Biochemie und Chemie
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Ziel dieser Arbeit ist es, Möglichkeiten darzustellen, wie die Thematik Mikrowellenstrahlung und Ultraschall als nichtklassische Energieeintragsformen im Chemieunterricht allgemeinbildender Schulen behandelt werden kann. Technologien, die Mikrowellenstrahlung und Ultraschall nutzen, gewinnen immer mehr an Alltags- und Lebensweltbedeutung. Deshalb ist die experimentelle Erschließung dieser Thematik für den modernen Chemieunterricht, der sich an der praktischen Lebenswelt orientiert, von fachdidaktischem Interesse. Für den Chemieunterricht wurden einfache Experimente entwickelt, die mit haushaltsüblichen Geräten und Materialien durchgeführt werden können. Die Experimente demonstrieren die unterschiedlichen Eigenschaften und Wirkungen der beiden nichtklassischen Energieeintragsformen. Es wurde bei der Entwicklung der Experimente besonderer Wert darauf gelegt, dass sie von Schülern (1) selbst durchgeführt werden können. Für den Experimentalunterricht wurde eine Experimentiertechnik entwickelt, die es ermöglicht, durch Eintrag von Mikrowellenenergie zeit- und kostensparend Hochtemperaturprozesse in einem Temperaturbereich um 1.200 °C durchzuführen. Mit dieser Technik eröffnen sich vielfältige neue schulexperimentelle Möglichkeiten in diesem Temperaturbereich. In unterschiedlichen Schülerprojekten und Lehrerfortbildungsveranstaltungen wurde die Thematik eingeführt. Die entwickelten Experimente stießen dabei auf großes Interesse bei Schülern und Lehrern und wurden häufig in den Chemieunterricht übernommen. Im Experimentalunterricht kann die Thematik des nichtklassischen Energieeintrags durch Ultraschall und Mikrowelle sehr erfolgreich in der Sekundarstufe I und II vermittelt werden. (1) Aus Gründen der Kürze und besseren Lesbarkeit wird in dieser Arbeit bei geschlechtsbezogenen Begriffen nur eine Form verwendet. Es sind aber dennoch immer beide Geschlechter gleichberechtigt angesprochen.
Biophysical investigation of the ligand-induced assembling of the human type I interferon receptor
(2005)
Type I interferons (IFNs) elicit antiviral, antiproliferative and immunmodulatory responses through binding to a shared receptor consisting of the transmembrane proteins ifnar1 and ifnar2. Differential signaling by different interferons – in particular IFNalpha´s and IFNbeta – suggest different modes of receptor engagement. In this work either single ligand-receptor interactions or the formation of the extracellular part of a signaling complex were investigated referring to thermodynamics, kinetics, stoichiometry and structural organization. Initially an expression and purification strategy for the extracellular domain of ifnar1 (ifnar1-EC) using Sf9 insect cells yielding in mg amounts of glycosylated protein was established. Using reflectometric interference spectroscopy (RIfS) the interactions between IFNalpha2/beta and ifnar1-EC and ifnar2-EC was studied in order to understand the individual energetic contributions within the ternary complex. For IFNalpha2 a Kd of 5 µM for the interaction with ifnar1-EC was determined. Substantially tighter binding of IFNbeta with both ifnar2-EC and ifnar1-EC compared to IFNalpha2 was observed. For neither IFNalpha2 nor IFNbeta stabilization of the complex with ifnar1-EC in presence of soluble ifnar2-EC was detectable. In addition, no direct interaction between ifnar2 and ifnar1 was could be shown. Thus, stem-stem interactions between the extracellular domains of ifnar1 and ifnar2 do not seem to play a role for ternary complex formation. Furthermore, ligand-induced cross-talk between ifnar1-EC and ifnar2-EC being tethered onto solid-supported, fluid lipid bilayers was investigated by RIfS and total internal reflection fluorescence spectroscopy. A very stable binding of IFNalpha2 at high receptor surface concentrations was observed with an apparent kd approximately 200-times lower than for ifnar2-EC alone. This apparent kd was strongly dependent on the surface concentration of the receptor components, suggesting kinetic rather than static stabilization, which was corroborated by competition experiments. These results indicate that signaling is activated by transient cross-talk between ifnar1 and ifnar2, which is by several orders of magnitude more efficiently engaged by IFNbeta than by IFNalpha2. With respect to differential recognition of different IFNs ifnar1-EC was dissected into sub-fragments containing different of the four Ig-like domains. The appropriate folding and glycosylation of these proteins, also purified in mg amounts were confirmed by SDS-PAGE, size exclusion chromatography and CD-spectroscopy. Surprisingly, only one construct containing all three N-terminal Ig-like domains was active in terms of ligand binding, indicating that these domains were required. Competitive binding of IFNalpha2 and IFNbeta to both this fragment and ifnar1-EC was demonstrated. Cellular binding assays with different fragments, however, highlight the key role of the membrane-proximal Ig-like domain for the formation of an in situ IFN-receptor complex and the ensuing signal activation. Even substitution with Ig-like domains from homologous cytokine receptors did not restore high-affinity ligand binding. Receptor assembling analysis on supported lipid bilayer revealed that appropriate orientation of the receptor is required, which is controlled by the membrane-proximal Ig-domain. All results indicate that differential signalling is encoded by the efficiency of signalling complex formation, which is controlled by the binding affinity of IFNs to the extracellular domains of ifnar1 and 2.
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen am Cytochrom-bc1-Komplex aus Paracoccus denitrificans
(2005)
Cytochrom bc-Komplexe sind zentrale Enzyme energietransduzierender Elektronen-transportketten. Anerkanntes Funktionsprinzip ist der Q-Zyklus; mechanistische Details insbesondere der Chinoloxidation am Qo-Zentrum sind noch unklar. Ein Verständnis des Qo-Zentrums ist auch von Interesse, da hier Inhibitoren in Form von Fungiziden und Malariatherapeutika wichtige Anwendung finden. In den vergangenen Jahren wurde eine Reihe mitochondrialer Komplexe kristallographisch charakterisiert, die Struktur eines bakteriellen Enzyms steht jedoch aus. Hauptziel dieser Arbeit war es, Ansätze zur Strukturaufklärung des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans (P.d.) zu finden, der als homologes Enzym mitochondrialer Komplexe bei einfacher genetischer Zugänglichkeit ein wichtiges Modellsystem darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die Kristallisation des bc1-Komplexes aus S. cerevisiae aufgebaut, die mit Hilfe monoklonaler Antikörperfragmente (Fv) gegen die Rieske-Untereinheit (ISP) erreicht wurde; die Fv-Fragmente erleichtern die Ausbildung von Kristallkontakten. Die Epitopregion des Hefeenzyms wurde genetisch auf den bakteriellen Komplex übertragen, um dessen Ko-Kristallisation mit dem bereits verfügbaren Fv zu ermöglichen. Punktuelle Anpassungen führten zu keiner signifikanten Bindung, ein weitergehender Austausch des entsprechenden ISP-Bereichs verbesserte die Bindung hingegen deutlich. Die besten Ergebnisse konnten mit chimären Enzymen erzielt werden, bei denen die gesamte ISP-Ektodomäne durch das Hefe-Homologe ersetzt wurde. Aufbauend auf dieser Arbeit scheint die Fv-vermittelte Kristallisation des Enzyms ein greifbares Ziel. Eine komplementäre Strategie zielte auf die strukturelle Charakterisierung der Rieske-Ektodomäne (ISF). Das klonierte ISF wurde in E. coli überexprimiert, lag jedoch fast vollständig in inclusion bodies vor. Das ISF konnte in eine lösliche Form rückgefaltet werden, die anschließende chemische Rekonstitution zum Holo-Protein gelang jedoch nur mit einer Ausbeute von ~ 1 %. Die geringe Menge an löslichem ISF, die sich nach Expression in E. coli isolieren lässt, trägt kein [2Fe-2S]-Zentrum. Durch Koexpression der für die Biogenese von Eisen-Schwefel-Zentren relevanten Gencluster konnte die lösliche ISF-Fraktion in vivo in die Holo-Form konvertiert werden. Auch hier war aber die Gesamtausbeute für strukturelle Untersuchungen zu gering. Eine homologe Expression in P.d. war nur für das komplette ISP nachweisbar, nicht für das verkürzte ISF. Durch gerichtete Mutagenese konnte hier erstmals gezeigt werden, dass das bakterielle Rieske-Protein über den Tat-Translokationsweg in die Membran inseriert. Die Kristallstrukturen mitochondrialer bc1-Komplexe zeigen ein dimeres Enzym. Die Assoziation des bakteriellen Komplexes wurde in dieser Arbeit mit der analytischen Ultrazentrifugation untersucht, und auch hier wurde eindeutig ein Dimer nachgewiesen. Dynamische Messverfahren deuteten jedoch auf einen höheren Assoziationszustand hin. Es bleibt unklar, ob diese Diskrepanz durch Formparameter oder die Detergenzbindung begründet ist oder ob unter bestimmten Versuchsbedingungen möglicherweise Tetramere vorliegen. In situ ist der bc1-Komplex strukturell mit den Komplexen I und IV sowie dem Elektronenüberträger Cyt c552 assoziiert. Die Analyse verschiedener Deletionsstämme zeigte, dass Komplex I der Atmungskette durch diesen Superkomplex stabilisiert wird. Dieser Befund konnte kürzlich in anderen Arbeiten auch an menschlichen Mitochondrien bestätigt werden. Neben strukturellen Aspekten wurden am bc1-Komplex auch die H+-Translokation und die Chinonbindung untersucht. Da chemische Modifikationsexperimente zeigen, dass ein saurer Rest im ISP eine kritische Rolle für die Kopplung von H+-Translokation und Elektronentransport spielt, wurden durch gerichtete Mutagenese kombinatorisch saure Reste gegen entsprechende Säureamide ersetzt. Die biochemische Charakterisierung wurde nur für eine Fünffach-Mutante durchgeführt; diese erwies sich jedoch als zu instabil, um verlässliche Daten aus H+-Pumpexperimenten zu gewinnen. Die Charakterisierung der übrigen Mutanten scheint lohnenswert, da der relevante Aminosäurerest auch in anderen Arbeiten noch nicht identifiziert werden konnte. Der Gehalt des aufgereinigten Enzyms an spezifisch gebundenem Chinon wurde FTIR-spektroskopisch quantifiziert. Eine Stöchiometrie von ~ 3 Chinonmolekülen/Monomer stützt das double occupancy-Modell, demzufolge zwei Substratmoleküle am Qo-Zentrum binden; das dritte Chinon bindet am Qi-Zentrum. Partielle Extraktion des Chinons und Messungen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Substratbindung mit Protonierung eines sauren Rests einhergeht. Möglicherweise handelt es sich dabei um Glu295 des Cytochrom b, das auf Basis der Kristallstrukturen als primärer H+-Akzeptor am Qo-Zentrum diskutiert wird. Aufbauend auf dieser Arbeit können die an der Chinonbindung beteiligten Reste durch Mutagenese identifiziert werden.
Metallic radii rm are correlated with the ionic radii ri by linear relationships. For groups 1 up to 7 as well as for Al, Ga, In, Tl, Sn, and Pb the ionic radii refer to the maximum valences (oxidation states) as known from compounds according to rm ~ 1.16 x (ri + 0.64) [A° ]. For groups 8 up to 12, rm ~ 0.48 x (ri + 2.26) [°A] with valences W = 14 - G (G = group number). These valences are considered regular (Wr). For groups 1 up to 12, they obey the equation Wr = 7 - |G - 7|. According to this equation all outer s electrons and the unpaired d electrons should be involved in chemical bonding, i.e. in the cohesion of the element in the solid state. From the melting temperatures and the atomic volumes it is concluded, however, that only 19 out of the 30 d-block elements have regular valences, namely the elements of groups 3, 5, 6, 10, 11 as well as Os, Ir, Zn, Cd, and possibly Ru. All of the non-regular valences are lower than the regular ones. Four of them are integers: Mn 3; Fe, Co 4; Re 6.
Mitochondial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) the largest multiprotein enzyme of the respiratory chain, catalyses the transfer of two electrons from NADH to ubiquinone, coupled to the translocation of four protons across the membrane. In addition to the 14 strictly conserved central subunits it contains a variable number of accessory subunits. At present, the best characterized enzyme is complex I from bovine heart with a molecular mass of about 980 kDa and 32 accessory proteins. In this study, the subunit composition of mitochondrial complex I from the aerobic yeast Y. lipolytica has been analysed by a combination of proteomic and genomic approaches. The sequences of 37 complex I subunits were identified. The sum of their individual molecular masses (about 930 kDa) was consistent with the native molecular weight of approximately 900 kDa for Y. lipolytica complex I obtained by BN-PAGE. A genomic analysis with Y. lipolytica and other eukaryotic databases to search for homologues of complex I subunits revealed 31 conserved proteins among the examined species. A novel protein named “X” was found in purified Y. lipolytica complex I by MALDI-MS. This protein exhibits homology to the thiosulfate sulfurtransferase enzyme referred to as rhodanese. The finding of a rhodanese-like protein in isolated complex I of Y. lipolytica allows to assume a special regulatory mechanism of complex I activity through control of the status of its iron-sulfur clusters. The second part of this study was aimed at investigating the possible role of one of these extra subunits, 39 kDa (NUEM) subunit which is related to the SDRs-enzyme family. The members of this family function in different redox and isomerization reactions and contain a conserved NAD(P)H-binding site. It was proposed that the 39 kDa subunit may be involved in a biosynthetic pathway, but the role of this subunit in complex I is unknown. In contrast to the situation in N. crassa, deletion of the 39 kDa encoding gene in Y. lipolytica led to the absence of fully assembled complex I. This result might indicate a different pathway of complex I assembly in both organisms. Several site-directed mutations were generated in the nucleotide binding motif. These had either no effect on enzyme activity and NADPH binding, or prevented complex I assembly. Mutations of arginine-65 that is located at the end of the second b-strand and responsible for selective interaction with the 2’-phosphate group of NADPH retained complex I activity in mitochondrial membranes but the affinity for the cofactor was markedly decreased. Purification of complex I from mutants resulted in decrease or loss of ubiquinone reductase activity. It is very likely that replacement of R65 not only led to a decrease in affinity for NADPH but also caused instability of the enzyme due to steric changes in the 39 kDa subunit. These data indicate that NADPH bound to the 39 kDa subunit (NUEM) is not essential for complex I activity, but probably involved in complex I assembly in Y. lipolytica.
Die bei der Photosynthese verwendete Lichtenergie wird zu einem großen Anteil von Lichtsammlersystemen bereitgestellt. In der pflanzlichen Photosynthese wird unterschieden zwischen Lichtsammlersytem I (light harvesting complex I, LHC-I), assoziiert mit Photosystem I (PS-I) und Lichtsammlersystem II (light harvesting complex II, LHC-II), assoziiert mit Photosystem II (PS-II). LHC-II ist der häufigste Protein-Pigment Komplex der Chloroplasten und bindet bis zu 50% aller Chlorophylle in der Thylakoidmembran. Der Protein-Pigment Komplex LHC-II hat vier, teils miteinander verwandte Funktionen in der Photosynthese. I) Die Sammlung und Weiterleitung von Lichtenergie, II) Stabilisierung der Granastapel, III) Ausgleich der Anregungsenergie von PS-I und PS-II, IV) Schutz der Photosynthese vor Überanregung mittels nichtphotochemischer Eliminierung von Anregungsenergie (NPQ). In der Pflanze bildet LHC-II Trimere in verschiedenen Kombinationen dreier Isoformen (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3), wobei Lhcb1 mit 70-90% den Hauptteil des LHC-II stellt. Jedes Monomer bindet 8 verschiedene Co-Faktoren in unterschiedlichen Mengen, die ca. 30% seiner Masse ausmachen. Die drei Isoformen des LHC-II sind in allen Pflanzen stark konserviert. Die funktionelle Bedeutung der Isoformen ist jedoch weitestgehend unklar. Dies liegt vor allem an der schwierigen Isolierung reiner Isoformen aus Pflanzenmaterial. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden deshalb alle drei Isoformen rekombinant hergestellt und mit getrennt isolierten Lipiden und photosynthetischen Pigmenten in ihre native Form gefaltet. Die anschließende biochemische und spektroskopische Charakterisierung zeigte einen hohen Grad an Homologie zwischen den drei Isoformen, wobei Lhcb3 die größten Unterschiede aufwies (Standfuss und Kühlbrandt 2004). Die wahrscheinlichsten Funktionen für Lhcb1 und Lhcb2 ist die Anpassung der Photosynthese an variierende Lichtbedingungen. LHC-II Heterotrimere mit Lhcb3 Anteil könnten an der Weiterleitung von Lichtenergie von der Haupt Lhcb1/Lhcb2 Antenne zum PS-II Reaktionszentrum beteiligt sein. Für die Erforschung des LHC-II war das mittels Cryo-Elektronenmikroskopie an 2D Kristallen erstellte atomare Modell des Komplexes von enormer Bedeutung. Ein tiefes Verständnis der Funktionen des LHC-II benötigt jedoch eine Struktur von höherer Auflösung, welche mit 2D Kristallen nur schwer zu erreichen ist. Im Verlauf der Arbeit wurden deshalb mehr als 100000 3D Kristallisationsexperimente durchgeführt, wodurch die Kristallisation von aus Erbsenblättern isoliertem und in vitro gefaltetem LHC-II gelang. Die 3D Kristalle aus nativem Material zeigten einen für die röntgenkristallographische Strukturaufklärung ausreichenden Ordnungsgrad und führten zu einer Struktur des LHC-II bei 2.5 Å Auflösung (Standfuss et al., eingereicht). Die Struktur zeigt 223 der 232 Aminosäuren und die Position und Orientierung von 4 Carotinoiden (2 Luteine, 1 Neoxanthin und 1 Violaxanthin), 14 Chlorophyllen (8 Chl a und 6 Chl b) und zwei Lipiden (PG und DGDG) pro Monomer. Diese Informationen sind essentiell für das Verständnis des Energietransfers innerhalb des LHC-II und zu den Photoreaktionszentren und sollten zusammen mit der großen Anzahl von spektroskopischen Untersuchungen eine zukünftige detaillierte Modellierung dieser ultraschnellen und extrem effizienten Energietransfer Prozesse ermöglichen. Auf Basis der Ladungsverteilung der stromalen Seite des Komplexes konnte ein Modell für die Beteiligung des LHC-II an der Stapelung von Grana in Chloroplasten erstellt werden. Dieses liefert außerdem eine plausible Erklärung für den mittels Phosphorylierung des N-Terminus gesteuerten Ausgleich von Anregungsenergie zwischen PS-I und PS-II. Die 2.5 Å Struktur des LHC-II zeigt schließlich einen einfachen aber effektiven Mechanismus zur Optimierung und Schutz des Photosyntheseapparates mittels NPQ. Dieser benötigt keine Strukturänderungen des LHC-II oder der restlichen Lichtsammelantenne und beruht auf der reversiblen Bindung der Xanthophylle Violaxanthin und Zeaxanthin an LHC-II. Diese Arbeit liefert damit Beiträge zu allen Funktionen des LHC-II Komplexes und hilft damit grundlegende Regulationsmechanismen und die Bereitstellung von solarer Energie für die pflanzliche Photosynthese zu verstehen.
Calcium-activated potassium channels are fundamental regulators of neuron excitability. SK channels are activated by an intracellular increase of Ca++ (such as occurs during an action potential). They have a small single channel conductance (less than 20pS) and show no voltage dependence of activation. To date, there are only a few examples of high-resolution structures of eukaryotic membrane proteins. All of them were purified from natural sources. Since no abundant natural sources of eukaryotic K+ channels are available we overexpressed rSK2 in order to produce the quantities necessary for structural analysis. Unfortunately the Pichia pastoris expression system did not yield sufficient amount of pure protein, mainly because most of the protein was retained by in the ER and was only partially soluble. Subsequently, two constructs were expressed: SK2-FCYENE (containing a specific sequence that promotes surface expression), and SK2-q-CaM a concatamer of SK2 and calmodulin. Although these proved an improvement in terms of solubilisation, little improvement was found in terms of amounts of purified material obtained. For this reason we tested the Semliki Forest virus expression system, since the protein is expressed in a mammalian system where we hoped that it would be trafficked in the same way as in vivo. Using this system it was possible to express rSK2 and solubilise it with several detergents and to achieve much better purification. However, the levels were still not sufficient for high-resolution structural studies, although sufficient for single particle electron microscopy analysis.
Molecular dynamics (MD) simulation serves as an important and widely used computational tool to study molecular systems at an atomic resolution. No experimental technique is capable of generating a complete description of the dynamical structure of the biomolecules in their native solution environment. MD simulations allow us to study the dynamics and structure of the system and, moreover, helps in the interpretation of experimental observations. MD simulation was first introduced and applied by Alder and Wainwright in 1957 \cite{Alder57}. However, the first MD simulation of a macromolecule of biological interest was published 28 years ago \cite{McCammon77}. The simulation was concerned with the bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) protein, which has served as the hydrogen molecule'' of protein dynamics because of its small size, high stability, and relatively accurate X-ray structure available in 1977 \cite{Deisenhofer75}. This method is now widely used to tackle larger and more complex biological systems \cite{Groot01,Roux02} and has been facilitated by the development of fast and efficient methods for treating the long-range electrostatic interactions \cite{Essmann95}, the availability of faster parallel computers, and the continuous development of empirical molecular mechanical force fields \cite{Langley98,Cheatham99,Foloppe00}. It took several years until the first MD simulations of nucleic acid systems were performed \cite{Levitt83,Tidor83,Prabhakaran83,Nilsson86}. These investigations, which were also performed in vacuo, clearly demonstrated the importance of proper handling of electrostatics in a highly charged nucleic acid system, and different approaches, such as reduction of the phosphate charges and addition of hydrated counterions, have been applied to remedy this shortcoming and to maintain stable DNA structures. A few years later, the first MD simulation of a DNA molecule, including explicit water molecules and counterions was published \cite{Seibel85}. Various MD simulations on fully solvated RNA molecules with explicit inclusion of mobile ions indicated the importance of proper treatment of the environment of highly charged nucleic acids \cite{Lee95,Zichi95,Auffinger97,Auffinger99}. Given the central roles of RNA in the life of cells, it is important to understand the mechanism by which RNA forms three dimensional structures endowed with properties such as catalysis, ligand binding, and recognition of proteins. Furthermore, the increasing awareness of the essential role of RNA in controlling viral replication and in bacterial protein synthesis emphazises the potential of ribonucleicacids as targets for developing new antibacterial and new antiviral drugs. Driven by fruitful collaborations in the Sonderforschungsbereich RNA-Ligand interactions" the model RNA systems in this study include various RNA tetraloops and HIV-1 TAR RNA. For the latter system, the binding sites of heteroaromatic compounds have been studied employing automated docking calculations \cite{Goodsell90}. The results show that it is possible to use this tool to dock small rigid ligands to an RNA molecule, while large and flexible molecules are clearly problematic. The main part of this work is focused on MD simulations of RNA tetraloops.
The quinol:fumarate reductase (QFR) is the terminal reductase of anaerobic fumarate respiration, the most commonly occurring type of anaerobic respiration. This membrane protein complex couples the oxidation of menaquinol to menaquinone to the reduction of fumarate to succinate. The three-dimensional crystal structure of the QFR from Wolinella succinogenes has previoulsy been solved at 2.2 Å resolution. Although the diheme-containing QFR from W. succinogenes is known to catalyze an electroneutral process, structural and functional characterization of parental and variant enzymes has revealed active site locations which indicate electrogenic catalysis across the membrane. A solution to this apparent controversy was proposed with the so-called “Epathway hypothesis”. According to this, transmembrane electron transfer via the heme groups is strictly coupled to a parallel, compensatory transfer of protons via a transiently established pathway, which is inactive in the oxidized state of the enzyme. Proposed constituents of the E-pathway are the side chain of Glu C180, and the ring C propionate of the distal heme. Previous experimental evidence strongly supports such a role for the former constituent. One aim of this thesis is to investigate by a combination of specific 13C-heme propionate labeling and FTIR difference spectroscopy whether the ring C propionate of the distal heme is involved in redox-coupled proton transfer in the QFR from W. succinogenes. In addition to W. succinogenes, the primary structures of the QFR enzymes of two other e- proteobacteria are known. These are Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori, which unlike W. succinogenes are human pathogens. The QFR from H. pylori has previously been established to be a potential drug target, and the same is likely for the QFR from C. jejuni. The two pathogenic species colonize mucosal surfaces causing several diseases. The possibility of studying these QFRs from these bacteria and creating more efficient drugs specifically active for this enzyme depends substantially on the availability of large amounts of high-quality protein. Further, biochemical and structural studies on QFR enzymes from e- proteobacteria species other than W. succinogenes can be valuable to enlighten new aspects or corroborate the current understanding of this class of membrane proteins.
Im ersten Teil dieser Studie wurde zunächst untersucht, welche Mechanismen für die akute und chronische Desensitivierung der glattmuskulären löslichen Guanylylcyclase (GC) gegenüber NO bei intakter Gefäßfunktion verantwortlich sind. Das Kontraktions- und Relaxationsverhalten von isolierten Rattenaorten im Organbad diente als Maß für die GC-Aktivität. Es wurden sowohl der Einfluß des endogen gebildeten NO als auch der Einfluß von exogen zugeführtem NO untersucht. Hierbei wurde ermittelt, ob die Sensitivitätsänderung der GC gegenüber NO direkt durch NO vermittelt wird oder ob eine gesteigerte cGMP-Bildung die indirekte Ursache für die Desensitivierung des Rezeptorproteins ist. Es konnte gezeigt werden, daß die Desensitivierung aufgrund der basalen NO-Freisetzung erfolgte. Wir konnten weiterhin zeigen, daß exogen zugeführtes NO die glatte Gefäßmuskulatur der Ratte gegenüber NO in gleichem Maße desensitiviert wie endogen gebildetes NO. Durch Untersuchungen mit dem Atrialen Natriuretischen Faktor konnten wir den Signaltransduktionsweg näher charakterisieren und zeigen, daß sehr wahrscheinlich eine gesteigerte cGMP-Bildung für die akute Desensitivierung der GC verantwortlich ist. Ergänzend führten wir Analysen über das Redoxgleichgewicht der GC durch. Hierzu wurden neu entwickelte selektive Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC - S973448 und HMR1766 (schwefelsubstituierte Sulfonylamino-carbonsäure-N-arylamide) - verwendet. Wir konnten in unseren Befunden zeigen, daß die akute Desensitivierung der GC durch physiologische Konzentrationen von NO nicht auf einer Oxidation des Hämeisens des Enzyms beruht. In Tiermodellen wurden die Auswirkungen einer chronischen Aktivierung der Eisen (II)-Form und der Eisen (III)-Form der GC auf die NO-Sensitivität, den Redoxstatus und die Proteinexpression der GC analysiert. Außerdem wurde untersucht, ob Aktivatoren der Häm- oxidierten GC bei chronischer in vivo Anwendung eine Toleranz induzieren. Hierbei wurde insbesondere die Frage berücksichtigt, inwieweit diese Substanzen langfristig in der Lage wären, organische Nitrate bei der Behandlung von Krankheitsbildern mit endothelialer Dysfunktion, wie z. B. Atherosklerose und Bluthochdruck, zu ersetzen. Wir konnten erstmals zeigen, daß die Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC wesentliche Vorteile gegenüber den organischen Nitraten aufweisen, da dieBehandlung der Ratten mit S973448 und HMR1766 weder über einen Zeitraum von drei Tagen noch über vier Wochen zu einer Wirkungsabschwächung dieser Substanzen (Eigentoleranz) führt. Auch gegenüber organischen Nitraten sowie endogenem NO (Kreuztoleranz) konnten wir trotz der chronischen Aktivierung der Häm-oxidierten GC keinen Wirkungsverlust dieser Pharmaka beobachten. Expressionsänderungen der GC konnten wir ebenfalls nicht feststellen. Es ist daher anzunehmen, daß die neuen, selektiven Aktivatoren günstigere Eigenschaften als die bisher verwendeten organischen Nitrate aufweisen und therapeutisch zur Behandlung der genannten Herz- Kreislauf- Erkrankungen geeignet sind. Im zweiten Teil der Arbeit untersuchten wir in Tiermodellen mit einer experimentell induzierten Störung der Funktion des glatten Gefäßmuskels, ob die chronische Aktivierung der Eisen (II)-Form der GC zu einer Veränderung der NO-Empfindlichkeit, des Oxidationsstatus des Enzyms und der Expression der GC-Untereinheiten a (alpha) 1 und ß(beta) 1 führt. Wir konnten im Tiermodell der nitrattoleranten Ratte sowohl eine Toleranz gegenüber Nitroglycerol als auch gegenüber endothelabhänigen Dilatatoren und - wenn auch nicht so ausgeprägt - gegenüber Natriumnitroprussid (Kreuztoleranz) beobachten. Einen Wirkungsverlust gegenüber den Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC konnten wir nicht feststellen. Weiterhin zeigten wir, daß die chronische Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems zu einer gesteigerten Superoxidbildung führt, die wiederum eine verminderte Bioverfügbarkeit von NO bewirkt. Dies führt zu einer kompensatorisch gesteigerten Expression der GC-Untereinheiten ( a(alpha) 1 / ß (beta) 1 ) in nitrattoleranten Rattten. Im Tiermodell der genetisch salzsensitiven Dahl-S-Ratte konnten wir nachweisen, daß die durch den renalen Bluthochdruck hervorgerufene Gefäßdysfunktion in den Rattenaorten zu einer Abnahme der Sensitivität gegenüber Acetylcholin und Natriumnitroprussid sowie dem NO- unabhängigen, direkten Aktivator der GC, YC-1, führt. Auch war die Expression beider GC-Untereinheiten in den Aorten der hypertensiven Ratten vermindert.