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Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.
Hepatitis C virus (HCV) assembly and production is closely linked to lipid metabolism. Indeed, lipid droplets (LD) have been shown to serve as a platform for HCV assembly. To investigate the effect of HCV on the host cell proteome, 2D-gelelectrophoresis with subsequent MALDI-TOF mass spectrometry of HCV replicating and the corresponding control cells were done. Based on this analysis, it was found out that HCV-replicating Huh7.5 cells revealed lower amounts of TIP47 (tail interacting protein of 47kD) compared to HCV-negative cells. TIP47, a cytoplasmic sorting factor, has been shown to be associated with lipid droplets. As it is known that HCV-replication and assembly takes place at the so called ”membranous web” that is composed of LDs and rearranged ER-derived membranes, it was tempting to investigate the role of TIP47 in HCV life-cycle. Western blot analysis did reveal that overexpression of TIP47 in HCV replicating Huh7.5 cells leads to decreased amounts of the HCV core protein while the levels of non-structural protein (NS)5A and intracellular HCVgenomes are increased. Moreover, in TIP47 overproducing cells higher amounts of infectious HCV particles are secreted. Vice versa, inhibition of TIP47 expression by siRNA results in a decreased level of intracellular NS5A, increased amounts of intracellular core and less infectious viral particles in the supernatant. In addition, complete silencing of TIP47 by lentiviral transduction abolishes HCV replication that can be restored by transfection of these cells with a TIP47 expression construct. It has been shown recently that apoE binds to NS5A and that this interaction plays an important role for the HCV life cycle (Benga et al., 2010). The C-terminal part of TIP47 harbours a 4 helix bundle motif and displays high homology to the N-terminus of apoE. Therefore, we investigated the interaction of NS5A and TIP47. Confocal double immunofluorescence microscopy revealed that a fraction of NS5A colocalizes with TIP47. Coimmunoprecipitation experiments and a yeast-two-hybrid screening confirmed the interaction between NS5A and TIP47 and deletion of the N-terminal-TIP47-PAT domain abolishes this interaction. From this we conclude that the TIP47-NS5A interaction is required for virus morphogenesis. Moreover, TIP47 can bind to Rab9 and this is relevant for targeting the viral particle out of the cell. In accordance to this, TIP47 was identified to be associated to the viral particle. Mutants of TIP47 that fail to bind Rab9 reveal lower amounts and a changed distribution of the HCV core protein. Furthermore, we could see that the core staining colocalizes with subcellular structures that were identified as autophagosomes using a p62-specific antibody which is a specific autophagosome-marker. Based on this, we hypothized that destruction of the Rab9 binding domain misdirects the viral particle towards the lysosomal compartment.
For the first time it could be shown that TIP47 interacts with NS5A and is associated to the viral particle, therefore plays a crucial role for the virus morphogenesis and secretion of the viral article.
Taken together, these results indicate that TIP47 is an essential cellular factor for the life cycle of HCV Abstract and might be used as target for antiviral treatment, e.g. by targeting the NS5A-TIP47 interaction, based on small molecules that mimic the NS5A-specific sequence that binds to TIP47 which might result in a competition of the TIP47/NS5A interaction.
Nep1 (Emg1) is a highly conserved nucleolar protein with an essential function in ribosome biogenesis. A mutation in the human Nep1 homolog causes Bowen–Conradi syndrome—a severe developmental disorder. Structures of Nep1 revealed a dimer with a fold similar to the SPOUT-class of RNA-methyltransferases suggesting that Nep1 acts as a methyltransferase in ribosome biogenesis. The target for this putative methyltransferase activity has not been identified yet. We characterized the RNA-binding specificity of Methanocaldococcus jannaschii Nep1 by fluorescence- and NMR-spectroscopy as well as by yeast three-hybrid screening. Nep1 binds with high affinity to short RNA oligonucleotides corresponding to nt 910–921 of M. jannaschii 16S rRNA through a highly conserved basic surface cleft along the dimer interface. Nep1 only methylates RNAs containing a pseudouridine at a position corresponding to a previously identified hypermodified N1-methyl-N3-(3-amino-3-carboxypropyl) pseudouridine (m1acp3-Psi) in eukaryotic 18S rRNAs. Analysis of the methylated nucleoside by MALDI-mass spectrometry, HPLC and NMR shows that the methyl group is transferred to the N1 of the pseudouridine. Thus, Nep1 is the first identified example of an N1-specific pseudouridine methyltransferase. This enzymatic activity is also conserved in human Nep1 suggesting that Nep1 is the methyltransferase in the biosynthesis of m1acp3-Psi in eukaryotic 18S rRNAs.
Die Beteiligung an Schlüsselfunktionen in zellulären Signalwegen macht Kinasen zu einem vielversprechenden Ansatzpunkt in der Wirkstoffentwicklung bei verschiedenen menschlichen Erkrankungen wie z.B. Krebs oder auch Autoimmun- und Entzündungskrankheiten. Die Prävention von post-translationalen Modifikationen durch Phosphorylierung und somit die Regulierung der nachgeschalteten Signalwege ist das Ziel von Kinaseinhibitoren. Die katalytische Aktivität von Kinasen ist abhängig von ATP, welches im hochkonservierten aktiven Zentrum bindet. Bedingt durch diese kinomweite hohe Konservierung stellt die Entwicklung von hoch selektiven ATP-mimetischen Inhibitoren eine Herausforderung dar. Typische ATP-Mimetika sind flach und die oft hydrophoben Moleküle weisen meist eine große Zahl an frei rotierbaren Bindungen auf. Um das aus dieser Flexibilität hervorgehende Problem der teils mangelnden Selektivität zu umgehen, kann eine bioaktive Konformation des Inhibitors durch Makrozyklisierung fixiert werden. Als Konsequenz dieser konformationellen Einschränkung können die entropischen Kosten während des Bindens reduziert werden und folglich zu einer gesteigerten Affinität gegenüber der Kinase führen.
Der Grundstein dieser Arbeit war der makrozyklische Pyrazolo[1,5-a]pyrimidin basierte FLT3 Kinaseinhibitor ODS2004070 (37). Im Rahmen eines kinomweiten Screenings konnten hohe Affinitäten zu verschiedensten Kinasen detektiert werden, was 37 zu einer guten Leitstruktur für das Design von potenten und selektiven Kinaseinhibitoren machte. Im Rahmen dieser Arbeit blieb das literaturbekannte Pyrazolo[1,5-a]pyrimidin basierte ATP-mimetische Bindemotiv sowie das makrozyklische Grundgerüst 37 bis auf einige wenige Variation unverändert.
Strukturelle Optimierungen zur Fokussierung der Selektivität wurden am sekundären Amin zwischen Bindemotiv und Linker als auch über die freie Carbonsäure durchgeführt. Mit einer Anzahl von mehr als 430 identifizierten Phosphorylierungsstellen ist die pleiotropisch und konstitutiv aktive Casein Kinase 2 (CK2) an verschiedensten zellulären Prozessen wie dem Verlauf des Zellzyklus, der Apoptose oder der Transkription regulatorisch beteiligt. Die Fehlregulation von CK2 wird häufig mit der Pathologie von Krankheiten wie zum Beispiel Krebs assoziiert, was CK2 zu einem vielversprechenden Ziel klinischer Untersuchungen macht.
Im Rahmen des CK2-Projekts war es möglich, durch spezifische Modifikationen an 37, die hoch selektiven und potenten CK2-Inhibitoren 47 und 60 zu entwickeln. Ebenfalls gezeigt wurde, dass kleine strukturelle Veränderungen, wie z.B. Makrozyklisierung, einen signifikanten Effekt auf Selektivität und Potenz des Inhibitors haben kann.
Weiter Untersuchungen der Verbindungen lenkten den Fokus weiterer Arbeiten u.a. auf die Serin/Threonin Kinase 17A (STK17A) oder auch death-associated protein kinase-related apoptosis-inducing protein kinase 1 (DRAK1) genannt. Sie ist Teil der DAPK Familie und gehört zusammen mit anderen Kinasen zu den weniger erforschten Kinasen. Bis heute ist nicht viel über ihre zellulären Funktionen und die Beteiligung an pathophysiologischen Prozessen bekannt. Berichtet wurde jedoch eine Überexpression in verschiedenen Formen von Hirntumoren des zentralen Nervensystems (Gliom). Strukturelle Modifikationen, unter Erhalt des makrozyklischen Grundgerüsts 37, führten zu dem hoch selektiven und potenten DRAK1 Inhibitor 121, der alle Kriterien für eine chemical probe Verbindung erfüllt.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die AP-2-assoziierte Protein Kinase 1 (AAK1) aus der NAK Familie, bestehend aus AAK1, BIKE und GAK. Sie ist als potenzielles therapeutisches Ziel für viele verschieden Krankheiten wie z.B. neuropathische Schmerzen, Schizophrenie und Parkinson identifiziert. Durch die Regulierung der Clathrin-mediierten Endozytose ist AAK1 an intrazellulären Bewegungen verschiedener nicht zusammenhängenden RNS- und DNSViren, wie beispielsweise HCV, DENV oder EBOV, beteiligt. Ebenfalls berichtet wurde eine mögliche Assoziation mit dem SARS-CoV-2 Virus, was das Interesse an neuen selektiven AAK1 Inhibitoren verstärkte. Die Entwicklung der hochpotenten und selektiven AAK1 Inhibitoren 61 und 63 basierte ebenfalls auf dem makrozyklischen Grundgerüst 37, das bereits im CK2- und DRAK1-Projekt verwendet wurde.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es im Rahmen dieser Arbeit gelungen ist, ausgehend von einem höchst unselektiven makrozyklischen Grundgerüst, hochpotente und selektive Kinaseinhibitoren für CK2, DRAK1 und AAK1 zu entwickeln und zu charakterisieren. Im Zuge von Untersuchungen verschiedener Struktur-Wirkungsbeziehungen wurde gezeigt, dass es durch geringfügige strukturelle Modifikationen möglich ist, die kinomweite Selektivität zu variieren und auf eine Kinase zu fokussieren. Diese Arbeit brachte nicht nur die erwähnten Inhibitoren hervor, sondern bildet auch die Grundlage für weitere Projekte zur Entwicklung von hoch potenten und selektiven Verbindungen als potenzielle chemische Werkzeuge für den Einsatz in der Forschung.
The interaction of fibroblast growth factors (FGFs) with their fibroblast growth factor receptors (FGFRs) are important in the signaling network of cell growth and development. SSR128129E (SSR),[1, 2] a ligand of small molecular weight with potential anti-cancer properties, acts allosterically on the extracellular domains of FGFRs. Up to now, the structural basis of SSR binding to the D3 domain of FGFR remained elusive. This work reports the structural characterization of the interaction of SSR with one specific receptor, FGFR3, by NMR spectroscopy. This information provides a basis for rational drug design for allosteric FGFR inhibitors.
The access to information on the dynamic behaviour of large proteins is usually hindered as spectroscopic methods require the site-specific attachment of biophysical probes. A powerful emerging tool to tackle this issue is amber codon suppression. Till date, its application on large and complex multidomain proteins of MDa size has not been reported. Herein, we systematically investigate the feasibility to introduce different non-canonical amino acids into a 540 kDa homodimeric fatty acid synthase type I by genetic code expansion with subsequent fluorescent labelling. Our approach relies on a microplate-based reporter assay of low complexity using a GFP fusion protein to quickly screen for sufficient suppression conditions. Once identified, these findings were successfully utilized to upscale both the expression scale and the protein size to full-length constructs. These fluorescently labelled samples of fatty acid synthase were subjected to initial biophysical experiments, including HPLC analysis, activity assays and fluorescence spectroscopy. Successful introduction of such probes into a molecular machine such as fatty acid synthases may pave the way to understand the conformational variability, which is a primary intrinsic property required for efficient interplay of all catalytic functionalities, and to engineer them.
Introduction: Despite the excellent anti-inflammatory and immunosuppressive action of glucocorticoids (GCs), their use for the treatment of inflammatory bowel disease (IBD) still carries significant risks in terms of frequently occurring severe side effects, such as the impairment of intestinal tissue repair. The recently-introduced selective glucocorticoid receptor (GR) agonists (SEGRAs) offer anti-inflammatory action comparable to that of common GCs, but with a reduced side effect profile.
Methods: The in vitro effects of the non-steroidal SEGRAs Compound A (CpdA) and ZK216348, were investigated in intestinal epithelial cells and compared to those of Dexamethasone (Dex). GR translocation was shown by immunfluorescence and Western blot analysis. Trans-repressive effects were studied by means of NF-κB/p65 activity and IL-8 levels, trans-activation potency by reporter gene assay. Flow cytometry was used to assess apoptosis of cells exposed to SEGRAs. The effects on IEC-6 and HaCaT cell restitution were determined using an in vitro wound healing model, cell proliferation by BrdU assay. In addition, influences on the TGF-β- or EGF/ERK1/2/MAPK-pathway were evaluated by reporter gene assay, Western blot and qPCR analysis.
Results: Dex, CpdA and ZK216348 were found to be functional GR agonists. In terms of trans-repression, CpdA and ZK216348 effectively inhibited NF-κB activity and IL-8 secretion, but showed less trans-activation potency. Furthermore, unlike SEGRAs, Dex caused a dose-dependent inhibition of cell restitution with no effect on cell proliferation. These differences in epithelial restitution were TGF-β-independent but Dex inhibited the EGF/ERK1/2/MAPK-pathway important for intestinal epithelial wound healing by induction of MKP-1 and Annexin-1 which was not affected by CpdA or ZK216348.
Conclusion: Collectively, our results indicate that, while their anti-inflammatory activity is comparable to Dex, SEGRAs show fewer side effects with respect to wound healing. The fact that SEGRAs did not have a similar effect on cell restitution might be due to a different modulation of EGF/ERK1/2 MAPK signalling.
5-Lipoxygenase (5LO) is a key enzyme in biosynthesis of leukotrienes (LTs), lipid mediators of inflammation. To study the roles of the 5LO accessory proteins coactosin-like protein (CLP) and 5LO-activating protein (FLAP), we knocked down these proteins in human monocytic cells. Our results show that expression of CLP was required for full cellular 5LO activity when cells were activated with Ca2+ ionophore, as well as with a physiological stimulus (lipopolysaccharide followed by N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine). During LT biosynthesis in stimulated cells, 5LO typically translocates to the nuclear membrane. This redistribution, from cytosolic to perinuclear, was clearly compromised in both CLP- and FLAP-deficient cells. Our results suggest that the CLP–5LO interaction may be a target for reduced LT production.
Acute myeloid leukemia is a hematopoietic stem cell disorder and a type of acute leukemia which is characterized by clonal proliferation of myeloid precursors with a reduced capacity to differentiate into more mature cellular elements. Clinically AML is characterized by a high degree of heterogeneity with respect to chromosome abnormalities, gene mutations, and changes in expression of multiple genes and microRNAs. Cytogenetic abnormalities can be detected in approximately 50% to 60% of newly diagnosed AML patients. Majority of AML cases are associated with chromosomal aberrations, more specifically translocations that often result in gene arrangements and expression of aberrant fusion proteins. This study was carried out with two fusion proteins: PML/RARα and DEK/CAN which results from the translocations t(15;17) and t (6,9) respectively. PML/RARα is the most common translocation (97%) and the main driver in Acute Promyelocytic Leukemia (APL), a wellcharacterized and well treatable subtype of AML. In contrast, DEK/CAN occurs in 1-5% of AML, associated with poor prognosis and defines a high risk group in AML. The expression of PML/RARα results in a fusion protein that acts as a transcriptional repressor by interfering with gene expression programs involved in differentiation, apoptosis, and selfrenewal. Current therapy focused on the targeting of PML/RARα fusion protien. Success has been achieved by using either ATRA, anthracyclines and Arsenic trioxide or their combinations. These agents induce differentiation in PML/RARα positive AML and hence called differentiation therapy. In comparison with ATRA, ATO and anthracyclines are poor cellular differentiation agents. Despite early promise, several studies have reported that differentiation therapy is unable to target/eradicate leukemic stem cells or eradicate the disease. Therefore current therapeutic focus is to eliminate leukemic stem cells and achieve complete molecular remission not only in APL but also in acute lymphoblastic leukemia and chronic myeloid leukemia as well. Key enzymes of the eicosanoid pathways in the arachidonic acid metabolism, such as COX1/2 as well as the 5-LO have been shown to be good targets for leukemic stem cell therapy approach in AML by interfering with the Wntsignaling which is known to be indispensable for the pathogenesis of AML. Recently it was reported that the third eicosanoid pathway based on the cytochrome P450 (CYP) enzymes interferes with Wnt-signaling as well as with the proliferation and mobilization of hematopoietic stem cells...