Synthese markierter Proteine und Nukleinsäuren.
Basierend auf den Nukleotiden Uridin und Cytidin konnten zwei für die RNA-Synthese vorgesehene Phosphoramidite synthetisiert werden, welche jeweils an der 5-Position des Pyrimidinrings mit einem photolabil geschützten Spinlabel auf Basis von TPA versehen waren. Durch Einbau des Uridinderivats in das Neomycin-Aptamer konnte zudem der Einfluss der Spinlabel auf die lokale Struktur mit Hilfe von in-line probing gezeigt werden.
Der gleiche TPA-Label konnte ebenfalls mit einem Lysin gekuppelt werden, welches später über ein orthogonales tRNA/Aminoacyl-tRNA Synthetase Paares in eine Polypeptid eingebaut werden sollte. In Kooperation mit dem AK Grininger ist auch ein nicht geschützter Spinlabel zur kupferfreien Markierung der Fettsäuresynthase entstanden. Abschließend war noch die Synthese eines auf Phenylalanin basierenden photolabil geschützten Spinlabel in Arbeit, welcher jedoch nicht beendet werden konnte. Dieser sollte mittels Festphasensynthese einbaubar sein, weswegen er am N-Terminus mit Fmoc geschützt ist.
Specialized transporter proteins facilitate controlled uptake and extrusion of molecules across biological membranes that would otherwise be impermeable to them. The superfamily of solute carriers (SLC) comprises the second largest group of membrane proteins in humans, acting on a variety of small polar and non-polar molecules and ions. Because of their central role in metabolism, malfunctioning of these proteins often is pathogenic. The interest in SLC transporters as drug targets – as well as for drug delivery – has therefore increased in the past years. For many SLC subfamilies, however, structural and functional information remains scarce to date.
The here presented data provides important insights into different aspects of the transport mechanism of the SLC23 and SLC26 protein families. Importantly, we show that SLC23 nucleobase transporters, in contrast to what was been previously reported, work as uniporters rather than as proton-coupled symporters. In order to do so, we developed the first and only in vitro transport assay for the SLC23 family, which enables investigation of protein function in a defined environment. Moreover, we provide a hypothesis on the role of the extremely conserved negative charged substrate binding site residue found not only in the SLC23, but also SLC4 and SLC26 families. Based on a detailed analysis of binding and transport we conclude that this conserved negative charged has a relevance for protein stability rather than for substrate binding, which explains its conservation for all three protein families that otherwise differ in their substrate specificities and modes of transport. Lastly, we investigated the relevance of oligomerization for the SLC23 and SLC26 families, highlighting the importance of the STAS domain for forming active dimers in the SLC26 anion transporter family.
The enzyme 5-lipoxygenase (5-LO) occupies a central role in the biosynthesis of inflammatory leukotrienes and thus takes part in the pathogenesis of related diseases. Its occurrence is mainly restricted to cells of the immune system including granulocytes, monocytes/macrophages or B-lymphocytes and can be induced by cell differentiation of myeloid cells after treatment with differentiating agents, such as DMSO, retinoic acid or the combination of TGFβ/1,25(OH)2D3. The latter contribute to the highest level of induction of mRNA and protein expression. Its cell specific occurrence is at least partly due to DNA methylation in cells that do not exhibit 5-LO activity and genetic regulation is further dependent on histone acetylation. 5-LO expression is controlled by transcription factors binding to the promoter sequence of the ALOX5 gene that induce basal promoter activity, as well as promoter independent effects including transcript initiation and elongation, which are mostly attributed to TGFβ/1,25(OH)2D3 signaling. The ALOX5 gene resembles a typical housekeeping gene, hence lacks TATA- or CAAT-boxes for transcriptional regulation, but displays a high GC-content with eight GC-boxes, five of which are arranged in tandem, that provide binding sites for transcription factors Sp1, Sp3 and Egr-1.
The proximal ALOX5 promoter is furthermore a target for additional factors, such as TGFβ effector proteins SMADs or the vitamin D receptor and possesses additional consensus sequences for transcriptional regulators, including NF-κB or PU.1. However, as yet no actual binding of these proteins to the promoter sequence was demonstrated and an unbiased screening for identifying further ALOX5 promoter interacting proteins, which might have impact on 5-LO expression, is still lacking. For this purpose, the present study focused on the identification of significantly interacting proteins, employing DNA-affinity enrichment coupled to label-free quantitative proteomics, spanning a sequence of about 270 base pairs of the proximal ALOX5 promoter. For the elucidation of potential cell specific differences in protein patterns and compositions, DNA pulldowns were performed by using oligonucleotide stretches comprising the core promoter sequence including the 5-fold GC-box, which were incubated with different cell lines and differentiation states of myeloid, as well as B-lymphocytic lineages. In order to compare different mass spectrometric quantification strategies that would allow for identification of interactors, dimethyl labeling and label-free techniques were used. Since the label-free approach outperformed the label-based one in initial experiments, it was established as standard quantification strategy in all DNA pulldowns performed. The pulldowns of myeloid cell lines in both undifferentiated and differentiated state and B-lymphocytes resulted in a cell-unspecific protein pattern whose composition was similar, regardless of cell lineage. Additionally, further DNA sequences comprising either a vitamin D response element or a SMAD binding element were investigated in the promyelocytic model cell line HL-60 in both undifferentiated and differentiated state. The identified proteins confirmed known interaction partners and furthermore revealed novel potential regulators of the 5-LO promoter. Out of these, the most prominently identified and promising proteins included transcription factors of the KLF- and CCAAT/enhancer binding protein-family. In this context, KLF5 and KLF13 are both involved in the regulation of inflammatory processes, the former additionally being an effector protein of TGFβ-signaling, whose functional characterization is of utmost interest in terms of regulation of 5-LO expression. Further protein characterization will be inevitable for the CCAAT/enhancer binding proteins C/EBPα, C/EBPβ and C/EBPε. These transcription factors are involved in the regulation of inflammatory processes and heterodimers thereof (C/EBPα/β) are known to control TGFβ/1,25(OH)2D3-mediated effects of the CD14 gene.
Several of the identified proteins of the pulldowns containing the tandem GC-box represented interactors of G-quadruplex DNA, including the helicases BLM and DHX36, the ribonucleoproteins hnRNP D and hnRNP K and transcription factor MAZ. Since G-quadruplexes form in G-rich DNA sequences as secondary DNA structures and exhibit substantial regulatory effects on the transcription of their target genes, the potential formation thereof in the ALOX5 core promoter sequence was investigated in a second project. Out of the proteins mentioned above, MAZ is shown to exert resolving effects on G4-DNA and synergistically induce Sp1-dependent gene activation of oncogene h-RAS, which displays analogous promoter characteristics to the ALOX5 gene. A DNA stretch comprising the tandem GC-box was used for elucidating the potential of secondary DNA structure formation. Intriguingly, both immune-based and spectroscopic methods provided clear evidence for the in vitro G-quadruplex formation of the proximal promoter sequence for the first time. In order to provide additional information on a possible regulatory effect of existing G-quadruplex structures on 5-LO transcription, differentiated HL-60 cells were subsequently treated with two distinct G4-DNA stabilizing agents. A porphyrin analogon (TMPyP4) did not exhibit any effects on 5-LO mRNA and protein expression after cell treatment. A second G4-DNA stabilizing agent (pyridostatin) on the other hand revealed significant reduction on 5-LO protein expression after cellular treatment. These mixed results render further experiments inevitable, in order to provide a clear assertion as to whether 5-LO expression is regulated by G-quadruplex structures or not.
Altogether, this study enlarges the knowledge of ALOX5 proximal promoter interacting proteins by corroborating the binding of already known transcription factors and identifying novel interactors. It yields essential groundwork for subsequent functional studies of proteins involved in 5-LO transcription and introduces G-quadruplexes as a new potential mechanism in ALOX5 gene regulation.
Structure-function relationships in substrate binding protein dependent secondary transporters
(2023)
This work provides new insights into the relevance of SBP dependent secondary transport systems, especially in the thus far under-researched subgroup of TAXI transporters. Importantly, we identified and characterized the TAXI transport system TAXIPm-PQM from Proteus mirabilis. We demonstrated that, in contrast to previously characterized SBP dependent secondary transport systems, TAXIPm-PQM is a proton coupled system and transports the C5-dicarboxylate α- ketoglutarate. Since initially the transport of α-ketoglutarate could only be demonstrated in vivo but not in vitro using established protocols (Mulligan et al. 2009), we investigated in detail the differences between the in vivo and in vitro assay. This resulted in a bioinformatic analysis of TRAP and TAXI signal peptides, which strongly implied that TAXIPm-P requires a transmembrane anchor to allow for transport. We then provided TAXIPm-P surface tethered to the membrane in in vitro transport assays and confirmed the prediction of our bioinformatic analysis that TAXIPm-PQM deploys a membrane-anchored instead of a soluble SBP. Furthermore, the TAXI transport system TAXIMh-PQM from Marinobacter hydrocarbonoclasticus transports fumarate only if both membrane domains Q and M are present. For further characterization, Michaelis-Menten kinetics and affinities were determined for both TAXI transport systems TAXIPm-PQM from Proteus mirabilis and TAXIMh-PQM from Marinobacter hydrocarbonoclasticus. In addition, nanobodies were selected for the membrane domain TAXIPm-QM from Proteus mirabilis to stabilize different conformations which can serve in subsequent structural elucidation studies. Furthermore, the TRAP SBP TRAPHi-SiaP from Haemophilus influenzae was shown to interact not only with its corresponding membrane domain TRAPHi-SiaQM but with at least one additional transporter. It was thereby excluded that TRAPHi- SiaP transfers N-acetylneuraminic acid to the only native E. coli TRAP transporter TRAPEc-YiaMNO and suggested to rather interact with a SBP dependent ABC transport system as this protein family represents the largest SBP dependent protein group in E. coli (Moussatova et al. 2008).
The transcriptional regulator RcsB controls the expression of a minimum of 20 different genes having diverse functionalities and biosynthetic operons in the family of Enterobacteriaceae. While in the heterodimeric complex with the co activator RcsA, the RcsAB box consensus is recognized, DNA binding sites for RcsB without RcsA have also been identified. The conformation of RcsB might therefore be modulated upon interaction with various co activators, resulting in recognition of different DNA targets. In this study the interaction of RcsB with some of these DNA targets have been analysed by a diverse array of techniques including gel shift assay and SPR. The solution structure of the C-terminal DNA-binding domain of RcsB from Erwinia amylovora spanning amino acid residues 129-215 has been solved in this study by heteronuclear NMR spectroscopy. The C-terminal domain is composed of four α-helices where the two central helices of the H-T-H motif are similar to the structures of the regulatory proteins GerE, NarL and TraR. The DNA-binding activity of the C-terminal domain alone is established for the first time in this study and was specified by fluorescence spectroscopy, SPR and NMR titration experiments. The molecular interaction between the individual RcsB domains was analysed by cross-linking experiments and heteronuclear NMR spectroscopy and the amino acid residues of the C-terminal domain involved in this interaction were identified precisely. Another important part of this project was the cell-free production of different Trp analogue labelled RcsB protein. RcsB protein was produced in quite a good yield with different Trp analogue having spectrally enhanced properties. The isolated RcsB alloproteins proved to be ideal for protein interaction studies by fluorescence spectroscopy and the very first evidence of an oligomerization of RcsB due to molecular association has been put forth from these studies. The phosphorylated state of the RcsB protein was mimicked by a beryllofluoride complex in order to study its role in transcriptional regulation. It was found that RcsB alone could bind to DNA targets upon this modification by the beryllofluoride complex. Thus the phosphorylation of the protein that involves the Asp 56 residue induces a structural change of the protein followed probably by a domain movement also, so that the C-terminal domain having the H-T-H DNA binding motif that was previously eclipsed by the N-terminal domain is relieved of this constraint.
H/ACA-RNPs are involved in RNA guided pseudouridylation of rRNAs and snRNAs. In this thesis I reconstituted active and labeled archaeal as well as eukaryotic H/ACA-RNPs and studied the structural dynamics of complex assembly and pseudouridine formation. Single molecule FRET spectroscopy was used as method of analysis to study structure, assembly and dynamics of these important complexes.
ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute an omnipresent superfamily of integral membrane proteins, which catalyze the translocation of a multitude of chemically diverse substrates across biological membranes. In humans, ABC transporters typically act as highly promiscuous exporters, responsible for many physiological processes, multi-drug resistance, and severe diseases, such as hypercholesterolemia, lipid trafficking disorders, and immune deficiency. In all ABC transporters, ATP-driven movements within two highly conserved nucleotide-binding domains (NBDs) are coupled to conformational changes of two transmembrane domains (TMDs), which provide a framework for substrate binding and release on the opposite side of the membrane and enable the transporter to cycle between inward-facing and outward-facing orientations. Several structures of ABC transporters determined either by X-ray crystallography or single-particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) have been reported, mostly exhibiting a variation of the inward-facing state, which highlights their dynamic behavior. However, for a complete understanding of the conformational dynamics, further structural information on intermediates is needed – especially for heterodimeric ABC transporters, which are predominant in humans and for which only limited structural information is available.
One prime example of such human heterodimeric ABC transport complexes is the transporter associated with antigen processing (TAP). TAP is a key player of the adaptive immune response, because it translocates proteasomal degradation products into the ER lumen for loading of MHC I molecules. Many functional aspects of TAP have been disclosed in recent years. However, structural information is lacking far behind and a major challenge in the field of medical relevant transporters. Recently, the heterodimeric ABC export system TmrAB (Thermus thermophilus multidrug resistance proteins A and B) was identified as an ortholog of TAP, by sharing structural homology with TAP and, intriguingly, being able to restore antigen presentation in human TAP-deficient cells. Thus, TmrAB is a biochemically well-characterized ABC exporter that can be regarded as a functional ortholog of TAP and serves as a model system for (heterodimeric) ABC export systems in general.
Thus, to illuminate the molecular basis of substrate translocation by single-particle cryo-EM, one of the main objectives of this work was the generation of stabilizing chaperones (synthetic antibodies, nanobodies, cyclic peptides) to reduce the conformational heterogeneity of TAP and TmrAB. Selected antibodies were analyzed with respect to stable complex formation, conformational trapping, and the ability to serve as alignment tools for structural studies by single-particle cryo-EM. Both antibody types were shown to form sufficiently stable complexes to serve as a rigid body for EM analyses. However, all selected antibodies bound to the inward-facing state exclusively.
Hence, for EM studies, various ligands were added to elucidate the full spectrum of conformational states during the catalytic cycle. For TAP, first attempts by negative-stain EM revealed a homogenous distribution of particles on the grid. Surprisingly, no transporter-like features were observed although various attempts were applied to increase the overall sample quality.
For TmrAB, in contrast, the complete conformational space in a native-like lipid environment under turnover conditions was mapped. Cryo-EM analysis of TmrAB incubated with ATP-Mg2+ and substrate revealed two distinct inward-facing conformations (IFwide and IFnarrow) as well as two asymmetric conformations with dimerized NBDs, which were markedly different from all previously reported structures. Here, the catalytically active site was slightly wider and contained ADP, while ATP was still bound at the catalytically-inactive site within the NBDs, demonstrating an asymmetric post-hydrolysis state. Intriguingly for the inward-facing conformations, a weak additional density close to residues M139TmrB and W297TmrB was observed in the inward-facing conformation, which displayed a higher degree of cytosolic gate opening (IFwide) indicating the presence of substrate. To verify that this density corresponds to substrate, single alanine mutations of M139TmrB and W297TmrB were introduced, leading to a strong reduction in substrate binding and transport. Since substrate release requires the opening of the extracellular gate, the absence of an outward-facing open conformation indicated that the opening must be highly transient. In order to explore the outward-facing open conformation, a cryo-EM analysis of the catalytically-inactive TmrAE523QB mutant upon incubation with ATP-Mg2+ was performed. Remarkably, within the same dataset, two different outward-facing conformations (occluded and open) were resolved, both in an ATP-bound state, which indicated that binding of ATP is sufficient to drive the large-scale conformational transition from inward-facing to outward-facing open. To explore the effect of nucleotide hydrolysis, TmrAB was trapped by vanadate. Again, two populations were observed, representing the outward-facing open and outward-facing occluded conformation.
Based on several structures of key intermediates, determined under turnover conditions or trapped in the pre-hydrolysis and hydrolysis transition state, for the first time the complete description of the ATP hydrolysis and translocation cycle of a heterodimeric ABC transport complex was elucidated in one single study. By mapping the conformational landscape during active turnover, aided by mutational and chemical modulation of kinetic rates, fundamental and so-far hidden steps of the substrate translocation cycle of asymmetric ABC transporters were resolved and a general template for (heterodimeric) ABC exporter-catalyzed substrate translocation was provided.
In this thesis, we characterized megasynthases such as fatty acid synthases (FASs) and polyketide synthases. The obtained insights into structure and function were used to engineer such systems to produce new-to-nature compounds.
The in vitro characterization of megasynthases requires reproducible access to these enzymes in high quality. Therefore, we established purification strategies for the yeast FAS and the methylsalicylic acid synthase (MSAS) from Saccharopolyspora erythraea (SerMSAS) and applied the latter one on MSAS from Penicillium patulum (PenPaMSAS) and on 6-deoxyerythronolide B synthase (DEBS) module 6. With the purified samples, we were able to obtain initial structural data for SerMSAS and solve the complete structure of the yeast FAS (PDB: 6TA1). On the example of the yeast FAS, we could show that the sample can suffer from adsorption to the water-air interface during the grid preparation for electron microscopy and presented how the use of graphene-based grids can overcome this problem. The combined structural and functional analysis of the yeast FAS showed that the structural domains trimerization module and dimerization module 2 are not essential for the assembly of the whole system. Therefore, they can potentially be used for domain exchange approaches. The in-depth functional analysis of SerMSAS revealed that not SerMSAS itself releases the product, but a 3-oxoacyl-(acyl-carrier protein) synthase like enzyme within the gene cluster transfers 6-methyl salicylic acid from SerMSAS to another carrier protein for subsequent modifications. In contrast, we showed that PenPaMSAS can release its product by hydrolysis and that non-native substrates can be incorporated although at significantly slower turnover rates compared to the native starter substrate. Our further investigation demonstrated that the substrate specificity of the acyltransferase (AT) is a critical factor for the incorporation of non-native substrates.
With the insight from the functional and structural characterization, we engineered megasynthases for the biosynthesis of natural product derivatives. We targeted the AT of PenPaMSAS for active site mutagenesis and discovered a mutant which can transfer non-native substrates significantly faster (~200-300%). Additionally, the malonyl/acetyl transferase (MAT) of the mammalian FAS was used as a promising target for protein engineering because of its previously reported properties including polyspecificity, fast transfer kinetics, robustness, and plasticity. We showed that the MAT can transfer fluorinated substrates and accept the acyl carrier protein of DEBS module 6. By exchanging the substrate specific AT of DEBS with the polyspecific MAT of the mammalian FAS, we demonstrated an efficient DEBS/FAS hybrid and an optimal truncation site for the applied ATs. In contrast to the wild type system, the DEBS/FAS enzyme was able to synthesize demethylated and fluorinated derivatives. The production and purification of a fluoro-methyl-disubstituted polyketide was of particular interest, as it has a high potential for the generation of new drugs and shows the potential of protein engineering. Furthermore, the incorporation of the disubstituted substrate had important implication in the mechanistic details of the ketosynthase-mediated C-C bond formation.
Während meiner Promotion habe ich zwei Projekte unter der Aufsicht von Dr. Misha Kudryashev durchgeführt. Im ersten Projekt habe ich die Strukturen des Ryanodinrezeptors 1 (RyR1) in Apo- und Ryanodin-Bindungszuständen in der nativen Membran durch Tomographie und Subtomogramm-Mittelung bei 12,6 bzw. 17,5 Å bestimmt. Im Vergleich zur Struktur von gereinigtem RyR1 unter Verwendung der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) können zusätzliche Dichten in der cytoplasmatischen Domäne und der sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membran bzw. im SR-Lumen beobachtet werden. Die Auflösung der Struktur von RyR1 im Apo-Zustand wurde von den Kollegen in meinem Labor mithilfe der Hybridmethode auf 9,5 Å verbessert. Diese Arbeit hat unser Verständnis für die Mechanismen von RyR1 in nativen Membranen erweitert. Im zweiten Projekt habe ich die Struktur des Proteins SdeC der SidE-Familie durch Einzelpartikel-Kryo-EM bei 4,6 Å bestimmt. Die Kristallstruktur des C-Terminus von SdeA wurde von meinem Forschungspartner Dr. Mohit Misra gelöst. Durch Überlagerung einer gemeinsamen Helix dieser beiden Strukturen konnten wir ein kombiniertes Modell erstellen und ein allgemeines Verständnis der Proteine der SidE-Familie erhalten.
The post-transcriptional modification of the canonical nucleoside uridine into its rotational isomer pseudouridine occurs in non-coding as well as coding RNA and is the most abundant post-transcriptional modification in all kingdoms of life. While the occurrence of pseudouridine has been linked to the enhancement of stability and the codon-anticodon interaction in tRNAs, enhancement of the translation efficiency in rRNAs, regulatory functions in spliceosomal snRNA and nonsense codon suppression in mRNA, its exact role in many RNAs is still ambiguous. The uridine to pseudouridine isomerization can either be catalyzed by one of various standalone pseudouridylases or it can be performed in an RNA-guided manner by H/ACA ribonucleoproteins. In eukaryotes, the guide RNA always adapts a conserved bipartite, double-hairpin conformation. Each hairpin contains an internal RNA-loop motif, which can recruit a specific substrate RNA via base pairing. The catalytically active RNP is formed by the interactions of the guide RNA with four proteins. While Cbf5 forms the catalytically active center, Nop10 and Nhp2 perform auxiliary functions and Gar1 is involved in substrate turnover. Up until now, most structural knowledge about H/ACA RNPs has been derived from archaeal complexes, while the exact structure-function-relationships between RNA and proteins in eukaryotic RNPs is still ambiguous. While archaeal H/ACA RNPs share many similarities with eukaryotic RNPs and act as good model system, there are also many differences between them like eukaryotic specific protein domains as well as the overall bipartite complex structure, dictated by the snoRNA. Investigating pseudouridylation by eukaryotic H/ACA RNPs opens up a broad area of research and helps to gain a better understanding of this enzyme class – especially since malfunction of H/ACA RNPs has been linked to the genetic disease Dyskeratosis congenita as well as several types of cancer.
The main goal of this thesis was to gain new insights into the RNA/protein interactions in the eukaryotic snR81 H/ACA snoRNP from Saccharomyces cerevisiae on a structural as well as dynamical level. In the first part of this thesis, the main goal was to in vitro prepare a functionally active snR81 H/ACA RNP. The guiding snoRNA was prepared by in vitro transcription and purification, while the Saccharomyces cerevisiae proteins were recombinantly expressed from Escherichia coli. Apart from the full length, bipartite snR81 snoRNP, several sub-complexes of the RNP were reconstituted. Therefore, snoRNA constructs were designed and prepared, which only contained a single hairpin motif of the complex. Furthermore, snoRNA constructs in which the apical hairpin stem was replaced by a stable tetraloop were prepared, to investigate the influence of the apical stem on protein binding and activity. Also, for the eukaryotic proteins, a shortened version of Gar1 (Gar1Δ) was utilized, which lacks the eukaryotic specific RGG domains, that have been characterized as accessory RNA binding motifs. Reconstituted snoRNPs were utilized in catalytic activity assays, monitoring the turnover rate of uridine to pseudouridine. For this purpose, radioactively labeled substrate RNAs were prepared by phosphorylation and splinted ligation of oligonucleotides and were objected to reconstituted H/ACA RNPs under single as well as multiple turnover conditions. In the second part of this thesis, the RNA/protein interactions were dissected via single molecule FRET spectroscopy. Therefore, the snoRNA was labeled with an acceptor fluorophore via NHS ester/amine-reaction. Furthermore, the snoRNA contained a biotin-handle, allowing immobilization of the complex during the experimental time-window of the spectroscopic analysis. Eukaryotic specific protein Nhp2 was labeled with a donor fluorophore via “click” chemistry, which included the chemical synthesis and incorporation by genetic code expansion of non-canonical amino acids. The interactions of Nhp2 with the different snoRNA constructs (standalone-hairpins “H5” and “H3”, as well as hairpins lacking the apical binding motif “H5Δ” and “H3Δ”) were monitored on a single molecule level.
In summary, it was possible to gain new insights into the complex structure and the dynamical behavior of the still sparsely characterized eukaryotic H/ACA RNPs. Especially, new knowledge could be obtained about the hairpin specific behavior on the bipartite RNA complex structure, including the rather ambiguous role of the protein Nhp2 and the contribution of the eukaryotic specific features of Gar1 in their interaction with the guide/substrate RNA.
Human protein kinases play essential roles in cellular signaling pathways and - if deregulated - are linked to a large diversity of diseases such as cancer and inflammation or to metabolic diseases. Because of their key role in disease development or progression, kinases have developed into major drug targets resulting in the approval of 52 kinase inhibitors by the Food and Drug Administration (FDA) so far.
Within the drug discovery process, the affinity of the inhibitors is the parameter that is used most often to predict the later efficacy in humans. However, the kinetics of binding have recently emerged as an important but largely neglected factor of kinase inhibitor efficacy. To efficiently suppress a signaling pathway, the targeted kinase needs to be continuously inhibited. Thus, it has been hypothesized that fast binding on-rates and slow off-rates would be the preferred property of an efficacious inhibitor. Despite optimizing the potency of kinase inhibitors, in the past decade optimization of kinetic selectivity has therefore gained interest as a molecule cannot be active unless it is bound, as Paul Ehrlich once stated. There is increasing evidence of correlations between prolonged drug-target residence time and increased drug efficacy, and that inhibitor selectivity in cellular contexts can be modulated by altered residence times. In order to contribute to the understanding of the effect of long residence times on cellular targets we initiated two projects.
The first of these projects is related to the STE20 kinase Serine/threonine kinase 10 (STK10) and its close relative STE20 like kinase (SLK) which have been reported to be frequent off-targets for kinase inhibitors used in the clinics. Also, an inhibition of STK10 and SLK has been linked to a common side-effect of severe skin rash developed upon treatment with the EGFR inhibitor erlotinib, but not gefitinib and the severity of this rash correlated with the treatment outcome, which fits the known biology of STK10 and SLK to be regulators of lymphocyte migration and PLK kinases. However, there are yet no explanations why these two proteins show such high hit-rates across the kinome among the kinase inhibitors. Using structural analysis, we identified the flexibility of STK10 to be the main reason for this hit-rate. The observed strong in vitro potencies did however not translate to the cellular system which is why we investigated the inhibitors residence time on STK10. We found the same flexibility to be the main reason for slow residence times among several inhibitors. We observed large rearrangements in the hydrophobic backpocket of STK10 including the αC, the P-loop enclosing the inhibitor like a lid and strong π-π-stackings to be the main reasons for prolonged residence times on STK10. Interestingly, we observed an increased residence time for erlotinib, which showed skin-related side-effects, giving rise whether the binding kinetics should be investigated for weak cellular off-target effects in future drug discovery efforts.
In the second project we initiated, we illuminate a structural mechanism that allows kinetic selection between two closely related kinases, focal adhesion kinase (FAK) and proline-rich tyrosine kinase 2 (PYK2). Using an inhibitor series designed to probe the mechanism, residence times measured in vitro and in cells showed a strong correlation. Crystal structures and mutagenesis identified hydrophobic interactions with L567, adjacent to the DFG-motif, as being crucial to kinetic selectivity of FAK over PYK2. This specific interaction was observed only when the DFG-motif was stabilized into a helical conformation upon ligand binding to FAK. The interplay between the protein structural mobility and ligand-induced effect was found to be the key regulator of kinetic inhibitor selectivity for FAK over PYK2.
These two projects showed that the parameter residence time should be considered for different problems among the drug discovery process. First, in an open in vivo system not only the potency of a drug alone, but as well its residence time might be of importance. Here we showed that the weak cellular potency translated to prolonged residence times for several inhibitors in cells and established a link between the phenotypic outcome of skin rash after erlotinib treatment and the residence time of this inhibitor on STK10 in cells. On the other hand, medicinal chemistry efforts should consider structure kinetic relationships (SKR) in the optimization process and aim to understand the molecular basis for prolonged target residence times. Here, we showed that a hydrophobic interaction that is enforced upon inhibitor binding is crucial for an unusual helical DFG conformation which arrests the inhibitor and prolongs its residence time providing the molecular basis for understanding the kinetic selectivity of two closely related protein kinases. Establishing the SKRs will help medicinal chemists to kinetically optimize their drug candidates to select a suitable molecule to proceed into further optimization programs. Hence, the projects showed that the target residence time parameter needs to be considered both as a molecular optimization parameter to improve compound potency and binding behavior as well as a parameter to be understood for proceeding to the open system of in vivo models to later modulate the in vivo efficacy of protein kinase targeting drugs.
The endoplasmic-reticulum-associated protein degradation pathway ensures quality control of newly synthesized soluble and membrane proteins of the secretory pathway. Proteins failing to fold into their native structure are processed in a multistep process and finally ubiquitinated and degraded by the proteasome in order to protect the cell from proteotoxic stress. My thesis covers structural as well as functional studies of various protein components that constitute the protein complexes that are responsible for this process.
One sub-project addressed the mechanism of glycan recognition by Yos9 as part of the ERAD substrate selection. NMR solution structures of the mannose-6-phosphate homology (MRH) domain of Yos9 both in a free and glycan bound conformation reveal a gripping movement of loop regions upon binding of correctly processed glycan structures.
The main projects focused on revealing the mechanism of efficient ubiquitin chain assembly by the ERAD ubiquitination machinery. This included the investigation of the role of the ERAD components Cue1 and Ubc7 in processive ubiquitin chain formation, how ubiquitin chain conformations change during elongation, how the conformation of a chain is impacted by interacting proteins and finally understand the activity regulation of the ERAD E2 enzyme Ubc7 by its cognate RING E3 ligases. Nuclear magnetic resonance (NMR) analysis and fluorescence-based ubiquitination assays show that the CUE domain of Cue1 contributes with its proximal binding preference as well as with its position dependent accelerating effect to efficient ubiquitin chain formation. This is required to efficiently drive degradation of substrates. Specific ubiquitin binding events dictate and coordinate the spatial arrangement of the E2 enzyme relative to the distal tip of a chain. This process can be further accelerated by RING E3 ligases that promote Ubc7 activity by more than ~20 fold via inducing allosteric changes around the catalytic cysteine. My results additionally suggest a model where Ubc7 dimerization results in proximity induced activation of the E2. This data ensures rapid diubiquitin formation that is followed by a CUE domain assisted chain elongation mechanism where Cue1 acts in an E4 like fashion.
How ubiquitin binding events can modulate the conformations of a ubiquitin chain were investigated by pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) spectroscopy combined with molecular modeling. This shows that K48-linked diubiquitin samples a broad conformational space which can be modulated in distinct ways. The CUE domain of Cue1 uses conformational selection of pre-populated open conformations to support ubiquitin chain elongation. In contrast, deubiquitinating enzymes shift the conformational distribution to weakly or even non-populated conformations to allow cleavage of the isopeptide bond that connects adjacent ubiquitins. Ubiquitin chain elongation increases the sampled conformational space and suggests that this high conformational flexibility might contribute to efficient proteasomal recognition.
Cytochrome c oxidases are among the most important and fundamental enzymes of life. Integrated into membranes they use four electrons from cytochrome c molecules to reduce molecular oxygen (dioxygen) to water. Their catalytic cycle has been considered to start with the oxidized form. Subsequent electron transfers lead to the E-state, the R-state (which binds oxygen), the P-state (with an already split dioxygen bond), the F-state and the O-state again. Here, we determined structures of up to 1.9 Å resolution of these intermediates by single particle cryo-EM. Our results suggest that in the O-state the active site contains a peroxide dianion and in the P-state possibly an intact dioxygen molecule, the F-state may contain a superoxide anion.
N6-methyladenosine (m6A) is the most abundant and well understood modification in eukaryotic mRNA and was first identified in polyadenylated parts of the mRNA.The distinct distribution of m6A in the transcriptome with special enrichment in long internal exons, 39UTRs and around stop codons was uncovered by early biochemical work and later on antibody based sequencing techniques. The so called m6A writer, reader and eraser machinery is responsible for the dynamic and with that regulatory nature of the m6A modification. As m6A writer, the human N6-methyltransferase complex (MTC) cotranscriptionally methylates the central adenine within a RRACH (preferably GGACU) sequence context to form m6A in the nascent RNA chain.9–15 The catalytic core of the complex is formed by the two proteins METTL3 and METTL14, with the active site located in the methyltransferase domain (MTD) of METTL3.16–18 The DPPW motif near the methyl donor S-adenosylmethionine (SAM) binding site in this MTD was postulated to bind the target adenine during catalysis. Moreover, a positively charged groove in the METTL3-METTL14 interface, the C-terminal RGG domain in METTL14 and the zinc finger motifs in METTL3 were identified as important domains for RNA binding. However, to date there are no full-length or substrate-RNA-bound structures of the catalytic METTL3-METTL14 complex.
In addition, a set of accessory proteins assembles to the METTL3-METTL14 heterodimer to form the full MTC, mediated by WTAP that firmly binds to the N-terminal leader helix in METTL3.20 WTAP was shown to locate the whole complex to the nuclear speckles and can modulate m6A deposition to specific sites in the RNA. Moreover, WTAP acts as binding platform for other accessory proteins including VIRMA, RBM15, ZC3H13 and HAKAI that are mostly identified to mediate position specific methylation. For example, RBM15 was shown to mediates region-selective methylation in a WTAP dependent manner, directing specificity towards U-rich sequences.
The observed specificity of the methyltransferase complex to methylate only site specific DRACH sequenced is still poorly understood. Some possible modulators like the role of the accessory proteins are under investigation, however, the structural context of the RNA methylation sites or a structural preference of the complex have been mainly neglected so far. Moreover, the structural dynamics of this methylation process still remain elusive. This thesis contributes to the afore-mentioned aspects by analysis of the methylation process regarding RNA structure sensitivity with enzymatic activity assays and its dynamic nature by implementing a smFRET approach.
We hypothesized the target RNA secondary structure to be an additional important modulator of methylation efficiency, based on the RNA binding elements of the complex (positively charged binding groove, zinc finger domain, RGG domain) and the supposed target adenine binding in the active site. Here, we postulated the possibility for a flipped-out adenine to be of special relevance, which is closely related to the local stability of the target adenine containing structure. Moreover, efficient binding of the protein complex to the RNA should require the ability to anchor the RNA on both sides of the target sequence.
Die vorliegende Dissertation mit dem Titel “Structural dynamics of eukaryotic H/ACA RNPs from Saccharomyces cerevisiae & Structural dynamics of the Guanidine-II riboswitch from Escherichia coli” besteht aus zwei Projekten. Das erste Projekt befasst sich mit den eukaryotischen H/ACA Ribonukleoproteinen (RNP) aus der Hefe. Diese können sequenzspezifisch in der RNA ein Uridin Nukleotid in das Rotationsisomer Pseudouridin (Ψ) umwandeln. Die H/ACA RNPs bestehen aus einer Leit-RNA und vier Proteinen, der katalytisch aktiven Pseudouridylase Cbf5, Nhp2, Gar1 und Nop10. Die Leit-RNA besteht in Eukaryoten konserviert aus zwei Haarnadelstrukturen, die von einem H-Box oder ACA-Box Sequenzmotiv gefolgt sind. In jeder dieser Haarnadeln befindet sich ein ungepaarter Bereich, die sogenannte Pseudouridylierungstasche, wo durch komplementäre Basenpaarung die Ziel-RNA gebunden wird. Fehlerhafte H/ACA RNPs können beim Menschen zu schweren Krankheiten wie verschiedenen Krebsarten oder dem Knochenmarksversagen Dyskeratosis congenita führen, aber sie bieten auch Möglichkeiten zum Einsatz als Therapiemethode. In dieser Arbeit wurde hauptsächlich der zweiteilige Aufbau der H/ACA RNPs untersucht.
Dafür wurden zunächst die einzelnen Komponenten hergestellt werden. Cbf5, Nop10 und Gar1 wurden zusammen heterolog in E. coli exprimiert und gereinigt. Außerdem wurden mehrere Deletionsvarianten von Gar1 hergestellt. Zusätzlich wurde die Leit-RNA unmarkiert über T7 Transkription synthetisiert, sowie sechs verschiedene FRET-Konstrukte mit verschiedenen Markierungschemas der Fluorophore Cy3 und Cy5 über DNA-geschiente Ligation. Anschließend wurde über Größenausschlusschromatographie und radioaktiven Aktivitätsassays geprüft, dass sich die aktiven H/ACA RNPs in vitro aus den einzelnen Komponenten rekonstituieren lassen.
In smFRET Experimenten wurden einzelne Haarnadelstrukturen mit dem zweiteiligen Komplexen verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die H3 Haarnadel durch die Anwesenheit von H5 dynamischer und heterogener wurde, während H5 überwiegend unbeeinflusst war. Außerdem konnte die dreidimensionale Orientierung der Haarnadelstrukturen in verschiedenen Assemblierungsschritten mittels smFRET untersucht werden. Hier deutete sich an, dass in Abwesenheit von Proteinen beide Haarnadeln eher entgegengesetzt stehen als in einer parallelen Konformation. Cbf5 scheint den Linker zwischen den Beiden auszustrecken bzw. zu orientieren und die Haarnadelstrukturen etwas gegeneinander zu neigen. Ein Zusammenspiel von Nhp2 und Gar1 war nötig um die oberen Bereiche der Haarnadeln zusammenzuziehen. Es konnte auch ein Modell für den vollen H/ACA RNP vorgeschlagen werden. Im kompletten Komplex könnte das Zusammenziehen der Haarnadelstrukturen durch Nhp2 und Gar1 mit dem Effekt von Cbf5 konkurrieren und könnte hauptsächlich den oberen Bereich von H3 betreffen. Zum Schluss wurde das Zusammenspiel von Gar1 und Nhp2 auf eine Abhängigkeit von den RGG Domänen von Gar1 hin untersucht. Hier besteht möglicherweise eine Hierarchie, die eine Kooperativität von den N- und C-terminalen Domänen benötigt.
Das zweite Projekt befasst sich mit dem Guanidin-II Riboschalter aus E. coli. Der Riboschalter kann das toxische Molekül Guanidinium (Gdm+) spezifisch in seiner Aptamerdomäne binden und dadurch die Genexpression von Proteinen zur Detoxifizierung von Gdm+ aktivieren. Der Riboschalter besteht aus zwei Haarnadelstrukturen, mit einer Schleife, die aus der Sequenz ACGR besteht, wobei R ein Purin ist. In einem vorgeschlagenen Modell soll die Ribosomenbindestelle (Shine-Dalgarno Sequenz) in Abwesenheit von Ligand mit dem Linker komplementär Basenpaaren und so die Translation verhindern. Mit Ligand würde sich dann eine Schleifen-Schleifen Interaktion mit den beiden CG Basen ausbilden, wodurch die Anti-Shine-Dalgarno Sequenz nicht mehr zugänglich wäre. Bisherige Studien arbeiteten zumeist nur mit der Aptamerdomäne, den einzelnen Haarnadeln oder noch kleineren Elementen. In dieser Arbeit wurden die Strukturdynamiken von verschiedenen Längen, auch mit der Expressionsplatform, untersucht. Außerdem wurden verschiedene Mutationen analysiert und die Effekte auf den Riboschalter in seiner natürlichen Umgebung in E. coli.
Zunächst mussten insgesamt 24 FRET-Konstrukte hergestellt werden, die sich in Länge, Markierungsschema und Mutationen unterschieden. Hierfür wurde DNA-geschiente Ligation verwendet. Dank der verschiedenen Fluorophorpositionen konnte ein konformationelles Modell für die Aptamerdomäne vorgeschlagen werden. In diesem Modell könnte in Abwesenheit von Ionen das Aptamer offen vorliegen. Durch Mg2+ würde sich bereits eine lockere Schleifen-Schleifen Interaktion ausbilden. Zusätzlich deuten die Ergebnisse auf eine neue Konformation hin, der stabilisierten Schleifen-Schleifen Interaktion, bei der der Linker zusätzlich mit den Haarnadelstrukturen interagiert, beispielswese mit den Purinen an der vierten Schleifenposition...
Electron microscopy (EM) demarcates itself from other structural biology techniques by its applicability to a large range of biological objects that spans from whole cells to individual macromolecules. In single-particle cryo-EM, frozen-hydrated samples, prepared by vitrification with liquid ethane, retain macromolecules in a medium that approximates their natural aqueous environment and that, in this way, preserves high-resolution structural information. Nonetheless, the sensitivity of biological specimens to the high-energy electron beam introduces restrictions on the total dose that can be used during imaging while avoiding significant radiation damage. Consequently, the signal-to-noise ratio attained in each individual image is very low, and structures with high-resolution detail must be recovered by averaging thousands of projections in random orientations. This is achieved through the use of image processing algorithms capable of aligning and classifying particle images through the evaluation of cross-correlation functions between each particle and a reference.
In recent years, several innovations took place in the field of single-particle cryo-EM, among which the development of direct electron detectors must be highlighted. Direct electron detectors have a better detective quantum efficiency (DQE) than both photographic film and CCD cameras, and offer a fast readout, compatible with the acquisition of movie stacks. Additionally, new image processing software has become available, with more sophisticated algorithms and designed to take advantage of the specific characteristics of the movies produced with direct electron detectors. These technological advances in both hardware and software catalyzed a revolution in single-particle cryo-EM, which is now routinely used for the determination of near-atomic structures. As a result, the range of macromolecules accessible to cryo-EM has increased drastically, as targets that were unsuitable before for imaging due to their small dimensions can now be adequately visualized and refined to high-resolution.
During my doctoral work, I have used single-particle cryo-EM to structurally characterize challenging membrane proteins, with a strong emphasis on protein complexes from aerobic respiratory chains. In chapter I of this thesis, I present my results on the bovine respirasome, a mitochondrial supercomplex composed of complexes I, III and IV. Chapter II is dedicated to the analysis of the structure of alternative complex III (ACIII) from Rhodothermus marinus, a bacterial quinol:cytochrome c/HiPIP oxidoreductase unrelated to the canonical cytochrome bc1 complex (complex III). In addition, in chapter III I describe the structure of KimA, a high-affinity potassium transporter that drives the transport of its substrate by using the energy stored in the form of a proton gradient. These three membrane proteins, with molecular weights ranging from 140 kDa to 1.7 MDa, illustrate the possibilities and limitations faced in single-particle cryo-EM.
The aerobic respiratory chain is responsible for the generation of a transmembrane difference of electrochemical potential that is then used by ATP synthase for the production of ATP or for driving solute transport over the membrane. They catalyze the transfer of electrons from a substrate, such as NADH or succinate, to molecular oxygen and use the chemical energy released in these redox reactions to drive the translocation of protons, or in some cases sodium ions, to the intermembrane space in mitochondria or the periplasm in bacteria.
In mitochondria, the respiratory chain is composed of four complexes: complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase), complex II (succinate dehydrogenase), complex III (cytochrome bc1 complex) and complex IV (cytochrome c oxidase). While it was for a long time believed that these complexes existed as single entities in the membrane, the use of milder procedures for protein purification and analysis revealed that respiratory complexes associate into well-ordered structures, known as supercomplexes. These have been proposed to offer different structural and functional advantages that are still controversial, including substrate channeling, stabilization of individual complexes and reduction of reactive oxygen species (ROS) production. The most thoroughly studied respiratory supercomplex has been the respirasome, conserved in higher eukaryotes and composed of one copy of complex I, a complex III dimer and one complex IV. By single-particle cryo-EM analysis, I retrieved a 9 Å map of the respirasome from Bos taurus, which allowed the accurate docking of atomic models of the three component complexes. The structure shows that complex III associates to the concave side of the membrane arm of complex I, while complex IV is located between the end of the complex I hydrophobic arm and complex III. Several defined protein-protein contacts are observed between the component complexes, which are mediated predominantly by supernumerary subunits and close to the membrane surfaces. The interactions established between complex I and complex III are extensive and may support the argument that the association of complex I into supercomplexes is required for the stabilization or even the biogenesis of this complex.
...
The focus of this thesis is the integral membrane protein Escherichia coli diacylglycerol kinase (DGK). It is located within the inner membrane, where it catalyzes the ATP-dependent phosphorylation of diacylglycerol (DAG) to phosphatic acid (PA). DGK is a unique enzyme, which does not share any sequence homology with typical kinases. In spite of its small size, it exhibits a notable complexity in structure and function. The aim of this thesis is the investigation of DGK’s structure and function at an atomic level directly within the native-like lipid bilayer using MAS NMR. This way, a deeper understanding of DGK’s catalytic mechanism should be obtained.
First, the preparation of DGK was optimized, leading to a sample, which provides well-resolved MAS NMR spectra. The high quality MAS NMR spectra formed the foundation for the second step, the resonance assignment of DGK’s backbone and side chains. The assignment was performed at high magnetic field (1H frequency 850 MHz). The sequential assignment of immobile domains was carried out using dipolar coupling based 3D experiments, NCACX, NCOCX and CONCA. The measurement time could be reduced by paramagnetic doping with Gd3+-DOTA in combination with an E-free probehead. The sequential assignment was mainly performed using a uniformly labelled sample (U-13C,15N-DGK). Residual ambiguities could be resolved by reverse labelling (U-13C,15N-DGK-I,L,V). Resonances could be assigned for 82% of the residues, from which 74% were completely assigned. For validation, ssFLYA was applied, which is a generally applicable algorithm for the automatic assignment of protein solid state NMR spectra. Its principal applicability for demanding systems as membrane proteins could be proven for the first time. Overall, ~90% of the manually obtained assignments could be confirmed by ssFLYA. For the completion of DGK’s assignment, J-coupling based 2D experiments, 1H-13C/15N HETCOR and 13C-13C TOBSY, were carried out to detect highly mobile residues. This way, residues of the two termini and the cytosolic loop, which were not detectable by dipolar coupling based experiments, could be assigned tentatively. Whereupon, peaks for arginine and lysine were assigned unambiguously to Arg9 and Lys12. Overall, ~84% of the residues could be assigned by the applied NMR strategy. Furthermore, a secondary structure analysis was carried out. It showed substantial similarities between wild-type DGK, its thermostable mutant determined both by MAS NMR and the crystal structure of wtDGK. However, there are few differences around the flexible regions most likely caused by the high mobility of these regions. During the assignment procedure, no systematic peak doublets or triplets were detected, indicating that the DGK trimer adopts a symmetric conformation. This is in contrast to the X-ray structure, which shows asymmetries between the three subunits. Especially, crystal packing may be a potential source for these structural asymmetries.
On the basis of the nearly complete assignment of DGK, the apo state was compared with the substrate bound states. Perturbations in peak position and intensity of the substrate bound states were analysed for all assigned residues in 3D and 2D spectra. The nucleotide-bound state was emulated by adenylylmethylenediphosphonate (AMP-PCP), a non-hydrolysable ATP analogue, whereas the DAG-bound state was mimicked by 1,2-dioctanoyl-sn-glycerol (DOG, chain length n = 8). Upon nucleotide binding, extensive chemical shift perturbations could be observed. These data provide evidence for a symmetric DGK trimer with all of its three active sites concurrently occupied. Additionally, it could be demonstrated that the nucleotide substrate induces a substantial conformational change. This most likely supports the enzyme in binding of the lipid substrate, indicating positive heteroallostery. In contrast, the overall alterations caused by DOG are very minor. They involve mainly changes in peak intensities. For DGK bound with either AMP-PCP+DOG or only AMP-PCP, a similar spectral fingerprint was observed. This implies that binding of the nucleotide seems to set the enzyme into a catalytic active state, triggering the actual phosphoryl transfer reaction.
The investigation of DGK’s remarkable stability and the cross-talk between its subunits forms the last part of this thesis. This demands for the identification of key intra- and interprotomer contacts, which are of structural or functional importance. For this purpose, 13C-13C DARR and 2D NCOCX spectra with long mixing times were recorded using high field MAS NMR. Additionally, DNP-enhanced 13C−15N TEDOR experiments were conducted on mixed labelled DGK trimers to enable the visualization of interprotomer contacts. With the applied NMR strategy, intra- (Arg32 - Trp25/ Glu28/ Ala29 and Trp112 - Ser61) and interprotomer (ArgNn,e - AspCg/ GluCd/ AsnCg) long-range interactions could be identified.
Proteostasis stressors that destabilize the cellular proteome, like heat shock, trigger transcription and translational reactions leading to the accumulation of heat shock proteins, also called molecular chaperones. During stress, induction of stress response genes is prioritized so that molecular chaperones and other stress response proteins are synthesized to cope with proteome misfolding and aggregation. In order to promote the selective translation of stress-specific genes, translation of others genes that are nonessential for cell survival has to stop. Nonessential protein-coding mRNAs accumulate in the cytosol with the associated proteins to form granular structures called stress granules (SG). These membrane-less organelles are thought to be involved in cell survival, mRNA stabilization and mRNA triage. They were proposed to form via the liquid-liquid phase separation which can be triggered by the high local concentration of RNA-binding proteins. mRNAs were long thought to simply play a scaffolding role by bringing RNA-binding proteins together and allowing their concentration and local aggregation. Recently, the active role of mRNAs in the SG assembly became apparent, too. For example, the spontaneous assembly of total yeast RNA into granules was observed, and these RNA granules showed a large overlap with SG transcriptome. Furthermore, cytosolic mRNAs can be released from polyribosomes under stress and be exposed to the cytosolic contents as free mRNAs. It has been suggested that this massive increase of free mRNA in the cytosol might overload the capacities of RNA-stabilizing proteins. The remaining free mRNA molecules would then become exposed to misfolded and aggregation-prone proteins and trigger granulation.
We investigated the role of free mRNAs in different stress conditions during the early and chronic phases of stress response and explored their involvement in SGs assembly and amlyoidogenesis. We identified and studied the interactome of a free mRNA probe incubated with heat shocked cell lysate by means of quantitative mass spectrometry. Proteomics analysis allowed us to identify 79 interactors of free mRNA. Among these interactors, we focused on the translation initiation factor eIF2α and on the RNA methyltransferase TRMT6/61A. Both interactions were verified biochemically, which confirmed that the association is enhanced in heat shocked lysate. In vitro reconstitution showed that free mRNA and TRMT6 interact directly. Ex vivo pulldowns revealed that eIF2α and TRMT6/61A interact under stress conditions and that this interaction is RNA-dependent.
TRMT6/61A is a tRNA methytransferase responsible for the methylation of the adenosine 58 at the position 1 producing m1A. However, also mRNAs have been recently found to be methylated by TRMT6/61A. Our bioinformatics analyses revealed that significantly more mRNAs enriched in SG contain the motif for methylation than SG-depleted mRNAs. We hypothesized that m1A methylation of mRNAs could constitute a tag for the mRNAs targeting to SGs. TRMT61A knock-down (KD) cell lines were generated using the CRISPR-Cas9 technique. In TRMT61A KD cells, m1A was significantly reduced on mRNAs, which correlated with an increased sensitivity of the cells to proteostasis stress. KD cells also showed defects in SG assembly. In heat shocked cells, an m1A motif-containing mRNA recovered better after returning to normal temperature than a control mRNA with mutated motif. In addition, we could isolate SGs and analyze their m1A and m6A content by mass spectrometry. While m6A content in SG mRNAs was very similar to cytosolic mRNAs, m1A was almost 8 times enriched in SGs. Thus, we could confirm experimentally the results of the bioinformatics analysis and directly support the hypothesis that m1A is a tag to direct mRNAs for sequestration. Finally, we compared amyloidogenesis in wild-type and TRMT61A KD cell lines. Cells with reduced levels of TRMT61A demonstrated an increased accumulation of transfected Aβ and an impaired aggregate clearance. Various assays led us to conclude that the lack of m1A deposition on mRNAs enhanced RNA co-aggregation with amyloids.
Based on our results, we propose a model explaining the fate of free mRNA during proteostasis stress. Upon polysome disassembly, free mRNA is released and becomes free to interact with other proteins, including the methyltransferase TRMT6/61A. TRMT6/61A methylates the freed mRNAs containing the cognate motif. The m1A tag then targets mRNAs to SGs promoting sequestration. Upon stress release, SGs disassemble, thus releasing rescued mRNAs which could now reenter translation and support cell recovery. On the other hand, non-sequestered mRNAs increasingly co-aggregate with aggregating proteins. Thus, deficiency of the N1-adenine methylation of mRNAs due to the lack of TRMT6/61A increases the amount of unpacked mRNAs. The deposition of m1A on mRNAs could then be a way to protect them during exposure to stress, to limit their co-aggregation with misfolded proteins and to allow a faster recovery upon stress release.
In der vorgelegten kumulativen Arbeit wurden strukturelle und funktionale Untersuchungen an Nukleinsäuren durchgeführt, hauptsächlich, aber nicht ausschließlich unter Verwendung von NMR-Spektroskopie (Kernspin Resonanzspektroskopie) als Analysemethode. Die untersuchten Biomoleküle umfassten kleinere und größere biologisch relevante RNAs sowie einen artifiziellen DNA G-Quadruplex. Hierbei konnten Ergebnisse im Bereich der Bestimmung der molekularen Struktur, der Aufklärung der biologischen Funktion und der Wirkstoffentwicklung gewonnen werden, die in sechs verschiedenen Publikationen dargelegt sind, an deren Erstellung der Autor maßgeblich oder hauptverantwortlich beteiligt war. Des Weiteren wird in einem mehrgliedrigen Einleitungssegment auf den Stand der aktuellen Forschung in den jeweiligen Teilgebieten eingegangen.
Membrane proteins are a diverse group of proteins that serve a multitude of purposes with one of the most important ones being transport. All kinds of substrates are shuffled over biological membranes with the help of dedicated proteins enabling the transport along and against a concentration gradient. Within the group of actively transporting proteins a diverse set of proteins that rely on an electrochemical gradient to facilitate transport of a substrate against its concentration gradient can be found. Those so-called secondary active
transporters are a group on integral membrane proteins ubiquitous to all cells. They allow the transport of all kinds of substrates like nutrients, ions, other metabolites and drugs over the hydrophobic barrier created by the cellular and organellar membrane. The gradients that provide the main driving force for most of the transporters are either sodium ions or protons, although transporters utilizing other ions or organic compounds are found as well. In case of exchangers two very similar substrates are transported in opposing direction over the membrane, one against its electrochemical gradient driven by the other.
Along with a structural diversity of the transporters concerning overall shape, oligomerization and number of transmembrane elements comes a mechanistic variety though still following the principle of alternating access. In humans the malfunction of secondary active transporters can lead to a physiological disorders such as epilepsy, depression or obesity.
The focus of this thesis was the structural and functional characterization of the secondary active transporter SeCitS from Salmonella enterica, a symporter of the 2-hydroxycarboxylate family. The transport of citrate as a bivalent ion is facilitated by the flux of sodium ions that have an inward-facing gradient over the inner membrane of Salmonella enterica. Transport experiments showed that the transport ratio is two sodium ions per citrate molecule, netting in an electroneutral transport. Compared to other members of the family the specificity of the transporter towards its main substrate is very high.
Structural information on the protein was initially obtained through 2D electron crystallography, which allowed the identification of the oval shaped dimer and a first hint towards a significant conformational change that the protein undergoes during its transport cycle. Using 3D crystallography, the X-ray structure of the transporter was solved. The protein crystalizes as a stable, but conformationally asymmetric dimer. As bound citrate can be readily identified in both protomers they can be assigned into an outward- and an inward-facing conformation, with the main citrate binding site in the outward-facing conformation.
One interesting feature of the crystal structure was the large surface available for multimerization, providing a platform for tight dimerization of the two protomers. On the other hand, SeCitS did not show a true cooperativity of transport. With those two aspects taken into account the question arose if any potential crosstalk between the monomers within the dimer takes place and influences transport (negative cooperativity) or the conformational distribution within the dimer (stabilization of the protein within the membrane).
The functional approach in answering this question was the use of mutated variants of the protein for cross-linking within one monomer. Two residues were chosen respectively to lock one of either conformation to be able to test for transport activity in the remaining protomer. The suitability of the residues was derived from the crystal structure (D112 – R205 to lock the inward-facing conformation and L337 – S412 for the outward-facing conformation). After initial promising results the final variants were not stable enough to be analyzed in transport assays.
To analyze the distribution of relative conformations within the dimer the protein was reconstituted into native-like lipid environment such as nanodiscs or saposin nanoparticles to be analyzed by cryo-electron microscopy. The first images were recorded and did yield promising 2D classes where the general features of the transporter were identified. Yet, an improved preparation is required to obtain a high resolution structure.
The key functional aspects of a transporter are its ability to bind and transport its substrates. In a set of experiments those features were investigated by a radioligand transport assay and by isothermal titration calorimetry (ITC). The transport properties of the protein were assessed in a filter assay using a radioactively labeled citrate as a read-out. The protein was reconstituted into proteoliposomes and subjected to different substrate conditions. Different ions were tested in its ability to drive or inhibit transport, but only sodium ions were able to drive transport and also not hindered by the presence of other ions...
The electron transport chain (ETC) is used by cells to create an electrochemical proton gradient which can be used by the ATP synthase to produce ATP. ETC, also called respiratory chain, is formed in mitochondria by four complexes (complex I-IV) and mediated by two electron carriers: cytochrome c and ubiquinone. Electrons are passed from one complex to another in a series of redox reactions coupling proton pumping from the negative (N) side of the membrane to the positive (P) side. Complex I can introduce electrons into the ETC by oxidizing NADH to NAD+ and reducing quinone (Q) to quinol (QH2). The process accomplishes pumping of four protons across the membrane. Complex II is another electrons entry point. It catalyzes the oxidation of succinate to fumarate while reducing Q to QH2. Complex III, also called cytochrome bc1 complex, can transfer the electrons from QH2 to cytochrome c and couple to proton pumping. In complex III the Q-cycle contributes four proton translocations: two protons are required for the reduction of one quinone to a quinol and two protons are released to the P side. Complex IV (cytochrome c oxidase), the terminal complex of the ETC, catalyzes the electron transfer to oxygen and pumps four protons to the P side. Structures of ETC complexes are available. However, the structure of a hyperthermophilic cytochrome bc1 complex has not been elucidated till now. Additionally, the dimeric crystal structure of cytochrome c oxidase from bovine has been discussed controversially.
To build up a functional complex, cofactors are required. The active site of A- and B-type cytochrome c oxidases contain the high spin heme a which is synthesized by the integral membrane protein heme A synthase (HAS). HAS can form homooligomeric complexes and its oligomerization is essential for the biological function of HAS. HAS is evolutionarily conserved among prokaryotes and eukaryotes. Despite its importance, little is known about the detailed structural properties of HAS oligomers.
During my PhD studies, I focused on the cytochrome c oxidase (AaCcO), the cytochrome bc1 complex (Aabc1) and the heme A synthase (AaHAS) from Aquifex aeolicus. This organism is one of the most hyperthermophilic ones and can live at extremely high temperatures, even up to 95 °C. Respiratory chain complexes provide energy for the metabolism of organisms, and their structures have been studied extensively in the past few years. However, there has been a lack of atomic structures of complexes from hyperthermophilic and ancient bacteria, so little is known about the mechanism of these macromolecular machines under hyperthermophilic conditions. Therefore, my PhD studies had four main objectives: 1) to structurally and functionally characterize AaCcO, 2) to reveal the mechanism of Aabc1 thermal stability based on its structure, 3) to determine the oligomerization of AaHAS, 4) to provide valuable insights into the relationship between function and oligomerization of AaHAS.
1) Structure of AaCcO
Heme-copper oxidases (HCOs) catalyze the oxygen reduction reaction being the terminal enzymes in the plasma membranes in many prokaryotes or of the aerobic respiratory chain in the inner mitochondrial membrane. By coupling this exothermic reaction to proton pumping across the membrane to the P side, they contribute to the establishment of an electrochemical proton gradient. The energy in the proton electrochemical proton gradient is used by the ATP synthase to generate ATP. HCOs are classified into three major families: A, B and C, based on phylogenetic comparisons. The well-studied aa3-type cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans (P. denitrificans) represents A-family HCOs. So far, the only available structure of the ba3-type cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus represents the B-family of HCOs. This family contains a number of bacterial and archaeal oxidases. The C-family contains only cbb3-type cytochrome c oxidases.
The AaCcO is one of the ba3-type cytochrome c oxidases. Based on the genomic DNA sequence analysis, it has been revealed that A. aeolicus possesses two operons coding for cytochrome c oxidases (two different subunit I genes, two different subunit II genes and one subunit III gene). So far, only subunits CoxB2 and CoxA2 were identified. The presence of the additional subunit IIa was reported in 2012. Moreover, a previous paper reported that AaCcO can use horse heart cytochrome c and decylubiquinol as electron donors and the typical cytochrome c oxidase inhibitor cyanide does not block the reaction completely.
In the course of my PhD studies, I performed heterologous expression of AaCcO in Pseudomonas stutzeri (P. stutzeri) and co-expression with AsHAS in Escherichia coli, respectively. The subcomplex CoxA2 and CoxB2 can be purified from P. stutzeri, however, it lacks heme A. Additionally, a protocol for the heterologous production of cytochrome c555 from A. aeolicus was established. In parallel, I also purified the AaCcO from native membranes according to previously reported methods with some modifications. The activity of AaCcO with its native substrate, cytochrome c555, was 14 times higher than with horse heart cytochrome c.
To enable a detailed investigation and comparison of AaCcO and other cytochrome c oxidases, the cryo-EM structure of AaCcO was determined to 3.4 Å resolution. It shows that the three subunits CoxA2, CoxB2, and IIa are tightly bound together to form a dimer in the membrane. Surprisingly, CoxA2 contains two additional TMHs (TMH13 and TMH14) to enhance the protein stability. The cofactors heme a3, heme b, CuA and CuB are also identified. Interestingly, two molecules of 1,4-naphthoquinone and cardiolipin were observed in the dimer interface. Based on the structure analysis, the AaCcO possesses only the K-pathway for proton delivery to the active site and proton pumping.
...
The members of the multidrug/oligosaccharidyl-lipid/polysaccharide (MOP) transporter superfamily mediate export of a wealth of molecules of physiological and pharmacological importance. According to the Transporter Classification Database (TCDB), the MOP superfamily is mainly categorized into six distantly related families functionally characterized families: the multidrug and toxic compound extrusion (MATE), the polysaccharide transporter (PST), the oligosaccharidyl-lipid flippase (OLF), the mouse virulence factor (MVF) the agrocin 84 antibiotic exporter (AgnG), and the progressive ankylosis (Ank) family. Among these, the multidrug resistance MATE family transporters are most ubiquitous, being present in all domains of life: Archaea, Bacteria and Eukarya. As secondary active transporters, they utilize transmembrane electrochemical ion gradients of Na+ and/or H+ in order to drive the efflux of xenobiotics or cytotoxic metabolic waste products with specificity mainly for polyaromatic and cationic substrates. Active efflux of drugs and toxic compounds carried out by multidrug transporters is one of the strategies developed by bacterial pathogens to confer multidrug resistance. MATE proteins provide resistance to, e.g., fluoroquinolone, aminoglycoside antibiotics, and anticancer chemotherapeutical agents, thus serving as promising pharmacological targets for tackling a severe global health issue. Based on their amino acid sequence similarity, the MATE family members are classified into the NorM, the DNA-damage-inducible protein F (DinF), and the eukaryotic subfamilies. Structural information on the alternate conformational states and knowledge of the detailed mechanism of the MATE transport are of great importance for the structure-aided drug design. Over the past decade, the crystal structures of representative members of the NorM, DinF and eukaryotic subfamilies have been presented. They all share similar overall architecture comprising 12 transmembrane helices (TMs) divided into two domains, the N-terminal domain (TMs 1-6) and the C-terminal domain (TMs 7-12), connected by a cytoplasmic loop between TM6 and TM7 (Fig. II.1). Since all available MATE family structures are known only in V-shaped outward-facing states with the central binding cavity open towards the extracellular side, a detailed understanding of the complete transport cycle has remained elusive. In order to elucidate the underlying steps of the MATE transport mechanism, structures of distinct intermediates, particularly inward-facing conformation, are required.In my PhD project, structural and functional studies have been performed on a MATE family (DinF subfamily) transporter, PfMATE, from the hyperthermophilic and anaerobic archaeon Pyrococcus furiosus. This protein was produced homologously in Pyrococcus furiosus as well as heterologously in Escherichia coli, and used for the subsequent purification and crystallization trials by the vapor diffusion (VD) and lipidic cubic phase (LCP) method. To the best of my knowledge, PfMATE is the first example of a successful homologous production of a membrane protein in P. furiosus. Due to the very low final amount of the purified protein from the native source, the heterologously produced PfMATE samples were typically used for the extensive structural studies. Crystal structures of PfMATE have been previously determined in an outward-facing conformation in two distinct states (bent and straight) defined on the arrangement of TM1. A pH dependent conformational transition of this helix regulated by the protonation state of the conserved aspartate residue Asp41 was proposed. However, it has been discussed controversially, leading to the hypothesis about TM1 bending to be rather affected by interactions with exogenous lipids (monoolein) present under the crystallization conditions. Based on these open questions, an experimental approach to investigate the role of lipids as structural and functional modulators of PfMATE has been taken in the course of my PhD project. The interplay between membrane proteins and lipids can affect membrane protein topology, structure and function. Considering differences between archaeal and bacterial lipid composition, cultivation of P. furiosus cells and extraction of its lipids was followed by the mass spectrometry (MS) based lipidomics for identification of individual lipid species in the archaeal extract. In order to assess the effects of lipids on PfMATE, different lipid molecules were used for co-purification and co-crystallization trials. This dissertation presents a workflow leading to the structure determination of a MATE transporter in the long sought-after inward-facing state, which has been achieved upon purification and crystallization of the heterologously produced PfMATE in the presence of lipids from its native source P. furiosus. Also, the PfMATE outward-facing state obtained from the crystals grown at the acidic pH conditions sheds light on the previously proposed pH-dependent structural alterations within TM1. It is interesting to note that the inward and outward-facing states of PfMATE were obtained from the crystals grown under similar conditions, but in the presence and absence of native lipids, respectively. This observation supports the hypothesis about physiologically relevant lipids to act as conformational modulators or/and a new class of substrates, expanding the substrate spectrum of the MATE family transporters. Comparative analysis of two PfMATE states reveals that transition from the outward to the inward-facing state involves rigid body movements of TMs 2-6 and 8-12 to form an inverted V, facilitated by a loose binding of TMs 1 and 7 to their respective bundles and their conformational flexibility. Local fluctuations within TM1 in the inward-facing structure, including bending and unwinding in the intracellular half of the helix, invoke its highly flexible nature, which is suitable for ion and substrate gating.
...
The health status of every nucleated cell in the human body is monitored through peptides presented by major histocompatibility complex class I (MHC I) to T-cell receptors of CD8+ T-cells. Thereby, the adaptive immune system ensures the recognition and elimination of infected or cancerous cells. MHC I molecules comprise the polymorphic heavy chain (hc) and the light chain β2-microglobulin (β2m). More than 13,000 allomorphs of the MHC I hc have been identified. All MHC I hcs associate with β2m but differ in their binding preferences for peptides, ensuring the presentation of a large peptide pool. After maturation of MHC I hc/β2m heterodimers in the endoplasmic reticulum (ER), most of the peptide-deficient MHC I molecules are recruited to the peptide-loading complex (PLC). There, they go through peptide loading and editing before they are released as stable peptide-MHC I (pMHC I) complexes and traffic to the cell surface for antigen presentation.
During the stringent quality control of MHC I peptide loading and editing within the PLC, the chaperone tapasin in conjunction with the oxidoreductase ERp57 stabilizes peptide-receptive MHC I molecules and alters the peptide cargo for high immunogenicity by catalyzing peptide-exchange. The tapasin-homologue TAP-binding protein related (TAPBPR) is involved in downstream quality control, editing the peptide repertoire of MHC I molecules that slipped through peptide proofreading by tapasin. Both chaperones were shown to adopt similar binding-modes for MHC I, suggesting related mechanisms of peptide editing. Nevertheless, the MHC I specific chaperones operate in different subcellular locations with differing assistance. While TAPBPR mediates peptide-exchange solely in the peptide-poor environment of the cis-Golgi and ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC), tapasin functions mainly within the PLC together with ERp57 and the lectin-like chaperone calreticulin. Calreticulin with its lectin-, arm- and C-terminal domain contacts the MHC I heterodimer, ERp57 and the C-terminal domain of tapasin, respectively. Notably, the interaction site between calreticulin and tapasin has not yet been elucidated experimentally at molecular detail. The depletion of tapasin leads to a compromised immune response and a change in the pool of peptide cargo. The numerous MHC I allomorphs vary in their plasticity and their dependence on tapasin for the loading of optimal peptides. Moreover, the conformational plasticity of MHC I correlates with their dependence on tapasin. However, the molecular basis on how tapasin edits the various MHC I allomorphs and the structural features that are essential for peptide exchange catalysis at atomic resolution remained elusive.
In the first part of this thesis, the trimeric complex of tapasin–ERp57/calreticulin was analyzed. To this end, laser induced liquid bead ionization mass spectrometry (LILBID-MS) was performed as part of a collaboration and revealed the trimeric assembly for tapasin–ERp57 and calreticulin. Furthermore, additional to a wildtype construct of calreticulin, a second construct, lacking the acidic helix of calreticulin that was found to come to close contact with tapasin, was utilized for isothermal titration calorimetry (ITC). A micromolar affinity of wildtype calreticulin to tapasin–ERp57 was determined. Previous biochemical and NMR studies utilizing the P-domain of calreticulin and solely ERp57 provided a micromolar affinity for the complex of calreticulin and ERp57. In this study, no interaction of calreticulin lacking the acidic helix with tapasin–ERp57 could be measured by ITC. However, these results undergo with findings that calreticulin lacking the acidic helix impairs the function of the PLC. Most likely, the negatively charged acidic helix is located in a groove of tapasin, carrying a more positive charge. Taken together, the functional data demonstrates the importance of the acidic helix of calreticulin for assembly of the trimeric subunit of calreticulin/tapasin–ERp57.
In the main part of this study an MHC I–tapasin–ERp57 complex was structurally analyzed. Therefore, a photo-triggered approach was chosen to assemble the transient complex of MHC I–tapasin–ERp57. Various allomorphs were screened for complex formation with the tapasin–ERp57 heterodimer after photocleavage by size exclusion chromatography (SEC), resulting in mouse MHC I H2-Db as the suited allomorph. Microseed matrix screening was performed. Crystals diffracting X-rays to a resolution of 2.7 Å were obtained showing one tetrameric tapasin–ERp57–MHC I complex per asymmetric unit.
The MHC I-chaperone structure shows molecular rearrangements upon MHC I engagement and unveils structural features of tapasin, involved in peptide-exchange catalysis...
Im Rahmen dieser vorliegenden Thesis wurden verschiedene photosensitive Systeme anhand statischer und zeitaufgelöster optischer Spektroskopiemethoden charakterisiert. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag in der Entwicklung und Untersuchung neuer Quantenpunkt-basierter Hybridsysteme. Es war möglich die optischen Eigenschaften der Quantenpunkte über Optimierung der Syntheseschritte zu variieren und so auf geplante Projekte anzupassen.
Im Projekt „Quantenpunkte als Zwei-Photonen Antenne“ sollten die hohen Zwei-Photonen Einfangquerschnitte von Quantenpunkten ausgenutzt werden um in Kombination mit einer photolabilen Schutzgruppe, ein Uncaging im NIR-Bereich zu realisieren. Es wurden ZnSe/ZnS Partikel synthetisiert, die eine starke Emission im Bereich der Absorption der Schutzgruppe zeigen. Anhand von zeitaufgelösten transienten Absorptionsexperimenten mit einer Anregungswellenlänge bei 775 nm wurde eine Zwei-Photonen Absorption der Partikel nachgewiesen. Jedoch wurden starke Emissionsbeiträge aus Fallenzuständen und eine geringe Stabilität beobachtet. Die Synthese von CdS/ZnS Quantenpunkten lieferte stabile Partikel mit geringer trap state Emission. Diese Partikel wurden in einem Modellhybridsystem als Energiedonoren eingesetzt. Als Akzeptor wurde der Farbstoff Cumarin343 gewählt. In statischen Absorptions- und Emissionsmessungen, zeitkorrelierten Einzelphotonenmessungen sowie in fs-zeitaufgelösten transiente Absorptionsmessungen konnte ein ultraschneller Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung des Hybridsystems beobachtet werden. Über TPiF Messungen wurde die Zwei-Photonen Absorption der Quantenpunkte detektiert. Ein Energietransfer nach Zwei-Photonen Anregung der Quantenpunkte wurde beobachtet. Schließlich wurde ein Hybridsystem aus CdS/ZnS und der photolabilen Schutzgruppe Az-NDBF (Synthese im AK Heckel, Goethe Universität, Frankfurt a. M.) untersucht. Auch in diesem System wurde ein Energietransfer von Quantenpunkt auf die Schutzgruppe nach Ein- und Zwei-Photonen Anregung beobachtet. Anhand von TA Experimenten wurde eine Zeitkonstante von <100 ps für den Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung ermittelt. Es konnte anhand der vorgestellten Resultate gezeigt werden, dass sich Quantenpunkte, aufgrund der guten Anpassung ihrer optischen Eigenschaften generell sehr gut als Antennen für organische Verbindungen eigenen.
Des Weiteren wurde ein Hybridsystem aus CdSe/ZnS Quantenpunkten und einer Dyade (Verbindung eines DTE Photoschalters und BODIPY Derivats), entworfen und charakterisiert. Ein ultraschneller EET von BODIPY auf den geschlossenen DTE Schalter wurde in vorangegangenen Studien beobachtet. Dieser EET führte zur Löschung der BODIPY-Emission. Sobald der Photoschalter im offenen Zustand vorliegt, findet aufgrund des fehlenden spektralen Überlapps kein EET statt und es wird die BODIPY-Emission detektiert. Die Erweiterung der Dyade um einen Quantenpunkt zeigte nach Anregung des Quantenpunkts dessen Fluoreszenzlöschung. Da die Emissionsbande der Quantenpunkte im Absorptionsbereich des BODIPY Farbstoffes liegt, konnte über statische und zeitaufgelöste Experimente ein ultraschneller EET von CdS/ZnS auf den Farbstoff ermittelt werden. Dies führte zu der Erweiterung des Anregungsspektrums des BODIPY Farbstoffs. Die Kopplung der Dyade an die Quantenpunktoberfläche lieferte eine Verbindung mit dem breiten Anregungsspekrum des Quantenpunkts und der schaltbaren Fluoreszenz der Dyade.
Das Hybridsystem aus CdSe Quantenpunkten und PDI zeigte vom Verhältnis der Quantenpunkte zu gekoppelten PDI Molekülen abhängige Fluoreszenzsignale. In TA Experimenten wurde ein ultraschneller EET ermittelt. Für hohe PDI Konzentrationen wurde ein weiterer EET von höher angeregten Elektronen auf das PDI identifiziert. Neben der EET Charakterisierung konnte ein zusätzlicher Prozess innerhalb des Hybridsystems mit hoher PDI Konzentration beobachtet werden. Auf den EET von Quantenpunkt auf PDI folgt ein ET aus dem Valenzband des Quantenpunkts in das HOMO des PDI*. In vorangegangene Arbeiten zu Hybridsystemen aus CdSe/ZnS und PDI wurde kein ET beobachtet. In dem beschriebenen Projekt konnte der Einfluss einer passivierenden Schale auf die elektronischen Eigenschaften von CdSe Quantenpunkten gezeigt werden.
Im letzten Teil dieser Thesis wurde die spektroskopische Charakterisierung einer NVOC und zweier NDBF Schutzgruppen beschrieben. Es konnten anhand statischer Absorptionsmessungen eine Freisetzungsquantenausbeute für NVOC-Adenin von 1,1 % ermittelt werden. Die Charakterisierung der Schutzgruppen mit einer NDBF Grundstruktur (DMA-NDBF und Az-NDBF) ergab eine Abhängigkeit der Freisetzungs- und Fluoreszenzausbeute von der Polarität des Lösungsmittels. In polarer Umgebung reduzierten sich die Quantenausbeuten deutlich...
Die Steuerung biochemischer Prozesse oder die Verbesserung von Materialien erfordert zunächst ein tiefgründiges Verständnis über die zugrundeliegenden Systeme. Zur Untersuchung eignet sich Licht als ideales Werkzeug, da hiermit nützliche Informationen über die chemische Struktur, ihre Eigenschaften sowie den zusammenhängenden, schnellen Reaktionsabläufen erhalten werden können. Um die Aufklärung zu erleichtern können kleine, chemische Verbindungen eingeführt werden, welche beispielsweise ein Fluoreszenzmarker, eine photolabile Schutzgruppe oder eine photoschaltbare Verbindung sein können. Von jeweils einem Vertreter dieser Moleküle wurden unterschiedliche Studien durchgeführt, dessen Ergebnisse in dieser Arbeit in insgesamt drei Projekten zusammengefasst werden.
Zunächst wurde die Funktionalität der Helikase RhlB untersucht, die der Familie der DEAD-Box Proteine zugeordnet wird, und RNA-Duplexe in ihre Einzelstränge entwindet. Als RNA-Modellduplex diente JM2h, an dem ein RNA-Einzelstrang fluoreszenzmarkiert war (M2AP6). Die Einführung dieses Markers ermöglichte die Durchführung von statischen Fluoreszenzmessungen sowie von Mischexperimenten, die mit Hilfe der stopped-flow-Technik durchgeführt wurden. In den einleitenden Studien wurde die Helikase weggelassen, wodurch der Fokus auf den Fluoreszenzeigenschaften der RNA gelegt wurde. Die Ergebnisse hierzu zeigten, dass die Fluoreszenzintensität des Einzelstrangs durch Zugabe des komplementären Strangs deutlich abnimmt, wobei das Minimum bei einem äquimolaren Verhältnis erreicht wird. Die dazugehörigen stopped-flow-Messungen zeigten eine Beschleunigung der Hybridisierungsreaktion, wenn höhere Konzentrationen des Gegenstrangs in der Lösung vorhanden waren. Nach anschließender Zugabe der Helikase zur Lösung wurde ein Anstieg der Fluoreszenzintensität erwartet, der vom separierten Einzelstrang M2AP6 herrühren sollte. Dieser Anstieg wurde jedoch erst nach weiterer Zugabe von ATP beobachtet, der auf eine ATP-Abhängigkeit der Entwindungsreaktion von RhlB hindeutet. Diese Abhängigkeit wurde auch bereits für andere Helikasen der DEAD-Box Familie entdeckt. Die korrekte Funktionalität sowie die ATP-Abhängigkeit wurden in stopped-flow-Messungen verfiziert, bei denen der Fluoreszenzanstieg auch zeitaufgelöst betrachtet werden konnte. Für die spektralen Korrekturen der Fluoreszenzspektren wurde ein selbstgeschriebenes MATLAB-Programm namens FluCY verwendet (engl.: Fluorescence Correction & Quantum yield), welches eine schnelle und fehlerfreie Verarbeitung des Datensatzes ermöglichte.
Die zwei im folgenden beschriebenen Projekte handeln von photoaktivierbaren Molekülen. Zum einen photolabile Verbindungen, welche die Funktion z.B. eines Biomoleküls durch eine chemische Modifikation deaktivieren können. Durch eine lichtinduzierte Reaktion kommt es zur Abspaltung der Modifikation und die Funktion ist wiederhergestellt. In dieser Arbeit wurden verschiedene photolabile Schutzgruppen untersucht, die denselben Chromophor BIST (BIsStyryl-Thiophen) tragen. Durch die Einführung dieses Chromophors absorbierten sämtliche untersuchte Verbindungen sehr effizient sichtbares Licht (epsilon(445)=55.700 M^(-1) cm^(-1)), wodurch der photoinduzierte Bindungsbruch mit Wellenlängen durchgeführt werden, die bei einer biologischen Anwendungen keinen Schaden an der Zelle anrichten würden. Hieraufhin wurden in statischen und zeitaufgelösten Absorptionsmessungen Teilschritte der Freisetzungsreaktion untersucht, indem nach Photoanregung die Absorptionsänderungen auf verschiedenen Zeitskalen analysiert wurden. Die ultraschnelle Dynamik im Piko- bis Nanosekundenbereich (10^(-12)-10^(-9) s) wird durch eine spektral breite, positive Absorptionsänderng dominiert. Diese impliziert, dass die Deaktivierung über den Triplettpfad abläuft, der die vergleichsweise niedrigen Freisetzungsausbeuten erklärt (phi(u) < 5). Aufgrund des hohen Extinktionskoeffizienten reichen dennoch bereits niedrige Strahlungsdosen aus, um eine Freisetzung zu initiieren. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieser Reaktion ist dem Zerfall des aci-nitro Intermediats zugeordnet. Für ein sekundäres Amin, welches mit BIST geschützt wurde, ist eine Lebensdauer des Intermediats von 71 µs gefunden worden.
In einigen Fällen ist es erwünscht, eine vorliegende Aktivität nicht nur ein-, sondern auch ausschalten zu können, wofür photochrome Verbindungen (oder Photoschalter) verwendet werden. Die in dieser Arbeit untersuchte Verbindung ceCAM ist ein Alken-Photoschalter und vollführt bei Bestrahlung mit Licht eine cis/trans-Isomerisierung. ceCAM ist das Cyanoester-Derivat (ce) von Cumarin-substituierten Allylidenmalonat, von denen beide Konformere sehr effizient sichtbares Licht absorbieren trans: epsilon(489)=50.300 M^(-1) cm^(-1); cis: epsilon(437)=18.600 M^(-1) cm^(-1)). Andere photophysikalische Eigenschaften umfassen u.a. hohe thermische und photochemische Stabilität. Letztere wurde über ein Experiment nachgewiesen, bei dem die lichtinduzierte Isomerisierung alternierend durchgeführt wurde und selbst bei über 250 Zyklen keine signifikate Abnahme der Absorption beobachtet werden konnte. Des Weiteren konnte die Reaktion mit Quantenausbeuten von 39% (trans) und 42% (cis) induziert werden, wobei im photostationären Gleichgewicht auch hohe Isomerenverhältnisse mit bis zu 80% (trans) und 96% (cis) akkumuliert werden konnten. Die Geschwindigkeit der Reaktion wurde mit Hilfe der Ultakurzzeit-Spektroskopie untersucht. Die Dynamik im Zeitbereich von ps-ns zeigte, dass die trans/cis-Isomerisierung unterhalb von 0,5 ns und die umgekehrte Reaktion noch viel schneller (wenige ps) abgeschlossen ist. Durch die Untersuchungen in dieser Arbeit an den BIST-Verbindungen und ceCAM sind viele vorteilhafte, photophysikalische Eigenschaften charakterisiert worden, wodurch sie als verbesserte Alternative zu den bisher bekannten photolabilen Schutzgruppen oder Photoschaltern anzusehen sind.
Ein Hauptziel dieser Arbeit war die spektroskopische Charakterisierung einer neuartigen photolabilen Schutzgruppe (Photocage). Diese besteht aus dem weitverbreiteten (7-Diethylaminocumarin)methyl (DEACM), welches zusätzlich mit einer Art Antenne (ATTO 390) ausgestattet ist. Letztere soll die Zwei-Photonen-Absorption (2PA) erleichtern, was neben dem Energietransfer von der Antenne zur photolabilen Schutzgruppe sowie die Freisetzungsreaktion eines gebundenen Effektormoleküls untersucht wurde. Der Nachweis der erhöhten 2PA wurde durch Zwei-Photonen-induzierte Fluoreszenz erbracht, welche die Bestimmung des Zwei-Photonen-Einfangquerschnitts ermöglicht. Die 2PA wurde durch Messungen mit variierender Anregungsenergie an Rhodamin B und dem neuartigen Antennen-Photocage-System bestätigt, welche eine fast perfekte quadratische Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität nach vorangegangener 2PA widerspiegelten. Die Werte des Zwei-Photonen-Einfangquerschnitts der neuartigen photolabilen Schutzgruppe sind über alle Wellenlängen hinweg größer als die von DEACM-OH. Der Beweis eines intramolekularen Energietransfers von der Antenne zu DEACM erfolgte durch transiente Absorptionsspektroskopie. Hierfür wurde der Photocage mit 365nm angeregt, was überwiegend die Antenne adressiert. Ein intramolekularer Energietransfer konnte mit einer Zeitkonstante von 20 ps beobachtet werden, welcher wahrscheinlich von einem nachgelagerten Ladungstransfer von DEACM auf ATTO 390 begleitet wurde. Die Funktionalität des neuartigen Photocages wurde durch Aufnahme von Absorptionsspektren im IR-Bereich während kontinuierlicher Belichtung bei 365 nm untersucht. Hierbei konnte die Entstehung der intensiven Absorption von Kohlendioxid aufgrund der Photodecarboxylierung detektiert werden. Absorptionsänderungen während kontinuierlicher Belichtung wurden ebenfalls im UV/Vis-Bereich detektiert, in welchen eine hypsochrome Verschiebung der langwelligen Absorptionsbande sowie ein Anstieg der Absorption festgestellt wurden. Hieraus konnte eine Quantenausbeute der Freisetzungsreaktion von 1,5% ermittelt werden. Die Ergebnisse zum Antennen-Photocage-System zeigen auf, dass durch Anbringen einer Antenne die 2PA verbessert werden kann, ohne die Funktionalität des Freisetzungsprozesses negativ zu beeinflussen. In einem nächsten Schritt zielen Verbesserungen des untersuchten Photocages darauf ab, den Ladungstransfer zu unterdrücken. Die Validierung dieses Ansatzes sollte die Einführung anderer Antennen mit erhöhten Zwei-Photonen-Einfangquerschnitten, wie z.B. Quantenpunkte, weiter motivieren. Der zweite Ergebnisteil dieser Arbeit konzentriert sich auf drei verschiedene Photosysteme, die sich durch eine sehr kurzlebige Fluoreszenz auszeichnen, welche mit einem Kerrschalter aufgenommen wurde. Das erste der drei untersuchten Systeme umfasst eine kooperative BODIPY-DTE-Dyade(Bordipyrromethen-Dithienylethen), die einen hocheffizienten photochromen Förster-Resonanzenergietransfer aufweist. Dieser wurde durch verkürzte Lebenszeiten der Differenzsignale im transienten Absorptionsspektrum der Dyade im photostationären Zustand abgeleitet. In diesem stellt BODIPY-DTE eine hochkonjugierte Einheit dar, welches durch die geschlossene Form des photochromen DTEs einen Energietransfer vom photoangeregten BODIPY zum DTE ermöglicht. Bei diesem Prozess wird die Fluoreszenz des Donors um einige Größenordnungen reduziert. Die Ergebnisse der transienten Absorptionsmessung wurde durch ein zeitaufgelöstes Fluoreszenzexperimentbestätigt. Die detektierte Fluoreszenztransiente zerfällt mit einer Zeitkonstante von etwa 15 ps und weist somit sehr hohe Ähnlichkeit mit dem Signal des Grundzustandsbleichens (GSB) aus dem transienten Absorptionsexperiment auf. Des Weiteren wurde die photochrome Ringschlussreaktion eines wasserlöslichen Indolylfulgimids spektroskopisch charakterisiert. Transiente Absorptionsmessungen geben einen direkten Einblick in den Mechanismus der Reaktion, in welcher, nach Photoanregung, die Relaxation aus dem Franck-Condon Bereich und die schnelle biphasische Relaxation des Moleküls über die konische Durchschneidung abgeleitet werden kann. Zusätzlich wurden zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen mit Hilfe des Kerrschalters durchgeführt, da die stimulierte Emission (SE) in transienten Absorptionsmessungen durch die Überlagerung mehrerer Signale nicht vollständig zu erkennen war. Die globale Lebensdaueranalyse der mit dem Kerrschalter aufgenommenen Breitband-Fluoreszenz lieferte drei Zeitkonstanten, welche wesentliche Übereinstimmung mit den Zeitkonstanten aus der globalen Lebensdaueranalyse der transienten Absorptionsmessungen aufweisen. Schlussendlich wurde die Deaktivierung des elektronisch angeregten Zustands des flavinbindenden Dodecins aus Mycobacterium tuberculosis mit Hilfe von unterschiedlichen spektroskopischen Methoden charakterisiert. Stationäre Fluoreszenzmessungen bei unterschiedlichen pH-Werten zeigten bei pH 5 eine im Vergleich zu nahezu physiologischen Bedingungen (pH 7,5)reduzierte Fluoreszenz auf. Auffällig ist, dass diese Beobachtungen durch transiente Absorptionsmessungen nicht bestätigt werden konnten, da diese eine große Ähnlichkeit bezüglich der Dynamik und der spektralen Signatur zueinander besaßen. Ein negatives Signal, hervorgerufen durch die SE, wurde hierbei nicht gefunden. Allerdings konnte in den zerfallsassoziierten Spektren eine spektrale Signatur beobachtet werden, die auf eine SE hindeutete, welche allerdings mit größeren positiven Signalen überlagert ist. Dieser Aspekt wurde in einer Kerrschalter-Messung untersucht, in der eine schwache Emission bei pH 7,5 festgestellt werden konnte. Zusätzlich wies die Zerfallsdynamik der Emission Übereinstimmung mit dem GSB-Signal aus den transienten Absorptionsmessungen auf.
Natural science is only just beginning to understand the complex processes surrounding transcription. Epitranscriptional regulation is in large parts conveyed by transcription factors (TFs) and two recently discovered small RNA (smRNA) species: microRNAs (miRNAs) and transfer RNA fragments (tRFs). As opposed to the fairly well-characterised function of TFs in shaping the phenotype of the cell, the effects and mechanism of action of smRNA species is less well understood. In particular, the multi-levelled combinatorial interaction (many-to-many) of smRNAs presents new challenges to molecular biology. This dissertation contributes to the study of smRNA dynamics in mammalian cells in several ways, which are presented in three main chapters.
I) The exhaustive analysis of the many-to-many network of smRNA regulation is reliant on bioinformatic support. Here, I describe the development of an integrative database capable of fast and efficient computation of complex multi-levelled transcriptional interactions, named miRNeo. This infrastructure is then applied to two use cases. II) To elucidate smRNA dynamics of cholinergic systems and their relevance to psychiatric disease, an integrative transcriptomics analysis is performed on patient brain sample data, single-cell sequencing data, and two closely related in vitro human cholinergic cellular models reflecting male and female phenotypes. III) The dynamics between small and large RNA transcripts in the blood of stroke victims are analysed via a combination of sequencing, analysis of sorted blood cell populations, and bioinformatic methods based on the miRNeo infrastructure. Particularly, importance and practicality of smRNA:TF:gene feedforward loops are assessed.
In both analytic scenarios, I identify the most pertinent regulators of disease-relevant processes and biological pathways implicated in either pathogenesis or responses to the disease. While the examples described in chapters three and four of this dissertation are disease-specific applications of miRNeo, the database and methods described have been developed to be applicable to the whole genome and all known smRNAs.
Mitochondria perform essential energetic, metabolic and signalling functions within the cell. To fulfil these, the integrity of the mitochondrial proteome has to be preserved. Therefore, each mitochondrial subcompartment harbours its own system for protein quality control. However, if the capacity of mitochondrial chaperones and proteases is overloaded, mitochondrial misfolding stress (MMS) occurs. Upon this stress condition, mitochondria communicate with the nucleus to increase the transcription of nuclear encoded mitochondrial chaperones and proteases. This proteotoxic stress pathway was termed the mitochondrial unfolded protein response (UPRmt) aiming at restoring protein homeostasis. Despite being discovered over 25 years ago, the signalling molecules released by stressed mitochondria as well as the corresponding receptor and transcription factor remain poorly understood. With this study, we aimed at characterising the underlying signalling events and mechanisms of how mitochondria react to misfolded proteins. First, we aimed to establish different methods to induce MMS that triggers the transcriptional induction of mitochondrial chaperones and proteases detected by quantitative polymerase chain reaction. We were able to induce UPRmt signalling by overexpression of an aggregation-prone protein and by knock-down or inhibition of mitochondrial protein quality control components. To study the signalling in a time-resolved manner, we focused on the usage of the mitochondrial HSP90 inhibitor GTPP and the mitochondrial LONP1 protease inhibitor CDDO.
Early time point RNA sequencing analysis of cells stressed with GTPP or CDDO revealed upregulated genes in response to oxidative stress. Indeed, measurements of mitochondrial superoxide with the fluorescent dye MitoSOX showed increased levels of reactive oxygen species (ROS) upon MMS induction. In contrast, there was no induction of mitochondrial chaperones and proteases when combining MMS with antioxidants. Compartment-specific targeting of the hydrogen peroxide sensor HyPer7 revealed increased ROS levels in the intermembrane space and matrix of mitochondria, followed by elevated ROS levels in the cytosol at later time points. The importance of cytosolic ROS for the signalling was supported by preventing UPRmt induction with an inhibitor blocking the outer mitochondrial membrane pore. Thus, ROS were identified as an essential UPRmt signal.
To understand which cytosolic factor is modified by ROS, redox proteomics was performed. Here, reversible changes on cysteine residues of the HSP40 co-chaperone DNAJA1 were observed upon MMS. Consequently, transcriptional induction of UPRmt genes was abolished by DNAJA1 knock-down. To understand the function of DNAJA1 during UPRmt signalling, quantitative interaction proteomics upon MMS revealed an increased binding to mitochondrial proteins and its interaction partner HSP70. Immunoprecipitation confirmed a ROS-dependent interaction between HSP40 and HSP70. Increased binding to mitochondrial proteins represented a cytosolic interaction of DNAJA1 with mitochondrial precursor proteins, whose accumulation was confirmed by western blot. Moreover, a fluorescent protein targeted to mitochondria accumulated in the cytosol during GTPP treatment, confirming a reduced import efficiency upon MMS. Preventing the accumulation of precursors by a translation inhibitor or depletion of a general mitochondrial transcription factor resulted in reduced UPRmt activation. Thus, DNAJA1 is essential for UPRmt signalling, since its oxidation by mitochondrial ROS and its enhanced recruitment to mitochondrial precursors allows the integration of both MMS-induced signals.
To link these findings to an increased transcription of mitochondrial chaperones and proteases, we screened for transcription factors accumulating in the nucleus upon MMS by cellular fractionation mass spectrometry. We demonstrated that specifically HSF1 accumulates in nuclei of cells stressed with GTPP or CDDO. Depletion of HSF1 by knock-down or knock-out resulted in the abrogation of the UPRmt-specific transcriptional response. HSF1 activation was visualised by nuclear accumulation on western blot, a process inhibited by ROS and precursor suppression. Moreover, DNAJA1 depletion prevented HSF1 activation. Ultimately, we proved by immunoprecipitation that the inhibitory interaction between HSF1 and HSP70 is reduced upon MMS.
Thus, we conclude that MMS increases mitochondrial ROS that are released into the cytosol. In addition, the import efficiency is reduced upon MMS, resulting in the accumulation of non-imported mitochondrial precursor proteins in the cytosol. Both signals are recognised via DNAJA1 oxidation and substrate binding. The concurrent recruitment of HSP70 to DNAJA1 results in the loss of the inhibitory HSP70-HSF1 interaction. Thus, active HSF1 can migrate to the nucleus to initiate transcription of mitochondrial chaperones and proteases. These findings are in accordance with observations in yeast, where mistargeted mitochondrial proteins activate cellular stress responses. Our results highlight a surprising interconnection and dependence of the mitochondrial and the cytosolic proteostasis network, in which the UPRmt is activated by a combination of two mitochondria-specific proteotoxic stress signals.
Bioactive small molecules are used in many research areas as important tools to uncover biological pathways, interpret phenotypic changes, deconvolute protein functions and explore new therapeutic strategies in disease relevant cellular model systems. To unlock the full potential of these small molecules and to ensure reliability of results obtained in cellular assays, it is crucial to understand the properties of these small molecules. These properties encompass their activity and potency on their designated target(s), their selectivity towards unintended off-targets and their phenotypic effects in a cellular system. Approved drugs often engage with multiple targets, which can be beneficial for some applications such as treatment of cancer where several pathways need to be inhibited for treatment efficacy. However, targeting multiple key proteins in diverse pathways also increases the possibility for unspecific or unwanted side effects. For many drugs the entire target space that they modulate is not known. This makes it difficult to use these drugs for target deconvolution or functional assays with the aim to understand the underlying biological processes. In contrast to drugs, for mechanistic studies, a good alternative are chemical tool compounds so called chemical probes that are usually exclusively selective as well as chemogenomic compounds, that inhibit several targets but have narrow selectivity profiles. Because they are mechanistic tools, chemical tool compounds must meet stringent quality criteria and they are therefore well characterized in terms of their potency, selectivity and cellular on-target activity. To ensure that an observed phenotypic effect caused by a compound can be attributed to the described target(s), it is essential to study also properties of chemical tools leading to unspecific cellular effects. There are a variety of unspecific effects that can be caused by physiochemical compound properties that can interfere with phenotypic assays as well as functional compound evaluations. One of these effects is low solubility causing toxicity or intrinsic fluorescence potentially interfering with assay readouts. But unanticipated cellular responses can also arise from unspecific binding, accumulation in cellular compartments or damage caused to organelles such as mitochondria or the cytoskeleton that can result in the induction of diverse forms of cell death.
In this study, we investigated the influence of a variety of small molecules on distinct cell states, by establishing and validating high-content imaging assays, which we called Multiplex assay. This assay portfolio enabled us to detect different cellular responses using diverse fluorescent reporters, such as the influence of a compound on cell viability, induction of cell death programs and modulation of the cell cycle. Additionally, general compound properties such as precipitation and intrinsic fluorescence were simultaneously detected. The assay is adaptable to assess other cellular properties of interest, such as mitochondrial health, changes in cytoskeletal morphology or phospholipidosis. A significant advantage of the assay is that we are using live cells, so we can capture dynamic cellular changes and fluctuations that can be crucial for the understanding of cellular responses.
Uncontrolled constitutive activation of Wnt signaling is a hallmark of colorectal cancer (CRC), which is responsible for the initiation of the vast majority of CRC cases (Fearon and Vogelstein, 1990; Morin et al., 1997; Wood et al., 2007). Paneth cells support the small intestinal stem cells by providing them with the required niche factors and especially Wnt3. Although the normal colonic epithelium does not contain Paneth cells, Paneth cell metaplasia is frequently observed in human and mouse adenoma (Joo et al., 2009). The occurrence of Paneth cells suggests the presence of high levels of Wnt ligands with unknown function in the tumor microenvironment of Wnt-independent tumor cells. Tumor progression is recognized as result of evolving crosstalk between tumor cells and their surrounding non-transformed stromal cells (Hanahan and Weinberg, 2011; Wang et al., 2017). Although Wnt signaling has been intensively studied in colorectal cancer (CRC) cells (Zhan et al., 2017), it remains unclear whether Wnt activity in the tumor-associated stroma contributes to the tumor malignancy. The present thesis used the organoid 3D cell culture system, genetically modified mouse models as well as next generation sequencing technology to identify and characterise the role of Wnt signaling in the tumor microenvironment of CRC.
Ceramide synthase (CerS) is the enzyme responsible for the de novo synthesis of ceramide. In this process, the different CerS isoforms are substrate-specific and produce ceramides of different chain lengths. Ceramides form the backbone for other sphingolipids and are enriched in membrane microdomains called lipid rafts. Lipid rafts are important signaling platforms for many transmembrane proteins, but can also act as bioactive lipids. Depending on the chain length, the effects on signaling pathways can vary. The aim of this work was to further investigate the chain length-specific effects by CerS4 on the progression of inflammatory colon cancer. To understand the tissue-specific effects of CerS4 deficiency on the progression of acute colitis and colitis-associated cancer (CAC), CerS4 knockout models were used. Disease progression of wild-type CerS4 (WT) was compared with that of mice with global CerS4 knockout (CerS4 KO) and mice in which CerS4 deficiency was restricted to T cells (CerS4 LCK/Cre) or intestinal cells (CerS4 Vil/Cre). Acute colitis was induced with sodium dextran sulfate (DSS), whereas azoxymethane (AOM)/DSS combinations were used to induce CAC in mice. The results showed a different disease progression depending on the specific knockout. While CerS4 KO mice were sensitive to DSS. AOM/DSS treatment was lethal for these mice, indicating an important role of CerS4 in other tissues. CerS4 Vil/Cre mice were protected from tumor formation. In contrast, CerS4 LCK/Cre mice experienced increased tumor formation and pan-inflammation. The mechanism behind this is due to the absence of cytotoxic T cells and the increase of regulatory T cells in the CerS4 LCK/Cre mice, demonstrating that CerS4 is critical for T cell function and development. To understand the role of CerS in humans, organoids were prepared from patients and the CerS profile in the different organoids was elucidated. This work provides, for the first time, insights into the CerS profile in human organoids and demonstrates a link between differentiation markers and stem cell markers with CerS. In addition, the role of CerS4 was investigated in vitro using three different colon cell lines-Caco-2 cells, HCT116 cells, and HCT15 cells. Hypoxia induced downregulation of CerS4 in all cell lines. Using the luciferase promoter assay, hypoxia-induced downregulation could already be detected at the promoter. Downregulation of CerS4 and CerS5 in Caco-2 cells and HCT116 cells resulted in different metabolic changes and mitochondrial dynamics after hypoxia. In conclusion, the results show that the role of CerS4 depends on the tissue cell type and stage of colorectal carcinoma, which complicates the consideration of CerS4 as a target in patients.
Das Glykoprotein AICL gehört zur Familie der C-Typ Lektin-ähnlichen Rezeptoren und wird nach Aktivierung humaner NK Zellen und Makrophagen auf deren Oberfläche exprimiert. Die Bindung von AICL an den genetisch gekoppelten, aktivierenden NKRezeptor NKp80, der auf allen reifen humanen NK Zellen exprimiert ist, induziert Effektorfunktionen von NK Zellen, wie Zytotoxizität und Zytokinsekretion. AICL Glykoproteine werden in ruhenden NK Zellen intrazellulär zurückgehalten und gelangen erst nach Zellaktivierung an die Oberfläche (Klimosch et al. 2013). Der Mechanismus dieser Regulation ist bisher unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, um weitere Einblicke in die Funktion des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares im Rahmen einer Immunantwort zu ermöglichen.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach der Aktivierung von NK Zellen sowohl präformierte im Golgi-Komplex zurückgehaltene als auch de novo synthetisierte AICL Glykoproteine an die Zelloberfläche gelangen. Bei der intrazellulären Retention von AICL handelt es sich um eine intrinsische Eigenschaft von AICL, die auch im ektopen Kontext von Insektenzellen auftritt. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die N-Glykosylierungen von AICL differentiell die AICLOberflächenexpression bestimmen. Die AICL Ektodomäne wird an einer nichtkonventionellen (N-X-C) und an drei konventionellen (N-X-S/T) N-Glykosylierungsstellen glykosyliert, wobei die Glykosylierung an ersterer ineffizient ist, sodass stets zwei Glykoisoformen vorhanden sind. Während die Glykosylierung zumindest einer konventionellen Stelle essenziell für die AICL-Oberflächenexpression ist, und diese mit zunehmender Glykosylierung konventioneller Stellen zunimmt, vermindert die nichtkonventionelle Glykosylierungsstelle die AICL-Oberflächenexpression. Für eine effiziente Oberflächenexpression ist auch die Ausbildung einer nicht-konservierten Disulfidbrücke erforderlich, die im membran-distalen Bereich der C-Typ Lektindomäne AICL-Homodimere miteinander verknüpft. Das Fehlen dieser Disulfidbrücke führt auch zu dem Verlust der NKp80-Bindung. Die intrazelluläre Reifung von AICL Glykoproteinen ist, im Gegensatz zu dem verwandten Glykoprotein KACL, in besonderem Maße abhängig von der Interaktion mit den ER-ständigen Proteinen der Proteinqualitätskontrolle. Insbesondere konnte mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen eine starke Interaktion von AICL mit dem ER Chaperone Calnexin gezeigt werden. Entsprechend ist die zelluläre Expression von AICL in Abwesenheit von Calnexin stark reduziert. Massenspektrometrisch konnte auch eine spezifische Interaktion von AICL mit dem Protein ITM2A gezeigt werden, wobei allerdings eine funktionelle Relevanz in Folgeversuchen nicht bestätigt werden konnte. Schließlich konnte eine zusätzliche Regulation der AICL-Oberflächenexpression durch proteasomale Degradation nachgewiesen werden, die über zwei Lysine im kurzen zytoplasmatischen Bereich von AICL bestimmt wird.
Frühere Untersuchungen hatten eine Bindung von sowohl AICL- als auch NKp80-Ektodomänen an K562 Zellen, eine Erythroleukämie-zelllinie, ergeben. Da K562 Zellen weder NKp80 noch AICL exprimieren, handelt es sich bei der gebundenen Struktur um einen potenziellen weiteren Liganden des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares. Hier konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Bindestruktur um ein Oberflächenprotein der K562 Zellen handelt, das allerdings nicht identifiziert werden konnte.
Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit mehrere AICL-spezifische, molekulare Mechanismen identifiziert und charakterisiert werden, die die aktivierungsabhängige Oberflächenexpression von AICL regulieren. Offensichtlich unterliegt diese einer strikten Kontrolle auf mehreren Ebenen, was vermutlich mit der Funktion von AICL als Ligand für einen aktivierenden Immunrezeptor auf zytotoxischen NK Zellen erklärbar ist. Weitere Untersuchungen zur AICL-Expressionsregulation und zur Funktion des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares in vivo sind erforderlich, um ein besseres Verständnis der Immunbiologie von NK Zellen zu erreichen.
The innate immune system is the first line of host defense that senses invading pathogens by various surveillance mechanisms, involving pattern recognition receptors (PRRs) such as Toll-like receptors (TLRs). Furthermore, in response to stress, tissue injury or ischemia, cells release endogenous danger-associated molecular patterns (DAMPs) which activate PRRs in order to prompt an effective immune response. Activation of PRRs by DAMPs initiates signaling transduction pathways which drive sterile inflammation by the production of pro-inflammatory effector molecules. Biglycan, a class I small leucine-rich proteoglycan (SLRP), is proteolytically released from the extracellular matrix (ECM) in response to tissue stress and injury or de novo synthesized by activated macrophages. In its soluble form, biglycan operates as an ECM-derived DAMP and triggers a potent inflammatory response by engaging TLR2 and TLR4 on immune cells. By selective utilization of TLR2/4 and the TLR adaptor molecules adaptor molecule myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) or TIR domain-containing adaptor-inducing interferon-β (TRIF) biglycan differentially regulates the production of TLR downstream mediators or inflammatory molecules. In this way, biglycan triggers the activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) p38, extracellular signal-regulated kinase (Erk) and nuclear factor kappa-light-chain enhancer of activated B cells (NF-κB) in a primarily MyD88-dependent manner. In contrast, biglycan induces the expression of (C–C motif) ligand (CCL)5 and chemokine (C-X-C motif) ligand (CXCL)10 over TLR4/TRIF, heat shock protein 70 (HSP70) production over TLR2 and the synthesis of tumor necrosis factor (TNF)-α, CCL2 and CCL20 by utilizing TLR2/4/MyD88. As a consequence, biglycan promotes the recruitment of immune cells such as neutrophils, T cells, B cells and macrophages into the inflamed tissue. Research over the past years showed that biglycan-induced inflammation is involved in the pathogenesis of various inflammatory diseases such as lupus nephritis (LN), sepsis and renal ischemia/reperfusion injury (IRI), whereby genetic deletion of biglycan or TLR2/4 alleviated disease outcome. Unfortunately, the selective interaction of biglycan to TLRs and TLR adaptors complicates the identification of an efficient pharmacological target in biglycan-mediated inflammation. Yet, the necessity of possible co-receptors in biglycan signaling such as cluster of differentiation 14 (CD14) which was found in a high molecular complex with biglycan was not addressed so far.
In the first part of the present study, by utilizing primary peritoneal murine macrophages we demonstrated that the biglycan-induced expression and synthesis of TNF-α and CCL2 via TLR2/4/MyD88, CCL5 through TLR4/TRIF and HSP70 over TLR2 is blunted in CD14 deficient mice, proving that CD14 is essential in TLR2- and TLR4-mediated biglycan signaling. Pre-incubation of macrophages with an anti-CD14 antibody significantly reduced the protein levels of TNF-α, CCL2, CCL5 and HSP70. In line with these data, pharmacological inhibition of CD14 alleviated the transcriptional activation of NF-κB by biglycan in HEK-Blue cells expressing hTLR2/CD14 as well as hTLR4/CD14/MD2 supporting CD14-dependency for biglycan/TLR2/4 signaling. Western blot analysis of phosphorylated p38, p44/42 and NF-κB in WT and CD14 deficient mice revealed that activation of biglycan-mediated TLR downstream signaling is CD14-dependent. Accordingly, biglycan-induced activation and nuclear translocation of p38, p44/42 and NF-κB was blocked in Cd14-/- mice as analyzed by confocal microscopy. Co-immunoprecipitation studies combined with microscale thermophoresis analysis showed that biglycan is in complex with CD14 in macrophages and in vitro binds directly with high affinity to CD14, thereby sustaining the concept that CD14 is a novel co-receptor in biglycan-mediated inflammation. Additionally, we provided proof-of-principle of our concept in an in vivo mouse model of renal IRI. Transient overexpression of biglycan in WT mice exacerbated the expression and production of TNF-α, CCL2, CCL5 and HSP70 in a CD14-dependent manner. Interestingly, pLIVE or pLIVE-hBGN-injected Cd14-/- mice displayed lower chemo- and cytokine levels in reperfused kidneys as compared to respective WT controls during renal IRI (30 h), indicating a renoprotective effect by CD14 deficiency. Flow cytometry analysis of kidney homogenates underlined the pivotal effect of CD14 in biglycan signaling as biglycan-mediated infiltration of CD11b- and F4/80-positive renal macrophages was abolished in Cd14-/- mice. Additionally, pLIVE or pLIVE-hBGN-injected CD14 deficient mice displayed lower numbers of renal CD11b- and F4/80-positive cells during renal IRI compared to WT mice. Analysis of F4/80- and CD38-positive cells isolated from mononuclear cell extracts from kidney homogenates of pLIVE or pLIVE-hBGN-injected WT and Cd14-/- mice revealed that biglycan triggers the polarization of pro-inflammatory M1 macrophages in a CD14-dependent manner. In line with this, Cd14-/- mice, either injected with pLIVE or pLIVE-hBGN, showed less F4/80- and CD38-positive cells during renal IRI than the respective WT control. As a corroboration of our data PAS-stained renal sections of pLIVE- or pLIVE-hBGN-injected WT or Cd14-/- mice uncovered that biglycan worsens tubular damage in IRI-subjected mice via CD14. At the same time, tubular damage was significantly reduced in IRI-subjected Cd14-/- mice as compared to WT mice. In correlation with these data, serum creatine levels were increased in pLIVE-hBGN-injected WT mice during renal IRI. In contrast, serum creatine levels were significantly less increased in pLIVE- or pLIVE-hBGN-injected Cd14-/- mice than in WT littermate controls. In conclusion we demonstrated that CD14 is a new high affinity ligand for biglycan-mediated pro-inflammatory signaling over TLR2 and TLR4 in macrophages. In vivo, soluble biglycan triggers the expression of various inflammatory mediators by utilizing the co-receptor CD14. Ablation of CD14 abolishes biglycan-induced renal macrophage infiltration and M1 macrophage polarization as well as overall kidney function by reduced tubular damage and serum creatinine levels. Therefore, this study identifies CD14 as a promising therapeutic target to ameliorate biglycan-induced inflammation.
...
The human Long Interspersed Nuclear Element-1 (LINE-1, L1) is a member of the group of autonomous non-LTR retrotransposons found in almost every eukaryotic genome. L1 elements generate copies of themselves by reverse transcription of an RNA intermediate and integrate into the host genome by a process called Target Primed Reverse Transcription (TPRT). They are responsible for the generation of approximately 35% of the human genome, cover about 17% of the genome and represent the only group of active autonomous transposable elements in humans. L1 activity bears several risks for the integrity of the human genome, since the L1-encoded protein machinery generates DNA double-strand breaks (DSBs) and is capable of conducting numerous genome-destabilizing effects, e.g. causing deletions at insertion sites, disrupting or rearranging coding sequences and deregulating transcription of functional host genes. On the other side, L1 elements have had and still exert a great impact on human genome structure and evolution by increasing the genome size and rearranging and modulating gene expression. Furthermore, due to its endogenous and generally non-pathogenic nature, L1 is a promising candidate as vector for gene delivery in somatic gene therapy. The structure of the flanking regions between de novo L1 integrants and the genomic sequence suggests an involvement of cellular DSB repair pathways in L1 mobilization. To elucidate the role of DSB repair proteins in L1 retrotransposition, I disabled DSB repair factors ATM, ATR, DNA-PK, p53 and Ku70 by knock down (KD) using short hairpin RNA (shRNA) expression constructs. To inhibit the function of DSB repair factors PARP and Rad51, I used dominant negative (DN) PARP and Rad51 mutants. Applying a well established L1-retrotransposition reporter assay in HeLa cells, de novo retrotransposition events were launched in order to test L1 for its retrotransposition activity in the context of altered DSB repair conditions. I could show that L1 retrotransposition frequency after ATM KD had increased by 3-fold, while ATR and p53 KD reduced L1 retrotransposition by approximately one third. Unfortunately, the cytotoxic effects of the DNA-PK and Ku70 shRNA expression constructs were too strong to determine potential effects of DNA-PK and Ku70 KD on L1 retrotransposition. Inhibition of PARP function by expression of the DN mutant and overexpression of wild type PARP were found to increase L1 retrotransposition by 1.8 and 1.5, respectively, while Rad51 DN had no detectable effect. Interestingly, overexpression of wild type Rad51 seemed to roughly double L1 retrotransposition frequencies. Since in my experiments KD or expression of DN mutants was time-delayed to the onset of L1 retrotransposition after transfection into the cells, I developed a temporally controllable, tetracyclin transactivator (tTA)-dependent L1 retrotransposition reporter assay which will be of great value for future L1 retrotransposition studies that rely on temporally controllable retrotransposition. Due to a previously published hypothesis of L1 playing a role in brain development by contributing to somatic mosaicism in neuronal precursor cells, I generated a transgenic mouse (LORFUS) using the tTA-dependent L1 construct to further test this hypothesis. LORFUS harbors a bidirectional cassette driving simultaneous expression of a GFP-tagged L1 retrotransposition reporter and beta-galactosidase. It was bred to another transgenic mouse line expressing tTA in the forebrain. The double transgenic offspring was used to characterize L1 expression and retrotransposition patterns in the brain at postnatal day 15 (P15). General transgene expression indicated by beta-galactosidase activity was found in hippocampus, cortex and striatum, while retrotransposition events revealed by GFP expression were found in hippocampus, cortex, striatum, olfactory bulb and brainstem. These results suggested L1 retrotransposition in the granule layer of the dentate gyrus earlier than P15 and migration of cells carrying these events along the rostral migratory stream into the olfactory bulb. To facilitate the use of L1 as gene delivery tool in gene therapy or genetic engineering, I furthermore intended to manipulate the L1 target site recognition to allow the site-specific integration into defined genomic locations. To this end, I performed crystal structure-guided mutational analysis exchanging single amino acid residues within the endonuclease (EN) domain of L1 to identify residues influencing target site recognition. However, individual point mutations did not change the nicking pattern of L1-EN, but resulted in a reduction of endonucleolytic activity reflected by a reduced retrotransposition frequency. This suggests that additional factors other than the DNA nicking specificity of L1-EN contribute to the targeted integration of non-LTR retrotransposons in the host genomes.
Acute lymphoblastic leukemia (ALL), a neoplastic disorder of blood cells of the lymphoid lineage, is the most frequent childhood cancer. In spite of increasing survival rates, the outcome for adults, infants or relapsed patients is still less favorable, highlighting the need for novel treatment options. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules that are involved in a variety of cellular pathways. As high ROS levels lead to oxidative stress and irreversible oxidation of cellular macromolecules, the production and elimination of ROS is tightly controlled. Therefore, cells express several antioxidant molecules and enzymes, including glutathione, catalase and the thioredoxin (Trx) system, to balance ROS levels. As cancer cells were found to have increased ROS levels that could contribute to tumor progression and metastasis, they rely strongly on these antioxidant systems to prevent oxidative damage, making cancer cells especially vulnerable to ROS-inducing treatments. ROS and oxidative stress have been shown to induce programmed cell death via different pathways, however the exact mechanisms that couples oxidative signaling and cell death is not completely understood.
As a disturbance of the cellular redox homeostasis was reported during leukemia development and progression, we wanted to determine the potential of Trx inhibitors for ALL therapy. Additionally, we aimed to further understand the role of ROS and subsequent protein oxidation in the induction and execution of programmed cell death.
First, we demonstrated that the Trx1 inhibitor PX-12 induced cell death in three ALL cell lines. Further analysis of the events leading to PX-12-induced cell death in FADD-deficient (FD) Jurkat cells revealed an increase in ROS levels and oxidation-mediated dimer formation of peroxiredoxin 3 (PRDX3). Interestingly cell death was inhibited by the thiol-containing antioxidant N-acetylcysteine (NAC), but not by non-thiol-containing ROS scavengers. PX-12 treatment further induced cleavage of caspase-9 and -3 and activation of the pro-apoptotic BCL-2 protein BAK, leading us to the conclusion that mitochondria-dependent apoptosis was induced. Interestingly, we could demonstrate an important role for the BH3-only protein NOXA in the mediation of PX-12-induced apoptosis as knock-down of NOXA prevented cell death induction and BAK activation. Our findings give novel insights into the mechanism of PX-12-induced cell death in ALL cell lines and underscores the potential of PX-12 for the treatment of ALL.
To further understand the processes leading to cell death upon inhibition of the Trx system, we analyzed global protein oxidation in Jurkat FD cells upon treatment with the Trx reductase inhibitor Auranofin. In line with previous results, Auranofin induced intrinsic apoptosis that was dependent on BAK and accompanied by increased ROS levels. Using a BIAM Switch Assay followed by mass spectrometry, we demonstrated that Auranofin treatment induced oxidation of over 200 proteins. We identified several proteins whose oxidation upon Auranofin treatment was expected, like Trx1, Trx2 and several peroxiredoxins. Additionally, we verified oxidation of APAF1-interacting protein (APIP) and protein arginine N-methyltransferase (PRMT1) that are both implicated in the regulation of apoptosis. With this analysis we were able to demonstrate that Auranofin treatment leads to changes in global protein oxidation. Whether oxidation of the determined proteins changes their functionality and contributes to apoptosis induction remains to be elucidated.
As we identified BAK as an important player in PX-12- and Auranofin-induced cell death in the previous parts of this study, we wanted to further understand its involvement in ROS-mediated cell death. First analyses in wild-type (WT) and BAK-/- murine embryonic fibroblasts (MEFs) revealed that BAK was essential for Auranofin-induced cell death and that this cell death was caspase-independent in MEFs. Interestingly, BAK oxidation was induced upon treatment with Auranofin, but not upon stimulation with the apoptosis-inducing compound Etoposide. Expression of mutated BAK, with either one or both oxidation-sensitive cysteines mutated to oxidation-insensitive serines, revealed that mutating already one cysteine protected cells from Auranofin , but not Etoposide-induced cell death. Of note, mutation of the BAK BH3 domain rescued MEFs from both, Auranofin- and Etoposide-mediated cell death. The presence of cysteine residues also altered BAK interactions as observed by a mass spectrometric analysis of Auranofin-treated MEFs expressing either WT or cysteine-less BAK. We identified interactions of WT BAK with proteins involved in mitochondrial fission and vesicle transport upon Auranofin treatment. Of note, interaction with proteins involved in apoptosis, like BAX or BCL-XL, was not changed between WT and cysteine-less BAK. Our results demonstrate a critical role for BAK oxidation in Auranofin-induced cell death. Furthermore, we identified novel oxidation-dependent BAK interaction partners.
To conclude, this study highlights the potential of ROS-inducing treatments for ALL therapy and provides novel insights into the redox regulation of programmed cell death.
Aim of the present study was the characterization of the RORa receptor (Retinoidrelated Orphan Receptor a). RORa is a member of the nuclear receptor family and is involved into the differentiation of Purkinje cells, inflammation, arteriosclerosis, and bone mineralization. Nuclear receptors are transcription factors and mediate biological responses within target cells to outer signals such as lipophilic hormones. They are involved in development, growth, differentiation, proliferation, apoptosis, and maintenance of homeostasis. Ligand binding, posttranslational modifications, and cofactor recruitment control their activity. Nearly all nuclear receptors share a common modular structure with an Nterminal A/B region, a DNA-binding domain (DBD) that is composed of two zinc finger motifs, a hinge region, and a C-terminal ligand-binding domain (LBD). The RORs comprise the subtypes RORa, RORb, and RORg, which are encoded by different genes. All isoforms of the respective subtypes only differ in their A/B domain. This study focused mainly on the exploration of the gene structure, expression, and subcellular distribution of RORa...
Nitric oxide (NO) is a potent mediator with pleiotropic functions such as inhibition of platelet aggregation, smooth muscle relaxation and regulation of neuronal transmission. These effects are mostly mediated by intracellular NO-sensitive guanylyl cyclases (GCs) which convert GTP into the second messenger, cGMP. This messenger in turn activates multiple downstream effectors such as cGMP-dependent protein kinases, cGMP-regulated ion channels and cGMPdependent phosphodiesterases. Mammalian NO-sensitive GCs are obligate heterodimers of an α and β subunit each. Given that these enzymes play a key role in cGMP-mediated pathways, one may anticipate that mechanisms other than allosteric activation via NO may exist to regulate the production and turnover of cGMP. In this thesis, novel aspects of the regulation of the most abundantly expressed GC heterodimer α1β1 are presented.
A possible mechanism of regulation that was tested here, is tyrosine phosphorylation. Using anti-phosphotyrosine antibodies, the phosphorylation of the β1 subunit was detected after incubation of β1-overexpressing COS-1 cells with protein tyrosine phosphatase (PTP) inhibitors such as pervanadate and bpV(phen). β1 phosphorylation on tyrosines was also observed in PC-12 cells which endogenously express GC and in rat aorta after inhibition of PTPs. Furthermore, hydrogen peroxide was found to be a physiological stimulus for the induction of reversible β1 tyrosine phosphorylation in intact cells. Using phenylalanine mutants of different tyrosines, residue 192 (Y192) of β1 was identified as the major phosphorylation site. Consistent with this finding, sequence analyses showed that Y192 forms part of a motif that resembles a preferential target site for Src-like kinases. When tyrosine-phosphorylated, this motif exposes a typical SH2 docking site for members of the Src kinase family.
Experiments with inhibitors of Src kinases, PP1 and PP2, clearly showed that phosphorylation of Y192 is Src-dependent. Preincubation of β1-expressing cells with these inhibitors significantly reduced the level of phosphorylated β1 after bpV(phen) treatment. Furthermore, co-expression of β1 with Src led to a strong phosphorylation of this subunit. Co-precipitation experiments showed that Src interacts with GC. Interestingly, kinases of the Src family are recruited to β1 via the SH2 domain upon phosphorylation of Y192. Together, these results indicate that Src kinases phosphorylate tyrosine 192 thereby creating a docking site for their own SH2 domains. Kinase bound to GC may then catalyze phosphorylation of GC or other downstream effectors. Inhibition of PTPs altered GC activity in two ways: it increased both the basal activity and the YC-1- and BAY 41-2272-stimulated activity two-fold, and it reduced the sensitivity of the enzyme towards NO. The detailed mechanism of action is still unknown, but experiments using the mutant β1[Y192F] demonstrated that residue 192 is not responsible for these effects.
Another major focus of this thesis was the identification of novel GC binding proteins. Using the yeast two-hybrid approach, the carboxy-terminal portion of a protein named AGAP1 (amino acid (aa) 399-804) was found to interact with the catalytic domain of α1 (aa 466-690) and with the regulatory domain of β1 (aa 1-348). Human AGAP1 is a multidomain protein of 804 amino acids with a calculated molecular mass of 89,1 kDa comprising an Arf-GAP (GAP:GTPase activating protein), a putative GTPase domain, two Ankyrin repeats and a PHdomain. Co-precipitation experiments using lysates from mammalian cells overexpressing both binding partners confirmed the interaction of AGAP1 with the GC subunits. Immunofluorescence analyses demonstrated that AGAP1 co-localizes with GC in the cytoplasm of COS-1 cells.
In Northern blots, AGAP1 mRNA was detected in various human and murine tissues showing a comparable expression pattern described for the mRNA of α1 and β1. Using an AGAP1-specific antibody, endogenous protein was precipitated from lysates of HEK-293 cells derived from human embryonic kidney. The same antibody efficiently cross-reacted with the rat homologue (rAGAP1) and immunoprecipitated endogenous rAGAP1 from lysates of PC-12 cells, aorta and heart. The molecular mass of rAGAP1 is larger than that of the human protein, possibly due to an additional exon present in the rat genome. Like β1, AGAP1 is a substrate for tyrosine kinases. Phosphorylation of AGAP1 was detected after inhibition of PTPs or by coexpression of Src. Furthermore, the kinase inhibitor PP2 strongly impaired phosphorylation of AGAP1 after pervanadate treatment suggesting that tyrosine kinases of the Src family are involved. Measurements of cGMP production showed that AGAP1 has no influence on the activity of NO-sensitive GC. Interestingly, inhibition of PTPs potently increased the complex formation between AGAP1 and GC indicating that the interaction between these two proteins is modulated by reversible tyrosine phosphorylation. Whether this effect is due to the phosphorylation of AGAP1 or GC is still unknown. AGAP1 associates with endosomes and exposes Arf-GAP activity towards Arf1 and Arf5 which are involved in vesicular transport. Thus, one may hypothesize that binding of α1β1 to AGAP1 targets GC to distinct subcellular compartments in close proximity to cGMP-dependent effectors, thereby optimizing cGMP generation and fostering cGMP-driven actions.
Taken together, these results demonstrate that beside the modulation of GC by NO the enzyme is regulated by tyrosine phosphorylation and interaction with AGAP1.
Resistant microbes are a growing concern. It was estimated that about 33,000 of people die because of the infections caused by multidrug resistant bacteria each year in Europe (ECDC, 2018, https://www.ecdc.europa.eu/). Bacteria can acquire resistance against toxic compounds via different mechanisms and intrinsic active efflux is one of the first mechanisms deployed by bacterial cells. The membrane-localized efflux pumps catalysing this reaction, extract toxic compounds from the interior of the cell and transport these to the outside, thereby maintaining sub-lethal toxin levels in the cytoplasm, periplasm and membranes. Gram-negative three-component efflux pumps, analysed in this study, are composed of an inner membrane protein, a member of the Resistance-Nodulation cell Division (RND) superfamily, an Outer Membrane Factor (OMF) protein and a Membrane Fusion Protein (MFP) that connects the two afore mentioned components into an active efflux pump. The pumps described in this work, AcrAB-TolC and EmrAB-TolC, are drug efflux pumps belonging to the RND and MFS superfamilies, respectively, while CusCBA is an efflux pump that belongs to the RND heavy metal efflux family. Another efflux pump that was used as a model for the design of an in vitro assay for the silver ion transport studies, CopA, belongs to the P-type ATPase superfamily. All pumps analysed in this study are part of the resistance system of Escherichia coli, which is a highly clinically relevant pathogen.
In order to examine the AcrAB-TolC, CopA and CusA efflux pumps, the individual components were separately produced in E. coli, purified to monodispersity and reconstituted in large unilamellar vesicles, LUVs. Means for the optimized production and adequate conditions for efficient reconstitution were presented in this study. The activity of AcrB in LUVs was detected using fluorescence quenching of the dye 8-hydroxy-1,3,6 pyrenetrisulfonate (pyranine), which is incorporated inside the proteoliposomes and is sensitive to the pH changes in its surrounding. The inactive AcrB variant with a substitution in the proton relay network, D407N, showed no activity in proteoliposomes, which correlates with the measurements done in empty liposomes. When AcrA was co-reconstituted with AcrB D407N proteoliposomes it did not restore protein activity. To test the assembly of the AcrAB-TolC pump out of its single components, an in vitro assay was established where the complex assembly was tested with AcrAB- and TolC-containing liposomes. These experiments showed putative AcrAB-TolC formation in the presence or absence of a pump substrate, taurocholate, as well as in the presence of the pump inhibitor, MBX3132. The assembly appeared stable over time and results were invariant in the presence or absence of a pH gradient across the AcrAB-containing membrane.
After determination of the ATPase activity of the P-type ATPase, CopA, in detergent micelles, the protein was reconstituted in LUVs. Quenching of the Ag+-sensitive dye Phen Green SK (PGSK), present on the inside of the CopA-containing proteoliposomes, was observed in presence of ATP and Ag+. Under the same conditions, but in absence of Ag+-ions, quenching was reduced by 80 % after 300 seconds. No PGSK-quenching was observed in control liposomes in the presence of ATP and Ag+. The additional presence of sodium azide led to minimal reduction of the PGSK-quenching as expected since sodium azide is not an inhibitor of P-type ATPases, but the quenching rate was similar to that of the same experimental condition with control liposomes.
The RND superfamily member CusA, as part of the tripartite CusCBA efflux pump, has been proposed to sequester Ag+ or Cu+ from either the cytoplasmic or periplasmic side of the inner membrane. The periplasmic transport of silver ions was implied from an in vitro assay where the quenching of a pH sensitive dye, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine (ACMA), indicates acidification of the lumen of the proteoliposomes containing CusA when an inwardly directed pH was imposed. The same experiment with the CusA D405N variant, which was previously reported to be an inactive variant, also led to ACMA quenching, although at a slightly lower rate. Under application of an inwardly directed pH and a (negative inside), CusA-containing proteoliposomes showed a strong quenching of the incorporated PGSK dye, suggesting strong Ag+ influx.
The Major Facilitator Superfamily-(MFS-) type EmrAB-TolC pump has an analogous structural setup as the RND-type AcrAB-TolC pump. To examine the efflux of one of its substrates, carbonyl - cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), a plate-based susceptibility assay was used. The presence of the EmrAB-TolC pump confers lower susceptibility levels towards CCCP in E. coli, compared to cells not expressing the pump or cells expressing only the MFS component, indicating that EmrAB-TolC extrudes CCCP.
The work done in this study opens up a path towards investigation of drug and metal resistance in vitro. The methodologies to obtain proteoliposomal samples of multicomponent efflux pumps and subsequent measurements of drug/metal ion and H+ fluxes, as well as the determination of pump assembly are crucial for the future research on pump catalysis and transport kinetics. The in vivo drug-plate assays done in this work provide initial insights for future investigations of the drug susceptibility of E. coli expressing the MFS-type tripartite efflux pumps.
Epigenetic mechanisms largely influence how genetic information on DNA level is translated into different phenotypes. DNA methylations and histone post-translational modifications make up what is referred to as "epigenetic landscape", an interconnected pattern that regulates access to genes and serves as platform for specific binding partners. The epigenetic landscape is maintained by "writers", which add the modifications, "erasers", which delete the modifications and "readers" which specifically bind modifications and mediate their location to other proteins connected to transcription. In the context of acetylations, which are the focus of this thesis, the writers are called histone acetyl transferases (HATs), the erasers are called histone deacetylases (HDACs) and the readers comprise Bromodomains (BRDs) as well as Yaf9, ENL, AF9, Taf14, Sas5 (YEATS) domains. An aberrant epigenetic landscape and mutated forms of epigenetic readers can lead to diseases including cancer and inflammatory diseases, making epigenetic reader domains attractive drug targets.
The focus of this thesis were YEATS domains and the development of inhibitors for this new class of epigenetic readers. Eleven-nineteen-leukemia protein (ENL) and ALL1-fused gene from chromosome 9 protein (AF9) are also part of the super elongation complex and are common fusion partners of mixed lineage leukemia protein (MLL) in acute myeloid leukemia (AML) (Wan et al., 2017, Erb et al., 2017). In this thesis, the first ligand-free crystal structure of ENL YEATS revealed an inherent flexibility of the Y78 side chain in the aromatic triad and two conserved water molecules. Soaking experiments led to the first co-crystal structures between a YEATS domain and small molecule inhibitors and defined prerequisites for ENL YEATS inhibitor scaffolds. The discovered inhibitory fragments had a central amide bond in common, which replaced one of the two conserved water molecules to form beta-sheet-like hydrogen bonds between the loop 6 backbone and the S58 side chain. The amide bond was flanked by two aromatic moieties, of which one stacks with H56 in the front pocket and the other interacts with the aromatic triad in the rear pocket. The development of the first chemical probe for ENL/AF9, SGC-iMLLT, show that the affinity is increased to low nanomolar levels if the rear flanking aromatic moiety forms additional hydrogen bonds with loop 6 and the side chain of E75 (Moustakim et al., 2018). In case of the probe, this is achieved with a 2-methyl-pyrrolidine-benzimidazole moiety. The probe binds with high affinity to ENL (129 nM) and AF9 (77 nM) and shows no significant affinity towards other human YEATS domains or BRDs. Target engagement was shown by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), cellular thermal shift assay (CETSA) and in case of AF9 also with NanoBRET. The probe changed the expression of three AML-related genes (MYC, dendrin and CD86) in MV4;11 cells, encouraging application of this probe in more AML cell lines.
Ferroelektrische Strontium-Wismut-Tantalat- (SBT) Filme werden in der Mikroelektronik als nicht-flüchtige Speichermedien verwendet und weiterentwickelt. Informationen werden durch Polarisation des Materials gespeichert und bleiben ohne weiteren Energieaufwand über einen Zeitraum von Jahren in solchen Speichern erhalten – sogenannten FeRAMs (Ferroelectric Random Access Memories). Darüber hinaus können gespeicherte Daten innerhalb von wenigen Nanosekunden wieder ausgelesen werden. Zusammengefasst ist eine Langzeitspeicherung kombiniert mit niedrigem Energieverbrauch und schneller Informationsverarbeitung durch den Einzug ferroelektrischer Materialien in die Computertechnologie möglich geworden.
Da die fortschreitende Miniaturisierung in der Mikroelektronik von zentraler Bedeutung ist, sind zur Charakterisierung der verwendeten Materialien Untersuchungsmethoden mit hoher Ortsauflösung unverzichtbar. Das Rasterkraftmikroskop – engl. Atomic Force Microscope (AFM) – ist eine solche Technik, mit der im Submikrometerbereich die Topographie sowie physikalische Eigenschaften von Materialien abgebildet werden können. Die vorliegende Arbeit widmet sich der Untersuchung von SBT-Filmen mit solchen AFM-Methoden.
Besonders die Rauhigkeit der einzelnen Filme in schichtartig aufgebauten Mikrochips ist bei der Herstellung von Halbleiterbauelementen von großer Bedeutung, wobei möglichst glatte Filme favorisiert werden. Deshalb wurden zunächst verschiedene SBT-Filme auf ihre topographischen Merkmale hin charakterisiert. Die Rauhigkeiten von SBT Filmen verschiedener Herstellungsverfahren wie der Metal Organic Decomposition (MOD) und der Metal Organic Chemical Vapour Deposition (MOCVD) wurden gegenübergestellt. Außerdem ist der Einfluss der SBT-Schichtdicke sowie der des Ferro-Anneals untersucht worden – Ferro-Anneal ist ein Temperungs-Schritt während der Filmherstellung, der zur Bildung der ferroelektrischen Aurivillius-Phase durchgeführt werden muss. Zudem wurde das unterschiedliche Kurzschlussverhalten zweier SBT-Filme in Zusammenhang mit ihren verschiedenen RMS-Rauhigkeitsdaten gebracht.
Der größte Teil der Arbeit setzt sich mit einer Methode auseinander, mit der die Polarisationseigenschaften von ferroelektrischen SBT-Filmen charakterisiert werden sollen – dem AFM/EFM-Polarisationsexperiment – engl. Electrostatic Force Microscope (EFM). Die SBT-Filme werden dabei mit einer AFM-Spitze polarisiert und in einem zweiten Schritt die daraus resultierenden elektrostatischen Felder mit einem EFM über der Probe abgebildet. Es wurde dabei kritisch hinterfragt, in wieweit diese Methode als Beurteilungskriterium der Materialeigenschaften herangezogen werden kann. Zudem wurden Aufladungsphänomene bei dieser Versuchsführung dokumentiert.
Außerdem wurde das Leckstromverhalten von SBT-Filmen auf der Submikrometerskala mit einer relativ neuen Messmethode, dem conducting-AFM (C-AFM), untersucht.
Die Ergebnisse aller Untersuchungen sind im folgenden stichpunktartig dargestellt.
Topographieuntersuchungen:
• Die RMS-Rauhigkeit von MOD/SBT-Filmen ist größer als die der MOCVD/SBTFilme. Mit steigender Prozesstemperatur des Ferro-Anneals wird die Oberflächenrauhigkeit von SBT-Filmen erhöht.
• SBT-Filme, die mit niedrigen Prozesstemperaturen hergestellt wurden, hier als Niedrigtemperatur-Filme bezeichnet, erfahren mit zunehmender Schichtdicke eine Glättung. Sie ist auf die Einbettung der Kristallite in die verhältnismäßig glatte FluoritPhase zurückzuführen, die wegen der geringen Temperaturen während des FerroAnneal-Prozesses noch nicht vollständig in die rauere ferroelektrische AurivilliusPhase umgesetzt wurde.
• Die unterschiedliche Zusammensetzung der Filme SrxBi2.2Ta2O8,3+x mit X1 = 0.9 und X2 = 1,0, im Text als Sr0,9-Film und Sr1,0-Film bezeichnet, führte zu höheren Kurzschlussraten des Sr0,9-Films in fertiggestellten FeRAM-Kondensatoren. Die Ursache kann auf die höhere Oberflächenrauhigkeit des Sr0,9-Films zurückgeführt werden. EFM-Untersuchungen:
• Bei der Polarisation ferroelektrischer SBT-Filme mit einer elektrisch gepolten AFMSpitze werden Ladungen in undefinierbarer Anzahl auf die Oberflächen gebracht. Diese Ladungen sind mehr oder weniger auf den Oberflächen beweglich. Mit zunehmender Polarisierbarkeit des ferroelektrischen Films wird die Ladung stärker am Polarisationsort durch elektrostatische Anziehung zwischen den orientierten Dipolen und der Oberflächenladung fixiert.
This thesis primarily covers a systematic assessment of quantum chemical methods to predict accurate 19F NMR shifts for fluoroarenes and magnetic exchange coupling constant (J) in organic spin dimers which are basic building blocks for rational designing of organic magnetic materials.
One of the most important goals in chemistry is to design and synthesize molecules with optimum properties. This thesis is divided into two parts: the first part comprises of a systematic effort to find an inexpensive quantum chemical method to predict accurate 19F NMR chemical shifts (within an accuracy of 2 ppm) for perfluoraromatics. Essentially, these strenuous efforts have been devoted to find best DFT functional and basis set combination to predict accurate 19F shifts. In addition,the influence of geometrical parameters, solvents, chemical environment was also analyzed. Various correction approaches were tested to correct the calculated shifts. The influence of various functionals and basis sets was also analyzed on the correction efficiency of an individual scheme. All the NMR calculation methods already being used and correction approaches were verified to predict shifts of three different fluorine-substituted molecular sets. These structure sets include fluorobenzenes, substituted benzenes and fluorine substituted aromatic fused rings (e.g. fluorine substituted anthracene).
In the second part of this thesis, we investigated the accurate prediction of magnetic exchange couplings (J) for organic spin dimers using quantum chemical methods. We analyzed the performance of various DFT methods and various post-HF methods, such as the CASSCF, CASPT2, MSTDISD, DDCI1, DDCI2, DDCI3, and FCI to predict magnetic exchange couplings (J).
Overview of the Chapters:
Chapter 1, presents a brief theoretical introduction to the Schrödinger equation and its application in quantum mechanical calculations, the Hartree-Fock approximation, basis sets, electron correlation energy, and density functional theory (using pure and hybrid functionals).
In chapters 2 and 3, an introduction is given for quantum chemical approaches used to calculate NMR parameters and magnetic exchange coupling constants. We discuss an effective spin Hamiltonian, the Breit-Pauli Hamiltonian (BPH), chemical shielding tensor and total energy relationship, measuring of the NMR spectra, and different techniques to deal with gauge origin problem. In addition, the theoretical background of magnetic exchange coupling constant calculation for spin dimers, the Heisenberg-Dirac-van-Vleck Hamiltonian (HDVV) and the Noodelman's broken-symmetry approach for calculating J values are briefly discussed.
Chapter 4, presents a benchmark study of various DFT functionals and basis sets to calculate accurate C-F bond lengths and 19F chemical shifts. High-resolution NMR spectral data of complex molecules are often difficult to interpret. Great scientific efforts have been devoted to search for a computational approach to interpret experimental NMR data. Quantum chemical methods such as the CCSD(T) method offer high accuracy in calculation of NMR parameters but being computationally too demanding they cannot be applied to large chemical systems. On the other hand, density functional theory (DFT) is achieving a steady progress among diversity of computational techniques. An accuracy within 2 ppm deviation from the experimental values in 19F chemical shifts can be achieved if the NMR calculation is performed using accurate equilibrium geometries, GIAO is used to tackle gauge origin problem and electron correlation is properly treated by employing a high level of theory (e.g. CCSD (T)/cc-pVQZ). We found that the calculation of 19F shielding tensors with the density-functional theory does not provide any noticeable improvement over the HF method. Post-HF theory demands too much computational resources that makes them impossible to use for large systems [35] .
We found that a quantitative prediction of NMR shifts can be made as the errors introduced by theoretical methods are cancelled out while calculating shifts. Various benchmark studies in this thesis show that 19F chemical shifts calculated for perfluoraromatics with the M06-L, BHandH, BHandHLYP in combination with the 6-311+G (2d,p) basis set are within 4 ppm deviation from the experiments. Furthermore, we noted that NMR calculations on accurate
C-F (e.g. PBE/6-311G (d, p)) bond lengths does not show any improvement if the NMR calculation and optimization are performed at the same level of theory. A significant improvement can be achieved on calculated 19F NMR shifts, if some correction schemes are used.
In chapter 4 we discuss various correction schemes applied to correct the calculated 19F chemical shifts. A multi-standard approach (MSTD) was used to minimize the error that may occur due to the difference in the nature of the reference compound and test molecules [122]. We propose another approach to correct shielding constants which is the reference corrected approach. This approach makes a correction similar to the MSTD. We also tested a Linear Regression Correction Approach and we noted that this is the best approach amongst all. This is found to be less dependent on the theoretical method. We use conformation averaging corrections to correct the calculated shifts[126].
...
Die Plasmamembran eukaryotischer Zellen dient als Barriere zwischen dem Inneren einer Zelle und ihrer Umgebung. Eine wichtige Aufgabe von Proteinen, die sich in der Plasmamembran befinden, besteht in der Erkennung der Umgebung, der Übermittlung dieser Informationen über die Plasmamembran in das Innere einer Zelle und der Einleitung einer zellulären Antwort. Membranrezeptoren binden Liganden, was zu ihrer Aktivierung und der Rekrutierung von intrazellulären Proteinen führt. Funktionelle Signalkomplexe werden gebildet und leiten einen Informationstransfer durch die Zellmembran ein, so dass die Expression bestimmter Gene stimuliert oder unterdrückt wird. Eine Störung der Signalinitiierung und -übertragung tritt bei vielen Krankheiten auf, so dass Membranproteine ein wichtiges Ziel in der Medikamentenentwicklung sind.
In dieser Arbeit wird die Fragestellung bearbeitet, wie der Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFR1) in funktionelle Komplexe in der Plasmamembran einer intakten Zelle organisiert ist. TNFR1 besitzt vier cysteinreiche Domänen (CRDs) in seiner extrazellulären Region. Die erste und von der Plasmamembran am weitesten entfernte CRD ist die Pre-Ligand Assembly Domain (PLAD). Kristallstrukturen zeigten, dass sich in einem TNFR1-Dimer zwei PLAD in unmittelbarer Nähe befinden. Crosslinking-Experimente berichteten über mehrere oligomere Zustände von TNFR1; die Ergebnisse unterschieden sich nach Art und Konzentration des Crosslinkers. In der nativen Umgebung einer intakten Zelle wurde der oligomere Zustand von TNFR1 bisher nicht bestimmt. Der kanonische Ligand für TNFR1 ist der Tumornekrosefaktor alpha (TNF), ein Homotrimer, welches in löslicher oder membrangebundener Form vorliegt. Nach der Bindung von TNF an TNFR1 bilden sich Rezeptortrimere. Diese Proteinkomplexe rekrutieren intrazellulär Proteine und bilden einen funktionellen Membrankomplex, der intrazelluläre Signalkaskaden aktiviert. Die kanonische Signalweiterleitung erfolgt durch den nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells (NF-B), welcher Zellteilung oder Entzündung induziert. TNFR1 kann auch andere Signalwege wie beispielsweise Apoptose durch einen zytosolischen Komplex und die Procaspase-8, oder Nekroptose durch das Nekrosom und die mixed lineage kinase domain-like (MLKL)-Domäne einleiten. Die Dysregulation von TNFR1 ist bei einer Vielzahl von Krankheiten zu finden. Erhöhte TNFR1-Expressiosraten treten bei acquired immune deficiency syndrome (AIDS), multipler Sklerose und verschiedenen Krebsarten auf.
In einem zweiten Projekt wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Michael Lanzer (Heidelberg, Germany) der Expressionsgrad des Proteins VAR2CSA in membranassoziierten knobs bestimmt, welche in Erythrozyten vorkommen, die mit dem Parasiten Plasmodium falciparum infizierten wurden. VAR2CSA gehört zur Proteinfamilie des Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 (pfEMP1). Nach einer Infektion wird VAR2CSA zur Wirtszellmembran transportiert und in knobs eingelagert. Patienten, die Sichelzellenanämie-Erythrozyten (HbAS) aufweisen, sind im Gegensatz zu Patienten mit gesunden Erythrozyten (HbAA) immun gegen Malaria. Während die beiden Erythrozytentypen eine unterschiedliche Morphologie der knobs aufweisen, blieb ihre Zusammensetzung in Bezug auf VAR2CSA bisher ungeklärt.
Das Verständnis der Proteinfunktion erfordert eine Beschreibung der molekularen Organisation funktioneller Einheiten in der zellulären Umgebung. Hierfür ist die Fluoreszenzmikroskopie eine geeignete Methode, da sie eine gezielte Markierung von Zielproteinen ermöglicht. Die hohe Sensitivität ermöglicht die Visualisierung einzelner Proteine. Eine Einschränkung in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie ist die Auflösungsgrenze. Strukturelle Elemente, die kleiner als etwa die halbe Anregungswellenlänge sind (für die meisten Anwendungen 200 bis 300 nm) können nicht aufgelöst werden. Die Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie ermöglichte es, diese Auflösungsgrenze zu umgehen und eine räumliche Auflösung von wenigen Nanometern zu erreichen, was die Visualisierung und Charakterisierung einzelner Proteinkomplexe ermöglichte. Eine Art der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie ist die single-molecule localization microscopy (SMLM), die auf der Detektion einzelner Fluorophore, einer genauen Bestimmung ihrer Position (Lokalisation) und der Erzeugung eines rekonstruierten Bildes unterhalb der optischen Auflösungsgrenze basiert. Da die meisten Proben in der Fluoreszenzmikroskopie eine zu hohe räumliche Dichte an Fluorophoren aufweisen, um den Nachweis von einzelnen Fluorophoren zu ermöglichen, werden Verfahren zur Kontrolle der Emission von Fluorophoren eingesetzt. Eine Möglichkeit ist der Einsatz von Fluorophoren, die optisch zwischen einem nicht-fluoreszierenden und einem fluoreszierenden Zustand geschaltet werden können, z.B. photoschaltbare fluoreszierende Proteine in photoactivated localization microscopy (PALM) oder organische Farbstoffe in (direct) stochastic optical reconstruction microscopy ((d)STORM). SMLM erreicht eine räumliche Auflösung von 20 nm, was in den meisten Fällen ausreicht, um einzelne Proteinkomplexe in einer Zelle aufzulösen. Diese räumliche Auflösung ist jedoch nicht ausreichend, um Untereinheiten innerhalb eines Proteinkomplexes zu visualisieren. Zu diesem Zweck wurde SMLM erweitert und die verfügbare kinetische Information genutzt, die bei der Detektion einzelner Fluorophore ausgelesen wird. Viele Fluorophore weisen metastabile Dunkelzustände auf, die eine Lebensdauer von bis zu Sekunden aufweisen. Diese Übergänge erscheinen als "Blinken" der Fluoreszenzemission. In Kombination mit kinetischen Modellen kann aus der Anzahl an Blink-Ereignissen die Anzahl der Fluorophore ermittelt werden. Angewendet auf hochaufgelöste Proteinkomplexe kann die Auflösungsgrenze von hochauflösender Mikroskopie umgangen werden, und die Anzahl der Protein-Untereinheiten in einem hochaufgelösten Proteincluster ermittelt werden. Hierzu wird beispielsweise das photoschaltbare fluoreszierende Protein mEos2 an ein Zielprotein funsioniert (quantitative PALM (qPALM)).
...
Three types of post-translation modifications (PTMs) containing N-glycosylation, phosphorylation, ubiquitylation were characterized in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) on a global scale using quantitative mass spectrometry based proteomics technology in this study.
DLBCL is the most common type of malignant lymphomas and has a heterogeneous gene expression profiling, phenotype and clinical response to chemotherapy. DLBCL is a good model for the correct classification of cancers into molecularly different subtypes, which benefits for the selection of rational therapeutic strategies. It resulted in two histologically indistinguishable subtypes-activated B-cell-like (ABC) subgroup and germinal center B-cell-like (GCB) subgroup according to gene expression profiling. Signals originating from the B-cell receptor (BCR), the key protein on the surface of B cells, promote growth and survival of DLBCL. Antigen-dependent/independent BCR signaling is found in DLBCL subtypes.
Recent researches reveal that glycosylation plays role in human cells via site-specific regulation. Aberrant N-glycosylation in BCR-related effectors, such as, CD79a, immunoglobulin M or G (IgM or IgG), has been found to be associated with lymphoid malignancies. However, accurate quantification of intact glycopeptides and their individual glycan moieties in a cell-wide manner is still challenging. Here we established a site-specific quantitative N-glycoproteomics platform termed SugarQuant. It included a fast sample preparation workflow using Protein Aggregation Capture (PAC), an optimized multi-notch MS3 acquisition workflow (Glyco-SPS-MS3), a self-developed R-based tool (GlycoBinder). The robustness and accuracy of quantitation in SugarQuant were proved in a study using the different amounts of TMT-labelled IgM N-glycopeptides spiked into a background of TMT-labelled yeast peptides. Next, we used SugarQuant to identify and quantify more than 5000 unique glycoforms in Burkitt’s lymphoma cells treated with a series of doses of 2-deoxy-2-fluoro-L-fucose (2FF) and determine the more accurate site-specific glycosylation changes that occurred upon inhibition of fucosylation compared to using MS2 analysis. It revealed that 2FF-sensitive N-glycosylation on key players in BCR-mediated signaling in DG75. Furthermore, 2FF treatment also affects phosphorylation of the key players involving in B cell receptor signaling.
Then we investigated the site-specific quantitative N-glycoproteome in the cell lines of DLBCL subtypes using SugarQuant. More than 7000 unique intact glycopeptides (glycoforms) were quantified in five ABC DLBCL and four GCB DLBCL cell lines. The glycoproteome mapping (intact glycopeptide expressions) in each cell line allows to segregate DLBCL subtypes. The majority of these glycoforms were from the key cell-surface BCR effectors, such as IgM, CD79 and PTPRC. Lastly, we investigated the change of fucosylated glycopeptides in TMD8 cell line upon knockout of the fucosyltransferase FUT8, which is responsible for core-fucose synthesis, and by the treatment with 2FF. The results revealed that FUT8 might also regulate the synthesis of sub/terminal fucose on glycan chain and the inhibition of fucosylation increased the sialyated glycopeptide expression.
Phosphorylation is involved in regulating multiple processes as an important mediator in BCR signaling. Likewise, ubiquitylation plays vital roles in the activation of the nuclear factor-kappaB (NF-κB) pathway in BCR signaling. There are two vital upstream BCR-proximal tyrosine kinases, Bruton’s tyrosine kinase (BTK) and spleen tyrosine kinase (SYK), which regulate the auto-phosphorylation and phosphorylation of other proteins in BCR signaling pathway. Here we investigated the dynamics of downstream phosphorylation and ubiquitylation signaling in ABC DLBCL and GCB DLBCL cell lines upon the inhibitions of BTK and SYK using quantitative proteomics strategy. In the phosphoproteome analysis, a large dataset of quantified phosphorylation sites was obtained in the three ABC and four GCB DLBCL cell lines. BCR signaling in the subtypes of DLBCL cell lines was found to be highly individual in distinct cell lines. These significantly regulated phosphorylation events in each cell line with individual treatment were involved in multiple Reactome pathways, such as, M phase, signaling by Rho GTPases and diseases of signal transduction. Moreover, the gene regulation-related biological processes including chromosome organization and medication, DNA metabolic process, nuclear export, were involved in the DLBCL cell lines. In the ubiquitinome analysis, we identified more than 15,000 ubiquitylation sites in two ABC and one GCB cell lines upon the inhibition of BTK and SYK. The different ubiquitylation events observed in ABC and GCB subtypes revealed distinct BCR signaling pathways in two subtypes. The similar signaling perturbations across each cell line upon BTK and SYK inhibition, which were obtained from the significantly regulated ubiquitylated peptides expression, revealed the cell-type-specific concordance in ubiquitylation regulation upon BTK and SYK inhibition. These ubiquitylation modified proteins who bore the significantly regulated ubi-peptides in the samples were also found to be highly involved in gene regulatory processes.
...
Die Lebensfunktion der Zelle beruht unter anderem auf der Funktion und Wechselwirkung der Nukleinsäuren DNA (2’-Desoxyribonukleinsäure) und RNA (Ribonukleinsäure). Mit Hilfe von PDS (engl. ’pulsed dipolare spectroscopy’)-Techniken, basierend auf der EPR (engl. ’electron paramagnetic resonance’)-Spektroskopie, können Abstände in einem Bereich von 2-10 nm zwischen zwei markierten Positionen einer Nukleinsäure bestimmt werden. Daneben kann mit der Abstandsverteilung auf die Flexibilität des Moleküls geschlossen werden. Durch PDS-Messungen eröffnet sich die Möglichkeit, Bewegungen und Zustandsänderungen zu untersuchen. Die Messungen beruhen auf der dipolaren Kopplung von Radikalen (Spinlabel). Da die gemessenen dipolaren Kopplungen eine anisotrope Wechselwirkung sind, können an starren Systemen neben den Abstandsinformationen auch die Orientierungen der beiden Spinlabel zueinander bestimmt werden. Diese zusätzliche Information ermöglicht es, mittels orientierungsselektiver PDS-Messungen noch genauer die Geometrie und Flexibilität des Systems zu untersuchen. Klassischerweise werden alle Messungen mit der Doppelfrequenztechnik PELDOR (engl. ’pulsed electron-electron double resonance’) durchgeführt. Einzelfrequenzmethoden basieren dagegen auf Breitbandanregung, die mit den technischen Gegebenheiten l nge nicht möglich war. Eine solche Sequenz ist 2D-SIFTER.ImmRahmen dieser Arbeit von PELDOR ausgehende, weiterentwickelte Simulationsprozedur etabliert. Eine große Herausforderung ist die eindeutige Interpretation der sensitiven orientierungsselektiven PELDOR-Messungen. Sie mittels MD (Moleküldynamik)-Simulationen zu beschreiben war bisher nur qualitativ möglich. Allerdings wurden mehrere neue Kraftfelder publiziert. Mit einem quantitativen Vergleich mit orientierungsselektiven PELDOR-Daten kann sichergestellt werden, dass die Flexibilität des Systems durch Kraftfelder richtig beschrieben ist. PELDOR-Zeitspuren, gemessen bei Raumtemperatur und 50 K, unterscheiden sich besonders in ihrer Dämpfung. Der physikalische Unterschied beider Messungen konnte durch MD-Simulationen qualitativ nachvollzogen worden. Eine Schwierigkeit für speziell orientierungsselektive PELDOR-Messungen ist die aufwendige Synthese von mit dem starren Ç-Label markierten Nukleinsäuren. Als Alternative wurde in der Sigurdsson-Gruppe das halbstarre IMU-Label entwickelt. Die Analyse der orientierungsselektiven Daten ergab ein klares Bild der Dynamik dieses Labels. Ein weiterer interessanter Spinlabel ist der `G. Dieser Label ist nicht kovalent gebunden, sondern interkaliert in eine Stelle der Nukleinsäure, in der eine Guanin- Base fehlt. MD-Simulationen im quantitativen Vergleich mit orientierungsselektiven PELDOR-Messungen an verschiedenen Magnetfeldern haben eine hohe Übereinstimmung. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Label, interkaliert in eine dsDNA, flippen kann, was zu einer Ausmittelung der Anisotropie führt, allerdings zu keiner Verbreiterung der Abstandsverteilung. Dagegen wird in der dsRNA dieses Flippen um die Einfachbindung sterisch gehindert, so dass neben dem Abstand auch die Orientierung des Labels bestimmt werden kann. Kurze dsRNA-Bausteine tendieren dazu, Oligomere zu bilden, was zu Multispineffekten führte. Zusätzlich beeinflusst diese Aggregation die Dynamik der einzelnen RNAs. Daher musste dieses ’end-to-end’-Stacking verhindert werden. Eine Nukleobasean einem Ende der dsRNA führt zu einer Dimerisierung, während eine Nukleobase an beiden Seiten dieses Stacking vollständig verhindert. Messungen mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen konnten zusätzlich zeigen, dass die Interaktion zweier dsRNAs bei höheren Salzkonzentrationen zunimmt.
In dieser Arbeit soll identifiziert werden, welcher der zahlreichen Vertreter einer Arzneistoffklasse sich letztlich auf dem Markt durchsetzen kann und ob bestimmte pharmakokinetische, pharmakodynamische, klinische oder praktische Substanzeigenschaften retrospektiv für den Markterfolg einer Substanz verantwortlich gemacht werden können. Zudem stellt sich die Frage, ob und in wie fern Analogpräparate einen Nutzen in der Arzneimitteltherapie mit sich bringen, obwohl ihnen zum Zeitpunkt ihrer Markteinführung nur ein geringer Innovationsgrad zugebilligt wurde. Um derartige Rückschlüsse ziehen zu können wurden exemplarisch folgende fünf Arzneistoffklassen untersucht, die sich durch eine Vielzahl an Vertretern auszeichnen: Arsphenamine, Sulfonamide, Benzodiazepine, Glucocorticoide sowie Betablocker. Der Untersuchungszeitraum bemisst sich folglich vom Anfang des 20. Jahrhunderts, als industriell gefertigte, chemisch definierte hochpotente Wirkstoffe die Therapie zu bestimmen begannen, bis etwa zum letzten Drittel des 20. Jahrhunderts als Preise und Kostenerstattungsfragen zusätzlich zu Substanzeigenschaften für den Markterfolg mitbestimmend wurden.
Chlorsilane stellen Schlüsselsubstanzen zur Herstellung von elementarem Silicium dar. Zum Beispiel ist HSiCl3 ein wichtiger Ausgangsstoff im Siemensprozess[1, 2]. Chlorsilane werden unter anderem zur Herstellung von Silikonen im Müller-Rochow-Prozess[3-5] verwendet. Bei beiden Prozessen werden Silylene[6-10] als Schlüsselmediate in den Reaktionen angenommen. So auch bei der Bildung von höheren Perchlorsilanen (Reaktion b), die nur in Form komplexer Polymergemischen erhalten werden. In der vorliegenden Dissertation wurde die Plausibilität eines auf Silylen basierenden Reaktionsmechanismus zur Bildung und Reaktivität von Chlorsilanen quantenchemisch untersucht.Mit den Berechnungen aus dieser Arbeit konnten diese molekularen Prozesse aufgeklärt werden[33-35].
Die quantenchemischen Rechnungen aus dieser Arbeit umfassen Kalibrierungsrechnungen an Chlorsilanen, um die Leistungsfähigkeit der quantenchemischen Methoden zu beurteilen.
Hierbei wurden berechnete Strukturen mit den experimentellen verglichen. Zusätzlich wurden Standardbildungsenthalpien berechnet, um diese auch mit den experimentellen Daten zu vergleichen. Nach Prüfung der Validität der Referenzmethoden wurde die Tragfähigkeit der rechengünstigeren Methoden der Dichtefunktionaltheorie evaluiert.
In Vereinbarung von Rechenaufwand und Genauigkeit einer Rechenmethode wurden thermochemische Stabilitäten, Reaktionsenergien zur Bildung von Chlorsilanen aus Schema 1 berechnet. Die Betrachtung der Reaktionsmechanismen erfolgte sowohl in der Gasphase als auch in Lösung. Dabei wurden die Bildung von cyclo-Chlorsilanen, kettenförmigen und verzweigten Chlorsilanen betrachtet. Unterstützend konnten alle Intermediate und Produkte unter Verwendung der ausgewählten quantenchemischen Methode mit 29Si-NMR-Rechnungen begleitet werden. Hierbei wurden auch Vergleichsdaten von nicht literaturbekannten 29Si-NMR Verschiebungen erstellt.