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Цель: Оценить влияние локализации точки разрыва в геномной ДНК гена MLL на прогноз острых лейкозов (ОЛ) у детей первого года жизни.
Методы: В исследование было включено 68 детей первого года жизни (29 мальчиков и 39 девочек с медианой возраста 4,8 мес.) с MLL-позитивными острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) (n = 46), острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) (n = 20) и ОЛ смешанной линейности (n = 2).
Результаты: 5-летняя бессобытийная выживаемость (БСВ) детей первого года жизни с ОЛЛ, включенных в исследование MLL-Baby, с точкой разрыва в интроне 11 ДНК гена MLL (n = 29) была статистически значимо ниже, чем у пациентов c локализацией точек разрыва, начиная с интрона 7 по экзон 11 (n = 17; 0,16 ± 0,07 и 0,38 ± 0,14; p = 0,039), а кумулятивная вероятность развития рецидива была значительно выше в группе с точкой разрыва в интроне 11 (0,74 ± 0,09 и 0,52 ± 0,17; p = 0,045). В то же время многофакторный анализ показал, что единственным значимым фактором, связанным с неблагоприятным прогнозом, остается сохранение минимальной остаточной болезни (МОБ) в точке наблюдения 4 протокола MLL-Baby (отношение опасности 5,994; 95%-й доверительный интервал 2,209–16,263; p < 0,001). У 22 пациентов с ОМЛ связи между прогнозом и локализацией точки разрыва в ДНК гена MLL не выявлено.
Заключение: Наличие точки разрыва в интроне 11 гена MLL у детей первого года жизни с ОЛЛ, получавших лечение по протоколу MLL-Baby, вело к статистически значимо более низким показателям БСВ и более высокой кумулятивной вероятности развития рецидива. Однако в многофакторной модели риска это нивелировалось сохранением МОБ в точке наблюдения 4. У детей первого года жизни с ОМЛ взаимосвязи между локализацией точки разрыва в ДНК гена MLL и прогнозом не выявлено.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des HIV-Protease-Inhibitors Saquinavir und seines Derivates Saquinavir-NO auf die ABC-Transporter vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Saquinavir-NO zeigte in drei verschiedenen Tumorentitäten stärkere zytotoxische Wirkung als Saquinavir. Weder die Expression der ABC-Transporter MDR1 oder BCRP1 noch der zelluläre p53-Status hatten einen Einfluss auf die Zellsensitivität. MDR1-exprimierende chemoresistente Tumorzellen wurden durch Saquinavir-NO stärker gegen ausgewählte Zytostatika resensitiviert als durch Saquinavir. An chemosensitiven MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Des Weiteren wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensiti-vität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Saquinavir-NO stärker erhöht als durch Saquinavir. Am Durchflusszytometer wurde der Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf die intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123 untersucht. In MDR1-exprimierenden Zelllinien führte Saquinavir-NO zu einer deutlich stärkeren Akkumulation von Rhodamin 123 als Saquinavir. In MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Mit Hilfe des MDR1-ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Saquinavir und Saquinavir-NO als Substrate oder als allosterische Inhibitoren für MDR1 fungieren. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass sowohl Saquinavir als auch Saquinavir-NO jeweils ein Substrat für MDR1 darstellen. Um den Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf den ABC-Transporter BCRP1 zu untersuchen, wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für BCRP1 transduziert. Die BCRP1-transduzierten Zellen wurden durch Saquinavir und Saquinavir-NO in vergleichbarem Ausmaß zu dem BCRP1-Substrat Mitoxantron sensibilisiert. Saquinavir-NO ist somit im Vergleich zu Saquinavir der deutlich potentere MDR1-Inhibitor, während beide Substanzen gleichermaßen BCRP1 beeinflussten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des MDM2-Inhibitors Nutlin-3 auf die ABC-Transporter-vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Nutlin-3 zeigte aufgrund seiner Funktion als MDM2-Inhibitor an Zellen mit Wildtyp-p53 stark zytotoxische Effekte. An Zellen mit einer p53-Mutation oder an Zellen, die p53-negativ sind, waren diese Effekte nicht zu beobachten. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte in p53-Wildtypzellen zur Induktion diverser p53-Zielgene (p21, MDM2, GADD). In Zellen mit mutiertem p53 blieb diese Induktion nach Nutlin-3-Behandlung aus. Chemoresistente MDR1-exprimierende Tumorzellen wurden durch Nutlin-3 stark gegen ausgesuchte Zytostatika resensitiviert. Des Weiteren wurde die chemosensitive, p53-mutierte (Nutlin-3-insensitive) und MDR1-negative Rhabdomyosarkomzelllinie RH30 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensitivität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Nutlin-3 stark erhöht. Am Durchflusszytomter zeigte sich in MDR1-exprimierenden Zellen durch Behandlung mit Nutlin-3 eine signifikant erhöhte intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123. In MDR1-negativen Zellen wurde dieser Effekt nicht beobachtet. Mit Hilfe des ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Nutlin-3 als Substrat oder als allosterischer Inhibitor für MDR1 fungiert. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass Nutlin-3 ein Substrat für MDR1 darstellt. Nutlin-3 ist ein Racemat und wurde in allen Versuchen als solches verwendet. Das Enantiomer Nutlin-3a hemmt die MDM2-p53-Interaktion als aktives Enantiomer ca. 150-fach stärker als Nutlin-3b. Im letzten Schritt der vorliegenden Arbeit wurde Nutlin-3 in seine Enantiomere Nutlin-3a und Nutlin-3b aufgetrennt und beide Enantiomere wurden im Hinblick auf ihre Wirkung auf MDR1 untersucht. Dabei wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Enantiomeren festgestellt. Nutlin-3a und Nutlin-3b interferieren demnach zu gleichen Teilen mit MDR1. Um den Einfluss von Nutlin-3 auf den ABC-Transporter MRP1 zu untersuchen, wurde mit zwei verschiedenen Zellmodellen gearbeitet. In beiden Zellmodellen zeigte sich, dass Nutlin-3 auch den MRP1-vermittelten Efflux der fluoreszierenden Substrate Rhodamin 123 und Calcein-AM inhibiert. Der Befund, dass Nutlin-3 mit der MDR1- und MRP1 vermittelten Chemoresistenz interferiert, ist neu und eine wichtige Information für die Bewertung der beginnenden klinischen Studien zur Untersuchung von Nutlin-3 als antitumorale Substanz.
Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder marked by progressive loss of memory and cognitive ability. The pathology of AD is characterised by the presence of amyloid plaques, intracellular neurofibrillary tangles and pronounced cell death. The aim of this thesis was to investigate pathways involved in the Aß cascade of neurodegeneration. Since novel findings indicate that already this Aß species exerts neurotoxic effects long before hyperphosphorylated tau, neurofibrillary tangles and extracellular Aß plaques appear, the investigations were accomplished with specific regard to the effects of intracellular Aß. The Swedish double mutation in the APP gene results in six- to eightfold increased Aß production of both Aß1-40 and Aß1-42 compared to human wildtype APP cells (APPwt). Data obtained from PC12 cells indicate that it is possible to specifically increase the Aß load without enhancing APP expression levels. On the basis of these findings, it seemed possible to investigate dose-dependent effects of Aß in multiple experimental designs. These assay designs were created in order to mimick different in-vivo situations that are discussed to occur in AD patients: APPsw PC12 cells exhibit low physiological concentrations of Aß within picomolar range in contrast to APPsw HEK cells, expressing Aß levels within the nanomolar range. Of note, the APPsw HEK cells showed a specific and highly significant increase in the intracellular accumulation of insoluble Aß1-42. Moreover, an intracellular accumulation of Aß and APP was found in the mitochondria of the HEK APPsw cells suggesting a direct impact on mitochondrial function on these cells. This effect might finally lead to disturbances in the energy metabolism of the cell or to increased cell death. Furthermore, baseline g- and ß-secretase activity was assessed since these enzymes represent promising therapeutic targets to slow or halt the disease process. As expected, ß-secretase activity was significantly elevated in all APPsw cell lines. This might be due to the proximity of the Swedish double mutation next to the N-terminus of the Aß sequence. Interestingly, g-secretase activity was similarly increased in PC12 APPsw cells. In addition, the toxicity of different Aß species was investigated in SY5Y and PC12 cells with regard to their effect on cellular viability mirrored by mitochondrial activity using MTT assay. Here, it turned out that not monomers, but already dimers are neurotoxic correlates. Fibrillar Aß species showed the highest toxicity. In the next step, SY5Y cells forming endogenous, dimeric APP and Aß were investigated. In accordance with previous findings, these cells showed a decreased MTT reduction potential in comparison to APPwt and control SY5Y cells reflecting a decrease of cellular viability. The impaired energy metabolism of the cells was even more drastically mirrored by reduced baseline ATP levels. In the second part of this thesis, the expression and intracellular distribution of Bcl-2 family proteins and pro-apoptotic mitochondrial factors under baseline conditions and during oxidative stress were analyzed in the APPwt and APPsw bearing cells. The most prominent finding was the reduction of expression levels of the anti-apoptotic factor Bcl-xL in the cytosolic fractions of APPwt and APPsw PC12 cells. This might indicate that a lack of anti-apoptotic factors or their altered intracellular distribution, rather than an increase in caspase-dependent pro-apoptotic factors, could be responsible for the increased vulnerability of APPwt- and APPsw-transfected PC12 cells against oxidative stress. Since total Bcl-xL expression was unaffected in PC12 cells, in contrast to APPwt and APPsw-expressing SY5Y and HEK cells revealing significantly decreased Bcl-xL expression levels. Thus, alterations in Bcl-xL distribution seem to be an early event in the disease process. Increasing Bcl-xL expression might potentially be one promising strategy for AD modification. PC12 and HEK cells bearing APPsw or APPwt were treated with the potent g-secretase inhibitor DAPT. Of note, DAPT did not only efficiently block Aß production, but additionally led to an elevation of the MTT reduction potential, reflecting an increase in cellular viability. As another disease-modifying strategy, several efforts are undertaken to ameliorate AD-relevant symptoms by the treatment with nerve growth factor (NGF). Generally, it is known that substituted pyrimidines have modest growth-promoting effects. Here, KP544, a novel substituted pyrimidine, was characterised. This drug increased MTT reduction potential in terminally differentiated and undifferentiated PC12 cells. Furthermore, treatment with KP544 led to a reduction in Aß1-40 secretion. Thus, one may conclude that the target of KP544, GSK-3ß, represents a connecting link between the two main pathological hallmarks of AD and might thus be a very promising therapeutic target for AD.
Ziel dieser Arbeit war es, die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf Leukämiezellen von pädiatrischen Patienten mit Akuten Leukämien zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in vitro und erste in vivo Untersuchungen durchgeführt: 1. In vitro Untersuchungen Zuerst wurde eine durchflusszytometrische Methode optimiert zum Nachweis der Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf maligne Zellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien. Mit diesem durchflusszytometrischen Assay war es möglich, die Zytotoxizität auf maligne von der auf nicht maligne Zellen zu unterscheiden. Dies war unerlässlich, da in den frisch isolierten Leukämiezellen der Patienten bis zu 55% normale Lymphozyten enthalten waren. Darüber hinaus erlaubte diese Methode die simultane Bestimmung der Zell-Apoptose in jeder Probe. An Leukämie-Zelllinien wurde dieser multiparametrische Assay anschließend mit dem MTT-Assay verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Bestimmung von Zytotoxizitäten mit beiden Methoden an den Zelllinien Molt 4/8 und H9 gut korrelierte (r≥0,95). Für das Arbeiten mit Patientenmaterial wurde ausschließlich die durchflusszytometrische Methode angewendet, da in den Proben der Patienten die Differenzierung zwischen leukemischen Zellen und normalen Lymphozyten essentiell war. In den Leukämie-Zelllinien Molt4/8, H9 und K562 zeigte sich, dass Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität zeigte als Busulfan. In die Untersuchungen frischer Leukämiezellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien konnten 24 Proben unterschiedlicher Leukämien (cALL, reife B-ALL, reife TALL, AML) und unterschiedlicher Erkrankungszeitpunkte (bei Diagnose oder bei Rezidiv) eingeschlossen werden. In diesen Proben zeigte Treosulfan eine deutlich bessere Wirkung als Busulfan. Es wurde trotz des kleinen Patientenkollektivs deutlich, dass die T-ALL gegenüber der cALL sensitiver auf Treosulfan reagiert. Außerdem war die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan gegenüber der T-ALL signifikant höher als gegenüber c-ALL (Treosulfan: p=0,02, Busulfan: p=0,03). Die IC50-Werte stiegen vom Zeitpunkt der Diagnose (Median: Treosulfan: 11,45 μM, Busulfan: 96,45 μM) über die Progression (Median: Treosulfan: 45,95 μM, Busulfan: 253,75 μM) bis zum Rezidiv (Median: Treosulfan: 153,15 μM, Busulfan: 223,3 μM) hin an, und zwar um das 8-fache bei Treosulfan und das 2,5-fache bei Busulfan. Der Unterschied der Zytotoxizität von Treosulfan auf Leukämieproben zum Zeitpunkt der Diagnose gegenüber dem Rezidiv war statistisch signifikant (p=0,02). Für Busulfan ergab sich für diese Untersuchungszeitpunkte keinen signifikanten Unterschied (p=0,13). Vergleichend zu den Ergebnissen an frisch isolierten Leukämiezellen wurde die Wirkung von Treosulfan und Busulfan auf normale Lymphozytensubpopulationen und Stammzellen untersucht. Auch hier zeigte Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität im Vergleich zu Busulfan. Insgesamt reagierten normale Lymphozyten sensitiver auf die Alkylanzien im Vergleich zu den Leukämiezellen (Mediane IC50-Werte für Treosulfan und Busulfan auf Lymphozyten: 12,3 μM und 89,9 μM, auf Leukämieproben: 30,6 μM und 133 μM mit p=0,03 und p=0,02). In einem weiteren Experiment sollte die Interaktion von Treosulfan und Busulfan mit Fludarabin untersucht werden. Fludarabin ist ein Purin-Analogon, das in der Pädiatrie in Kombination mit Alkylanzien zur Chemo-Konditionierung eingesetzt wird. Bei der Inkubation von Fludarabin mit Treosulfan-Konzentration größer 1 μM war ein deutlicher Synergismus zu verzeichnen. Die Kombination von Fludarabin mit Busulfan ergab Antagonismus. 2. In vivo Untersuchungen Es wurde die zelluläre Immunrekonstitution bei pädiatrischen Patienten mit AML (n=9) nach allogener Knochenmarktransplantation überwacht. Ein Patient wurde mit Treosulfan konditioniert (n=1), die anderen Patienten (n=8) erhielten Busulfan zur Konditionierung. Die Rekonstitution der Leukozyten, B-Zellen, NK-Zellen und T-Helferzellen verlief in beiden Gruppen ähnlich. Ein signifikanter Unnterschied konnte für die Rekonstitution der CD3+CD8+ zytotoxischen T-Zellen gezeigt werden, die bei dem Patienten, der mit Treosulfan konditioniert wurde, signifikant niedriger war im Vergleich zur Busulfangruppe. Da bei dem Patienten, der Treosulfan erhielt, die CRP-Werte über einen längeren Zeitraum erhöht waren und Infektionen die Rekonstitution von zytotoxischen T-Zellen maßgeblich beeinflussen, bietet dies eine mögliche Erklärung für diesen Unterschied. Aussagen können jedoch nur mit einem größeren Patientenkollektiv getroffen werden.
Dihydrocodein wird im wesentlichen zu Dihydrocodein-6-O-43-ß-glucuronid (DHC6G), Dihydromorphin (DHM), Dihydromorpbin-3-O-ß-D-glucuronid (DHM3G), Dihydromorphin-6-O-ß-D-glucuronid (DHM6G) und Nordihydrocodein (NDHC) biotransformiert. In Analogie zu Codein wird vermutet, dass die Metaboliten DHM und DHM6G pharmkologisch deutlich aktiver als die Muttersubstanz sind und somit zur Wirkung von DHC wesentlich beitragen können, auch wenn sie nur in geringen Mengen gebildet werden. Da die O-Demethylierung von Dihydrocodein zu Dihydromorphin durch das polymorphe Cytochrom P450-Enzym CYP2D6 katalysiert wird, sind in EM (schnelle Metabolisierer) und PM (langsame Metabolisierer, weisen kein funktionelles CYP2D6-Enzym auf) unterschiedliche Metabolitenprofile zu beobachten. In etwa 5-10% der Kaukasier, die PM für CYP2D6 sind, könnte sich somit ein Therapiemisserfolg nach Gabe von therapeutisch empfohlenen Standarddosen an DHC einstellen. Es war daher Ziel der vorliegenden Arbeit, die Bedeutung der Biotransformation für die Wirkung von Dihydrocodein beim Menschen zu untersuchen. Im Rahmen dieser Untersuchung wurden Affinitätsprofile an Hirnmembranpräparationen und Affinitäts- und Aktivitätsprofile an humanen Neuroblastomzellen für DHC und seine Metaboliten erstellt. Des weiteren wurden pharmakokinetische und pharmakodynamische Parameter (und deren Zusammenhang) von Dihydrocodein und seinen Metaboliten beim gesunden Menschen unter Berücksichtigung des CYP2D6-Phänotyps mit Hilfe einer Pilot-Probandenstudie bestimmt. Zuletzt wurden die Ergebnisse der Affinitäts- und Aktivitätsversuche mit den Ergebnissen der Probandenstudie unter Berücksichtigung der verfügbaren Literaturdaten in Zusammenhang gebracht. Di in vitro-Untersuchungen zeigten, dass alls Prüfsubstanzen mit Ausnahme des unwirksamen DHM3G vorwiegend u-selektive Agonisten waren und dass das prinzipielle Verhältnis der Affinitäten bzw. Aktivitäten der einzelnen aktiven Prüfsubstanzen zueinander in allen Untersuchungen annähernd gleich war. Auf Grundlage dieser Daten konnte folgender Grundsatz formuliert werden; Die Affinitäten/Aktivitäten von DHM und DHM6G waren etwa um den Faktor 100 größer als die von DHC, während die anderen Metaboliten (mit Ausnahme des unwirksamen DHM3G) vergleichbare Affinitäten/Aktivitäten besaßen. Die im Rahmen der Probandenstudie ermittelten pharmakokinetischen Werte bestätigten verfügbare Literaturdaten, insbesondere dass CYP2D6 wesentlich für die Bildung von DHM war. So konnten weder DHM, DHM3G noch DHM6G in Plasma und Urin von PM detektiert werden. Die pharmakodynamischep Untersuchungen mittels Pupillometrie zeigten einen signifikanten Unterschied im ursprünglichen Pupillendurchmesser an den Zeitpunkten 1 bis 6 Stunden zwischen Placebo einerseits und EM bzw. PM andererseits. Damit konnte zunächst eine eigene in vivo-Wirkung von DHC beim Menschen nachgewiesen werden. Jedoch ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen EM und PM. Im zweiten pharmakodynamischen Modell (Schmerzmodell) konnten bezüglich der Parameter R-III-Reflexschwelle und VAS-EC30 keine Unterschiede sowohl zwischen EM und PM als auch zwischen Placebo und EM bzw. PM festgestellt werden, so dass 60 mg DHC keine analgetische Wirkung hatte oder das Modell für die Ermittlung der analgetischen Potenz von 60 mg DHC ungeeignet war. Einschränkend muss jedoch hier erwähnt werden, dass die Studie aufgrund der kleinen Fallzahl nur Pilotcharakter aufwies. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit in Zusammenhang mit den verfügbaren Literaturdaten lassen die Schlussfolgerung zu, dass die pharmakologisch wesentlich aktiveren Metaboliten DHM und DHM6G nicht oder nur geringfügig zur Wirkung von DHC nach oraler Einzelgabe von 60 mg DHC beitragen. Gründe hierfür könnten die geringe Bildung von DHM und seinen Metaboliten (ca. 9%) und/oder durch Verteilung und Ausscheidung bedingte niedrige Konzentrationen am Rezeptor in vivo sein. Somit scheint die Biotransformation keine Bedeutung für die Wirkung von DHC zu haben. Entsprechend sind keine Unterschiede in der Therapie von EM und PM mit niedrigen therapierelevanten DHC-Dosen zu erwarten.
Schwerlösliche Arzneistoffe besitzen häufig unbeliebte biopharmazeutische Eigenschaften und ihre erfolgreiche Formulierung zur oralen Verabreichung stellt eine der häufigsten und größten Herausforderungen an die pharmazeutische Technologie dar. Unter zahlreichen Verfahren zur Überwindung von absehbaren Bioverfügbarkeitsproblemen kommt den physikalischen Methoden nach wie vor eine zentrale Bedeutung zu. In der vorliegenden Arbeit wurde erforscht, wie die Bioverfügbarkeit schwerlöslicher Verbindungen durch Anwendung physikalischer Verfahren und in fester Formulierung erhöht und ihre Auflösungsgeschwindigkeit als entscheidender Schritt hierzu optimiert werden kann. Als schwerlösliche Substanzen wurden die Arzneistoffe EMD 57033 und Albendazol, die eine vergleichweise niedrige Lipophilie aufwiesen, sowie Danazol, Felodipin und Fenofibrat (hohe Lipophilie) ausgewählt. Zunächst wurde untersucht, inwieweit eine klassische Wirkstoffmikronisierung dem Problem der schlechten Wasserlöslichkeit und der unzureichenden Auflösungsgeschwindigkeit zu begegnen vermag. In klassischer Art und Weise wurde gemäß der Noyes-Whitney-Beziehung durch Partikelgrößenreduktion die Auflösungsrate gesteigert. Bei großem Dosislöslichkeitsvolumen (>1000 ml) war eine Verbesserung nur bis zu einem gewissen Ausmaß möglich. Es wurde auch festgestellt, dass mit alleiniger Wirkstoffmikronisierung selbst bis in den unteren Mikrometerbereich und sogar bei Vorliegen eines kleinen Dosislöslichkeitsvolumens (<100 ml) eine optimale Auflösungsgeschwindigkeit nicht garantiert und oft nicht erzielt werden kann. Der Ansatz der Wirkstoffmikronisierung kann jedoch grundsätzlich empfohlen werden, da sich unabhängig von Dosis und Löslichkeit signifikante Verbesserungen in der Auflösungskinetik ergeben können. Luftstrahlmahlung ist eine zahlreichen anderen Verfahren überlegene Vermahlungstechnik. Sie erlaubt bei entsprechenden Einstellungen die trockene Herstellung ultrafeiner Partikel (1–3 Mikrometer) in kontinuierlichem oder Batch-Betrieb bei gut steuerbarem Prozess, der das Mahlgut praktisch keiner Temperaturbelastung unterwirft. Staubentwicklung und Abrieb müssen jedoch beachtet werden. Freisetzungen wurden in biorelevantem Medium (z.B. FaSSIF), das bestmöglich die gastrointestinalen Gegebenheiten simuliert, sowie zusätzlich in einem Mediumhöheren Tensidgehaltes durchgeführt, das zur Berücksichtigung einer ungehinderten Absorption der BCS-Klasse II-Substanzen in vivo-Sink-Bedingungen darstellte. Diese Vorgehensweise ist grundsätzlich zu empfehlen. Für EMD 57033 wurde zudem nachgewiesen, dass eine biorelevante Freisetzungsprüfung auch in einfachen SLSLösungen möglich ist. Das Dosislöslichkeitsvolumen nimmt grundsätzlich bedeutenden Einfluss auf das Freisetzungsverhalten. Die trockene Covermahlung ist ein äußerst erfolgreicher prozesstechnischer Schritt zur Formulierungsverbesserung. Sie wird durch Vermahlung eines Wirkstoffes mit einem oder mehreren Hilfsstoffen dargestellt. Durch Covermahlung per Gasstrahl zubereitete Formulierungen mit 10% Wirkstoffanteil erzielten für alle untersuchten Arzneistoffe eine optimale Auflösungsgeschwindigkeit und rasches Erreichen maximaler Freisetzung. Vergleichbaren physikalischen Mischungen sowie einfacher Mikronisierung war sie deutlich überlegen. Im Gegensatz zu reiner Wirkstoffmikronisierung bildete die Freisetzung nach Covermahlung nicht ausschließlich diskrete messbare Stoffeigenschaften ab (z.B. Korngröße), sondern war vielmehr das Ergebnis eines Herstellungsprozesses. Die qualitative und quantitative Auswahl der Hilfsstoffe prägte zudem das Freisetzungsverhalten entscheidend und in stärkerem Ausmaß als der Vermahlungsgrad. Die deutliche Verbesserung der Auflösungsgeschwindigkeit eines Wirkstoffes nach Covermahlung war unabhängig von der Wahl des Freisetzungsmediums und dem vorliegenden Dosislöslichkeitsvolumen. Die Kristallinität aller Arzneistoffe, mittels Röntgendiffraktometrie und DSC untersucht, wurde durch die Covermahlung nicht verändert. Die Korngröße eines covermahlenen Produktes konnte bei Einsatz schwer vermahlbarer Hilfsstoffe unter Umständen nicht auf den Wirkstoff projiziert werden. HPMC erwies sich als schwer vermahlbar. Für eine Aktivsubstanz (EMD 57033) wurde sogar die Ausbildung übersättigter Lösungen bei Freisetzung covermahlener Formulierungen nachgewiesen, die nicht in Phasenumwandlungen des Wirkstoffes oder in reiner Partikelgrößenreduktion begründet war. Lactose als Hilfsstoff förderte eine sehr hohe initiale Auflösungsgeschwindigkeit, oftmals wurde vollständige Freisetzung bereits nach 15 Minuten erreicht. Polymere wie HPMC und PVP wirkten stabilisierend, jedoch auch verzögernd. SLS förderte ebenfalls eine optimale Auflösungsrate durch Überwindung von etwaigen Benetzbarkeitsproblemen einesein gemahlenen) Wirkstoffes, unterband jedoch die Bildung von übersättigten Konzentrationen. Covermahlungen zeichneten sich durch eine sehr gute Reproduzierbarkeit von Herstellungsprozess und Produkt (einschließlich Freisetzungscharakteristik) aus und waren als deutlich robuster gegenüber reinen Wirkstoffvermahlungen einzustufen. Covermahlene Mischungen zeigten perfekte Homogenität. Der Wirkstoffgehalt ist zwingend nach Covermahlung zu prüfen, da sich durch den Herstellungsprozess leichte Verschiebungen in der quantitativen Zusammensetzung der Formulierung ergeben können. Covermahlungen sind industriell problemlos abbildbar. Covermahlene Formulierungen von EMD 57033 mit Lactose oder Polymeren bildeten ihre Überlegenheit gegenüber reinen Wirkstoffmikronisierungen, die sich in vitro durch die Ausbildung übersättigter Lösungen darstellte, auch in vivo in Hunden ab. Zwar steigerte bereits die Vermahlung des reinen Arzneistoffes seine orale Bioverfügbarkeit (0% - 37% relative BV), der Einsatz der Covermahlung konnte diese jedoch noch weiter erhöhen und nahezu verdoppeln (55%, 68%). Multiple Level CKorrelationen covermahlener und mikronisierter Wirkstoffformulierungen belegten erfolgreiche in vitro-Simulationen. Sprühtrocknungen schwerlöslicher Stoffe aus wässriger Umgebung geht das Problem voraus, den Stoff nicht in ausreichendem Maße auflösen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde daher mit Hilfe einer Rührwerkskugelmühle Kristallsuspensionen von Wirkstoffnanopartikeln (<200 nm, Messung durch Laserbeugung und Auswertung nach der Mie-Theorie) hergestellt, die dann getrocknet wurden. Den zwischenzeitigen Vorteil der extrem hohen Oberfläche in Form von Nanoteilchen gab der Wirkstoff nach Sprühtrocknung oder Sprüheinbettung (bei Anwesenheit gelöster oder (nano-) suspendierter Hilfsstoffe) wieder ab. Die Kombination aus Nanonisierung und Sprühtrocknung stellt prozesstechnisch zwei Herstellungsschritte dar und beeinträchtigt – neben der fundamentalen Problematik der Stabilisierung von Intermediaten – die Stabilität eines Wirkstoffes durch Flüssigkeitskontakt (Nassmahlung) und thermische Belastung (Sprühtrocknung). EMD 57033 verblieb bei Sprühtrocknungen kristallin und wies verglichen mit covermahlenen Formulierungen eine schwächere Auflösungsgeschwindigkeit auf. Eine Ausnahme bildete die Sprüheinbettung mit SLS, die jedoch in derPharmakokinetikstudie den Covermahlungen unterlegen war (relative Bioverfügbarkeit 47%). Fenofibrat ging fast vollständig in den amorphen Zustand über und zeigte bei Freisetzung das typische Bild einer schnellen Rekristallisation. Fazit Im Gegensatz zu Wirkstoffmikronisierungen oder Sprühtrocknungsverfahren können trockene Covermahlungen mit ausgewählten Hilfsstoffen universell das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Auflösung schwerlöslicher Stoffe optimieren (vollständige Auflösung oder Sättigung erreicht). In Abhängigkeit von Wirk- und Hilfsstoffen werden sogar Übersättigungen erzielt, die auch in vivo in einer gesteigerten oralen Bioverfügbarkeit abgebildet werden können.
Krebszellen zeichnen sich häufig durch Expression von tumorassoziierten Antigenen aus, über die grundsätzlich eine spezifische Erkennung durch das Immunsystem möglich ist. Ansätze zur Immuntherapie von Krebserkrankungen zielen darauf ab, das Potential der körpereigenen Immunabwehr zur Tumorabwehr auszunutzen. Für die Aktivierung von tumorspezifischen T-Zellen ist die Präsentation von Peptidepitopen eines Tumorantigens zusammen mit effizienter Kostimulierung durch professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs), insbesondere dendritische Zellen (DCs), entscheidend. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zur Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen das tumorassoziierte Antigen ErbB2/HER2 neuartige zelluläre Vakzine generiert und ihre Aktivität in der Therapie bestehender ErbB2-exprimierender Tumoren analysiert. ErbB2 ist ein Mitglied der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptorfamilie und wird von vielen humanen Tumoren epithelialen Ursprungs überexprimiert. Als Rezeptortyrosinkinase ist ErbB2 direkt an der Tumorpathogenese beteiligt und stellt eine wichtige Zielstruktur für unterschiedliche immuntherapeutische Ansätze dar. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurde ein chimäres Tumorvakzin entwickelt, das über die extrazelluläre Domäne des humanen B7-Liganden CTLA-4 die spezifische Beladung von B7-exprimierenden APCs mit einem immunogenen Abschnitt des humanen ErbB2 (HER2/neu) in vivo ermöglicht. Die Immunisierung von naiven Mäusen mit DNA-Vektoren, die für sekretierte CTLA-4-ErbB2 Fusionspoteine kodieren, induzierte in den vorangegangenen Arbeiten eine protektive Immunität gegen anschließend injizierte ErbB2-exprimierende murine Nierenkarzinomzellen (Renca-lacZ/ErbB2). Allerdings war eine therapeutische Vakzinierung mit den DNA-Vektoren gegenüber bereits bestehenden Tumoren nicht mehr wirksam. Zur Erhöhung der therapeutischen Wirksamkeit des CTLA-4-ErbB2 Tumorvakzins wurde in dieser Doktorarbeit eine alternative Behandlungsstrategie entwickelt, bei der das APC-spezifische Fusionsprotein durch ein zelluläres Vakzin in vivo zur Verfügung gestellt wird. Durch stabile Transfektion der aus BALB/c Mäusen stammenden nicht tumorigenen Mammaepithelzelllinie HC11 mit einem CTLA-4-ErbB2 kodierenden DNA-Konstrukt wurde dazu das klonale zelluläre Vakzin HC11/CTLA-4-ErbB2 abgeleitet und funktionell charakterisiert. Von diesem Zellvakzin wurde anhaltend CTLA-4-ErbB2 Fusionsprotein in das umgebende Milieu sezerniert, das in der Lage war, effizient an B7-exprimierende Zellen zu binden. Die dreimalige Immunisierung mit dem zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin im wöchentlichen Intervall löste im immunkompetenten BALB/c Mausmodell eine ErbB2-spezifische Immunantwort aus. Mit Hilfe des bereits zuvor in den prophylaktischen DNA-Vakzinierungsexperimenten eingesetzten BALB/c Renca-lacZ/ErbB2 Tumortransplantationsmodells wurde zunächst untersucht, ob das zelluläre HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin einen Einfluss auf das Wachstum von etablierten ErbB2-exprimierenden Tumoren hat. Die Inokulation des Vakzins in die Nähe von subkutan wachsenden Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren führte in BALB/c Mäusen zu einer kompletten Tumorregression in der Mehrzahl der behandelten Tiere. Dabei war der antitumorale Effekt von der starken Induktion ErbB2-spezifischer Antikörper und einer mäßigen ErbB2-spezifischen Aktivität systemischer zytotoxischer T-Zellen begleitet. Durch Vakzinierung und Tumorabstoßung wurde ein Langzeitschutz induziert, der die erneute Abstoßung einer zwei Monate nach dem Primärtumor systemisch applizieren letalen Dosis von Renca-lacZ/ErbB2 Tumorzellen bewirkte. Die Vakzinierung mit HC11/CTLA-4-ErbB2 hatte keinen Einfluss auf das Wachstum ErbB2-negativer Tumorzellen. Ebenso führte die Behandlung mit HC11 Zellen, die ein irrelevantes CTLA-4 Fusionsprotein sezernieren, nicht zur Abstoßung von RencalacZ/ ErbB2 Tumoren. Diese Resultate bestätigen die antigenspezifische Wirkung des zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzins. Für die Evaluierung von ErbB2-spezifischen Immuntherapien stehen eine Reihe transgener Mausmodelle zur Verfügung, welche die Untersuchung des Einflusses einer bestehenden immunologischen Toleranz gegenüber humanem ErbB2 auf die therapeutische Aktivität zulassen. Ein gut etabliertes und häufig verwendetes Tiermodell sind dabei transgene WAP-Her-2 Mäuse, für die der humane ErbB2-Rezeptor ein Selbstantigen darstellt. In dieser Arbeit wurden durch Kreuzung mit BALB/c WAP-Her-2 F1 Mäuse mit einem genetischen CB6F1 Hintergrund erzeugt. Diese Tiere wiesen eine ausgeprägte immunologische Toleranz gegenüber humanem ErbB2 auf und eigneten sich somit für die Analyse der Aktivität des zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzins in einem physiologisch relevanten Kontext. Eine therapeutische Vakzinierung mit dem ursprünglichen HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin führte in diesen WAP-Her-2 F1 Tieren nicht zu einer Abstoßung von Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren. Zur Erhöhung der Effektivität von HC11/CTLA-4-ErbB2 in der Therapie von ErbB2-positiven Tumoren in immunologisch toleranten Mäusen wurde daher ein ähnliches zelluläres Vakzin generiert, das zusätzlich das immunmodulatorische Zytokin IL-15 sezerniert. Im Gegensatz zu HC11/CTLA-4-ErbB2 war das optimierte zelluläre HC11/CTLA-4-ErbB2/IL-15 Vakzin auch in immuntoleranten WAP-Her-2 F1 Mäusen therapeutisch wirksam und verzögerte signifikant das Wachstum von ErbB2-exprimierenden Tumoren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die andauernde Expression und Sekretion des APC-spezifischen CTLA-4-ErbB2 Fusionsproteins durch peritumoral injizierte Epithelzellen eine wirksame antigenspezifische Immunantwort und antitumorale Aktivität gegen etablierte Tumoren induzieren kann. Es ist wahrscheinlich, dass sich ähnliche Zellvakzine auch in menschlichen Krebspatienten als wirksam und nützlich erweisen können. Eine weitere Entwicklung dieses Ansatzes hin zu einer klinisch anwendbaren Immuntherapie erscheint daher sinnvoll.
Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.
Cysteinyl leukotriene receptor 1 antagonists (CysLT1RA) are frequently used as add-on medication for the treatment of asthma. Recently, these compounds have shown protective effects in cardiovascular diseases. This prompted us to investigate their influence on soluble epoxide hydrolase (sEH) and peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) activities, two targets known to play an important role in CVD and the metabolic syndrome. Montelukast, pranlukast and zafirlukast inhibited human sEH with IC50 values of 1.9, 14.1, and 0.8 μM, respectively. In contrast, only montelukast and zafirlukast activated PPARγ in the reporter gene assay with EC50 values of 1.17 μM (21.9% max. activation) and 2.49 μM (148% max. activation), respectively. PPARα and δ were not affected by any of the compounds. The activation of PPARγ was further investigated in 3T3-L1 adipocytes. Analysis of lipid accumulation, mRNA and protein expression of target genes as well as PPARγ phosphorylation revealed that montelukast was not able to induce adipocyte differentiation. In contrast, zafirlukast triggered moderate lipid accumulation compared to rosiglitazone and upregulated PPARγ target genes. In addition, we found that montelukast and zafirlukast display antagonistic activities concerning recruitment of the PPARγ cofactor CBP upon ligand binding suggesting that both compounds act as PPARγ modulators. In addition, zafirlukast impaired the TNFα triggered phosphorylation of PPARγ2 on serine 273. Thus, zafirlukast is a novel dual sEH/PPARγ modulator representing an excellent starting point for the further development of this compound class.
In the past, the genetically diabetic-obese diabetes/diabetes (db/db) and obese/obese (ob/ob) mouse strains were used to investigate mechanisms of diabetes-impaired wound healing. Here we determined patterns of skin repair in genetically normal C57Bl/6J mice that were fed using a high fat diet (HFD) to induce a diabetes-obesity syndrome. Wound closure was markedly delayed in HFD-fed mice compared to mice which had received a standard chow diet (CD). Impaired wound tissue of HFD mice showed a marked prolongation of wound inflammation. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) was delayed and associated with the disturbed formation of wound margin epithelia and an impaired angiogenesis in the reduced granulation tissue. Normal wound contraction was retarded and disordered. Wound disorders in obese C57Bl/6J mice were paralleled by a prominent degradation of the inhibitor of NFκB (IκB-α) in the absence of an Akt activation. By contrast to impaired wound conditions in ob/ob mice, late wounds of HFD mice did not develop a chronic inflammatory state and were epithelialized after 11 days of repair. Thus, only genetically obese and diabetic ob/ob mice finally developed chronic wounds and therefore represent a better suited experimental model to investigate diabetes-induced wound healing disorders.