Pharmazie
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Die meisten nanopartikulären Ansätze im Bereich der Arzneiformenentwicklung befinden sich am Anfang der klinischen Evaluation, sodass das wirkliche Potenzial nanotechnologischer Produkte sich erst in den kommenden Jahren abzeichnen wird. Die Zusammenführung von „Drug-Targeting“ und „sustained release“ mit nanotechnologischer Entwicklung könnte in Zukunft zu einem Fortschritt in der Medizin beitragen. Auf dem Gebiet der Antisense-Oligonukleotid (ASO)-Therapie stellt der ASOTransfer in Zielzellen eine entscheidende Hürde dar. ASO benötigt, um im Körper an den Wirkort zu gelangen, einen zuverlässigen Träger, der vor dem Abbau in physiologischen Milieu schützt, den Transport über extra- und intrazelluläre Barrieren im Körper gewährleistet und die ASO zielgerichtet an den Wirkort bringt. Der Einbau von ASO in kolloidale Trägersysteme wie Nanopartikel vermittelt eine effiziente Aufnahme in Zellen bei gleichzeitigem Schutz vor abbauenden Enzymen im Körper. Des Weiteren kann eine gezielte Aufnahme in Zielzellen erreicht werden, die normalerweise nicht auftritt. Bisherige Trägersysteme bestanden meist aus Nanopartikeln von synthetischen Materialien, die entweder die ASO an der Oberfläche adsorbiert oder in der Partikelmatrix inkorporiert hatten. Als Trägermaterialien wurden oft Polyalkylcyanoacrylate verwendet. Sie sind aufgrund ihrer negativen Ladung und Hydrophobizität nicht geeignet ohne Zugabe von Hilfsstoffen, welche in höheren Konzentrationen toxisch wirken, anionische hydrophile Substanzen wie ASO zu adsorbieren. Außerdem besteht bei Nanopartikeln mit adsorbierten ASO die Gefahr, dass es bei einer intravenösen Gabe zu einer Desorption der ASO kommt und somit ASO die Zielzellen nicht in verpackter Form erreicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NP auf Basis von humanem Serumalbumin (HSA) als Trägersystem für ASO entwickelt. Durch Oberflächenmodifikation dieser Trägersysteme wurde eine Kopplung von anti-HER2 Antikörper ermöglicht und ein AK-vermitteltes Drug-Targeting erreicht. HSA als natürliches Makromolekül zeichnet sich durch geringe Toxizität und gute Biodegradierbarkeit aus. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass ein Wirkstoff mit vorhandenen Bindungsstellen im HSA-Molekül Wechselwirkungen eingehen kann, was eine erfolgreiche Einbindung gewährleistet. Zusätzlich eignen sich aus HSA hergestellte NP aufgrund funktioneller Gruppen an der Partikeloberfläche für die Kopplung von Antikörpern und ermöglichen somit eine zielgerichtete Arzneistofftherapie. Die entwickelten Trägersysteme wurden hinsichtlich kolloidaler Parameter wie Teilchengröße, Oberflächenladung, ASOBeladungseffizienz, Stabilität in physiologischen Medium und ihrem Vermögen, einen ASO-Effekt zu erzielen, in Zellkultur evaluiert. 4.1 Optimierung der Beladung von NP mit ASO Zunächst wurden HSA-NP hergestellt, bei denen die Beladung durch Inkorporieren des ASO in die Partikelmatrix erfolgte. Die Evaluierung des Desolvatationsprozesses ergab eine Abhängigkeit der ASO-Beladung vom zugesetzten Desolvatationsmittel Ethanol. Eine Mindestmenge eines 1,8-fachen Überschusses an Ethanol ist für die vollständige Desolvatation des HSA und damit für die Einbindung des daran adsorbierten ASO erforderlich. Ebenso beeinflusste die Quervernetzung der Partikel die ASO-Beladungseffizienz. Je mehr Glutaraldehyd zugesetzt wurde, desto stabiler waren die NP. Nimmt die Menge des Glutaraldehyds von 40% auf 200% zu, löste sich um so weniger ASO während der Waschschritte aus der Partikelmatrix heraus. Jedoch hat das Ausmaß der Quervernetzung einen entscheidenden Einfluss auf die Biodegradierbarkeit des Partikelsystems. Zu stark quervernetzte NP (Quervernetzung von 200%) können von intrazellulären Enzymen nicht mehr abgebaut werden, infolge dessen gelangt das eingebundene ASO nicht zu seinem Wirkort ins Zytoplasma. Im Folgenden wurde versucht über die Einführung einer permanenten kationischen Ladung (EDC/Cholamin-Reaktion) im HSA-Molekül ein Trägerpolymer mit höherer Beladungskapazität im Vergleich zu nativem HSA zu etablieren. Ein geringer Anteil von kationisiertem HSA (cHSA) in der HSA-Partikelmatrix reichte aus, um die ASOBeladungseffizienz um ein 2,5-faches signifikant zu steigern. Das Ziel der Oberflächenmodifikation der HSA-NP war eine Positivierung des Zetapotentials, um die Bindung negativ geladener Wirkstoffe wie ASO über elektrostatische Wechselwirkungen zu ermöglichen. Die Umsetzung der HSA-NP mit EDC und Cholamin führte zu einer deutlichen Verschiebung des Zetapotentials von ca. –20,0 mV in den positiven Bereich (+38,6 mV). Durch die Inkubation mit ASO konnten so große Menge an ASO effizient an die Partikeloberfläche (NP+) gebunden werden. Ein Vergleich dieser Ergebnisse zeigte, dass die Beladung mit ASO in der Reihenfolge von Albumin-NP (HSA-NP) mit einer Beladungseffizienz von 7,6 µg ASO / mg NP zu Nanopartikeln, die in der Partikelmatrix inkorporierten Anteil an kationisiertem Albumin enthielten (cHSA-NP) mit 18,2 µg ASO / mg NP, zu Oberflächen-kationisierten Nanopartikeln (NP+) mit 100 µg ASO / mg NP signifikant zunahm. 4.2 Mit ASO-beladene NP in der Zellkultur HSA-NP wurden von allen verwendeten Brustkrebszell-Linien gut vertragen. Nach Zellaufnahme der HSA-NP wurden bei niedriger Quervernetzung (40%) die Partikel gut intrazellulär abgebaut und das ASO in das Zytoplasma freigesetzt. Es konnte im CLSM gezeigt werden, dass die ASO-Freisetzung innerhalb von 24 h zunahm. Alle Versuche mittels den entwickelten ASO-beladenen Trägersystemen einen Antisense Effekt nachzuweisen schlugen fehl. Da die Beladung der HSA-NP nicht weiter erhöht werden konnte, richtete sich ein neuer Ansatz auf eine verbesserte Aufnahme der NP über einen Rezeptor-vermittelten Mechanismus. 4.3 Antikörper-vermittelte Anreicherung von NP in Zielzellen Die Anwendung von monoklonalen Antikörpern mit einer Spezifität gegenüber Tumorzellen ist eine relativ neue und spannende Modalität in der Krebstherapie. Eine der vielversprechenden Zielstrukturen für eine solche Immunotherapie stellt der HER2-Membranrezeptor dar, dessen Überexpression mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. HER2 ist ein Produkt des Proto-Onkogens erbB2, das für einen 185 kDa Transmembrantyrosinkinase Wachstumsfaktorrezeptor kodiert. Dieser Rezeptor ist in normalem Gewebe bei Erwachsenen nur geringfügig exprimiert [Press et al., 1990], aber ist bei ungefähr 30% der Patienten mit humanem Magenkarzinom, Lungen- und Brustkrebs überexprimiert. Gegenwärtig dient HER2 als Tumormarker für die zielgerichtete Behandlung mit dem humanisierten anti-HER2 AK Trastuzumab (Herceptin®) von Patientinnen bei metastasierendem Brustkrebs. Jedoch können bessere Ergebnisse erreicht werden, wenn Trastuzumab in Kombination mit anderen Zytostatika verabreicht wird. Antikörper haben bei alleiniger Gabe eine ausreichende Antitumoraktivität, aber sie können auch konjugiert mit Zytostatika sowie Toxinen und Radionukliden, genutzt werden, um diese zu den Tumoren bringen. Im Prinzip kann die Trägereigenschaft von Antikörpern gesteigert werden, wenn ein Antikörper an ein Arzneistoffreservoir, wie Nanopartikel oder Liposomen geknüpft ist. Der Vorteil dieses innovativen Ansatzes für eine zellspezifische Anreicherung im Vergleich zu herkömmlichen Biokonjugaten ist, dass eine höhere Arzneistoffträgerkapazität mit einer verbesserten Spezifität für eine zielgerichtete Pharmakotherapie kombiniert werden kann. Wegen seiner erhöhten Expression in Tumorzellen, seiner extrazellulären Verfügbarkeit und seiner Fähigkeit nach Antikörperbindung internalisiert zu werden, stellt HER2 eine geeignete Zielstruktur für die Tumortherapie mit zellspezifischen Nanopartikeln dar. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion Antikörpermodifizierter Protein-basierter Nanopartikel zu untersuchen und eine spezifische Aufnahme in HER2-überexprimierende Zell-Linien zu verbessern. Ein spezifisches Targeting wurde in verschiedenen Krebszell-Linien mit unterschiedlichen HER2- Expressionsleveln durch FACS-Analyse bewiesen. Die Versuche beinhalteten Inhibitionsexperimente durch Vorinkubation mit Trastuzumab, um die Selektivität der Bindungsstellen auf der Zelloberfläche zu unterstreichen. Die zelluläre Aufnahme dieser Nanopartikel, ebenso wie die zelluläre Verteilung, konnte im CLSM beobachtet werden. Diese ermutigenden Ergebnisse heben den potenziellen Wert Antikörper-modifizierter Nanopartikel für eine spezifische Anreicherung in Tumorzellen hervor. Anti-HER2-NP binden effizient an HER2-überexprimierende Zellen (85%) und werden anschließend internalisiert. Im Anschluss wurde die Beladung von ASO in HSA-NP mit den erhaltenen Erkenntnissen Antikörpermodifizierter HSA-NP kombiniert. Zunächst wurde die Freisetzung von farbmarkierten ASO aus AK-modifizierten HSA-NP in SK-Br-3- und MCF7-Zellen untersucht. Durch die spezifische Aufnahme der AK-modifizierten HSA-NP gelangt bereits innerhalb der ersten Stunde deutlich mehr ASO in die Zelle. Die Zellaufnahme und Freisetzung in das Zytosol der Zelle ist abhängig vom HER2- Protein auf der Zelloberfläche und nimmt über 24 h stark zu. SK-Br-3-Zellen reichern das farbmarkierte ASO stärker als die MCF7-Zellen an. Wirksame ASOKonzentrationen können in SK-Br-3-Zellen mit einer sehr geringen Partikelkonzentration von nur 50 µg anti-HER2-NP/ml erzielt werden, während in MCF7- Zellen eine weit aus höhere Partikelkonzentration notwendig ist. Da die HER2- überexprimierenden Zellen, die für einen Antisense-Testung zur Verfügung standen, sich nicht für den Nachweis eines Antisense-Effektes eigneten, konnte die entwickelte Kombination von ASO-beladenen AK-modifizierten Albumin- Nanopartikeln nicht weiter getestet werden. In Kombination mit einem in die Nanopartikel inkorporierten Arzneistoff wird eine wirksame intrazelluläre Arzneistoffabgabe erwartet. Die Anwendung Antikörpermodifizierter Nanopartikel kann Arzneistoff-Trägereigenschaften mit einer zielgerichteten Tumortherapie kombinieren. Diese neue Generation von immunospezifischen Nanopartikeln sollte auf jeden Fall noch weiter im Einzelnen untersucht werden, um die Wirksamkeit dieser Arzneistoffträgersysteme unter in vitro und in vivo Bedingungen zu belegen.
Die Entwicklung von Wirkstoffträgern für Antisense-Oligdesoxyonukleotide auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln stellt einen interessanten Ansatz für antivirale Strategien dar. So konnte gezeigt werden, dass bereits ab einem 1,5-fachen Massenüberschuss an Protamin eine spontane Komplexbildung mit Antisense-Wirkstoffen stattfindet, die einen Größenbereich von etwa 200 nm aufweisen und durch eine Oberflächenladung von ca. + 20 mV charakterisiert sind. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften besitzen diese Nanopartikel nahezu ideale Eigenschaften, die intrazelluläre Verfügbarkeit von Antisense-Wirkstoffen entscheidend zu verbessern. Eine sehr gute zelluläre Aufnahme von Protamin/Antisense-Nanopartikeln konnte entsprechend in primären humanen Makrophagen als auch in lymphozytären T-Zellen gezeigt werden. Die Anwendung dieser Wirkstoffträger in den beschriebenen Zellen erwies sich dabei als sehr gut verträglich und zeigte keine toxischen Wirkungen in insgesamt drei unterschiedlichen Testverfahren zur Bestimmung der Zelltoxizität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Protamin/Antisense-Nanopartikel mit unmodifizierten Antisense-Oligodesoxynukleotiden ein sehr günstiges intrazelluläres Auflösungsverhalten besitzen, was zu einer kontinuierlichen Freisetzung des inkorporierten Antisense- Wirkstoffs führte. Dabei wurde deutlich, dass nach spätestens 72 Stunden ein vollständiger Zerfall des Nanopartikels stattfand und der Wirkstoff sich gleichmäßig in intrazellulären Kompartimenten verteilte. Im Gegensatz dazu stellen Protamin/Antisense-Nanopartikel mit modifizierten Phosphorothioat-Wirkstoffen ein äußerst stabiles System dar, das zu keiner merklichen intrazellulären Wirkstofffreisetzung selbst nach 72 Stunden führte. Es konnte gezeigt werden, dass Protamin/AS-ODN-Nanopartikel die Expression eines von einem lentiviralen Vektor exprimierten Reportergens konzentrationsabhängig in primären humanen Makrophagen inhibieren konnte. Die antivirale Wirksamkeit dieser Wirkstoffträger konnte auch gegen das HIV-1-spezifische Transaktivatorprotein Tat in transient transfizierten Zielzellen der HIV-1-Infektion spezifisch demonstriert werden. Hier wurde eine selektive Inhibition der Tat-vermittelten Transaktivierung von 35 % bei einer Konzentration von 2 MikroM in Jurkat-Zellen nachgewiesen. Auch in primären Makrophagen, die mit einem HIV-1-Wildtypisolat infiziert wurden, führte die Anwendung von Protamin/AS-ODN-Nanopartikeln mit spezifischen Sequenzen gegen ein HIV-1-Gen zu einer deutliche Reduktion der Virusausbreitung in der Kultur. Bei einer wiederholten Behandlung von HIV-1-infizierten Makrophagen mit Protamin/AS-ODN-Nanopartikel in einer Konzentration von 2 MikroM zeigten nur einige wenige Zellen eine Infektion mit dem Virus, während sich in unbehandelten Zellen eine komplett durchinfizierte Kultur manifestiert hatte. Entsprechend der ungünstigen Bioverfügbarkeit von AS-PTO-Wirkstoffen nach intrazellulärem Transport in Form von Protamin-Nanopartikeln konnte für diese Formulierungen keine biologische Wirkung in Zellkultursystemen nachgewiesen werden. Die Inkorporation von destabilisierenden Zusätzen in die Nanopartikelmatrix bietet hier Möglichkeiten, die intrazelluläre Dekomplexierung dieser Wirkstoffträger günstig zu beeinflussen. Als Neuentwicklung konnte ein kolloidales Trägersystem für siRNA-Wirkstoffe auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln entwickelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Protaminbase als auch Protaminsulfat siRNA-Wirkstoffe ab einem 2,5-fachen Massenüberschuss komplexieren. Protamin basierte Nanopartikel für siRNA-Wirkstoffe waren durch ein sehr günstiges Zellaufnahmeverhalten und fehlende zytotoxische Wirkung in primären humanen Makrophagen gekennzeichnet. Trotz dieser idealen Ausgangsbedingungen zeigten biologische Wirksamkeitstestungen sowohl gegen das endogene Protein Lamin A/C als auch virale Hemmversuche in HIV-1- infizierten primären Makrophagen nur marginale Effekte. Eine weitere Optimierung der Nanopartikelzusammensetzung und Untersuchungen zur intrazellulären Stabilität sind nötig, um die biologische Aktivität dieser Formulierungen entscheidend zu verbessern. Oberflächenmodifizierte Nanopartikel auf der Basis von Gelatine erwiesen sich in den durchgeführten Experimente als besonders vielversprechend. Hier konnte gezeigt werden, dass ein spezifisches Targeting von T-Zellen mit CD3-Gelatine-Nanopartikel realisiert werden kann, die auf ihrer Oberfläche kovalent einen anti-CD3-Antikörper tragen, der gegen die T-Zell spezifische Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes gerichtet ist. Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie zeigten, dass dabei die Zellaufnahme dieser Wirkstoffträger von der Expression des durch den Antikörper erkannten Zielantigens auf der Oberfläche der Zielzellen ist. In Zellen mit besonders starker Expression des CD3-Epitops wurden Gelatine-Nanopartikel mit oberflächengebundenem anti-CD3-Antikörper zu einem sehr bedeutendem Ausmaß selektiv aufgenommen. In Kompetitionsexperimenten mit freiem anti-CD3-Antikörper konnte diese Aufnahme deutlich reduziert werden, was für die selektive Bindung und Internalisierung der CD3-Gelatine- Nanopartikel über den oberflächengebundenen Antikörper schließen läßt. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD3-Gelatine-Nanopartikel das Potential besitzen, als selektives Wirkstoffträgersystem für T-Zellen eingesetzt zu werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war, Arzneistoffformulierungen, wie kationische Nanopartikel, Liposomen und virale Hüllkapside, für den Transport von Antisense-Oligonukleotiden in Zellen zu untersuchen. Der Schwerpunkt lag hierbei auf der in vitro Testung in der Zellkultur. Als Zielstruktur wurde der NMDA-Rezeptor gewählt, dessen Expression durch die Gabe von Antisense-Oligonukleotiden gehemmt wurde. Testobjekt waren murine Fibroblasten, die in einer Vorgängerarbeit von Ralf Steinmetz mit der cDNA für die entsprechenden NMDA-Rezeptorsubtypen transfiziert worden sind und deren Eignung für die Testung von Rezeptorantagonisten schon gezeigt worden ist. Beim NMDA-Rezeptor handelt es sich um einen ligandgesteuerten Ionenkanal, der normalerweise nur in neuronalem Gewebe zu finden ist. Eine Überexpression und anschließende Stimulation des Rezeptors führt über einen massiven Ca2+-Einstrom zum Absterben der Zellen. Dieses Modell erlaubte die Auswertung der Antisense-Wirkung in einem funktionellen Assay über ein reduziertes Absterbeverhalten der Zellen. Die spezifischen Reduktion des Zielproteins wurde mittels Western-Blot-Technik gezeigt. Alle eingesetzten Trägersysteme wurden hinsichtilich ihrer physiko-chemischen Eigenschaften untersucht. Im Mittelpunkt standen dabei die Bestimmung von Größe und Oberflächenladung (Zetapotential), die mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (DLS) bestimmt wurden. Der Schwerpunkt bei der Untersuchung der Drug-Delivery-Systeme lag auf den biodegradierbaren Nanopartikeln auf Basis von Protamin. Im Anschluß an diese physikochemische Charakterisierung wurden diese Partikel in der Zellkultur im Vergleich zu freien, d.h. nicht an ein Trägersystem gebundenen, und zu liposomal (DOTAP) verpackten Oligonukleotiden getestet. Es zeigt sich, dass die Albumin-Protamin-Oligokukleotid-Formulierung gegenüber den freien Oligonukleotiden eine um den Faktor 12 verbesserte zelluläre Aufnahme aufweisen, was mit der liposomen Formulierung vergleichbar ist. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass 100 % der Zellen transfiziert worden sind. Es wurde sowohl im funktionellen Modell über Zelltod, als auch auf Proteinebene (Western-Blot) eine Reduktion des NMDA-Rezeptors von etwa 35 % 24 Stunden nach der Gabe des Oligonukleotide gefunden. Dieses Ergebnis spricht für eine intrazelluläre Freigabe der Oligonukleotide aus den Partikeln. Im Gegensatz zur liposomalen Zubereitung wurden keine zytotoxischen Nebenwirkungen der Nanopartikel gefunden. In einem abschließenden Vergleich wurden rekombinant hergestellte virale Hüllkapside (VP1 Kapside), zwei kationische liposomale Zubereitungen (DOTAP/Lipofectin), zwei kationische Alkylcyanoacrylat Nanopartikelpräparationen (PBCA/PHCA) und zwei auf Protamin basierende Nanopartikelsystme (mit/ohne Albumin-Zusatz) in der Zellkultur getestet. Untersucht wurde die Transfereffizienz für Oligonukleotide mittels einer Fluoreszenzmethode, die intrazelluäre Verteilung wurde im konfokalen Laser-Scan-Mikroskop dargestellt, es wurde eine Antisense-Wirkung im Vergleich zu einer Kontrollsequenz bestimmt (sowohl im funktionellen System, als auch im Western-Blot) und es wurden die zytotoxischen Nebenwirkungen betrachtet. Zusammenfassend ergaben diese Ergebnisse eine um das 2- bis 18-fache Erhöhung der Zellaufnahme im Vergleich zu freien Oligonukleotiden. Die protamin-basierten Nanopartikel zeigten keine nennenswerten zytotoxischen Nebenwirkungen.
Substanzen, die den intrazellulären pH-Wert beeinflussen, verändern den proteolytischen Abbau des Amyloidvorläuferproteins (APP) teilweise so, dass weniger Beta-Amyloid (A-Beta) entsteht. A-Beta ist nach heutigen Vorstellungen als Hauptbestandteil der senilen Plaques kausal in die Pathogenese der Alzheimer´schen Erkrankung involviert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war zu überprüfen, ob Hyperforin, ein wichtiger Inhaltsstoff des Johanniskrauts, in der Lage ist, in die APP-Prozessierung einzugreifen und eine Verschiebung der proteolytischen Spaltung von APP, die das Entstehen der senilen Plaques möglicherweise verringert, auszulösen, da bekannt war, dass Hyperforin den intrazellulären pH-Wert in Thrombozyten verändert. Für die Arbeit wurden untransfizierte und stabil transfizierte PC12 und HEK Zellen, zwei in der Alzheimer-Forschung geläufige Zell-Modelle, verwendet. Die Zellen waren entweder mit menschlichem wild-typ APP (APPwt) oder mit APP, das die schwedische Mutation beinhaltet (APPsw), eine Alzheimer-relevante Mutation, die einen frühzeitigen Erkrankungsbeginn zur Folge hat, stabil transfiziert. Um die Relevanz möglicher Hyperforin-Effekte abschätzen zu können, wurden PMA (Phorbolester, bekannter Alpha-Sekretase-Aktivator), Bafilomycin A1 (V-ATPase-Hemmer) und FCCP (Protonophor), für die eine Beeinflussung der APP-Prozessierung bekannt ist, zum Vergleich mit untersucht. Als erstes wurden an den verwendeten Zell-Linien die intrazellulären pH-Wert-Veränderungen durch Hyperforin, FCCP und Bafilomycin A1 gemessen und miteinander verglichen, wobei Hyperforin und FCCP den intrazellulären pH-Wert in gleichen Konzentrationsbereichen ähnlich schnell und stark reduzierten, während Bafilomycin A1 den intrazellulären pH-Wert kaum beeinflusste. Es konnte kein Einfluss von Transfektion und Mutation auf die Empfindlichkeit der intrazellulären pH-Wert-Verschiebung gefunden werden. Mögliche zelltoxische Eigenschaften von Hyperforin, PMA, FCCP und Bafilomycin A1 wurden überprüft, wobei auch ein Einfluss von Hyperforin und FCCP auf die Mitochondrien getestet wurde. Die Quantifizierung möglicher zytotoxischer Eigenschaften der Substanzen mittels MTT- und LDH-Tests ergaben, dass alle Ergebnisse bis zu einer Inkubationsdauer von 2 Stunden nicht auf eine Bioaktivitätsstörungen der Zellen zurückzuführen sind. Auch wenn Hyperforin, ähnlich wie FCCP, die Mitochondrien depolarisierte. Als nächstes wurde der mögliche Einfluss von Hyperforin auf die proteolytische Prozessierung von APP untersucht. Von Interesse war, ob ein Zusammenhang zwischen einer intrazellulären pH-Wert-Beeinflussung und einer veränderten proteolytischen Spaltung von APP durch Hyperforin besteht. Hyperforin zeigte einen deutlichen Einfluss auf die APP-Prozessierung, es erhöhte konzentrationsabhängig die Alpha-Sekretase-Spaltung, die Spaltung, die die Bildung des Alzheimer-relevanten A-Beta-Peptides verhindert. Da kein sAPP-Beta-spezifischer AK zur Verfügung stand, kann zu diesem Zeitpunkt nicht ausgeschlossen werden, dass auch die Beta-Sekretase-Spaltung durch Hyperforin beeinflusst wurde. Da die in dieser Arbeit verwendeten PC12 Zell-Linien nicht die abnorme hohe APP-Überproduktion wie andere Zell-Linien zeigen, war die Menge des in der kurzen Behandlungsdauer von 2-4 Stunden gebildeten A-Beta zu gering, um im ELISA erfasst zu werden. Die Tatsache, dass A-Beta unter den gegebenen Versuchsbedingungen durch ELISA nicht nachweisbar war, lässt eine stark erhöhte A-Beta-Produktion durch Hyperforin jedoch unwahrscheinlich erscheinen. Dadurch ist zum jetzigen Zeitpunkt auch der Einfluss der sw-Mutation auf die Hyperforin-Effekte noch unklar. Die Tatsache, dass Alpha- und Beta-Sekretasen in verschiedenen Kompartimenten aktiv sind und über verschiedenen Mechanismen aktiviert werden (vgl. Abschnitte 1.2.1.1 und 1.2.1.2), dass die Alpha-Sekretase-Spaltung bereits 90% der APP-Spaltung ausmacht und diese durch Hyperforin noch gesteigert wurde, wobei gleichzeitig intrazelluläres APP erniedrigt wurde (so dass die vermehrte Spaltung nicht auf ein erhöhtes Substratangebot zurückgeführt werden kann), lässt aber eine gleichzeitige Aktivierung von Alpha- und Beta-Sekretase unwahrscheinlich erscheinen. Vergleichende Untersuchungen mit FCCP und Bafilomycin A1 ergaben, dass für die Verschiebung der proteolytischen Prozessierung von APP weder die intrazelluläre pH-Wert-Erniedrigung, noch ein möglicher Einfluss auf Endosomen und Lysosomen, als Hauptursache in Frage kommt. Ein Vergleich mit PMA, das die Alpha-Sekretase durch eine direkte PKC-Aktivierung stimuliert, zeigte, dass Hyperforin auch keinen Phorbolester-ähnlichen Wirkungsmechanismus haben kann. Allerdings sieht es nach einigen Vorversuchen (SK&F, BAPTA/AM, Staurosporin, PKC-down Regulation Versuchen) so aus, als ob durch Hyperforin erhöhtes intrazelluläres Kalzium und/oder aktivierte PKC-Isoenzyme bei der Spaltung des intrazellulären APP und damit bei der Erhöhung der löslichen Spaltprodukte involviert ist/sind. Kalzium kann auch unabhängig von PKC die Alpha-Sekretase aktivieren (Buxbaum et al., 1994). Es aktiviert ERKs (Luo et al., 1997; Rosen et al., 1994; Rusanesco et al., 1995; Zhu et al., 2002), wobei aktivierte ERKs in der Lage sind, die Alpha-Sekretase zu stimulieren (Mills et al., 1997). Auch FCCP erhöht intrazelluläres Kalzium (Friel and Tsien, 1994; Luo et al., 1997; Park et al., 2002; Jensen and Rehder, 1991), wodurch es in PC12 Zellen zu einer Aktivierung von ERK1 und 2 kommen kann (Luo et al., 1997). Es muss aber bedacht werden, dass Hyperforin und FCCP unterschiedlich starke Effekte auf intrazelluläres APP und sAPP zeigten, so dass auch Mechanismen in Betracht gezogen werden müssen, bei denen Hyperforin anders als FCCP agiert. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Beeinflussung der Membranfluidität durch Hyperforin (Eckert and Müller, 2001) einen Einfluss auf die APP-Spaltung hat, da Veränderungen des Membrancholesterol-Gehaltes den Gehalt an sAPP und ABeta ändern, z.B. erniedrigt ein erhöhter Membran-Cholesterol-Gehalt sAPPAlpha (Bodovitz und Klein 1996, Racchi et al., 1998) und erhöht ABeta (Gouras et al., 2000). Eine Behandlung von Zellen, die zu einer Verringerung von intrazellulärem Cholesterol führt (Statine bzw. Cyclodextrin), reduziert die Spaltung von APP zu ABeta und erhöht sAPPAlpha (Fassbender et al., 2001; Kojro et al., 2001; Refolo et al., 2001).
Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Funktion und der Regulation des neuronalen GABA-Transporter 1 der Maus (mGAT1). Der mGAT1 ist ein elektrogener Neurotransmittertransporter, der in Gegenwart von GABA in Abhängigkeit des Membranpotentials und des Na+-Konzentrationsgradienten über der Membran einen sogenannten mGAT1-vermittelten Strom generiert. Der mGAT1 wurde in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert und mit elektro-physiologischen Methoden (Two-Electrode Voltage Clamp), mit radioaktiven Auf-nahmemessungen (3H-GABA, 22Na+, 36Cl-) und mit biochemischen Methoden untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte unter Verwendung des Tiagabin –Analogons SKF-89976-A gezeigt werden, daß der mGAT1-vermittelte Strom aus zwei Komponenten besteht, einem Transportstrom und einem Transporter-assoziierten Strom. Dabei wurde die hier gewonnene neue Erkenntnis genutzt, daß SKF-89976-A die Transporter-assoziierte Stromkomponente selektiv blockieren kann. Als Ursache des Transportstroms konnte die in der Literatur angenommene Transportstöchiometrie von 1GABA : 2Na+ : 1Cl- bewiesen werden. Als Ursache des Transporter-assoziierten Stroms konnte eine vom GABA-Transport entkoppelte Na+-spezifische Leitfähigkeit in Gegenwart von GABA identifiziert werden, die drei bis fünfmal größer ist als die Transport-Leitfähigkeit selbst. Transportstrom und Transporter-assoziierter Strom scheinen von zwei unterschiedlichen Konformeren des mGAT1 vermittelt zu werden, die nicht miteinander im Gleichgewicht stehen. In Abwesenheit von GABA ist in der Stromantwort auf einen Spannungspuls ein mit der Zeit abfallender transienter Strom zu beobachten. Hinsichtlich dieses langsamen transienten Stroms des mGAT1 konnte ein Bindungsmodell für Na+ und Cl- in Abwesenheit von GABA entwickelt werden. Nach diesem Modell kommt es vor der Bindung von GABA am Transporter zu einer sequentiellen Bindung zweier Na+-Ionen und eines Cl--Ion. Regulation des mGAT1 konnte durch Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung des mGAT1 mittels PKC und PP2B gezeigt werden. Dabei scheint der mGAT1-vermittelte Strom durch Serin- / Threonin-Phosphorylierung verstärkt zu werden. Durch Koinjektion von mGAT1-cRNA und humaner Hirn-mRNA konnte der mGAT1 zusammen mit unbekannten zytosolischen bzw. Membranproteinen des humanen Hirns koexprimiert werden. Dabei wird die Transportrate des mGAT1 signifikant gesteigert; der mGAT1-vermittelte Strom wird nicht signifikant beeinflußt. Es scheint, daß eines oder mehrere der koexprimierten humanen Proteine die Bildung des Transport-Modus bzw. die Bildung des Kanal-Modus mit beeinflussen.
FGF-2, a potent multifunctional and neurotrophic growth factor, is widely expressed in the brain and upregulated in cerebral ischemia. Previous studies have shown that intraventricularly or systemically administered FGF-2 reduces the size of cerebral infarcts. Whether endogenous FGF-2 is beneficial for the outcome of cerebral ischemia has not been investigated. We have used mice with a null mutation of the fgf2 gene to explore the relevance of endogenous FGF-2 in brain ischemia. Focal cerebral ischemia was produced by occlusion of the middle cerebral artery (MCAO). We found a 75% increase in infarct volume in fgf2 knock-out mice versus wild type littermates (P < 0.05). This difference in the extent of ischemic damage was observed after 24 h, and correlated with decreased viability in fgf2 mutant mice following MCA occlusion. Increased infarct volume in fgf2 null mice was associated with a loss of induction in hippocampal BDNF and trkB mRNA expression. These findings indicate that signaling through trkB may contribute to ameliorating brain damage following ischemia and that bdnf and trkB may be target genes of FGF-2. Together, our data provide the first evidence that endogenous FGF-2 is important in coping with ischemic brain damage suggesting fgf2 as one crucial target gene for new therapeutic strategies in brain ischemia.
Entwicklung einer In-vitro-Methode zur Detektion von residualer Toxizität in Tetanusimpfstoffen
(2004)
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Optimierung eines sensitiven, schnellen, immunologischen in-vitro-Nachweises für die Endoprotease Tetanustoxin. Der klassische ELlSA, bei dem an eine Festphase immobilisiertes Antigen detektiert wird, wurde hier um einen endoproteolytischen Schritt erweitert, in dem das gebundene Substrat des Tetanustoxins an der Festphase in das nachzuweisende Antigen gespalten wird. Somit wird die Enzymaktivität des Tetanustoxins indirekt bestimmt. Bei dem Substrat handelt es sich um rekombinantes Synaptobrevin-2 (rSyb2), das von Tetanustoxin spezifisch und selektiv an einer Peptidbindung hydrolysiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit molekularbiologischen Methoden drei unterschiedliche rSyb2 Fragmente in Escherichia coli hergestellt, die einen unterschiedlichen Aufbau des TeNT-Endopeptidase-Assays ermöglichen. Zur Maximierung der Proteinausbeute wurde die Expression in drei verschiedenen E. co/i-Stämmen miteinander verglichen. Der Stamm mit der höchsten Expressionsleistung wurde in 500ml-Schüttelkulturen sowie im 101-Maßstab fermentiert. Es wurde ein Protokoll zur Aufreinigung des rekombinanten Synaptobrevin-2 erstellt und optimiert. Zur immunologischen Detektion des durch Tetanustoxin gespaltenen rSyb2s standen zwei in Eigenarbeit hergestellte Antikörper zur Verfügung. Im Gegensatz zu den kommerziell erhältlichen Antikörpern gegen Synaptobrevin-2, deren Epitope inmitten der rSyb2-Aminosäuresequenz liegen, detektieren die beiden selbst hergestellten Antikörper die Aminosäuresequenzen, die die N- bzw. die C-terminale Seite der Tetanus-Spaltstelle in Synaptobrevin-2 darstellen. Beide Antikörper vermögen zwischen ungespaltenem und gespaltenem rSyb2 zu differenzieren. Besonders der gegen das N-terminale Spaltfragment gerichtete Antikörper ist ein hochspezifisches Werkzeug, das nur die von Tetanustoxin generierte, terminale Aminosäuresequenz an der SpaltsteIle detektiert. Im ELISA wurde zunächst untersucht, in welcher Reihenfolge Spaltung und Immobilisierung an die Festphase durchgeführt werden sollten. Die Immobilisierung des rSyb2s mit anschließender Spaltung durch Tetanustoxin erwies sich als die sensitivere Methode und wurde deshalb weiter optimiert. Dazu gehörte die Wahl der Festphase, die Untersuchung unterschiedlicher Beschichtungsmethoden, der Vergleich verschiedener Umgebungsbedingungen in der enzymatischen Reaktion sowie die Titration der eingesetzten Antikörper und die Auswahl der geeignetsten Pufferzusammensetzungen und Inkubationszeiträume. Zur Optimierung der Beschichtung wurden die drei rSyb2-Fragmente an unterschiedliche Polystyrenoberflächen gebunden. Die gezielte Ausrichtung der Moleküle, mit der nach der Inkubation mit Tetanustoxin nur ein bestimmtes Spaltfragment an der Platte gebunden bleibt und mit dem entsprechenden Antikörper detektiert werden kann, bringt dabei keinen Vorteil gegenüber der ungerichteten Bindung. Insgesamt differiert die Bindung an die Festphase zwischen Plattentypen und rSyb2-Fragmenten und hat einen großen Einfluss auf die Aktivität des Tetanustoxins und auf die Bindung des jeweiligen Antikörpers. Diese binden in Abhängigkeit vom Plattentyp teils stark an ungespaltenes rSyb2; offensichtlich ist das Epitop des jeweils eingesetzten Antikörpers in diesen Fällen also auch vor der Spaltung schon exponiert. Insgesamt zeigen die Versuche, dass die ungerichtete Bindung des Fragments rSyb2(N;1-97) mit der Detektion des N-terminalen Spaltfragments die sensitivste Methode zur Detektion von Tetanustoxin ist. Durch die Optimierung der weiteren InkubationsschriUe konnte die Nachweisgrenze des ELISA auf 0,54ng/ml Tetanustoxin gesenkt werden. Sie liegt damit im Bereich von Literaturdaten für eine Meerschweinchen-LD5o und könnte bereits unter der Nachweisgrenze des Tierversuchs liegen. Der Mangel an Daten zur Toxizität des in der Testentwicklung verwendeten, hochaufgereinigten Toxins lässt keine genauere Einschätzung zu. Der Vergleich mit der Empfindlichkeit von Tieren ist aber relevant, weil der ELiSA die Detektion des Toxins im Tierversuch ersetzen soll und eine vergleichbare Sensitivität aufweisen muss. Eine bessere Einschätzung kann mit einem krudem Tetanustoxin vorgenommen werden, für das die Meerschweinchen-LD5o vom Hersteller bestimmt wurde. Mit diesem Toxin wurde eine Nachweisgrenze des ELISA von 0,049 Meerschweinchen-LD5o ermittelt. Der ELISA scheint somit eine vielversprechende Methode zur Detektion von Tetanustoxin zu sein und könnte sich deshalb zum Ersatz des Tierversuchs eignen.
Ziel: Ziel der Untersuchungen war es, selektive und potente P2-Rezeptor-Antagonisten, die sich von Suramin und PPADS ableiten, zu ermitteln sowie die Charakterisierung UTP-sensitiver Rezeptoren in epididymalen Segmenten des Samenleiters der Ratte vorzunehmen. Methoden: Am Samenleiter der Ratte (P2X1-Rezeptoren) und dem Ileum des Meerschweinchens (P2Y1-Rezeptoren) wurden Kontraktions-Inhibitions-Studien durchgeführt. Zur Untersuchung des UTP-sensitiven Rezeptors im Samenleiter der Ratte wurden Kontraktions-, Kontraktions-Inhibitions-Studien und histochemische- bzw. immunzytochemische Studien herangezogen. Ergebnisse: Durch Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Analoga des NF023, Suramin, NF279, PPADS und SB9 konnten symmetrische Suramin-Analoga, wie NF816 (pA2=6,45) und unsymmterische NF279-Analoga, wie NF786 (pA2=6,76), erhalten werden, die potent, selektiv und kompetitiv ADPßS-induzierte Kontraktionen des Meerschweinchen-Ileums antagonisierten. Auch die heterodimer-bivalente Verbindung SB9, erwies sich an nativen P2Y1 -Rezeptoren als potenter, selektiver und kompetitiver Antagonist (P2Y1:pA2=6,91 vs. P2X1: pA2=5,98). Darüber hinaus ist SB9 P2-Rezeptor-spezifisch und schwach wirksam an Ekto-Nukleotidasen von Oozyten des Südafrikanischen Krallenfrosches (IC50 = 40 MikroM). Zur Charakterisierung des UTP-sensitiven Rezeptors des Samenleiters der Ratte wurde Evans Blau verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass Evans Blau die Spaltung von exogenem ATP zu 75 % hemmt. Insbesondere die glatte Muskulatur ist ATPase-aktiv. An epididymalen Segmenten ist UTP (100 MikroM Evans Blau) ein voller Agonist (EC50 = 36 MikroM). Die Kontraktion beruht auf der Aktivierung postsynaptischer Strukturen und wird nicht durch UDP oder Uridin beeinflusst. Mit Agonisten konnte in Anwesenheit von 100 MikroM Evans Blau folgende Reihe der Wirkstärke erhalten werden: natürliche Agonisten, Ap4A > ATP = ADP = UTP > UDP; synthetische Agonisten, 2MeSATP > ATPgammaS > ADPßS. In Anwesenheit von 100 MikroM Evans Blau wurden UTP-induzierte Kontraktionen durch PPADS (IC50 = 20 MikroM) und Reaktiv Blau 2 (IC50 = 43 MikroM) nicht aber durch Suramin und MRS 2179 gehemmt. P2Y2-Rezeptor-spezifische Antikörper ergaben die Expression von P2Y2-Rezeptoren auf der glatten Muskulatur des Samenleiter der Ratte. Schlußfolgerungen: Analoga als auch pharmakophore Gruppen des Suramins und PPADS eignen sich als Ausgangs-Verbindungen bzw. -Strukturen zur Synthese von potenten und Subtyp-selektiven P2-Rezeptor-Antagonisten. Die Wirkungen von UTP sind durch P2u-Rezeptoren vermittelt. Die Ergebnisse deuten auf die Beteiligung von P2Y2- bzw. P2Y4-Rezeptoren in epididymalen Segmenten des Sameneiters der Ratte hin.
Die Niere stellt im Organismus einen der Hauptangriffspunkte für Toxine dar. Dies liegt zum einen in der Tatsache begründet, dass zahlreiche Substanzen renal eliminiert werden. Eine weitere Funktion der Niere ist die Regulation des Flüssigkeitsund Elektrolythaushaltes durch Rückresorption von Wasser, Ionen, Aminosäuren und Glucose. Dies führt zu einer Aufkonzentrierung des Primärharns und folglich werden für die zu eliminierenden Toxine im Harn normalerweise höhere Konzentrationen erreicht, als beispielsweise im Blutplasma. Ein Portfolio von verschiedenen metabolisierenden Enzymen, die hauptsächlich in der Niere auftreten, sorgt weiterhin dafür, dass einige der gefilterten Substanzen erst in der Niere eine Bioaktivierung zum Toxin erfahren. Es ist somit von grosser Bedeutung, geeignete Testsysteme zu entwickeln, mit denen die Nephrotoxizität von Arzneistoffen, Chemikalien und anderen Substanzen untersucht werden kann. Die globale Analyse der Genexpression mit Hilfe von Mikroarrays bietet die Möglichkeit, die Veränderungen in der Expression von mehreren Tausend Genen gleichzeitig in der Niere oder in renalen Zellkulturen nach der Einwirkung eines potenziellen Nephrotoxins zu untersuchen. Eines der Ziele dieser Arbeit bestand darin, diese vielversprechende Methode für den Einsatz bei der Untersuchung von Nephrotoxizität zu evaluieren. In diesem Zusammenhang sollte geklärt werden, inwiefern sich aus der Literatur bekannte Tatsachen über den Toxizitätsmechanismus bestimmter Nephrotoxine bestätigen lassen und ob Hinweise auf bisher unbekannte Aspekte bezüglich der Vermittlung der Nephrotoxizität der Nephrotoxine gewonnen werden können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war es, ein Zellkulturmodell zu etablieren und zu charakterisieren, das es ermöglicht, Genexpressionsanalysen zur Untersuchung der Nephrotoxizität in vitro durchzuführen und das ausserdem mit in vivo vergleichbare Daten liefert. In verschiedenen Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass eine Kultur primärer Zellen etabliert werden konnte, die die funktionellen Eigenschaften von proximalen Tubuluszellen zeigt und keine Verunreinigung mit anderen Zelltypen des Nierencortex aufweist. Weiterhin wurden die optimalen Bedingungen für die Durchführung von Expressionsanalysen mit dieser Zellkultur definiert. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden das Expressionsprofil von Ochratoxin A mit Hilfe von cDNA-Mikroarrays, sowie die Profile von Quecksilber-II-chlorid, Paraquat und Puromycin mit Hilfe von Oligonukleotid-Mikroarrays in vivo und in vitro untersucht und bewertet. Ein Vergleich der beiden verfügbaren Plattformen (cDNA-Mikroarrays und Oligonukleotid-Mikroarrays) mit der Echt-Zeit-PCR als unabhängiger Methode lieferte aufschlussreiche Erkenntnisse über ihre Vor- und Nachteile. Die Analyse der Genexpressionsveränderungen nach der Einwirkung von OTA, HgCl2, Paraquat und Puromycin zeigte, dass sich mit Hilfe des Genexpressionsprofils zahlreiche Erkenntnisse über den Toxizitätsmechanismus der Substanzen gewinnen lassen, die sowohl durch die histopathologischen Befunde als auch mit Hilfe der einschlägigen Literatur bestätigt werden konnten. Zum Teil konnten sogar bisher unbekannte Aspekte der nephrotoxischen Wirkungen der untersuchten Modell- Toxine aufgedeckt werden, wie zum Beispiel die verstärkte Induktion von Golgi- Transport-assoziierten Genen im Nierencortex der Ratte nach Behandlung mit Paraquat. Die Analyse des Genexpressionsprofils kann somit vielversprechende Hinweise für das umfassende Verständnis des Toxizitätsmechanismus von Nephrotoxinen liefern. Der Vergleich der Expressionsmuster von HgCl2, Paraquat und Puromycin machte weiterhin deutlich, dass es einerseits transkriptionelle Änderungen gibt, die für das jeweilige Toxin spezifisch waren, andererseits aber auch Expressionsmuster aufgezeigt werden konnten, die allen untersuchten Nephrotoxinen gemeinsam waren. Durch die Identifizierung solcher gemeinsamen Genexpressionsprofile aus einer Datenbank mit zahlreichen bekannten Nephrotoxinen, könnte es in Zukunft sogar möglich sein, die potenzielle Nephrotoxizität unbekannter Arzneistoffe oder Chemikalien mit Hilfe von Mikroarrays vorherzusagen oder beispielsweise aus mehreren Kandidaten für einen neuen Arzneistoff, denjenigen mit dem geringsten nephrotoxischen Potenzial bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung herauszufiltern.
Die Depression gehört zu den häufigsten Volkskrankheiten. Derzeit sind rund vier Millionen Deutsche an einer behandlungsbedürftigen Depression erkrankt. Die Erkrankung verläuft typischerweise in Form von Episoden, die Wochen bis Monate, manchmal auch Jahre anhalten können. Wenn die Erkrankung unbehandelt bleibt, kann sie wiederkehren und einen chronischen Verlauf nehmen. Rund 75 Prozent der Betroffenen erleiden nach einer Ersterkrankung innerhalb von fünf Jahren mindestens eine neue depressive Phase. Zudem werden mit steigender Episodenzahl die episodenfreien Zwischenzeiten immer kürzer. Es gilt heute als unstrittig, dass mehr als die Hälfte aller Depressionen nicht diagnostiziert und allenfalls ein Fünftel adäquat behandelt werden. Das verursacht nicht nur enorme Kosten für die Volkswirtschaft, sondern ist für die Betroffenen auch mit erheblichem Leid und Lebensgefahr verbunden.