Biochemie und Chemie
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Der erste Teil dieser Promotionsarbeit umfasste die Etablierung und Validierung eines in vitro Testsystems zur Auffindung von Substanzen, die selektiv die Interaktion der mitogenen Signalmoleküle Ras und Raf inhibieren können. Die Deregulation der Ras-Signalkaskade spielt in einer Vielzahl maligner Transformationen eine bedeutende Rolle. Daher besteht in der pharmazeutischen Forschung großes Interesse an der Auffindung von Inhibitoren, die in der Lage sind, solche proliferativen Signale zu unterbinden und möglicherweise Ras- vermittelte Malignität einzudämmen. Das im Rahmen dieser Promotionsarbeit entwickelte Testsystem zur Detektion von Inhibitoren der Ras-Raf-Proteininteraktion basiert auf der intracistronischen ß-Galaktosidase Komplementation. Hierbei werden zwei sich nicht komplementierende Deletionsmutanten der ß-Galaktosidase, deren Affinität zueinander sehr niedrig ist, mit interagierenden Proteinpaaren fusioniert, wodurch es zur Ausbildung eines aktiven Enzymkomplexes kommen kann, dessen Aktivität sich über die Umwandlung eines fluorogenen Substrats nachweisen lässt. Bei Expression der interagierenden Fusionsproteine im E.coli Stamm ER2507 zeigte sich in intakten Zellen eine spezifische Komplementation der Interaktionspartner. Eine in vitro Komplementation der Fusionsproteine konnte trotz nativer Aufreinigung nicht beobachtet werden, da die Proteine im zellfreien System unter den gegebenen Versuchsbedingungen nur sehr schwach miteinander interagierten. Das zelluläre Testsystem ließe sich in dieser Form für die Wirkstoffsuche nach Inhibitoren der Ras-Raf-Proteininteraktion einsetzen. Die Evaluierung und Validierung muss aber für jedes interagierende Proteinpaar gesondert erfolgen. Der zweite Teil dieser Promotionsarbeit umfasste die Entwicklung und Charakterisierung zellulärer Systeme zur Validierung von PKB/Akt als Zielstruktur für die Entwicklung neuartiger anti-tumoraler Strategien. PKB/Akt wird in der Literatur als zentraler Mediator von zellulären Überlebenssignalen beschrieben. Zudem weisen verschiedene Tumore eine konstitutive Aktivierung und/oder eine Überexpression von PKB/Akt auf, was möglicherweise mit dem Auftreten von Chemoresistenz korreliert. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit konnte durch die Etablierung eines geeigneten zellulären Modells die Bedeutung von PKB/Akt bei der Verhinderung des Auftretens von Anoikis herausgestellt werden. Darüber hinaus gelang es erstmals, einen kausalen Zusammenhang zwischen konstitutiver Aktivierung von PKB/Akt und der Vermittlung von Chemoresistenz in vitro als auch in vivo darzulegen. Bei der molekularen Untersuchung der PKB/Akt- vermittelten Desensitivierung von Lungenkarzinomzellen gegenüber Zytostatika zeigte sich, dass PKB/Akt Chemoresistenz durch breit gefächerte Eingriffe in die apoptotischen Hauptsignalwege über eine Vielzahl von Mechanismen wie beispielsweise die verstärkte Phosphorylierung der Initiator-Caspase 9, die erhöhte Expression des anti-apoptotischen Proteins Bcl-xL oder die verlangsamte Induktion von p53 vermittelt. Die selektive Inhibition der Kinaseaktivität von PKB/Akt stellt somit einen interessanten Ansatz für neuartige therapeutische Strategien dar, die darauf abzielen, Tumorzellen, die Chemoresistenz aufgrund einer hohen intrinsischen Aktivität von PKB/Akt aufweisen, durch Applikation eines PKB/Akt-Inhibitors gegenüber Standard-Chemotherapeutika zu resensitivieren und auf diese Weise eine Vielzahl von chemoresistenten Tumoren einer Therapie zugänglich zu machen.
Für verschiedene gentherapeutische Ansätze zur Behandlung der HIV-Infektion oder anderer erworbener oder angeborener Krankheiten wie z. B. der angeborenen Immunschwäche SCID ist ein hocheffizienter Gentransfer in CD4-positive T- Lymphozyten erforderlich. In der vorliegenden Arbeit wurden daher geeignete retrovirale Pseudotypvektoren weiterentwickelt. Unter Einsatz von Markergenen wurden Methoden der Transduktion primärer humaner Lymphozyten optimiert. Schließlich wurden verschiedene potentielle therapeutische anti-HIV-Gene durch retroviralen Gentransfer in humane T-Zelllinien übertragen und hinsichtlich der Hemmung der in-vitro Replikation verschiedener HIV-Stämme verglichen. Zunächst wurden stabile Verpackungszelllinien zur Herstellung von [MLV(HIV-1)]- und [MLV(GaLV)]-Pseudotypvektoren entwickelt, die ein für die Analyse der Transduktionseffizienz geeignetes Markergen übertragen. [MLV(HIV-1)]-Vektoren konnten mit Titern bis zu 2 x 10 hoch 5 i.E. / ml hergestellt werden. Die Optimierung der Kultivierung primärer humaner T-Lymphozyten vor dem ex- vivo Gentransfer ergab, dass eine 24-stündige PHA/IL-2 Stimulation mit anschließender 48-stündiger Kultivierung in IL-2 Medium optimal für die Transduktion primärer CD4-positiver T-Lymphozyten unter weitgehender Erhaltung des Expressionsmusters der Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR5 ist. Bei längerer Stimulation mit PHA und IL-2 verändert sich sowohl das CD4/CD8-Verhältnis als auch die CCR5-Expression gegenüber nativem Blut signifikant. Die Analyse der Expression des übertragenen Markergens und anderen Oberflächenmarkern der Zellen nach der Transduktion zeigte eine strikte Abhängigkeit der Transduktion der [MLV(HIV-1)]-Vektoren vom HIV-Rezeptor CD4, während herkömmliche [MLV(GaLV)]-Vektoren sowohl CD4-positive als auch CD4-negative Zellen transduzierten. Die Effizienz von [MLV(HIV-1CXCR4)]- Vektoren für CD4-positive Zellen war signifikant höher als die der [MLV(GaLV)]-Vektoren, während die Transduktionseffizienz der [MLV(HIV-1CCR5)]-Vektoren aufgrund der geringen Anzahl CCR5-positiver CD4-T-Zellen am niedrigsten war. Zwei Tage nach der Transduktion wurde eine reduzierte Korezeptorexpression in den Zellen nachgewiesen. Gründe hierfür könnten die Internalisierung der Korezeptoren nach der Transduktion oder eine durch die Kultivierung der Zellen bedingte Änderung der Expression sein. Nach weiterer Optimierung des retroviralen Gentransferprotokolls, u.a. durch Verwendung autologen Plasmas, konnten schließlich bei einmaliger Transduktion mit einer m.o.i. von 5 mit den [MLV(HIV-1CXCR4)]-Vektoren Transduktionsraten von bis zu 80 % erreicht werden. Zum Vergleich der Wirkung potentieller anti-HIV-Gene, die mit den neuen Vektoren in der Gentherapie des Immunschwächesyndroms AIDS eingesetzt werden könnten, wurden fünf verschiedene HIV-Inhibitoren (zwei intrazellulär exprimierte Antikörperfragmente (scFv) gegen HIV-1 Integrase und Reverse Transkriptase, zwei Ribozyme, die die HIV-1 RNA in der 5´-LTR oder im Pol- Leserahmen spezifisch spalten, sowie Interleukin-16) in den gleichen Transfervektor kloniert und durch retroviralen Gentransfer in die T-Zelllinie SupT1 übertragen. In Infektionsversuchen mit zwei unterschiedlichen HIV-1 Stämmen vermittelte jedoch keiner der potentiellen Inhibitoren eine signifikante Resistenz gegenüber HIV-1. Erst nach Sortierung der Kulturen auf starke Expression der übertragenen Gene konnte in den sortierten Zellen eine geringe Hemmwirkung des 5´-LTR-spezifischen Ribozyms auf die in-vitro Replikation des Stammes HIV-1IIIB, nicht jedoch auf die des Stammes HIV-1NL4-3 gezeigt werden. Die Signifikanz dieser Beobachtung muß über den Vergleich der Hemmwirkung weiterer Inhibitorgene geklärt werden.
In bestimmten methanogenen Archaea wurde vor einigen Jahren eine metallfreie Hydrogenase gefunden, die den reversiblen und stereoselektiven Transfer eines Hydridions von Wasserstoff auf die an den C1-Carrier Tetrahydroniethanopterin (H4MPT) gebundene Methenyl-Gruppe katalysiert. Damit stellt dieses Enzym den ersten und einzigen rein organischen Hydrogenierungskatalysator dar, den man in der Natur kennt. Ziel der vorgelegten Arbeit war die kristallographische Bestimmung der Enzymstruktur. Versuche zur Strukturlösung des in aktiver Form aus M. marburgensis isolierten Enzyms durch mehrfachen isomorphen Ersatz, über die anomale Dispersion an nicht-isomorphen Quecksilberderivaten und die des Selens an mit Selenomethionin markiertem Enzym verliefen nicht erfolgreich. Ursächlich hierfür war die perfekte meroedrische Zwillingsbildung der Kristalle. Für die beiden heterolog produzierten, inaktiven Apoenzyme aus den Hyperthermophilen M. jannaschii und M. kandleri wurden in dieser Arbeit effektive Expressions- und Reinigungsprotokolle entwickelt. Für das Enzym aus M. jannaschii wurden Mikrokristalle erhalten, die lediglich ein Proteolysefragment von etwa der halben Masse des Vollängenproteins enthalten. Kristalle des Enzyms aus M. kandleri konnten durch serielles Microseeding so weit verbessert werden, daß die Durchführung eines MAD-Experiment möglich wurde. Erst unter Verwendung vor kurzem entwickelter direkter Methoden (Shake-and-Bake) gelang die Strukturlösung bei einer Auflösung von 2.8 Å. Die Monomere bilden ein sehr eng assoziiertes Homodimer; zwei dieser Dimere sind zu einem locker assoziierten Tetramer verbunden. Jedes Monomer besitzt zwei Domänen. Die N-terminale Domäne von etwa 255 Resten besitzt eine Faltung, wie sie für Dinukleotid-bindende Enzyme typisch ist, mit einem zentralen, verdrehten achtsträngigen beta-Faltblatt. Die C-terminale Domäne von etwa 100 Resten besitzt dagegen weitgehend alpha-helikale Struktur und ist für die außerordentlich enge Assoziation des Homodimers verantwortlich. Beide Domänen sind durch eine gestreckte, flexible Verbindung verknüpft. Im Dimer entstehen dadurch zwei tiefe Spalten, die von Anteilen der N-terminalen Domäne eines und der C-terminalen Domäne des jeweils anderen Monomers begrenzt werden. Das aktive Zentrum liegt wahrscheinlich in dieser Spalte, wobei postuliert wird, daß der fest gebundene Cofaktor eher mit der größeren N-terminalen Domäne assoziiert ist und das Substrat zwischen den Domänen bindet. An der Bindung dürfte die C-terminale Domäne und möglicherweise auch direkt der Cofaktor beteiligt sein. Die Struktur zeichnet sich durch außergewöhnlich hohe Tenmperaturfaktoren ans. Für das Enzym aus M. marburgensis konnte eine Lösung durch molekularen Ersatz erhalten werden. Da der für die Katalyse benötigte, noch unbekannte Cofaktor nicht in der Struktur enthalten ist, ist eine weitergehende Diskussion des enzymatischen Mechanismus noch nicht möglich. Die Verfügbarkeit eines ersten Strukturmodells der metallfreien Hydrogenase stallt aber bereits einen entscheidenden Schritt auf dem Weg zum Verständnis dieses ungewöhnlichen Hydrogenierungskatalysators dar.
Der lentivirale Gentransfer in humane blutbildende Stammzellen ist in Hinblick auf eine kurative Gentherapie von angeborenen und erworbenen Erkrankungen des hämatopoetischen Systems und er Krebstherapie von Bedeutung. Die Fähigkeit, sowohl zu proliferieren als auch in alle hämatopoetische Linien zu differenzieren, macht die pluripotenten CD34 - Stammzellen zu einem idealen Ziel für die dauerhafte Präsenz von Transgenen. Der Erfolg einer Gentherapie ist nicht nur abhängig von der Effizienz des Transfers des therapeutischen Gens in hämatopoetischen Stammzellen, sondern auch von der dauerhafte Expression des Transgens. Ein Modell zur Entwicklung einer somatischen ex vivo Gentherapie in hämatopoetischen Stammzellen ist die chronische Granulomatose (CGD). Die Krankheit beruht auf der genetisch bedingten Fehlfunktion der NADPH-Oxidase und ist mit wiederkehrenden, schweren und lebenslang auftretenden Infektionen verbunden. Eindringende Mikroorganismen wie Pilze und Bakterien werden aufgenommen, können jedoch in den phagozytierenden Vakuolen nicht abgetötet werden, da keine Sauerstoffradikale, Wasserstoffperoxid oder Folgeprodukte gebildet werden. Eine somatische Gentherapie, die eine autologe Knochenmarktransplantation mit genetisch modifizierten Zellen vorsieht, könnte CGD-Patienten die Möglichkeit einer kurativen Therapie eröffnen. Als Grundlage für die Entwicklung einer lentiviralen Gentherapie wurden zunächst lentivirale Vektoren konstruiert und mit diesen die Bedingungen der transienten Transfektion im Hinblick auf einen hohen Virustiter optimiert. Diese Vektoren wurden auf Basis des humanen Immundefizienzvirus (HIV) konstruiert und waren alle aufgrund von Deletionen in 3´ LTR selbst-inaktivierend. Das bedeutet, daß nach der reversen Transkription kein viraler Promotor mehr enthalten war, und damit die Transgen-Expression über einen internen Promotor initiiert wurde. Der pSIN-GFP Vektor enthielt grünes Fluoreszenzprotein (GFP) als Markergen und einen internen Cytomegalievirus(CMV)-Promotor. Durch Austausch der Promotor- /"Enhancer"-Sequenzen in der 5´LTR entstand der pCGWS Vektor, der unabhängig vom Tat- Transaktivator war. Die Expressionsrate konnte durch Insertion des posttranskriptionell regulatorisch wirkende Element (WPRE), das hinter das Transgene kloniert wurde, erhöht werden. Der pCIGWS Vektor wurde durch Einfügen einer multiple Klonierungsstelle und eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) zwischen dem internen Promotor und dem Transgen generiert. Dieser Vektor erlaubte jedoch nicht, wie gewünscht, die gleichzeitige Detektion der Expression eines Transgens und des Markerproteins. Die im Rahmen der Optimierung der Transfektionsbedingungen wurden unterschiedliche Verhältnisse der zur Virusproduktion notwendigen drei Plasmide zueinander ausgetestet. Die beobachteten Schwankungen des Virustiters waren bei den gewählten Verhältnissen nicht signifikant. Mit der Erhöhung der DNA-Menge an Hüllprotein Plasmid konnte auch in diesem Versuch eine vermehrte Bildung von Synzytien beobachtet werden, die sich negativ auf den Titer auswirkte. Die Behandlung der Transfektionsansätze mit Natriumbutyrat (NaBut) ergab eine deutliche Steigerung des Virustiters, wobei die Steigerung nicht mit dem Titer, der ohne NaBut erreicht wurde, korrelierte. Im Experiment zur Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Kulturmedien auf den Titer, wurden für die verwendeten Medien keine großen Unterschiede festgestellt. Bei den Experimenten zur Konzentrierung von infektiösen Viruspartikeln haben sich Ultrazentrifugation, "Low Speed"-Zentrifugation und Anionenaustauschchromatographie als Methoden bewährt. Mit diesen Verfahren konnten konzentrierte Viruslösungen generiert werden, die sehr hohe Transduktionseffizienzen auf Zellinien zeigten. Mit den angereicherten Viruspartikellösungen konnten auch CD34 -Stammzellen erfolgreich transduziert werden. Im Hinblick auf Angaben aus der Literatur konnten vergleichbare Transduktionseffizienzen erzielt werden, wobei hier fast ausschließlich ultrazentrifugierter Virusüberstand verwendet wurde. Mit der Etablierung des chromatographischen Verfahrens zur Anreicherung von Viren konnte ein alternatives System aufgezeigt werden. Am Modell der X-chromosomal gebundenen chronischen Granulomatose (X-CGD) konnte durch lentiviralen Transfer eines therapeutischen Gens (gp91phox) die funktionelle Rekonstitution der NADPH-Oxidase nachgewiesen werden. Dazu wurden lentivirale Vektoren konstruiert, die gp91phox als therapeutisches Gen enthielten. In molekularbiologischen Untersuchungen konnte zum einen die Integration des Transgens und zum anderen eine hohen Expression des gp91phox-Proteins gezeigt werden. In der durchflußzytometrische Untersuchung konnte für weniger als die Hälfte Zellen einer Modellzellinie (X-CGD PLB-985-Zellen) eine Transduktion nachgewiesen werden. In den funktionellen Untersuchungen wurde eine Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität von 80% und mehr im Vergleich zu PLB-985-Wildtypzellen detektiert. Die hohe funktionelle Rekonstitution bei geringer Transduktionseffizienz war auf eine hohe Expression aufgrund von Mehrfachintegration des Transgens zurückzuführen. Die Untersuchungen mit den lentiviralen gp91phox-Vektoren haben gezeigt, daß diese gute Voraussetzungen für die Entwicklung einer somatischen Gentherapie für CGD-Patienten mitbringen. Studien mit CD34 -Zellen und Stammzellen von X-CGD Patienten sind im weiteren notwendig, um die therapeutische Relevanz zu belegen. Neben der Fortentwicklung des Vektors muß auch die Methodik zur Generierung und Anreicherung der viralen Partikel, sowie das Transduktionsprotokoll der Stammzellen weiter optimiert werden.
In dieser Arbeit erfolgt eine Untersuchung der intrazellulären Transporteigenschaften des Na /Glucose Cotransporters SGLT1 aus dem Kaninchen. Der Transporter wird dazu heterolog in Xenopus laevis Oozyten exprimiert. Die hohe Expressionsdichte erlaubt die Anwendung der "giant excised patch clamp"-Technik in der inside-out Konfiguration. Die Patches mit Durchmessern von 20-30 µm enthalten ca. 2,5 - 5·10 hoch 6 Transportern bei einem durchschnittlichen Strom von 20-40 pA. Der Transport des Substrats Glucose bzw. des hier verwendeten alpha MDG wird angetrieben durch den elektrochemischen Gradienten für das Cosubstrat Na . Bei 0 mV Haltepotential wird zuerst die reine Konzentrationsabhängigkeit des Auswärtstransports durch die Bestimmung der apparenten intrazellulären Affinität für alpha MDG bei verschiedenen festen Na -Konzentrationen untersucht. Es kann eine deutliche Abhängigkeit des KM alpha MDG von der Na -Konzentration festgestellt werden. Eine Erhöhung der intrazellulären Na -Konzentration von 10 mM auf 400 mM führt zu einer ca. 12fachen Abnahme des KM alpha MDG. Experimente mit symmetrischer Na -Verteilung zeigen, dass auch ohne Na -Konzentrations-Gradient Transport stattfinden kann, allerdings mit einer deutlich geringeren Affinität für alpha MDG. Verglichen mit Literaturwerten für die extrazelluläre alpha MDG-Affinität ist die intrazelluläre Affinität 10-15mal geringer ist als die extrazelluläre. Die Untersuchung der Abhängigkeit von der Na -Konzentration bei verschiedenen festen MDG-Konzentrationen zeigt, dass KM Na eine geringe Abhängigkeit von der alpha MDG- Konzentration besitzt. Die 10fache Erhöhung der alpha MDG-Konzentration von 25 mM auf 250 mM führt nur zu einer leichten Erniedrigung des KM Na. Die intrazelluläre Na - Affinität liegt in der gleichen Größenordnung wie die extrazelluläre. Zur Untersuchung der intrazellulären Bindungsreihenfolge werden die gemessenen Abhängigkeiten des KM alpha MDG und des I Max von der Na -Konzentration mit Simulationen für die 3 möglichen Bindungsreihenfolgen (2Na :G), (Na :G:Na ) und (G:2Na ) verglichen. Mit den hier gemachten Annahmen für die intrazellulären Bindungskonstanten für MDG und Na wird die beste Übereinstimmung für die intrazelluläre Bindungsreihenfolge (2Na :G) gefunden. Zur Untersuchung des spannungsabhängigen Verhaltens der Affintitäten für alpha MDG und Na werden Spannungssprünge unter denselben Konzentrationsbedingungen wie vorher durchgeführt. Die Strom-Spannungs-Kennlinien zeigen eine Zunahme der zuckerinduzierten Stromamplituden zu positiven Potentialen hin. Dabei wird weder bei hyperpolarisierenden noch bei depolarisierenden Potentialen eine Sättigung erreicht. Dies läßt den Rückschluss, dass im betrachteten Spannungsbereich ein spannungsabhängiger Schritt im Transportzyklus geschwindigkeitsbestimmend ist. Die apparenten Affinitäten für alpha MDG und Na besitzen eine geringe Spannungsabhängigkeit. Der KM alpha MDG bei annähernd sättigender Na -Konzentration fällt zwischen 40 mV und 40 mV um einen Faktor 4,4. Bei verringerter Na -Konzentration beeinflusst das Membranpotential die MDG-Affinität stärker. Der KM Na fällt unter sättigenden Zuckerbedingungen im gleichen Spannungsbereich auf die Hälfte ab, wobei der Hill-Koeffizient konstant bleibt. Die Erniedrigung der alpha MDG-Konzentration verursacht keine Veränderung des spannungsabhängigen Verlaufs. Die Ergebnisse zeigen, dass SGLT1 ein reversibler Transporter ist, der sowohl Einwärts-, aber auch Auswärtstransport von Glucose generieren kann. Er zeigt dabei eine starke Abhängigkeit von der Na -Konzentration und eine geringe Abhängigkeit vom Membranpotential. Die hier bestimmten Eigenschaften zeigen aber auch, dass unter physiologischen Bedingungen ein Auswärtstransport von Glucose sehr unwahrscheinlich ist. Das Zusammenwirken der Faktoren Richtung des Na -Gradient, geringe Zuckeraffinität, negatives Membranpotential und geringe intrazelluläre Na - Konzentration verhindern den Auswärtstransport. Der physiologische Na -Gradient ist dem Auswärtstransport entgegengerichtet. Die geringe intrazelluläre Na -Konzentration und das negative Membranpotential verursachen eine sehr geringe intrazelluläre Zuckeraffinität von ca. 75 mM alpha MDG, so dass ein merklicher Auswärtstransport nur bei einer hohen Zuckerkonzentration innerhalb der Epithelzellen stattfinden kann. Dies wird jedoch durch basolaterale Glucose-Transporter verhindert. Das negative Membran- potential führt zu einer geringen Aktivität des Auswärtstransports. Die geringe intrazelluläre Na -Konzentration liegt weit unterhalb es KM Na , so dass auch hier die Transporteraktivität gering ist. Die asymmetrische Funktionsweise des SGLT1 gewährleistet, dass der Glucose- Transport nur in eine physiologisch sinnvolle Richtung, nämlich der Aufnahme von Glucose in die Epitheltzellen, stattfindet.
Bei einer HIV-1-Infektion ist die Krankheitsprogression zum Vollbild AIDS mit dem Auftreten von Virusvarianten assoziiert, die den Chemokinrezeptor CXCR4 zum Zelleintritt verwenden. Dagegen nutzen SIV ein breites Korezeptorspektrum, vor allem CCR5. Im Verlauf einer SIV-Infektion findet kein Korezeptorwechsel von CCR5 zu CXCR4 statt. In dieser Arbeit wurde der Einfluß einer solchen Änderung der Korezeptornutzung auf die SIVagm-Infektion in-vitro und auf den Verlauf der apathogenen SIV-Infektion in-vivo nach Infektion von Schweinsaffen untersucht. Um die Korezeptorspezifität eines SIV zu CXCR4 zu verändern, wurde das in AGM und Schweinsaffen apathogene SIVagm3mc verwendet, das als Korezeptoren zum Zelleintritt CCR5, BOB und BONZO nutzt. Die potentielle Korezeptorbindungsstelle, der zu HIV-1 homologe V3-Loop des Oberflächen-Hüllproteins gp130-SU des SIVagm3mc wurde durch den V3-Loop des CD4 / CXCR4-tropen HIV-1-Klons BH10 ersetzt. Das resultierende SIVagm3-X4mc erwies sich als replikationskompetent und verwendete zum Zelleintritt ausschließlich CD4 / CXCR4. Die Replikation wurde durch den natürlichen Liganden des CXCR4, SDF-1a, dosisabhängig gehemmt. Überraschenderweise besaß SIVagm3-X4mc die Eigenschaft, in-vitro nicht nur in IL2 / PHA-stimulierten sondern auch in unstimulierten PBMC von Schweinsaffen und AGM replizieren. Nach Infektion von je zwei Schweinsaffen (Macaca nemestrina) mit SIVagm3mc bzw. SIVagm3-X4mc konnte bis zu 14 Monate nach Inokulation keine Krankheitsentwicklung und kein Abfall der absoluten Anzahl der CD4 -T-Lymphozyten beobachtet werden. Die Virusbelastung der Tiere war vergleichbar und die Korezeptornutzung blieb auch nach in-vivo Replikation erhalten. Interessanterweise konnte SIVagm3-X4mc, nicht aber das Wildtypvirus SIVagm3mc, durch Sera von SIVagm3mc und SIVagm3-X4mc infizierten Schweinsaffen neutralisiert werden. HIV-1-spezifische Antikörper konnten in Sera eines mit SIVagm3-X4mc infizierten Tieren nachgewiesen werden. Diese Studie beschreibt zum ersten Mal den erfolgreichen Austausch eines V3-Loops bei SIV. Das resultierende SIVagm3-X4mc, das wie beabsichtigt CD4 / CXCR4-positive Zellen infizierte, war im Gegensatz zum Ausgangsvirus in der Lage, in nicht-stimulierten PBMC zu replizieren und zeigte Sensitivität gegenüber neutralisierenden Antikörpern, die in SIVagm3mc- und SIVagm3-X4mc-infizierten Schweinsaffen induziert wurden.
Für eine zukünftige Gentherapie der Immunschwächekrankheit AIDS ist ein effizienter, spezifischer und sicherer Gentransfer in CD4-positive Zellen des peripheren Blutes erforderlich. Hierzu bieten sich vom murinen Leukämievirus (MLV) abgeleitete retrovirale Pseudotypvektoren an, die das Hüllprotein (Env) des HIV-1 oder des simianen Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm) tragen und daher einen selektiven Gentransfer in CD4-positive Zielzellen bewirken (Transduktion). [MLV(SIVagm)]-Vektoren haben gegenüber [MLV(HIV-1)]-Vektoren den Vorteil, daß sie von Seren HIV-1-positiver Patienten nicht neutralisiert werden und daher auch in HIV-1-infizierten Patienten angewendet werden könnten. Jedoch kann aufgrund des Tropismus von SIVagm mit [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren nur die kleine Subpopulation der CCR5-positiven Zellen innerhalb der humanen CD4-positiven Lymphozyten (3 bis 15%) transduziert werden. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den Tropismus des SIVagm Env so zu modifizieren, daß auch die Mehrzahl der CD4-positiven Lymphozyten, die den CXCR4-Korezeptor exprimieren (70 bis 95%), transduziert werden kann. Hierzu wurde die putativ für die Korezeptorbindung verantwortliche V3- Loop-Region im Env des SIVagm durch die homologe Region eines CXCR4-tropen HIV-1-Stammes ersetzt. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [MLV(SIVagm-X4)]- Pseudotypvektoren herzustellen, die spezifisch CD4/CXCR4-positive Zellen transduzieren können. Neben der Bedeutung für die Generation neuer Vektoren für die Gentherapie beweist dieses Ergebnis die bisher nicht gezeigte Äquivalenz der V3- Loops der Hüllproteine von HIV-1 und SIVagm für die Korezeptornutzung. Um die neuen [MLV(SIVagm)]-Vektoren charakterisieren zu können und für eine spätere Anwendung weiterzuentwickeln, wurden stabile Zellinien etabliert, die große Vektormengen mit Titern zwischen 6x103 und 7,6x105 i.E./ml produzierten. Mittels Ultrazentifugation konnten Vektorpräparationen mit Titern bis zu 108 i.E./ml hergestellt werden. Die neu generierten [MLV(SIVagm-X4)]-Vektoren erwiesen sich wie die [MLV(SIVagm-wt)]-Vektoren als resistent gegenüber der Neutralisierung durch Seren HIV-1-infizierter Spender und könnten damit in vivo angewendet werden. In Experimenten zur Bestimmung der Transduktionseffizienz in primären peripheren Blutlymphozyten humaner Spender konnte der selektive Gentransfer mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren in CD4-positive Zellen gezeigt werden, während herkömmliche, amphotrope Vektoren CD4-positive und -negative Lymphozyten gleichermaßen transduzierten. Beide [MLV(SIVagm)]-Vektoren erlaubten im Vergleich zu den eingesetzten amphotropen MLV-Vektoren eine höhere Transduktionseffizienz in CD4-positiven Zellen. Neben Zielzell-Spezifität und Effizienz ist die Sicherheit neuer Vektorsysteme entscheidend für die Anwendbarkeit in der humanen Gentherapie. Eine Übertragung replikationskompetenter Retroviren (RCR) gilt hierbei als das Hauptrisiko bei der Nutzung retroviraler Vektoren. Auch bei der Herstellung von [MLV(HIV-1)]- oder [MLV(SIVagm)]-Pseudotypvektoren könnten durch Rekombinationsereignisse in den Verpackungszellen replikationsfähige Hybridviren entstehen. Bei der Untersuchung dieser Vektorsysteme wurde allerdings bisher keine spontane Bildung von RCR nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, durch molekulare Klonierung gezielt derartige Hybridviren zu generieren, um zu klären, ob solche Onko/Lenti-Hybridviren replikationsfähig sein können, zudem sollte gegebenenfalls das pathogene Potential dieser Viren untersucht werden. Dazu wurden die vollständigen Leserahmen des rev- und des env-Gens des HIV-1 bzw. SIVagm anstelle des MLV env-Gens in das Genom eines infektiösen molekularen Klon des MLV inseriert. Die Klonierungsstrategie wurde dabei so gewählt, daß alle notwendigen mRNAs gebildet werden konnten. Die Hybridvirusklone waren nach Transfektion in 293T-Zellen tatsächlich in der Lage, neben den MLV-Genen auch HIV-1 bzw. SIVagm env und rev funktionell zu exprimieren. Es konnten infektiöse Partikel nachgewiesen werden, die das Hybridvirusgenom auf Zielzellen übertragen konnten. In den infizierten Zielzellen wurde jedoch nur die Expression von MLV/SIVagm nachgewiesen werden. Keines der beiden Hybridviren erwies sich als replikationskompetent. Dies deutet darauf hin, daß die Bildung replikationskompetenter Onko/Lenti-Hybridviren unwahrscheinlich ist. Mit den [MLV(SIVagm)]-Vektoren steht somit ein Vektorsystem zur Verfügung, das sich für In-vivo-Anwendungen im HIV-infizierten Patienten eignet. Es konnte gezeigt werden, daß humane CD4-positive Lymphozyten mittels [MLV(SIVagm)]-Vektoren spezifisch, aber auch effizienter und sicherer transduziert werden als unter Verwendung bisher beschriebener amphotroper MLV-Vektoren.
Im Rahmen der Aufgabenstellung, Propenoxid durch eine heterogen initiierte homogene Autoxidation herzustellen, wurde ein neuer Reaktortyp konzipiert. Die wesentliche Anforderungen an die Reaktionsführung war dabei nach dem Katalysator einen steilen Temperaturgradienten im Abgasstrom zu verwirklichen. Die komplexen Wechselwirkungen der Autoxidation und deren Mechanismus sind nicht zweifelsfrei aufgeklärt. Insbesondere das Ausmaß der Radikalbildung ist nur unter NichtReaktionsbedingungen quantitativ bekannt. Anhand der verfügbaren Daten konnten daher keine quantitativen Rückschlüsse hinsichtlich Reaktorauslegung und erforderlichen Katalysatormengen bzw. Katalysatoraktivitäten gezogen werden. Basierend auf der postulierten Initiierung der Autoxidation durch Allylradikale wurde das Konzept des Reaktors entwickelt und dieser modular ausgelegt, um eine Nachoptimierung zu ermöglichen. Wegen der Unsicherheiten über das Ausmaß von Radikalbildung und Radikalreaktionsgeschwindigkeiten wurde der Reaktor modular ausgelegt und weite Bereiche an Reaktionsbedingungen (Temperatur und Verweilzeiten am Katalysator und im postkatalytischen Volumen) für verschiedene Katalysatorpräparationen ausgetestet. Aktivität wurde außer im Falle von Strontiumnitrat als Katalysator nur unter Reaktionsbedingungen gefunden, die bereits eine Leeraktivität bedingen. Die These, daß die von Keulks et al. [21,22] beobachtete Aktivität von Bismutoxid in der heterogen initiierten Autoxidation auf die von verschiedenen Autoren [26,27,29] beobachtete Allylradikalbildung über Bismutoxid zurückzuführen ist, ließ sich im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigen. Die Erkenntnis aus Arbeiten von Maier et al. [17], daß die Reaktion bei hohen Drücken (größer 10 bar) schneller und selektiver verläuft, stellt das Konzept einer heterogenen Initiierung bzw. Katalyse grundsätzlich in Frage. Durch die Druckerhöhung wurden sehr respektable RaumZeitAusbeuten erreicht und die Selektivität zu Propenoxid gesteigert, wobei letzteres auf die Umsetzung bei niedrigeren Temperaturen zurückzuführen sein dürfte, die durch die erhöhten Reaktionsraten ermöglicht wird. Im Rahmen von in dieser Arbeit durchgeführten Leertests unter Druck im mikrostrukturierten Reaktor konnte diese Reaktionsbeschleunigung bereits bei Drücken von 3 bar nachgewiesen werden. Beim Übergang auf 4,5 bar verdoppelte sich die Selektivität zu Propenoxid auf 15% bei fünffach erhöhtem (1,6%) Propenumsatz. Dieser Druckbereich war in den Arbeiten von Maier et al. nicht untersucht worden. Eine weitere Drucksteigerung bedingte aufgrund des hohen Sauerstoffpartialdrucks eine Explosion. Angesichts der Tatsache, daß bereits ohne Katalyse bei höheren Drücken hohe RaumZeitAusbeuten erreichbar sind, wurde das Vorhaben nicht weiter verfolgt und eine homogene Katalyse der Autoxidation durch das Abgas der Propandehydrierung getestet, die über Propylradikale verläuft. Diese hätte aufgrund der Verwendung von Propan anstelle eines Teils des Propens den Vorteil geringerer Rohstoffkosten. Auch hier konnte keine Übertragung der Reaktion auf die postkatalytische Zone, deren Temperatur auf unter 250°C begrenzt war, belegt werden. Lediglich die bekannte thermische Oxidation von Propen und Propan unter Nettoumsatz von Propan zu Propenoxid konnte in der Katalysatoraufnahme durchgeführt werden, wobei die Katalysatoraufnahme hier die Funktion eines Rohrreaktors erfüllte. Mit allen drei entwickelten Reaktortypen konnte ein steiler Temperaturgradient im Abgasstrom des Katalysators durch Zumischen kalter Gasströme bedingt verwirklicht werden, wobei die Limitierungen hinsichtlich der Höhe des Gradienten durch Wärmeleitungseffekte des Gehäuses hervorgerufen wurden. Dieses Reaktorschema erwies sich zwar als untauglich in der angestrebten Reaktion könnte aber für andere Reaktionen, die entsprechende Anforderungen an Temperaturgradienten haben, sinnvoll eingesetzt werden. Beispielsweise stellt die selektive Methanoxidation diese Anforderung, findet aber bei wesentlich höheren Temperaturen statt (>1000°C). Die Propenoxidation mit Wasserstoff/Sauerstoffgemischen, die zuvor nur über auf Titanoxid geträgerten Goldkatalysatoren beschrieben wurde, konnte erfolgreich an auf Titanoxid gefällten Silberkatalysatoren durchgeführt werden. Parallel zu dieser Arbeit wurden allerdings Patente der BAYER AG offengelegt, die die Aktivität von mit SilbernitratAmmoniaklösungen imprägnierten Titanoxid und TS1Katalysatoren beschreiben. Erstmalig wurde jedoch ein Titanoxid geträgerter Silberkatalysator in dieser Reaktion hinsichtlich verschiedener Beladungsgraden mit Silber, Calcinierungstemperaturen und den Reaktionsparametern Temperatur, Verweilzeit und Gaspartialdrücken untersucht. In allen Aspekten war eine erstaunliche Ähnlichkeit des Silber/TitanoxidSystems mit dem Gold/TitanoxidSystem festzustellen, welches in den letzten Jahren von verschiedenen Arbeitsgruppen gründlich untersucht wurde. So findet sich eine optimale Aktivität für die Silberkatalysatoren bei 2% Beladung mit Silber und einer Calcinierungstemperatur von 400°C. Diese betrug mit 4,14 g kg(Kat.) 1 h 1 nahezu die Hälfte der von Goldkatalysatoren (10,4 g kg(Kat.) 1 h 1 ) und die im TEM beobachteten Partikelgrößen des Silbers entsprechen mit 2 bis 4 nm denen der Goldpartikel [46]. Mit XRD konnte eine mit zunehmender Calcinierungstemperatur zunehmende Primärpartikelgröße bzw. Kristallisation des Titanoxids nachgewiesen werden. Mit zunehmender Temperatur findet eine schnellere Desaktivierung der Katalysatoren statt. Auch bei der üblichen Reaktionstemperatur von 50°C findet eine Desaktivierung über mehrere Tage statt. Mit zunehmender Verweilzeit am Katalysator sinkt die Reaktionsrate trotz differentieller Umsätze aufgrund der Produktinhibierung der Reaktion. Diese Produktinhibierung bewirkt durch Folgereaktionen die Belegung der Silberkatalysatoren mit verschiedenen Oligomeren des Propenoxids, die in TGMSExperimenten erst oberhalb 400°C vollständig desorbieren und auch die Desaktivierung bewirken. Die Reaktionsrate ist ungefähr proportional sowohl dem Propen, als auch dem Wasserstoffpartialdruck und unabhängig vom Sauerstoffpartialdruck. Auch die von Goldkatalysatoren berichtete Aktivität in der Tieftemperaturoxidation von CO und Propan konnte bei den Silberkatalysatoren gefunden werden. Eine Verbesserung hinsichtlich Standzeit des Katalysators könnte durch den Einsatz von TS1 als Trägermaterial erzielt werden, welches im Falle der Goldkatalysatoren keiner Desaktivierung unterlag. Dieses wurde mit der hohen Verdünnung der Titanzentren erklärt [47]. Auch durch den Zusatz von Gold bzw. anderen Dotierungsmetallen könnte eine weitere Verbesserung der Katalysatoren möglich sein. Ein Ansatz dazu wäre die chloridfreie Coimprägnierung mit Cyano Komplexen des Silbers und Goldes. Die bisher erzielten Ergebnisse sind jedoch noch sehr weit von technisch relevanten Umsätzen und Standzeiten entfernt. Die Erkenntnis, daß Silberkatalysatoren ähnliche Eigenschaften wie die von Haruta beschriebenen Goldkatalysatoren haben, eröffnet jedoch neue Perspektiven für die Untersuchung dieser Katalysatorklasse.
Natürliche Enantioselektivität und Isotopendiskriminierung - Schlüssel zur Echtheit ätherischer Öle
(2002)
Als Grundlage für die Beurteilung der Echtheit ätherischer Öle können zwei biochemische Prinzipien Enantioselektivität und Isotopendiskriminierung während der Biosynthese herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die enantioselektive Kapillargaschromatographie sowie die online-Kopplung der Gaschromatographie mit der Isotopenmas- senspektrometrie zur Authentizitätsbewertung verschiedener ätherischer Öle eingesetzt. Die Bestimmung von Enantiomerenverhältnissen mittels Multidimensionaler Gaschromatographie-Massenspektrometrie (MDGC-MS) sowie von 13C/12C-Isotopenverhältnissen mittels GC-C-IRMS (Gaschromatographie-Combustion- Isotopenmassenspektrometrie) sind etablierte Methoden, die in der Authentizitätsbewertung von Aroma- und Duftstoffen eingesetzt werden. Dagegen ist die Bestimmung von 2H/1H-Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS (Gaschromatographie-Pyrolyse-Isotopenmassenspektrometrie) eine relativ neue Methode. In der vorliegenden Arbeit wurden Strategien zur Bestimmung von zuverlässigen 2H/1H-Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS entwickelt. Die Kalibrierung des Referenzgases mit Hilfe von internationalen Standards kann nur mittels eines Elemental Analyzers (EA-IRMS) erfolgen, da für die Gaschromatographie geeignete Standards nicht zur Verfügung stehen. Daher ist insbesondere der Vergleich von Isotopenverhältnissen von Standardsubstanzen, die mittels TC/EA-IRMS und GC- P-IRMS bestimmt wurden, von Bedeutung. Es konnte gezeigt werden, dass eine Konditionierung (Einbringen einer Kohlenstoffschicht) des Pyrolysereaktors im GC- P-IRMS-System notwendig ist, um für die untersuchten Aromastoffe mittels GC-P- IRMS zum Elemental Analyzer vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Von zwei verschiedenen getesteten Methoden zur Konditionierung des Pyrolysereaktors war die Konditionierung durch Einleiten von Methan in den Pyrolysereaktor die geeignetere und effektivere Methode. Weiterhin wurden der Einfluss des Trägergasflusses des Gaschromatographen auf die bestimmten Isotopenwerte sowie der lineare Bereich der Methode untersucht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die mittels GC-P-IRMS bestimmten Isotopenverhältnisse von verschiedenen Parametern abhängig sind. Richtige Ergebnisse zu erzielen setzt folgende Konditionen voraus: Konditionierung des Pyrolysereaktors, optimaler Trägergasfluss sowie Mindestmenge des Analyten (> 0,3 µg on column). Die neuen Möglichkeiten, die die online-Bestimmung von 2H/1H-Isotopenverhältnissen in der Authentizitätsbewertung von Lavendelölen, Anis- und Fenchelölen sowie Kümmelölen bietet, wurden erstmalig untersucht. Darüber hinaus wurden die enantioselektive Kapillargaschromatographie und die Bestimmung von 13C/12C-Isotopenverhältnissen mittels GC-C-IRMS eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Bereiche der 2HV-SMOW-Werte von Linalool und Linalylacetat aus authentischen Lavendelölen deutlich vom Bereich der Isotopenverhältnisse kommerziell erhältlicher, synthetischer Analoga unterscheiden und somit eine Verfälschung von Lavendelölen mit synthetischem Linalool und/oder Linalylacetat nachweisbar ist. Mit dieser Methode konnten diverse Handelsöle eindeutig als verfälscht beurteilt werden. Über die Bestimmung der Enantiomerenverhältnisse von Linalool und Linalylacetat dieser Öle konnte die Aussage bestätigt werden (hohe Reinheit zugunsten des (R)-Enantiomeren in genuinen Lavendelölen). Anhand der unterschiedlichen 13C/12C-Isotopenverhältnisse ist eine Unterscheidung zwischen synthetischem und Linalylacetat aus Lavendel möglich. Die 13CV-PDB-Werte von synthetischem und natürlichem Linalool aus Lavendelölen liegen im gleichen Bereich und sind somit zur analytischen Differenzierung natürlich/naturidentisch nicht geeignet. Mittels GC-C(P)-IRMS Analyse von trans-Anethol aus Fenchel- und Anisölen wurden die authentischen Bereiche der 13C/12C- und 2H/1H-Isotopenverhältnisse ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass sich einige der synthetischen trans-Anethol- Muster nur aufgrund eines der beiden bestimmten Isotopenverhältnisse von dem authentischen Bereich abgrenzen lassen. Somit konnte gezeigt werden, dass die integrale Betrachtungsweise der 13CV-PDB-Werte und der 2HV-SMOW-Werte biogener Stoffe für die Authentizitätsbewertung von großer Bedeutung ist. Zur Authentizitätsbewertung von Kümmelölen wurden die Enantiomerenverhältnisse, die 13C/12C- und die 2H/1H-Isotopenverhältnisse der Hauptkomponenten Limonen und Carvon bestimmt. Aufgrund der 2HV-SMOW-Werte von Limonen lassen sich keine Unterscheidungen zwischen kommerziell erhältlichen Limonen und Limonen aus Kümmelölen treffen. Dagegen können die 13CV-PDB-Werte von Limonen zur Authentizitätsbewertung von Kümmelölen herangezogen werden. Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Bestimmung von 2H/1H- Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS neue Möglichkeiten in der Echtheitsbewertung ätherischer Öle bietet. Insbesondere die integrale Betrachtung von 2HV- SMOW- und 13CV-PDB-Werten ( 2H/ 13C-Korrelation) wird eine Authentizitätsbewertung künftig noch wesentlich differenzierter möglich machen. Weitere Perspektiven wird die Bestimmung von 18O/16O-Isotopenverhältnissen bieten. Die Authentizitätsbewertung anhand der Multielement-Analyse mittels GC- IRMS eröffnet gerade für achirale Aromastoffe Perspektiven, stellt aber auch eine Ergänzung zur enantioselektiven Analytik dar.
Vanille ein tropisches Orchideengewächs liefert eines der bedeutendsten Aromen weltweit. Die stetig wachsende Nachfrage und das hohe Preisniveau sind allerdings häufig die Ursache für Verfälschung von Vanilleextrakten und -aromen. Ziel der Arbeit war es daher, die Methoden zur Echtheitsbewertung von Vanille weiter zu entwickeln. Daneben sollten Untersuchungen im Hinblick auf aromaaktive Minorkomponenten durchgeführt werden. Als Basisdaten für die Authentizität von Vanille dienen häufig Verhältniszahlen, die aus den Gehalten der Hauptinhaltsstoffe Vanillin, 4-Hydroxybenzaldehyd, Vanillinsäure und 4-Hydroxybenzoesäure gebildet werden. Um diese Verhältniszahlen zuverlässig bestimmen zu können, wurden eine hochdruckflüssigkeits-chromatographische (HPLC) und zum ersten Mal eine gas-chromatographische (GC) Methode entwickelt. Unter Verwendung von internen Standards konnte mit beiden Methoden eine zuverlässige Quantifizierung erzielt werden. Die ermittelten Werte erwiesen sich als unabhängig von der Analysenmethode, von Erntejahrgang und Herkunft der Schoten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die bisher zur Bewertung herangezogenen Richtwerte im Vergleich mit den im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Werte durchweg zu enge Spannbreiten aufweisen. Die neu bestimmten Daten zur quantitativen Zusammensetzung von Vanilleschoten stellen daher wertvolle Basiskriterien für eine Echtheitsbewertung von Vanille dar. Für eine weitergehende, noch zuverlässigere Authentizitätsbewertung wurden die 13C/12C-Verhältnisse von Vanillin und der zweiten Hauptkomponente 4- Hydroxybenzaldehyd ermittelt. Als grundlegende Voraussetzung für die Bestimmung korrekter Isotopenwerte wurde zum einen die Gerätekonfiguration optimiert, um eine vollständige Verbrennung zu gewährleisten, zum anderen wurde der Einfluss der Schotenaufarbeitung untersucht. Durch Korrelation der Delta13CV-PDB-Werte der beiden Komponenten konnten klare Authentizitätbereiche festgelegt werden. Insbesondere durch die integrale Betrachtungsweise beider Kriterien Verhältniszahlen und Isotopenwerte konnte die Authentizitätsbewertung von Vanille erheblich verbessert werden. Neben den Hauptkomponenten kommen in der Vanille aber auch eine große Zahl von aromaaktiven Minorkomponenten vor. Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher auch Untersuchungen zu einigen dieser Minorkomponenten durchgeführt werden. Dabei ermöglichte es der Einsatz der neuen, hochempfindlichen Methode der Stir Bar Sorptive Extraction, eine enantioselektive Analyse von - Nonalacton und verschiedenen Monoterpenen durchzuführen. -Nonalacton konnte dabei in allen untersuchten Proben mit einem nahezu racemischen Enantiomerenverhältnis nachgewiesen werden. Die Enantiomerenreinheit und die Schwankungen der Enantiomerenverhältnisse für die untersuchten Monoterpene waren stark variierend. Es konnte dabei aber weder eine Herkunfts- noch eine Jahrgangsabhängigkeit festgestellt werden. Die sehr geruchsaktive Substanz Guajacol wurde in Schoten der Gattungen V. planifolia und V. tahitensis semiquantitativ untersucht. Es konnte aber auch hier keine Abhängigkeit von der Herkunft der Schoten festgestellt werden. Um weitere geruchsaktive Minorkomponenten zu identifizieren, wurde ein Headspace- Extrakt von Vanilleschoten mittels Gaschromatographie-Olfaktometrie untersucht. Es konnten dabei die beiden Substanzen Kreosol und 4- Hydroxybenzylamin identifiziert werden. Letztgenanntes war bisher als natürlicher Aromastoff nicht bekannt. Obwohl beide Komponenten nur im ppb- Bereich vorkommen, leisten sie dennoch eine Beitrag zum Gesamtaroma von Vanille. Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Wege im Hinblick auf die Analytik und Authentizitätsbewertung von Vanille aufgezeigt werden.