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Functional expression of recombinant N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors in eukaryotic cell lines
(2000)
Die Beschäftigung mit Muskarinrezeptoren reicht bis in das vergangene Jahrhundert zurück als, in Folge der verschiedenen Wirkungen des Neurotransmitters Acetylcholin, einerseits Nikotin- und andererseits Muskarinrezeptoren sowie deren Subtypen entdeckt und charakterisiert werden konnten. Aufgrund der weiten Verbreitung von Muskarinrezeptoren innerhalb des zentralen und peripheren Nervensystems sowie in entsprechend innervierten Organen sind diese nach wie vor als Target für bestimmte klinische Indikationen von großem Interesse. Besonders im Bereich der chronisch obstruktiven Atemwegserkrankungen (COPD) sind Bronchodilatoren Mittel der Wahl. Obwohl die derzeitige Behandlungsstrategie im wesentlichen auf dem Einsatz des unselektiven muskarinischen Antagonisten Ipratropiumbromid, allein oder in Kombination mit einem kurzwirksamen b2-Sympathomimetikum, beruht, ist ihr Einsatz aufgrund der dabei auftretenden unerwünschten Nebenwirkungen limitiert. Neben M3- Rezeptoren findet man in der menschlichen Lunge auch präsynaptische M2- Rezeptoren, deren Blockade zu einem Anstieg der Acetylcholinfreisetzung führt. Demzufolge würde die Entwicklung eines hochselektiven und/oder langwirksamen muskarinischen M3-Rezeptorantagonisten einen großen Fortschritt für die Behandlung von Patienten mit COPD und auch Asthma bedeuten. Untersuchung der Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids und der entsprechenden tertiären Analoga: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die vier reinen Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids als auch die entsprechenden vier tertiären Analoga untersucht. Bislang wird das Diastereomerengemisch (RS/SR), das als RobinulÒ im Handel ist, vorwiegend als Antisialagogum in der Prämedikation der Narkose oder als Spasmolytikum therapeutisch eingesetzt. Die molekulare Struktur des Glycopyrroniumbromids weist zwei Chiralitätszentren auf, woraus sich vier stereoisomere Verbindungen ergeben. Die pharmakologische Untersuchung sowohl der quartären als auch der korrespondierenden tertiären Isomere in den funktionellen Standardmodellen, Kaninchen-Vas-deferens für M1-Rezeptoren, linker Vorhof des Meerschweinchenherzens für M2-Rezeptoren und die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum für M3-Rezeptoren, ergab, dass sich alle Verbindungen an den untersuchten Muskarinrezeptorsubtypen als potente Antagonisten verhielten. Ihre Rezeptorselektivität war jedoch relativ gering, wobei im Allgemeinen die niedrigste Affinität zum M2-Rezeptor beobachtet wurde. Innerhalb der Stereoisomeren zeigten die (R/R')- und (S/R')-konfigurierten Verbindungen den stärksten, die (S/S')-konfigurierten Isomere hingegen den geringsten antagonistischen Effekt. Diese Ergebnisse konnten durch Radioligand- Bindungsstudien bestätigt werden. Bemerkenswert war jedoch, dass insbesondere am M3-Rezeptor eine extrem langsame Dissoziation der Substanzen vom Rezeptor festgestellt wurde. Verbunden mit der hohen Affinität und der in Bindungsstudien ermittelten Dissoziationshalbwertszeit von 120 min könnte das quartäre (R/R')-konfigurierte Stereoisomer des Glycopyrroniumbromids eine geeignete Alternative zur Behandlung der COPD darstellen: Die lange Halbwertszeit sollte eine Einmalgabe pro Tag erlauben und somit die Patientencompliance erhöhen, die hohe Affinität eine geringe Dosierung ermöglichen und die kinetische Selektivität' sowie die quartäre Struktur könnten zur Minimierung unerwünschter Nebenwirkungen führen. Aufgrund dieser Vorteile wurde die Substanz patentiert und der pharmazeutischen Industrie für weiterführende Untersuchungen zur Verfügung gestellt. Untersuchungen an der Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum in Hinblick auf die Verteilung von P2-Rezeptoren: Aufgrund der Pionierarbeit, die Ende der 70er Jahre von Burnstock und seinen Mitarbeitern geleistet wurde, wandelte sich das Bild von ATP als einer Energiequelle der Zelle zu einem Neurotransmitter ubiquitären Vorkommens mit entsprechenden Zielstrukturen, den P2-Rezeptoren. Inzwischen ist allgemein anerkannt, dass zwischen metabotropen P2Y-Rezeptoren und ionotropen P2X- Rezeptoren unterschieden werden kann. Mit Hilfe von Klonierungstechniken konnte diese Klassifizierung validiert und außerdem eine Vielzahl unterschiedlicher Subtypen identifiziert werden. Bis heute wurden sieben P2X- (P2X1-7) und sechs P2Y- Rezeptorsubtypen (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12) kloniert und pharmakologisch charakterisiert. Sie gelten unumstritten als Vertreter der P2-Rezeptorfamilie. Heute besteht eine der größten Herausforderungen auf diesem sich explosionsartig expandierendem Gebiet darin, die geklonten P2-Rezeptoren mit den verschiedenen physiologischen Antworten, die durch native P2-Rezeptoren vermittelt werden, in Einklang zu bringen. Da die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum ein bekanntes Modell, z.B. für Untersuchungen an Muskarinrezeptoren, darstellt, war das Ziel der vorliegenden Arbeit, dieses Modell in Bezug auf die Verteilung von P2-Rezeptoren hin zu untersuchen. Neben Agonisten, die eine Präferenz für entweder ionotrope (a,b-meATP) oder metabotrope (ADPbS) P2-Rezeptoren aufweisen, wurden im wesentlichen eine Reihe gut untersuchter Antagonisten mit zum Teil hoher Affinität für einen Rezeptorsubtyp für die funktionellen Untersuchungen verwendet. Die neuronale Lokalisation des P2X-Rezeptors konnte durch die komplette Aufhebung der durch a,b-meATP-vermittelten Kontraktionen nach Zugabe von TTX charakterisiert werden. Die ebenfalls fast vollständige Hemmung der Kontraktion nach Einsatz von Atropin wies auf einen indirekten, durch Acetylcholin vermittelten Effekt hin. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden sämtliche Versuche mit P2-Antagonisten unter Zusatz von 70 µM Physostigmin in der Nährlösung durchgeführt. Die eingesetzten Antagonisten Suramin, NF023 und NF279 erwiesen sich als kompetitive Antagonisten, während PPADS neben der Rechtsverschiebung einen Maximumabfall der Agonistenkurven bewirkte. Ein Vergleich der funktionell ermittelten pA2-Werte mit den Wirkstärken an rekombinanten P2-Rezeptoren von Ratte und Mensch lässt vermuten, dass es sich hierbei um einen P2X3- Rezeptorsubtyp handelt, der über die Freisetzung von Acetylcholin eine Kontraktion der glatten Muskulatur über einen indirekten Mechanismus auslöst. Da sich P2X-Rezeptoruntereinheiten neben homomeren auch zu heteromeren, funktionell aktiven Kanälen vereinen können, könnte es sich bei dem vorliegenden soma-dendritischen P2X-Rezeptor aber auch um ein Heteromer handeln, bei dem der P2X3-Rezeptor den Phänotyp bestimmt. Solange noch keine eindeutige Identifizierung dieses Rezeptors speziesspezifisch auf molekularer Ebene erfolgt ist, sollte man deshalb die Bezeichnung P2X3(-ähnlicher)-Rezeptor verwenden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation des präsynaptischen P2X3(- ähnlichen)-Rezeptors zur Ausschüttung von Acetylcholin führt, das wiederum postsynaptisch einen kontraktionsvermittelnden Muskarinrezeptor aktiviert. Um zu beweisen, dass es sich dabei um denselben Muskarinrezeptorsubtyp handelt, der bereits auf direktem Weg durch APE oder mittels EFS als M3-Rezeptor charakterisiert werden konnte, wurden die Affinitäten muskarinischer Antagonisten als Kriterien herangezogen. Die erhaltenen Korrelationen wiesen eindeutig darauf hin, dass dieser postsynaptisch im GPI lokalisierte Muskarinrezeptor dem nativen und rekombinanten, kontraktionsvermittelnden M3-Rezeptorsubtyp entspricht. Durch Zugabe von ADPbS konnten im GPI Kontraktionen ausgelöst werden, die allerdings mit TTX und Atropin nur zum Teil gehemmt wurden. Diese Beobachtungen führten zu der Erkenntnis, dass postsynaptisch P2Y-Rezeptoren lokalisiert sind. Ihre Subtypcharakterisierung erfolgte unter Zusatz von 0.3 µM Atropin in der Nährlösung, um den Einfluss der neuronalen P2X3-Rezeptoren zu unterbinden. Suramin, NF023 und NF279 zeigten wiederum einen kompetitiven Antagonismus gegen ADPbS, während PPADS auch hier eine Rechtsverschiebung mit Maximumdepression der Agonistenkurve hervorrief. Ein erneuter Vergleich mit beschriebenen Affinitätswerten von rekombinanten P2- Rezeptoren ließ den Schluss zu, dass der im GPI postsynaptisch gefundene P2Y- Rezeptor Eigenschaften des P2Y1-Rezeptorsubtyps aufweist. Eine Bestätigung dafür gaben außerdem die P2Y1-selektiven Bisphosphate A3P5P und MRS2179, obgleich sie geringere pIC50-Werte aufzeigten als in der Literatur beschrieben. Mit der Charakterisierung des neuronalen P2X3-Rezeptors und des postsynaptischen P2Y1-Rezeptors ist das GPI ein bisher einzigartiges funktionelles pharmakologisches Modell, in dem beide P2-Rezeptorsubtypen durch Einsatz des jeweiligen Agonisten, a,b-meATP oder ADPbS, pharmakologisch isoliert werden können. Charakterisierung von P2-Rezeptoren in der Längsmuskulatur des Rattenileum: Eine im Vergleich zum GPI gänzlich andere Situation zeigte sich im RI. Die getesteten P2-Agonisten ADPbS, a,b-meATP, a,b-meADP und ATPgS erzeugten Kontraktionen im untersuchten Gewebe, wobei sich a,b-meATP als effektivster Agonist erwies. Im Unterschied zum GPI führte eine wiederholte Gabe von a,b- meATP allerdings nicht zu einer Desensibilisierung des Rezeptors. Die durch Zugabe von TTX und Atropin erreichte Kontraktionshemmung lässt auf das Vorhandensein von sowohl prä- als auch postsynaptischen P2X-Rezeptoren schließen. Eine Trennung der durch diese Rezeptoren hervorgerufenen Effekte war im funktionellen Experiment jedoch nicht durchführbar. Keinerlei Effekt zeigte allerdings der Zusatz von TTX und Atropin auf die durch ADPbS ausgelösten Kontraktionen. Suramin, NF023 und PPADS erwiesen sich als sehr schwache Antagonisten an diesem Präparat. Auffällig war hingegen, dass die durch den Antagonisten verschobenen Kurven jeweils steiler und im Maximum höher waren als die Kontroll-Agonistenkurve. Man kann also hier nur spekulieren, dass durch die Antagonisten zunächst ein relaxationsvermittelnder Rezeptor geblockt wurde und in Folge nur noch der Effekt des kontraktionsvermittelnden Rezeptors sichtbar war. Obwohl Gewebe der Ratte häufig als funktionelle Modelle in der experimentellen Pharmakologie eingesetzt werden, konnten auf Grund fehlender subtypselektiver Agonisten und Antagonisten die kontraktionsvermittelnden P2-Rezeptorsubtypen im RI nicht identifiziert werden. Des weiteren zeigt ein Vergleich mit dem GPI, dass bedeutende Unterschiede bei der Verwendung gleichen Gewebes zweier verschiedener Spezies existieren können, die bei der vergleichenden Betrachtung von Affinitätswerten von Agonisten und Antagonisten zur Charakterisierung von Rezeptorsubtypen beachtet werden müssen.
GProteingekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine der größten in der Natur vorkommenden Proteinfamilien dar (Watson and Arkinstall, 1994). GPCRs sind plasmamembranständige Proteine, die mit heterotrimären GProteinen interagieren und eine Vielzahl an Signaltransduktionswegen aktivieren. Trotz der strukturellen Vielfalt der an GPCRs angreifenden Liganden stimulieren die meisten GPCRs nur eine begrenzte Anzahl strukturell sehr ähnlicher GProteine (Hedin et al., 1993; Conklin and Bourne, 1993). Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die dieser Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität zugrunde liegen, ist von fundamentaler Wichtigkeit für das Verständnis zellulärer Signaltransduktion. Ausführliche StrukturFunktionsanalysen verschiedener Neurotransmitter rezeptoren, einschließlich der Muskarinrezeptoren (Wess, 1996) und adrenergen Rezeptoren (Dohlman et al., 1991; Savarese and Fraser, 1992; Strader et al., 1994), haben einen beträchtlichen Beitrag zur Identifizierung der strukturellen Elemente, die für die GProteinKopplungsselektivität dieser Rezeptorgruppe verantwortlich sind, geleistet. Im Gegensatz dazu ist bisher noch weitgehend ungeklärt, welche molekularen Mechanismen der Kopplungsselektivität von GPCRs, die durch Peptidliganden aktiviert werden, zugrunde liegen. Das Ziel dieser Arbeit war daher, molekulare Grundlagen der GProtein Kopplungsselektivität von PeptidGPCRs näher zu untersuchen und aufzuklären. Die Vasopressinrezeptorfamilie unterscheidet sich von nahezu allen anderen PeptidGPCRs darin, daß die einzelnen Rezeptorsubtypen deutlich unterschiedliche GProtein Kopplungspräferenzen aufweisen. Die V1a und V1bVasopressinrezeptoren stimulieren selektiv GProteine der Gq/11 Familie, was zur Aktivierung von PhospholipaseCbeta-Isomeren führt. Im Gegensatz dazu koppelt der V2Vasopressinrezeptor vornehmlich an das GProtein G s , was in einem Anstieg an intrazellulärem cAMP resultiert. Daher stellen die Vasopressinrezeptorsubtypen ein attraktives Modellsystem zum Studium der Peptid GPCRRezeptordomänen, die für die selektive GProteinAktivierung verantwortlich sind, dar. Als Modellsystem für diese Arbeit diente primär der V2Vasopressinrezeptor. Molekulare Faktoren, die die Gs Kopplungsselektivität des V2 Vasopressinrezeptors bestimmen. Eine frühere Studie zeigte, daß die Gegenwart der V1aRezeptorsequenz in der zweiten intrazellulären (i2) Schleife notwendig war, um den Wildtyp V1a und V1a/V2 Rezeptorchimären effizient an Gq/11 Proteine zu koppeln (Liu and Wess, 1996). Effiziente Interaktionen zwischen Wildtyp V2 oder V1a/V2Rezeptorchimären und dem GProtein G s waren hingegen hauptsächlich von V2Rezeptorsequenzen in der dritten intrazellulären (i3) Schleife abhängig. Um die molekularen Grundlagen der Gs Kopplungsselektivität des V2Rezeptors näher zu untersuchen, wurden zunächst klassische Mutagenesetechniken (zielgerichtete Mutagenese'') angewandt. Definierte V2Rezeptorsegmente (oder einzelne Aminosäuren) wurden in den V1aRezeptor transferiert, und die resultierenden HybridVasopressinrezeptoren wurden anschließend in funktionellen Studien auf ihre Fähigkeit, hormonabhängig intrazelluläre cAMP Konzentrationen zu steigern (G s vermittelt), getestet. Diese Strategie schien besonders geeignet, da die Aktivierung des V1aWildtyprezeptors nahezu keine Auswirkungen auf intrazelluläre cAMPSpiegel hat. Wie bereits erwähnt, ist die effiziente Kopplung des V2Rezeptors an das Gs Protein vornehmlich von V2Rezeptorsequenzen in der i3Schleife abhängig (Liu and Wess, 1996). Eine V1aRezeptormutante, deren i3Schleife durch die homologe V2 Rezeptorsequenz ersetzt worden war, war in der Lage, effizient mit Gs zu interagieren. Die Fähigkeit dieser Rezeptormutante, Gs zu aktivieren, war jedoch im Vergleich zum V2Wildtyprezeptor vermindert. Diese Beobachtung ließ die Vermutung zu, daß noch andere intrazelluläre V2Rezeptordomänen zur optimalen Gs Kopplung notwendig sind. Daher wurde zunächst eine Reihe von V1a/V2Rezeptorchimären erzeugt, die den Beitrag der zweiten (i2) und vierten intrazellulären (i4) Rezeptordomäne zur V2 Rezeptor/G s Kopplungsselektivität klären sollten. Funktionelle Untersuchungen der resultierenden HybridRezeptormutanten in Säugetierzellen (COS7) zeigten, daß ein kurzes Segment im Nterminalen Abschnitt der i4Domäne einen deutlichen Beitrag zur V2Rezeptor/G s Kopplungsselektivität leistet. Eine V1aRezeptormutante, welche in der i3Schleife und dem Nterminalen Segment der i4Domäne (Ni4) homologe V2 Rezeptorsequenzen enthielt, zeigte ein funktionelles Profil (EC 50 und E max ), welches mit dem V2Wildtyprezeptor nahezu deckungsgleich war. Anschließend wurden strukturelle Elemente innerhalb der i3Schleife näher untersucht. Funktionelle Analysen zeigten, daß der Nterminale Abschnitt der i3Schleife weitgehend das GProteinKopplungsprofil des V2Rezeptors bestimmt. Eine Reihe von V1aRezeptormutanten wurde erzeugt, in denen kurze Segmente des Nterminalen Bereichs der i3Schleife mit der entsprechenden V2Rezeptorsequenz ausgetauscht wurden. Funktionelle Untersuchungen ergaben, daß ein Aminosäurepaar (Gln225, Val226) und triplet (Phe229, Arg 230, Glu231) am Beginn der i3Schleife des V2 Rezeptors für die effiziente Aktivierung von Gs von entscheidender Bedeutung sind. Durch Punktmutationen in diesem Bereich wurden zwei polare Aminosäuren, Gln225 und Glu231, identifiziert, die für die effiziente V2Rezeptor/G s Interaktion essentiell sind. Untersuchungen mit anderen GPCRKlassen (Dohlman et al., 1991; Savarese and Fraser, 1992; Strader et al., 1994; Wess, 1996) haben ebenfalls gezeigt, daß dem N Terminus der i3Schleife eine besondere Rolle im Rezeptor/GProteinKopplungsprozeß zukommt. In diesen Studien wird berichtet, daß vornehmlich hydrophobe und ungeladene Aminosäuren Schlüsselrollen in der rezeptorvermittelten GProteinAktivierung einnehmen. Die hier beschriebenen Untersuchungen hingegen ergaben, daß zwei polare/geladene Aminosäuren, Gln225 und Glu231, für die V2Rezeptor/G s Kopplung von besonderer Wichtigkeit sind und zeigen daher, daß die Rezeptor/GProtein Kopplungsselektivität nicht auf ausschließlich hydrophoben Wechselwirkungen beruht. Desweiteren konnte beobachtet werden, daß die Länge der i3Schleife die Effizienz, mit der der V2Rezeptor GProteine der Gs Klasse zu aktivieren vermag, beeinflußen kann. Die V1a und V2Rezeptoren weisen unterschiedlich lange i3 Schleifen auf (die i3Schleife des V2Rezeptors ist 13 Aminosäuren kürzer als die des V1aRezeptors). Eine V1aRezeptormutante, deren Nterminaler Abschnitt der i3 Schleife durch homologe V2Rezeptorsequenz ersetzt wurde, konnte deutlich effizienter mit Gs interagieren, wenn der mittlere Abschnitt der i3Schleife um elf Aminosäuren verkürzt wurde. Gleichermaßen konnte die effiziente Kopplung bestimmter V1a/V2Hybridrezeptoren an Gs durch Einfügen von elf Aminosäuren in den zentralen Bereich der i3Schleife deutlich gehemmt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, daß der zentrale Bereich der i3Schleife die Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität beeinflussen kann, obgleich diese Rezeptordomäne vermutlich nicht direkt mit dem GProtein interagiert. Es ist denkbar, daß die Länge der i3Schleife den Zugang des GProteins zu funktionell wichtigen Rezeptordomänen, z.B. Aminosäuren im Bereich der fünften Transmembrandomäne (TM V) und der i3Schleife, reguliert. Identifizierung einzelner Aminosäuresubstitutionen und Aminosäuredeletionen, die die GProteinKopplungsselektivität des V2Rezeptors beeinflussen: Einsatz von Hefeexpressionstechnologie und zufallsgerichteter Mutagenese (random mutagenesis'') Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Hefe(Saccharomyces cerevisiae) Expressionstechnologien angewandt, um StrukturFunktionsanalysen des V2Rezeptors zu erleichtern und Beschränkungen klassischer Mutagenesetechniken zu überwinden. Der V2Wildtyprezeptor und verschiedene GProteinchimären aus Hefe und SäugetierGalpha Untereinheiten wurden in genetisch modifizierten Hefelinien, deren Zellwachstum von effizienter Rezeptor/GProteinKopplung abhängig war, coexprimiert. In diesem System aktiviert produktive Rezeptor/GProteinKopplung den HefeMAPKinase/Pheromon Signaltransduktionsweg. Dies führt zur Transkription des FUS1HIS3Reportergens und somit zur Expression von His3Protein, was den Histidinauxotrophen (his3) Hefelinien ermöglicht, in histidinfreiem Medium zu wachsen (Pausch et al., 1998). Es konnte gezeigt werden, daß heterolog exprimierte V2Rezeptoren weder mit der HefeGProtein alphaUntereinheit (Gpa1p) noch mit einem mutierten Gpa1Protein, in dem die Cterminalen fünf Aminosäuren gegen homologe Galpha q Sequenz ausgetauscht worden waren (Gq5), effizient interagierten. Im Gegensatz dazu erwies sich die Interaktion zwischen dem V2 Rezeptor und einem mutierten Gpa1Protein, dessen Cterminale fünf Aminosäuren die homologe Galpha s Sequenz enthielten (Gs5), als hocheffizient. Diese Beobachtungen zeigten, daß der V2Rezeptor im Hefesystem sein physiologisches Kopplungsprofil beibehielt. Zur weiteren Validierung des Hefeexpressionssystems wurden die G q/11 gekoppelten M 1 , M 3 und M 5 Muskarinrezeptoren und verschiedene mutierte Vasopressin und M 3 Muskarinrezeptoren mit veränderten funktionellen Eigenschaften heterolog in Hefe exprimiert. Funktionelle Analysen zeigten, daß die Wildtyprezeptoren und die verschiedenen Rezeptormutanten in Hefe und Säugetierzellen ähnliche Phänotypen aufwiesen. Um zu untersuchen, weshalb der V2Rezeptor nicht effizient an GProteine der Gq/11 Familie koppelt, sollte der in Hefe exprimierte V2Rezeptor zufallsgerichteter Mutagenese (random mutagenesis'') unterzogen und Mutanten mit veränderten G ProteinKopplungeigenschaften isoliert werden. Im speziellen wurde die i2Schleife untersucht, da eine frühere Studie gezeigt hatte, daß vornehmlich die i2Schleife des V1a Rezeptors für die V1aRezeptor/G q/11 Kopplungsselektivität verantwortlich ist (Liu and Wess, 1996). Mittels zufallsgerichteter Mutagenesetechnik wurde in Hefe eine Bibliothek von V2Rezeptormutanten erzeugt, deren i2Schleife Mutationen mit einer Mutageneserate von ungefähr 10% (auf der Nukleotidebene) enthielt. Anschließend wurden in einem Selektionsverfahren (screen'') 30 000 V2Rezeptormutanten auf ihre Fähigkeit, mit Gq5 zu interagieren, überprüft. Es konnten vier V2Rezeptormutanten isoliert werden, welche effizient an Gq5 (jedoch nicht an HefeGpa1p) koppelten. Funktionelle Untersuchungen mit diesen und anderen mittels zielgerichteter Mutagenese erzeugter V2Rezeptormutanten zeigten, daß die Substitution einer einzigen Aminosäure (Met145) im zentralen Bereich der i2Schleife beträchtliche Auswirkungen auf die Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität hatte. Die Fähigkeit des V2Rezeptors, produktiv mit Gq5 zu interagieren, war von der Anwesenheit relativ großer, hydrophober Aminosäuren wie Leucin und Tryptophan abhängig. Austausch von Met145 mit kleinen Aminosäuren wie Glycin oder Alanin erlaubte dem V2Rezeptor nicht, Gq5 zu aktivieren. Interessanterweise interagierten alle V2Rezeptormutanten, die eine Met145 Punktmutation aufwiesen, mit Gs5 ähnlich effizient wie der V2Wildtyprezeptor. Die Unfähigkeit der V2(Met145Gly) und V2(Met145Ala)Rezeptoren, Gq5 zu aktivieren, beruht daher nicht auf einem Faltungsdefizit. Gleichermaßen basierte die Fähigkeit der V2(Met145Trp) und V2(Met145Leu)Rezeptoren, produktiv an Gq5 zu koppeln, nicht auf der Überexpression von Rezeptorprotein. Diese Ergebnisse zeigen, daß die chemische Eigenschaft der Aminosäure an Position 145 die V2Rezeptor/GProtein Kopplungsselektivität reguliert. Interessanterweise befindet sich in allen anderen Subtypen der Vasopressin/OxytocinRezeptorfamilie (V1a, V1b, und Oxytocin Rezeptoren), welche selektiv an GProteine der G q/11 Klasse gekoppelt sind, ein Leucin an der Stelle, die zu Met145 (V2Rezeptorsequenz) homolog ist. Eine der vier ursprünglich isolierten V2Rezeptormutanten enthielt neben verschiedenen Punktmutationen eine Deletion in Position Met145. In detaillierteren zielgerichteten MutageneseStudien wurden zwei V2Rezeptormutanten erzeugt, die alle drei GProteine (Gq5, Gs5 und Gpa1p) aktivieren konnten. Um zu untersuchen, ob ein generelles Verkürzen der i2Schleife um eine Aminosäure der Grund für die beobachtete Rezeptor/GProteinPromiskuität ist, wurden verschiedene V2Rezeptormutanten erzeugt, in denen einzelne Aminosäuren unmittelbar N und Cterminal von Met145 deletiert worden waren. Funktionelle Untersuchungen ergaben, daß die Deletion einzelner Aminosäuren Nterminal von Met145 (Ile141delta, Cys142delta, Arg143delta oder Pro144delta) in V2Rezeptormutanten resultierte, die nicht mit GProteinen interagieren konnten. RadioligandBindungsstudien zeigten, daß diese V2Rezeptormutanten keine V2Liganden binden konnten, was darauf schließen läßt, daß Deletionen einzelner Aminosäuren Nterminal von Met145 zu mißgefalteten Rezeptoren führen. Die Aminosäuren Ile141Pro144 befinden sich am Beginn der i2Schleife, unmittelbar neben der alphahelikalen zytoplasmatischen Verlängerung der dritten Transmembrandomäne (TM III) in der Nähe des hochkonservierten DRY(H)Motivs. Es ist denkbar, daß Aminosäuren innerhalb des Ile141Pro144Segments mit den zytoplasmatischen Abschnitten von TM III und/oder TM V interagieren und diese Wechselwirkungen die Rezeptorstruktur stabilisieren. Im Gegensatz dazu hatten Deletionen unmittelbar C terminal von Met145 (Leu146delta, Ala147delta, Tyr148delta oder Arg149delta) keinerlei Auswirkungen auf die Funktion des V2Rezeptors. Diese Aminosäuren befinden sich im zentralen Bereich der i2Schleife, der nicht mit den transmembranären Domänen des Rezeptorproteins interagieren kann.
More than 70 years ago, the effects of extracellular adenosine 5'-triphosphate (ATP), a newly identified and purified biomolecule at that time (Fiske and Subbarow, 1925; Lohmann, 1929) were observed by Drury and Szent-Györgyi (1929). Since then, many pharmacological studies were carried out with extracellular adenine nucleotides in various intact organ systems, isolated tissues, and purified cell preparations. Yet it was not until 1972 that Burnstock introduced the concept of "purinergic nerves" and suggested that ATP might fulfil the criteria generally regarded as necessary for establishing a substance as a neurotransmitter, summarised by Eccles (1964):
• synthesis and storage of transmitter in nerve terminals
Strips of guinea-pig taenia coli (GPTC) were shown to take up large amounts of tritium-labelled adenosine when incubated with tritium-labelled adenosine, adenosine 5'-monophosphate (AMP), adenosine 5'-diphosphate (ADP) and ATP. The nucleoside was rapidly converted into and retained largely as [ 3 H]-ATP (Su et al., 1971).
• release of transmitter during nerve stimulation
Spontaneous relaxation of GPTC as well as relaxations induced by nerve stimulation or nicotine, respectively, in the presence of compounds which block adrenergic and cholinergic responses were accompanied by a remarkable increase in release of tritium-labelled material from taenia coli incubated in [ 3 H]-adenosine (Su et al., 1971).
• postjunctional responses to exogenous transmitters that mimic responses to nerve stimulation
Burnstock et al. (1966) characterised ATP and ADP as the most potent inhibitory purine compounds in the gut and observed that the effects of ATP mimic more closely the inhibitory response of the taenia to non-adrenergic nerve-stimulation than to adrenergic nerve stimulation (Burnstock et al., 1970).
enzymes that inactivate the transmitter and/or uptake systems for the transmitter or its breakdown products
When ATP was added to a perfusion fluid recycled through the vasculature of the stomach, very little ATP remained, but the perfusate contained substantially increased amounts of adenosine and inosine, as well as some ADP and AMP (Burnstock et al., 1970).
• drugs that can produce parallel blocking of potentiating effects on the responses of both exogenous transmitter and nerve stimulation
Tachyphylaxis to ATP produced in the rabbit ileum resulted in a consistent depression of responses to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation, whereas responses to adrenergic nerve stimulation remained unaffected (Burnstock et al., 1970). Lower concentrations of quinidine reduced and finally abolished relaxation of GPTC induced by noradrenaline (NA) and by adrenergic nerve stimulation. Using higher concentrations of the compound, relaxant responses of GPTC to ATP as well as to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation were abolished (Burnstock et al., 1970). ...
P2X receptor subunits assemble in the ER of Xenopus oocytes to homomultimeric or heteromultimeric complexes that appear as ATP-gated cation channels at the cell surface. In this work it was intended to investigate the posttranslational modifications such as N-linked glycosylation and disulfide bond formation that is undergone by P2X1 receptors. In addition, the aim of this study was to examine the expression and the quaternary structure of selected P2X receptor isoforms in Xenopus oocytes. The investigation of the quaternary structure of the metabolically or surface labeled His-P2X2 receptor by BN-PAGE revealed that, while the protein complex is only partially assembling in oocytes, the plasma membrane form of the His-P2X2 receptor assembled into trimeric and even hexameric complex as was shown by the BN-PAGE analysis. Besides this finding, it is shown that the His-P2X5 protein that was purified from metabolically or surface labeled oocytes appeared as one single band corresponding to a trimer when analyzed by BN-PAGE. The present study signified that His-P2X6 alone does not reach a defined assembly status and possibly needs the hetero-polymerisation with other P2X subunits to assemble properly for insertion into the plasma membrane. Another finding of this study is that the P2X1 and P2X2 subunits could exist as heteromultimeric protein complexes in the plasma membrane of cells. Purification of surface expressed His-P2X2 subunit allowed the detection of co-injected P2X1 subunit and vice versa in Xenopus oocytes. Incubation with glutardialdehyde led to the cross-linking of P2X2 and P2X1 subunits to dimers and trimers. BN-PAGE analysis of the P2X2/P2X1 complex isolated under nondenaturing conditions from surface-labeled oocytes yielded one distinct band corresponding to a trimeric complex. The analysis of a C-terminally GFP tagged His-P2X1 fusion protein by confocal fluorescence microscopy revealed small clusters of the protein complexes, approximately 4-6 µm in diameter from a diffuse distribution of the protein in the plasma membranes of Xenopus oocytes. The cross-linking or BN-PAGE analysis of the fusion protein resulted in proteins that migrated quantitatively as trimers when purified in digitonin. The analysis of some chimeric constructs confirmed the results of others, which showed that desensitization can be removed from the P2X1 or P2X3 receptor by providing the N-domain from the P2X2 receptor (Werner et al., 1996) The exchange of this domain did not alter the quaternary structure of the chimeras, which showed to be present as trimers when expressed in oocytes. In addition, glycan minus mutants of His-P2X1 receptor were analyzed to examine whether carbohydrate side chains are important for P2X1 subunit assembly, surface expression, or ligand recognition. SDS-PAGE analysis of glycan minus mutants carrying Q instead of N at five individual NXT/S sequons reveals that 284N remains unused because of a proline in the 4 position. The four other sites (153Asn, 184N, 210N, and 300N) carry N-glycans, but solely 300N acquires complex-type carbohydrates. Like parent P2X1 receptor, glycan minus mutants migrate as homotrimers when resolved by blue native PAGE. Recording of ATP-gated currents revealed that elimination of 153N or 210N diminishes or increases functional expression levels, respectively. In addition, elimination of 210N causes a 3-fold reduction of the potency for ATP. If three or all four N-glycosylation sites are simultaneously eliminated, formation of P2X1 receptors is severely impaired or abolished, respectively. It is concluded that at least one N-glycan per subunit of either position is absolutely required for the formation of P2X1 receptors. The SDS-PAGE analysis of surface-labeled His-P2X2 and His-P2X5 receptors revealed that, while the His-P2X2 subunit acquires three complex-type carbohydrates, in case of His-P2X5 polypeptide, only two of the three N-glycans could obtain complex-type carbohydrates during transit of the Golgi apparatus. Furthermore, it was shown that DTT treatment blocked the appearance of newly made His-P2X1 at the plasma membranes of Xenopus oocytes. Also, it was revealed that the effects of DTT on His-P2X1 biogenesis are fully reversible. Removal of the reducing agent leads to subsequent folding and assembly into His-P2X1 receptor complex, followed by transport to the cell surface. The characterization of cysteine minus mutants by SDS PAGE and BN-PAGE demonstrated that, the cysteine substitution in the first cysteine rich domain (C1 - C6) does not have a major effect on assembly for the mutant receptors. In contrast, the replacement of the four cysteine residues (C7 - C10) from the second cysteine rich domain demonstrate a critical importance of this domain for the functional surface expression of P2X1 receptor. The investigations of several double cysteine mutants revealed that according to a similarity in the sensitivity to ATP, the C1 and C6, as well as C2 and C4 and finally C3 and C5 are pairs forming two disulfide bonds in each P2X1 subunit.
During the past several years, ceramide has emerged as an important second messenger triggering cell responses including proliferation, differentiation, growth arrest and apoptosis. This thesis has focused on the regulation of neutral ceramidase which critically determines, in concert with ceramide generating sphingomyelinases, the intracellular ceramide levels. In the first part it is reported that besides a rapid and transient increase in neutral sphingomyelinase activity a second delayed peak of activation occurs after hours of IL-1beta treatment. This second phase of activation is first detectable after 2 h of treatment, and steadily increases over the next two hours reaching maximal values after 4 h. In parallel, a pronounced increase in neutral ceramidase activity is observed, which accounts for a constant or even decreased level of ceramide after long-term IL-1beta treatment, despite continuous sphingomyelinase activation. The increase in neutral ceramidase activity is due to expressional up-regulation, as detected by an increase in mRNA level and enhanced de novo protein synthesis. The increase of neutral ceramidase protein levels and activity can be blocked dosedependently by the p38- mitogen-activated protein kinase (p38-MAPK) inhibitor, SB 202190, whereas the classical MAPK pathway inhibitor U0126, and the PKC inhibitor Ro 31-8220 were ineffective. Moreover, co-treatment of cells for 24 h with IL-1~ and SB 202190 leads to an increase in ceramide formation. Interestingly, IL-1beta-stimulated neutral ceramidase activation is not reduced in mesangial cells isolated from mice deficient in MAPK-activated protein kinase 2 (MAPKAPK-2), which is one possible downstream substrate of the p38-MAPK, thus suggesting that the p38-MAPK-mediated induction of neutral ceramidase occurs independently of MAPKAPK-2. The results suggest a biphasic regulation of sphingomyelin hydrolysis in cytokine-treated mesangial cells with a delayed de novo synthesis of neutral ceramidase counteracting sphingomyelinase activity and apoptosis. Neutral ceramidase may thus represent a novel cytoprotective enzyme for mesangial cells exposed to inflammatory stress conditions. In a second part, the effect of NO on neutral ceramidase was studied. Ceramide levels are strongly increased in a delayed fashion by stimulation of renal mesangial cells with NO. This effect is due to a dual action of NO, comprising an activation of sphingomyelinases and an inhibition of ceramidase activity. The inhibition of neutral ceramidase activity correlates with the decrease of neutral ceramidase protein. A complete loss of neutral ceramidase protein is obtained after 24h of NO stimUlation. Moreover, the NO-induced degradation is reversed by the protein kinase C (PKC) activator, 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) , but also by the physiological PKC activators platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), angiotensin II and ATP, resulting in a normalisation of neutral ceramidase protein as well as activity. In vivo phosphorylation studies using 32Pj-labelled mesangial cells, reveal that TPA, PDGF-BB, angiotensin II and ATP trigger an increased phosphorylation of the neutral ceramidase, which is blocked by the broad-spectrum PKC inhibitor Ro-31 8220, but not by CGP 41251, which has a preferential action on Ca2+-dependent PKC isoforms, thus suggesting the involvement of a Ca2+-independent PKC isoenzyme. In vitro phosphorylation assays using recombinant PKC isoenzymes and neutral ceramidase immunoprecipitated from unstimulated mesangial cells, show that particularly the PKC-alpha isoform, and to a lesser extent the PKC-a isoform, are efficient in directly phosphorylating neutral ceramidase. The data show that NO is able to induce degradation of neutral ceramidase thereby promoting accumulation of ceramide in the cell. This effect is reversed by PKC activation, most probably by the PKC-delta isoenzyme, which may directly phosphorylate and thereby, prevent neutral ceramidase degradation. In the third chapter it is demonstrated that the NO-triggered degradation of neutral ceramidase involves activation of the ubiquitin/proteasome complex. The specific proteasome inhibitor, lactacystin, completely reverses the NO-induced degradation of ceramidase protein and neutral ceramidase activity. As a consequence, the cellular amount of ceramide, which drastically increases by NO stimulation, is reduced in the presence of lactacystin. Furthermore, ubiquitinated neutral ceramidase accumulates after NO stimulation. The data clearly show that the ubiquitin/proteasome complex is an important determinant of neutral ceramidase activity and thereby regulates the availability of ceramide. In a last part, the cellular localisation of neutral ceramidase was investigated using green fluorescent protein (GFP) as fusion protein to examine cellular distribution and translocation of neutral ceramidase. Unstimulated HEK 293 cells reveal after transient transfection experiments that neutral ceramidase is preferentially localized in the cytoplasm. PKC activation led to an accumulation of neutral ceramidase at the nuclear membrane. In summary, this work demonstrates that the neutral ceramidase is a fine regulated protein that plays a critical role in regulating intracellular ceramide levels and thereby the cell's fate to undergo apoptosis or survive. Regulation of neutral ceramidase can be achieved on all levels, i.e. on the mRNA level, the protein level or posttranslationally by phosphorylation and subcellular translocation. Future work will reveal whether neutral ceramidase can serve as a therapeutic target in the development of novel antiinflammatory and anti-tumour drugs.
Der Produktion von Interleukin-8 (IL-8), Hämoxygenase-1 (HO-1), und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) wird zunehmend größere Bedeutung im Rahmen der Regulation der Immunantwort bei Entzündung, Infektion und Tumorwachstum zugemessen. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Regulation dieser Botenstoffe in vitro durch Verwendung der humanen Dickdarmkarzinomzellinie DLD-1. Die Substanz Pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC) verstärkt nicht nur die durch Tumornekrosefaktor-a (TNF-a) vermittelte Ausschüttung von IL-8, sondern induziert auch als alleiniger Stimulus die IL-8-Sekretion. Mutationsanalysen des IL-8-Promotors und "Electrophoretic Mobility Shift" Untersuchungen (EMSA) zeigten, daß die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 (Aktivator Protein-1) und die Bindungsaktivität von konstitutiv aktiviertem NF-KB in DLD-1 Zellen für die PDTC induzierte IL-8 Expression zwingend erforderlich waren. Weiterhin war PDTC in der Lage in DLD-1 Zellen neben IL-8 auch die Expression von HO-1 und VEGF zu verstärken. Die Induktion von IL-8 durch PDTC war nicht nur auf DLD-1 Zellen beschränkt, sondern wurde auch in Caco-2 Zellen (ebenfalls Dickdarmkrebszellen) und in humanen mononukleären Blutzellen beobachtet. Die Verwendung von PDTC wird seit kurzem als Kombinationspräparat für Zytostatia zur Behandlung von verschiedenen bösartigen Tumoren, unter ihnen auch Darmkrebs, vorgeschlagen. Aus unseren Versuchen läßt sich ableiten, daß die Induktion von IL-8, HO-1 und VEGF die therapeutische Anwendung dieser Substanz nachteilig beeinflussen könnte. Dies ergibt sich daraus, daß alle drei genannten Faktoren durch proangiogene Wirkungen das Tumorwachstum fördern. Die Expression der induzierbaren Stickoxidsynthase und die Produktion von Stickoxid (NO) korreliert mit der Angiogenese bei verschiedenen Krebserkrankungen darunter Melanome, Tumore im Hals- und Kopfbereich und Darmkrebs. Da tumorbegünstigende Funktionen von NO mit vermehrter Angiogenese in Verbindung gebracht werden, wurden die Effekte von NO hinsichtlich der Produktion von ausgesuchten Chemokinen, die an der Steuerung des Tumorwachstums beteiligt sind, untersucht. Zu diesen Chemokinen gehören das proangiogene IL-8 sowie das tumorsuppressiv durch Interferon induzierbare Protein-10 (IP-10) und das Monokin induziert durch Interferon-y (MIG). Diese Chemokine werden, nach Stimulation mit IL- 1ß und lnterferon-? (IFN-?) von DLD-1 Zellen, ausgeschüttet. Unter diesen Bedingungen wird die IL-8 Freisetzung alleine durch IL-1ß vermittelt, aber nicht durch INFy. Im Gegensatz zu IL-8 hängt die Sekretion von IP-10 und MIG von der Aktivierung durch IFNy ab. Die Effekte von NO wurden analysiert indem DLD-1 Zellen mit dem NO-Donor DETA-NO inkubiert wurden. DETA-NO besitzt eine Halbwertzeit von 16,5h und simuliert damit die Effekte der endogenen NO-Synthase. Synthese und Freisetzung von IL-8 wurden durch die Behandlung mit NO stark gesteigert. Außerdem wurde in Zellen die dem NO-Donor ausgesetzt wurden die basale Sekretion des VEGF signifikant verstärkt. Dies steht im Gegensatz zur IL-Iß/IFNy-induzierten Produktion von IP-10 und MIG, beide wurden durch Koinkubation mit NO unterdrückt. Ebenso wurde die Regulation der IFNy abhängigen induzierbaren Stickoxidsynthase in DLD-1 Zellen von NO unterdrückt. Die vorliegenden Daten ergänzen vorherige Studien, in denen NO mit Tumorangiogenese und verstärkten Tumorwachstum in Verbindung gebracht wird. Die NO vermittelte Induktion von IL-8 und VEGF, ebenso wie die Verminderung der IP-10 and MIG Expression, könnte zu diesem Phänomen beitragen. Unsere Studien stützen die Hypothese, daß spezifische lnhibitoren der iNOS therapeutischen Nutzen bei humanen Neoplasien haben könnten.
Role in routing to the plasma membrane of the L 0 domain of the multidrug resistance protein MRP1
(2003)
Die mehrfache Chemotherapieresistenz (Multidrug Resistance) beruht auf vermehrtem Transport von Xenobiotika aus der Zelle, was zu einer dramatischen Verringerung der intrazellulären Konzentration von chemotherapeutischen Substanzen führt. Dieser Effekt wird von transmembranen Transporter-Proteinen der ABC-Familie verursacht. Zu dieser Familie gehört MRP1, die eine große Vielfalt an Substraten transportieren kann. MRP1 ist ein 190 kDa Glykoprotein mit einer vermuteten Topologie, die zusätzlich zum typischen P-gp ähnlichen Kern (Delta MRP1) eine amino-proximale transmembrane Domäne aufweist, die aus fünf transmembranen Alpha-Helices besteht. Sie ist durch einen cytoplasmatischen Verbindungs-Loop (L0) mit Delta MRP1 verbunden. Wenn MRP1 in polarisierten Zellen exprimiert wird, wird es zu der basolateralen Membran geleitet. In der vorliegenden Arbeit sollte nun die Funktion des amino-terminalen Bereichs von MRP1, der aus der ersten transmembranen Domäne TMD0 und dem cytoplasmischen Verbindungs-Loop L0 besteht, durch Expression und Koexpression von diversen MRP1 Mutanten in polarisierten MDCKII Zellen untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass in der L0 Region eine amphipathische Helix vorhanden ist, die für die Funktionalität der MRP1 notwendig ist; dass das isolierte L0-Peptid in der Lage ist, sich mit Delta MRPI zu assoziieren (dadurch erlangt das Protein wieder seine Funktion und lokalisiert sich in der basolateralen Membrane); dass TMD0L0 sich teilweise in der basolaterale Membrane befindet und dass seine Anwesenheit genügt, um die Glycosilierung (Fig. 4.17 in der Dissertation) und die Lokalisierung in der basolateralen Membrane des Delta MRP1 zu ermöglichen (Fig. 4.18 in der Dissertation); dass die Koexpression der zwei komplementären Fragmente eine wild-type-ähnliche Transportaktivität ergibt (Fig. 4.19 in der Dissertation) und dass die beiden Fragmente interagieren (Fig. 4.21 in der Dissertation). Es wurde ausserdem ein chimerisches Protein hergestellt, welches aus TMD0 von MRP1 und L0 von MRP2 besteht und in MDCKII und MDCKII-Delta MRP1 Zellen exprimiert. Es wurde festgestellt, dass das unvollständig glycosiliert ist (Fig. 4.24 in der Dissertation) und dass es sich im endoplasmatischen Reticulum lokalisiert (Fig. 425 in der Dissertation).
In this study we investigated the regulation of IL-18BPa by IFN-y in the context of colon cancer and human autoimmune diseases. IL-18BPa is a naturally occuring inhibitor that counteracts IL-18 bioactivity. By enhancing IFN-y production IL-18 has been introduced as pivotal mediator of TH1 immune responses. Indeed, many IL-18 effects are mediated by IFN-y. IL-18 bioactivity is connected with the pathogenesis of different inflammatory diseases, for instance, septic shock, colitis, Crohn's disease, myasthenia gravis, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, atherosclerosis, and organ transplant rejection. In addition, IL-18 has tumor-suppressive properties. IFN-y induced IL-18BPa expression was shown on protein and mRNA level in different colon carcinoma cell lines, organ cultures of colonic intestinal biopsy specimens, HaCaT keratinocytes as well as rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocytes (RA-FLS). The IFN-y-mediated induction of IL-18BPa appears to be a more general phenomenom. The capability of IFN-y to induce IL-18BPa also has been confirmed on the promoter level by performing luciferase reporter gene studies with two IL- 18BP promoter fragments. A GAS-site proximal to the transcription start site has been identified to be relevant for IFN-y-mediated induction of these two IL18BP promoter fragments. The induction of IL-18BPa is most likely mediated by STAT-1 in DLD-1 colon carcinoma cells. Sodium butyrate inhibited IFN-y-induced IL-18BPa expression in these cells. On the basis of our observations, we postulate a negative feedback mechanism, by which IFN-y-dependent and -independent IL-18 action might be counterregulated. In this model sodium butyrate is an additional player, that may interrupt the postulated negative feedback loop. A coculture system was performed to simulate an inflammatory TH1 response. This model which is more close to the in vivo situation, confirmed upregulation of IL-18BPa by endogenously produced IFN-y. The role of IL-18BPa is manifold and depends on IL-18 function in each particular case. In autoimmune diseases, for instance, which are often characterized by a TH1 polarized immune response, IL-18BPa might counterregulate IL-18 and/or IL-18-induced IFN-y bioactivity. Important examples are Crohn's disease and rheumatoid arthritis. In CD therapeutic use of IL-18BPa may therefore restore a hypothetically disturbed IL-18/IL-18BP balance. Concerning RA, IL-18BPa expression might contribute to protective functions of IFN-y, observed in different murine models for arthritis and in rheumatoid arthritis patients. Moreover, IL-18BPa might inhibit IL-18-mediated induction of subsequent cardinal inflammatory cytokines responsible for the pathogenesis of these diseases. Indeed, the pharmaceutical industry successfully used IL-18BP as therapeutic agent in a murine model of RA and in phase I clinical trials. On the contrary, in the context of carcinogenesis IFN-y- mediated IL-18BPa expression might be disadvantageous. By counterregulating the IL-18 arm of immune defenses against tumors, IL-18BP may have the potential to promote carcinogenesis. Our hypothesis is underlined by the observation that sodium butyrate, known to be protective in colon cancer, inhibited IFN-y-induced IL-18BPa expression. In parallel, IL-18-induced IFN-y is also responsible for iNOS induction. iNOS-derived NO provides a second possible way for inhibition of IFN-y-dependent and -independent tumor suppressive effects of IL-18. Finally, IFN-y-induced IL-18BPa expression was confirmed on the promoter level. This induction on the promoter level was associated with STAT-1 binding to the GAS element proximal to the start of transcription. It is tempting to speculate that blockage of the cytokine cascade upstream of IL-1 and TNF- a on the level of IL-18 may be of therapeutic benefit. Our data reflect the relationship between inflammation and cancer, in that inflammatory cells and cytokines found in tumors are likely to contribute to tumor growth, progression, and immunosuppression than they are to mount an effective host antitumour response.
Remodeling of extracellular matrix (ECM) is an important physiologic feature of normal growth and development. In addition to this critical function in physiology many diseases have been associated with an imbalance of ECM synthesis and degradation. In the kidney, dysregulation of ECM turnover can lead to interstitial fibrosis, and glomerulosclerosis. The major physiologic regulators of ECM degradation in the glomerulus are the large family of zinc-dependent proteases, collectively refered to matrix metalloproteinases (MMPs). The tight regulation of most of these proteases is accomplished by different mechanisms, including the regulation of MMP gene expression, the processing and conversion of the inactive zymogen by other proteases such as serine proteases and finally the inhibition of active MMPs by endogenous inhibitors of MMPs, denoted as tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). Namely, the MMP-9 has been shown to be critically involved in the dysregulation of ECM turnover associated with severe pathologic conditions such as rheumatoid arthritis or fibrosis of lung, skin and kidney. In the present work I searched for a possible modulation of MMP-9 expression and/or activity in glomerular mesangial cells which are thought as key players of many inflammatory and non-inflammatory glomerular diseases. I found that various structurally different PPARalpha agonists such as WY-14,643, LY-171883 and fibrates potently suppress the cytokine-induced MMP-9 expression in renal MC. Furthermore, I demonstrate that the inhibition of MMP-9 expression by PPARalpha agonists was paralleled by a strong increase of cytokine-induced iNOS expression and subsequent NO formation, suggesting that PPARalpha-dependent effects on MMP-9 expression level primarily result from alterations in NO production which in turn reduces the MMP-9 mRNA half-life. Searching for the detailed mechanism of NO-dependent effects on MMP-9 mRNA stability, I found that NO either given from exogenous sources or endogenously produced increases the MMP-9 mRNA degradation by decreasing the expression of the mRNA stabilizing factor HuR. Furthermore, I demonstrate a reduction in the RNA-binding capacity of HuR containing complexes to MMP-9 ARE motifs in cells treated with NO. Since the reduction of HuR expression can be mimicked by the cGMP analog 8-Bromo-cGMP, I suggest that NO reduces in a cGMP-dependent manner the expression of HuR. Finally, I elucidated the modulatory effect of extracellular nucleotides, mainly ATP, on cytokine-triggered MMP-9 expression. Interestingly, I found that in contrast to NO, gamma-S-ATP the stable analog of ATP potently amplifies the IL-beta mediated MMP-9 expression. The increase in mRNA stability was paralleled by an increase in the nuclear-cytosolic shuttling of the mRNA stabilizing factor HuR. Furthermore, I demonstrate an increase in the RNA-binding capacity of HuR containing complexes to the 3'-UTR of MMP-9 by ATP. In summary, the data presented here may help to find new targets (posttranscriptional regulation) that could be used to manipulate or modulate the expression of not only MMP-9 but also other genes regulated on the level of mRNA stability.