Pharmazie
Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (329)
- Article (183)
- Book (32)
- Contribution to a Periodical (7)
- Conference Proceeding (3)
- Preprint (3)
- Habilitation (1)
Has Fulltext
- yes (558)
Is part of the Bibliography
- no (558)
Keywords
- Nanopartikel (10)
- Entzündung (6)
- Gentherapie (6)
- aging (6)
- 5-lipoxygenase (5)
- Proteomics (5)
- Schmerz (5)
- inflammation (5)
- Alzheimer-Krankheit (4)
- Apoptosis (4)
Institute
- Pharmazie (558)
- Medizin (56)
- Biochemie und Chemie (52)
- Präsidium (38)
- Biowissenschaften (24)
- Zentrum für Arzneimittelforschung, Entwicklung und Sicherheit (22)
- Psychologie (8)
- Sportwissenschaften (8)
- Georg-Speyer-Haus (7)
- Physik (7)
Taspase1 stellt die bisher einzige Typ2-Asparaginase mit proteolytischer Aktivität dar. Das wichtigste Substrat der Taspase1 ist das MLL-Protein, einem Homolog des Trithorax- Proteins aus Drosophila melanogaster, das auch dort eine wichtige Rolle bei Differenzierungsprozessen spielt. Bei Patienten mit einer t(4;11)-Translokation ist Taspase1 maßgeblich an der Ausbildung einer t(4;11)-assoziierten Leukämie beteiligt. Die Inhibierung der proteolytischen Aktivität der Taspase1 könnte daher einen Ansatzpunkt für eine neuartige Krebstherapie darstellen. Aufgrund der ungewöhnlichen Eigenschaften von Taspase1 ist es bisher nicht gelungen einen selektiven Inhibitor für das katalytische Zentrum der Taspase1 zu identifizieren. Unter nativen Bedingungen (ca. 50 mM NaCl) befindet sich Taspase1 bereits in einem nahezu vollständig inhibierten Zustand, da im katalytischen Zentrum der Taspase1 ein Chloridion komplexiert ist. Dieses Chloridion wird einzig und allein nach Interaktion mit dem natürlichen Substrat MLL aus dem katalytischen Zentrum verdrängt, was zu einer kurzfristigen Aktivierung der Taspase1 führt. Nach Ablauf der hydrolytischen Spaltung des Substrates nimmt das Chloridion wieder seine Position im katalytischen Zentrum ein. Unter diesen Bedingungen ist aus sterischen Gründen die Bindung eines potentiellen Inhibitors im katalytischen Zentrum nicht möglich. Durch Herstellung von Mutanten der Taspase1 und deren Substrats konnte der Mechanismus der katalytischen Spaltung durch Taspase1 aufgeklärt werden. Dabei erwiesen sich drei Aminoäuren als essentiell für die Hydrolyse. Interessanterweise ist die Anwesenheit des Substrates, insbesondere des Aspartates an Position Sieben der cleavage sites CS1 bzw. CS2 notwendig um den katalytischen Prozess zu starten. Das negativ geladene Aspartat, verdrängt zunächst das Chloridion von seiner Position und aktiviert dadurch das katalytische Zentrum (Rotation von Threonin 234). Erst dadurch wird Threonin 234 zu einer katalytisch aktiven Aminosäure und kann einen nukleophilen Angriff auf die Peptidbindung zwischen Aspartat und Glycin des Substrates durchführen. Die Hydrolyse wird dabei durch die OH-Gruppe des Serins 252 durch Wechselwirkung mit dem Carboxylsauerstoff unterstützt. Durch Mutation beider Aspartate an Position sieben im artifiziellen Substrat 2CL zu Glycin oder Lysin führte zu einem vollständigen Verlust der hydrolytischen Spaltung an CS1 und zu einem starken Rückgang der hydrolytischen Spaltung an CS2. Die Mutationen T234D und S252D der Taspase1 führten beide zum vollständigen Verlust der katalytischen Spaltung, sowohl in cis, als auch in trans. Unter Verwendung des Taspase1-Aktivitätsassays konnte der transkriptionelle Regulator MLL4 als potentielles Substrat der Taspase1 identifiziert werden.
Eine große Anzahl pharmakologischer und klinischer Studien zeigt die Wirksamkeit des standardisierten Ginkgo biloba Extraktes EGb 761 bei vaskulären und kognitiven Stö-rungen, wie der Alzheimer-Krankheit, der vaskulären Demenz und der peripheren arte-riellen Verschlusskrankheit. Experimentelle Ergebnisse weisen darauf hin, dass Terpen-laktone und Flavonolglykoside für die meisten pharmakologischen Wirkungen von EGb 761 verantwortlich sind. Allerdings gibt es wenige Studien, die die orale Biover-fügbarkeit von Terpenlaktonen und besonders von Flavonolglykosiden aus Ginkgo bilo-ba im Blut oder Zentralnervensystem untersuchten. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Fähigkeit der Flavonoidglykosiden bzw. deren Metaboliten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden im Tierversuch an männlichen Sprague-Dawley-Ratten erforscht. Unter-sucht wurden dabei orale Einfach- und Mehrfachgaben von EGb 761 über einen Zeit-raum von 8 Tagen in den Dosierungen 100 bzw. 600 mg Extrakt pro kg Körpergewicht. Zusätzlich wurde die Verteilung der Ginkgoflavonolmetabolite in den unterschiedlichen Bereichen des Gehirns untersucht (Hippocampus, frontaler Cortex, Striatum und Klein-hirn). Zu diesem Zweck wurde eine HPLC-Fluoreszenzmethode für die Ermittlung der Plasma- und Gehirnkonzentrationen der Flavonoidmetaboliten (Derivate von Quercetin, Kämpferol und Isorhamnetin) entwickelt und validiert. In beiden Studien (Einfach- und Mehrfachgabe) wurden Flavonoidmetaboliten im Plasma und im Gehirn nachgewiesen. Dabei wurden Metaboliten in allen untersuchten Gehirnbereichen gefunden. Bei der Dosierung von 100 mg/kg war Kämpferol vorzugsweise im frontalen Cortex lokalisiert, während die anderen Flavonole in allen Regionen vergleichbare Konzentrationen auf-wiesen. Bei der höheren Dosierung von 600 mg/kg waren die Konzentrationen der Fla-vonolmetaboliten in allen Gehirnbereichen vergleichbar. Obgleich die vier untersuchten Gehirnbereiche nur 38% des gesamten Gehirns darstellten, wurden die meisten Gink-goflavonole in diesen Regionen gefunden. Im übrigen Gehirngewebe wurden nur be-grenzte Mengen von Flavonolen nachgewiesen. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass es erstmalig gelungen ist, im Tier-versuch die Bioverfügbarkeit einer der therapeutisch aktiven Substanzklassen von Ginkgo biloba - die Flavonoide - sowohl im Plasma als auch im ZNS nachzuweisen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte mit der Aktivierung des Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptors eine Rationale und ein möglicher Wirkmechanismus für die traditionelle Anwendung von Gewürz- und Arzneipflanzen bei der Therapie des Typ 2 Diabetes aufgezeigt werden. Vor diesem Hintergrund wurden über fünfzig traditionell bei Diabetes angewandte Pflanzen ausgewählt und mit Ethanol extrahiert. Die erhaltenen Trockenextrakte wurden daraufhin in einem von mir etablierten Reporter-Gen Assay auf eine mögliche Aktivierung der drei Subtypen des PPAR hin untersucht. Von den getesteten Extrakten wurde für fünfundzwanzig, also annähernd die Hälfte, eine signifikante Aktivierung des PPARgamma nachgewiesen. Von diesen zeigten wiederum vierzehn außerdem eine signifikante Aktivierung des PPARalpha, lediglich drei dieser Extrakte zeigten auch eine signifikante Aktivierung des PPARdelta. Somit konnte ich eine mögliche Rationale und einen potentiellen Wirkmechanismus für die volksmedizinische Anwendung dieser Pflanzen bei Diabetes aufzeigen. Von den wirksamen Extrakten wiesen am PPARgamma sieben eine ausreichend hohe Aktivität auf, dass wir auch bei niedrigeren Testkonzentrationen noch einen signifikanten Effekt und somit eine Konzentrationsabhängigkeit des aufzeigen konnten. Für PPARa konnten wir lediglich für drei der Extrakte eine Konzentrationsabhängigkeit aufzeigen, bei PPARdelta für keinen der Extrakte. Die beiden am stärksten aktiven Extrakte aus Rosmarinus offic. und Salvia offic. zeigten bereits ab etwa 10 mg/L signifikante Aktivität am PPARgamma, so dass wir für diese beiden Extrakte mit 20 bzw. 40 mg/L EC50-Konstanten bestimmen konnten. Diese halbmaximale Aktivierungskonstante liegt damit für den potenteren Rosmarin-Extrakt lediglich um den Faktor 200 höher als die des bei Diabetes eingesetzten Arzneistoffs Pioglitazon (Actos®). Die weitere Untersuchung dieser beiden Extrakte ergab, dass in beiden Carnosolsäure bzw. Carnosol enthalten waren, welche bei der Untersuchung im Reporter-Gen Assay EC50-Konzentrationen von 20 bzw. 40 mikroM für die Aktivierung des PPARgamma aufwiesen. Damit sind diese Reinsubstanzen bereits nur noch um den Faktor siebzig schwächer wirksam als Pioglitazon. Vergleicht man hingegen mit Bezafibrat (Cedur®), einem als Lipidsenker eingesetzten Arzneistoff, welcher aufgrund seiner pan-PPAR-agonistischen Wirkung mit EC50-Konzentrationen von je etwa 50 mikroM von besonderem Interesse ist, so sind die beiden Diterpene Carnosolsäure und Carnosol im Hinblick auf PPARgamma äquipotent oder eher stärker aktiv. Der Gehalt an diesen beiden Diterpenen in den von mir hergestellten Extrakten war nun zwar mit in Summe drei bzw. neun Prozent um den Faktor zehn bzw. drei zu niedrig, als dass sich der PPARgamma Agonismus der beiden Extrakte hierdurch hinreichend erklären ließe. Allerdings konnten wir für einen kommerziell erhältlichen und auf 40% Carnosolsäure angereicherten Rosmarin-Extrakt einen EC50-Wert von 10 mg/L bestimmen für die Aktivierung von PPARgamma bestimmen. Eine Aktivität, welche sich zu 70% allein auf den Gehalt an Carnosolsäure zurückführen lässt. Neben dem Nachweis der PPARgamma Aktivität von Carnosolsäure und Carnosol einerseits und der von ethanolischen Rosmarin- und Salbei-Extrakten andererseits, konnte ich somit einen hinreichenden Beweis führen, dass Carnosolsäure zumindest für Rosmarin, vermutlich auch für Salbei, als eines der aktiven Prinzipien anzusehen ist. Meine Befunde liefern damit eine mögliche Erklärung und Wirkmechanismus für die in Tiermodellen gefundene hypoglykämische Wirksamkeit von Rosmarin, Salbei und Carnosolsäure. Darüber hinaus legen meine Untersuchungen nahe, dass in beiden Pflanzen weitere PPARgamma Aktivatoren enthalten sind. Da Carnosol selbst bereits ein Oxidationsprodukt der Carnosolsäure darstellt, kämen hier weitere auch bereits beschriebene Oxidationsprodukte sicherlich in Frage. Diese Oxidationsprodukte stellen allerdings zumeist nur labile Übergangsprodukte dar und sind aus diesem Grunde auch als nicht Reinstoffe erhältlich. Der Nachweis einer PPAR Aktivität könnte somit angesichts der benötigten Inkubationsdauer im Reporter-Gen Assay so nicht geführt werden. Neben den bereits angeführten Ergebnissen ist die hohe Rate von positiven Treffern in meinem Screening selbst einer der interessantesten Befunde. Die signifikante Aktivierung von PPARgamma durch nahezu die Hälfte der getesteten Extrakte lässt die Vermutung zu, dass PPAR agonistische Substanzen im Pflanzenreich sehr weit verbreitet sein könnten. Zwar bestehen zu Recht Vorbehalte gegenüber der Testung von Vielstoff-Gemischen bzw. den hierbei erhaltenen Ergebnissen. Viele pflanzliche Inhaltsstoffe z.B. Gerbstoffe können zu einer unspezifischen Hemmung der Aktivität von Enzyme führen. Das verwendete Testsystem setzt allerdings neben Membrangängigkeit der aktiven Prinzipien die spezifische Aktivierung der Expression eines Gens, dessen Aktivität anschließend bestimmt wird, voraus. Die Art des verwendeten Assay macht damit die Erfassung unspezifischer Effekte eher unwahrscheinlich. Darüberhinaus mag für die Güte der Ergebnisse meines Screenings sprechen, dass unabhängig von uns für einige der gescreenten Pflanzen z.B. Kurkuma und Chili mit den Kurkuminoiden und Capsaicin kürzlich PPAR aktive Prinzipien beschrieben wurden. Vielmehr lässt sich die Hypothese formulieren, dass eine ganze Reihe sekundärer pflanzlicher Inhaltsstoffe zumindest mäßig aktive PPAR Agonisten darstellen. An prominenter Stelle wäre hier die Substanzklasse der Terpene zu nennen, von denen eine ganze Reihe sowohl linearer etwa Farnesol und Phytansäure, als auch cyclischer z.B. Tumeron, Abietansäure, Oleanolsäure und Ursolsäure bereits als PPAR-Aktivatoren beschrieben wurden. Angesichts der hohen Lipophilie dieser Substanz-Klasse und einer relativ großen und wenig selektierenden Bindungstasche des PPAR lässt sich auch für andere Terpene ein PPAR Agonismus erwarten. Der positive Effekt, den eine überwiegend pflanzliche Ernährung nach epidemiologischen Erkenntnissen auf die Gesundheit bewirkt, mag deshalb in Teilen auf PPAR-agonistische Prinzipien zurückzuführen sein. Neben dem höheren Anteil an mehrfach ungesättigen Fettsäuren im Vergleich zu tierischer Nahrung könnten enthaltene Terpene hier durchaus einen relevanten Beitrag leisten. In einem weiteren in Kooperation durchgeführten Projekt konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass die schwache Aktivität des phenolischen Stilben-Derivats Resveratrol am PPARgamma einen Beitrag leistet zur Beeinflussung des Polyamin-Stoffwechsels und der hierdurch bedingten Regulation der Zell-Proliferation. Weiterhin konnte mit Hilfe der in unserem Reporter-Gen Assay erhaltenen Ergebnisse gezeigt werden, dass ein virtuelles Computer-basiertes Screening einer Substanzbibliothek effektiv ist, bei der Findung von PPAR Leitstrukturen.
Dynamische Proteininteraktionen sind die Grundlage biologischer Prozesse, ihr korrekter Ablauf ist essentiell für die intakte Physiologie aller Organismen. Die Aufklärung der Struktur und Funktion von Proteinen inklusive ihrer komplexen Interaktionen, ist entscheidend für das Verständnis biologischer Prozesse. Methoden zur Untersuchung von Protein-Interaktionen sind in der Regel auf die Modifikation von Proteinen angewiesen. Zum Einen ist die selektive Markierung von Proteinen mit spektroskopischen Sonden – insbesondere mit Fluorophoren – ein wichtiger Ansatz zur in vivo und in vitro Interaktionsanalyse. Zum Anderen gewinnen festphasenbasierte Analysemethoden zunehmend an Bedeutung. Multivalente Chelatoren (MCH) bieten vielseitige Möglichkeiten, rekombinante Proteine reversibel an spektroskopische Sonden oder Oberflächen anzubinden und haben dadurch ein enormes Potential für Anwendungen zur funktionalen Charakterisierung von Proteinen. Ziel dieser Arbeit war es, die Energetik und Dynamik der Interaktion von MCH mit Oligohistidinen zu charakterisieren, um diese insbesondere zur Organisation von Proteinen in Mikro- und Nanostrukturen einzusetzen. Die Interaktion der MCH mit Histidin-Tags unterschiedlicher Länge und Sequenz wurde in Lösung und an Oberflächen charakterisiert. Es zeigte sich, dass die zunehmende Länge und die Redundanz auf Seiten des Histidin-Tags in einer erhöhten Affinität resultierten. Das Einführen einzelner Spacer-Aminosäuren resultierte hingegen in einer drastischen Reduktion der Komplexstabilität. Ein Alanin-Scanning zeigte, dass vor allem die zentralen Histidine besonders wichtig für eine stabile Bindung sind. Dieser Effekt lässt sich dadurch erklären, dass es sich bei der MCH-Oligohistidin-Interaktion um einen äußerst dynamischen Prozess handelt, bei dem die Metallkoordinationsstellen mit ständig wechselnden Histidinen interagieren. Diese Permutation erhöht die Entropie des Komplexes, und ist somit Grund für die erhöhte Affinität mit steigender Redundanz des Histidin-Tags. Anhand von Chelator-Dichte-Arrays konnte gezeigt werden, dass die Stabilität der Bindung von Histidin-getagten Proteinen nicht nur mit der Multivalenz der Chelatoren, sondern auch mit der MCH-Dichte ansteigt. In Kompetitionsexperimenten mit Hexa- und Dekahistidinen auf den MCH-Dichte-Arrays wurden veränderte Stabilitäten beobachtet. Die Stabilität von H6 ver5. veringert sich in Anwesenheit von H10, wobei sich die scheinbare Affinität von H10 in Anwesenheit von H6 erhöht. Dies wird auf die gleichzeitige Interaktion mit verschiedenen MCH-Molekülen auf der Oberfläche, die Oberflächenmultivalenz, zurückgeführt. Um diesen Effekt anhand von MCHMolekülen mit definiertem Abstand zu untersuchen, wurde ein Tris-NTABiotin-Konjugat (BTTris-NTA) hergestellt und auf Streptavidin-Oberflächen bzw. fluoreszenzmarkiertem Streptavidin eingesetzt. Echtzeit TIRFS-RIf-Kompetitionsexperimente zeigten eine veränderte Bindungskinetik für H6 in Anwesenheit von H10, welche darauf zurückzuführen ist, dass H6 aktiv durch H10 verdrängt wird. Dieser Effekt ist offenbar auf die dynamische Interaktion des Oligohistidins mit multiplen Chelatoren auf der Oberfläche zurückzuführen, welche den aktiven Austausch von H6 gegen H10 ermöglicht. Sowohl auf Oberflächen als auch in Lösung wurden für die Interaktion von Streptavidin-gebundenem BTTris-NTA mit Oligohistidinen um Faktor 3-5 erhöhte Affinitäten, im Vergleich zu freiem Tris-NTA, festgestellt. Interaktionsanalysen in Lösung zeigten maximale Komplex-Stöchiometrien von 1:2 für die Interaktion von Streptavidin-BTTris-NTA mit Oligohistidinen. Diese Stöchiometrien sowie die erhöhte Affinität lassen sich durch die gleichzeitige Interaktion von zwei benachbarten an Streptavidin gebundenen BTTris-NTA-Molekülen mit einem Oligohistidin erklären. Die räumliche Nähe der Tris-NTA-Moleküle erhöht die Redundanz auf Seiten des Chelators, was sich wiederum positiv auf die Entropie auswirkt und damit zu einer erhöhten Affinität führt. Diese Ergebnisse bestätigen den postulierten Effekt der Oberflächenmultivalenz. Es wurde gezeigt, dass BTTris-NTA die reversible Biotinylierung Histidingetagter Proteine ermöglicht, und damit eine Brücke zwischen den zwei am meisten eingesetzten Werkzeugen der Biochemie, dem Histidin-Tag und dem Biotin-(Strept)Avidin-System, schlägt. BTTris-NTA findet in verschiedenen Bereichen Anwendung: zur Umwandlung kommerzieller (Strept)Avidin-Oberflächen in Tris-NTA-Oberflächen, in Phage-Display-Screenings und Western Blot Analysen sowie zur Markierung von Rezeptoren auf Zelloberflächen. Die Biotinylierung über BTTris-NTA ermöglicht es zudem, auch Proteine geringer Konzentrationen (<10 nM) effizient auf Streptavidinoberflächen zu immobilisieren. Diese Selbstassemblierung Histidin-getagter Proteine wurde zur Organisation von Proteinen auf Oberflächen in Mikro- bis Nanometer-Dimensionen genutzt.
The goal of this thesis was the development, evaluation and application of novel virtual screening approaches for the rational compilation of high quality pharmacological screening libraries. The criteria for a high quality were a high probability of the selected molecules to be active compared to randomly selected molecules and diversity in the retrieved chemotypes of the selected molecules to be prepared for the attrition of single lead structures. For the latter criterion the virtual screening approach had to perform “scaffold hopping”. The first molecular descriptor that was explicitly reported for that purpose was the topological pharmacophore CATS descriptor, representing a correlation vector (CV) of all pharmacophore points in a molecule. The representation is alignment-free and thus renders fast screening of large databases feasible. In a first series of experiments the CATS descriptor was conceptually extended to the three-dimensional pharmacophore-pair CATS3D descriptor and the molecular surface based SURFCATS descriptor. The scaling of the CATS3D descriptor, the combination of CATS3D with different similarity metrics and the dependence of the CATS3D descriptor on the threedimensional conformations of the molecules in the virtual screening database were evaluated in retrospective screening experiments. The “scaffold hopping” capabilities of CATS3D and SURFCATS were compared to CATS and the substructure fingerprint MACCS keys. Prospective virtual screening with CATS3D similarity searching was applied for the TAR RNA and the metabotropic glutamate receptor 5 (mGlur5). A combination of supervised and unsupervised neural networks trained on CATS3D descriptors was applied prospectively to compile a focused but still diverse library of mGluR5 modulators. In a second series of experiments the SQUID fuzzy pharmacophore model method was developed, that was aimed to provide a more general query for virtual screening than the CATS family descriptors. A prospective application of the fuzzy pharmacophore models was performed for TAR RNA ligands. In a last experiment a structure-/ligand-based pharmacophore model was developed for taspase1 based on a homology model of the enzyme. This model was applied prospectively for the screening for the first inhibitors of taspase1. The effect of different similarity metrics (Euc: Euclidean distance, Manh: Manhattan distance and Tani: Tanimoto similarity) and different scaling methods (unscaled, scaling1: scaling by the number of atoms, and scaling2: scaling by the added incidences of potential pharmacophore points of atom pairs) on CATS3D similarity searching was evaluated in retrospective virtual screening experiments. 12 target classes of the COBRA database of annotated ligands from recent scientific literature were used for that purpose. Scaling2, a new development for the CATS3D descriptor, was shown to perform best on average in combination with all three similarity metrics (enrichment factor ef (1%): Manh = 11.8 ± 4.3, Euc = 11.9 ± 4.6, Tani = 12.8 ± 5.1). The Tanimoto coefficient was found to perform best with the new scaling method. Using the other scaling methods the Manhattan distance performed best (ef (1%): unscaled: Manh = 9.6 ± 4.0, Euc = 8.1 ± 3.5, Tani = 8.3 ± 3.8; scaling1: Manh = 10.3 ± 4.1, Euc = 8.8 ± 3.6, Tani = 9.1 ± 3.8). Since CATS3D is independent of an alignment, the dependence of a “receptor relevant” conformation might also be weaker compared to other methods like docking. Using such methods might be a possibility to overcome problems like protein flexibility or the computational expensive calculation of many conformers. To test this hypothesis, co-crystal structures of 11 target classes served as queries for virtual screening of the COBRA database. Different numbers of conformations were calculated for the COBRA database. Using only a single conformation already resulted in a significant enrichment of isofunctional molecules on average (ef (1%) = 6.0 ± 6.5). This observation was also made for ligand classes with many rotatable bonds (e.g. HIV-protease: 19.3 ± 6.2 rotatable bonds in COBRA, ef (1%) = 12.2 ± 11.8). On average only an improvement from using the maximum number of conformations (on average 37 conformations / molecule) to using single conformations of 1.1 fold was found. It was found that using more conformations actives and inactives equally became more similar to the reference compounds according to the CATS3D representations. Applying the same parameters as before to calculate conformations for the crystal structure ligands resulted in an average Cartesian RMSD of the single conformations to the crystal structure conformations of 1.7 ± 0.7 Å. For the maximum number of conformations, the RMSD decreased to 1.0 ± 0.5 Å (1.8 fold improvement on average). To assess the virtual screening performance and the scaffold hopping potential of CATS3D and SURFACATS, these descriptors were compared to CATS and the MACCS keys, a fingerprint based on exact chemical substructures. Retrospective screening of ten classes of the COBRA database was performed. According to the average enrichment factors the MACCS keys performed best (ef (1%): MACCS = 17.4 ± 6.4, CATS = 14.6 ± 5.4, CATS3D = 13.9 ± 4.9, SURFCATS = 12.2 ± 5.5). The classes, where MACCS performed best, consisted of a lower average fraction of different scaffolds relative to the number of molecules (0.44 ± 0.13), than the classes, where CATS performed best (0.65 ± 0.13). CATS3D was the best performing method for only a single target class with an intermediate fraction of scaffolds (0.55). SURFCATS was not found to perform best for a single class. These results indicate that CATS and the CATS3D descriptors might be better suited to find novel scaffolds than the MACCS keys. All methods were also shown to complement each other by retrieving scaffolds that were not found by the other methods. A prospective evaluation of CATS3D similarity searching was done for metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) allosteric modulators. Seven known antagonists of mGluR5 with sub-micromolar IC50 were used as reference ligands for virtual screening of the 20,000 most drug-like compounds – as predicted by an artificial neural network approach – of the Asinex vendor database (194,563 compounds). Eight of 29 virtual screening hits were found with a Ki below 50 µM in a binding assay. Most of the ligands were only moderately specific for mGluR5 (maximum of > 4.2 fold selectivity) relative to mGluR1, the most similar receptor to mGluR5. One ligand exhibited even a better Ki for mGluR1 than for mGluR5 (mGluR5: Ki > 100 µM, mGluR1: Ki = 14 µM). All hits had different scaffolds than the reference molecules. It was demonstrated that the compiled library contained molecules that were different from the reference structures – as estimated by MACCS substructure fingerprints – but were still considered isofunctional by both CATS and CATS3D pharmacophore approaches. Artificial neural networks (ANN) provide an alternative to similarity searching in virtual screening, with the advantage that they incorporate knowledge from a learning procedure. A combination of artificial neural networks for the compilation of a focused but still structurally diverse screening library was employed prospectively for mGluR5. Ensembles of neural networks were trained on CATS3D representations of the training data for the prediction of “mGluR5-likeness” and for “mGluR5/mGluR1 selectivity”, the most similar receptor to mGluR5, yielding Matthews cc between 0.88 and 0.92 as well as 0.88 and 0.91 respectively. The best 8,403 hits (the focused library: the intersection of the best hits from both prediction tasks) from virtually ranking the Enamine vendor database (ca. 1,000,000 molecules), were further analyzed by two self-organizing maps (SOMs), trained on CATS3D descriptors and on MACCS substructure fingerprints. A diverse and representative subset of the hits was obtained by selecting the most similar molecules to each SOM neuron. Binding studies of the selected compounds (16 molecules from each map) gave that three of the molecules from the CATS3D SOM and two of the molecules from the MACCS SOM showed mGluR5 binding. The best hit with a Ki of 21 µM was found in the CATS3D SOM. The selectivity of the compounds for mGluR5 over mGluR1 was low. Since the binding pockets in the two receptors are similar the general CATS3D representation might not have been appropriate for the prediction of selectivity. In both SOMs new active molecules were found in neurons that did not contain molecules from the training set, i. e. the approach was able to enter new areas of chemical space with respect to mGluR5. The combination of supervised and unsupervised neural networks and CATS3D seemed to be suited for the retrieval of dissimilar molecules with the same class of biological activity, rather than for the optimization of molecules with respect to activity or selectivity. A new virtual screening approach was developed with the SQUID (Sophisticated Quantification of Interaction Distributions) fuzzy pharmacophore method. In SQUID pairs of Gaussian probability densities are used for the construction of a CV descriptor. The Gaussians represent clusters of atoms comprising the same pharmacophoric feature within an alignment of several active reference molecules. The fuzzy representation of the molecules should enhance the performance in scaffold hopping. Pharmacophore models with different degrees of fuzziness (resolution) can be defined which might be an appropriate means to compensate for ligand and receptor flexibility. For virtual screening the 3D distribution of Gaussian densities is transformed into a two-point correlation vector representation which describes the probability density for the presence of atom-pairs, comprising defined pharmacophoric features. The fuzzy pharmacophore CV was used to rank CATS3D representations of molecules. The approach was validated by retrospective screening for cyclooxygenase 2 (COX-2) and thrombin ligands. A variety of models with different degrees of fuzziness were calculated and tested for both classes of molecules. Best performance was obtained with pharmacophore models reflecting an intermediate degree of fuzziness. Appropriately weighted fuzzy pharmacophore models performed better in retrospective screening than CATS3D similarity searching using single query molecules, for both COX-2 and thrombin (ef (1%): COX-2: SQUID = 39.2., best CATS3D result = 26.6; Thrombin: SQUID = 18.0, best CATS3D result = 16.7). The new pharmacophore method was shown to complement MOE pharmacophore models. SQUID fuzzy pharmacophore and CATS3D virtual screening were applied prospectively to retrieve novel scaffolds of RNA binding molecules, inhibiting the Tat-TAR interaction. A pharmacophore model was built up from one ligand (acetylpromazine, IC50 = 500 µM) and a fragment of another known ligand (CGP40336A), which was assumed to bind with a comparable binding mode as acetylpromazine. The fragment was flexible aligned to the TAR bound NMR conformation of acetylpromazine. Using an optimized SQUID pharmacophore model the 20,000 most druglike molecules from the SPECS database (229,658 compounds) were screened for Tat-TAR ligands. Both reference inhibitors were also applied for CATS3D similarity searching. A set of 19 molecules from the SQUID and CATS3D results was selected for experimental testing. In a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay the best SQUID hit showed an IC50 value of 46 µM, which represents an approximately tenfold improvement over the reference acetylpromazine. The best hit from CATS3D similarity searching showed an IC50 comparable to acetylpromazine (IC50 = 500 µM). Both hits contained different molecular scaffolds than the reference molecules. Structure-based pharmacophores provide an alternative to ligand-based approaches, with the advantage that no ligands have to be known in advance and no topological bias is introduced. The latter is e.g. favorable for hopping from peptide-like substrates to drug-like molecules. A homology model of the threonine aspartase taspase1 was calculated based on the crystal structures of a homologous isoaspartyl peptidase. Docking studies of the substrate with GOLD identified a binding mode where the cleaved bond was situated directly above the reactive N-terminal threonine. The predicted enzyme-substrate complex was used to derive a pharmacophore model for virtual screening for novel taspase1 inhibitors. 85 molecules were identified from virtual screening with the pharmacophore model as potential taspase1- inhibitors, however biochemical data was not available before the end of this thesis. In summary this thesis demonstrated the successful development, improvement and application of pharmacophore-based virtual screening methods for the compilation of molecule-libraries for early phase drug development. The highest potential of such methods seemed to be in scaffold hopping, the non-trivial task of finding different molecules with the same biological activity.
In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Allergie gegen Süßkirsche untersucht. Zunächst wurde die Leistungsfähigkeit eines professionellen Tests mit re-kombinanten Allergenen aus Süßkirsche untersucht. Hierzu wurden rPru av 1, 3 und 4 einzeln eingesetzt, um die Sensibilisierungsmuster von Kirschallergikern aus Mitteleuropa und Spanien zu untersuchen. Vor allem die Untersuchung LTP-sensibi-lisierter Patienten aus diesen Regionen in einer Zahl, die einen statistischen Ver-gleich ermöglichte, offenbarte neue Aspekte des Phänomens schwerer Reaktionen bei solchen Patienten. Die drei rekombinanten Kirschallergene wurden auch kombiniert in einem einzigen Test eingesetzt, um schwer standardisierbare Proteinextrakte als Hilfsmittel zur in vitro Diagnose zu ersetzen. Um die Leistungsfähigkeit dieses Tests umfassend beurteilen zu können, wurde sie mit der des SPT in Birkenpollenallergikern mit und ohne Kirschallergie verglichen. Die mögliche Bedeutung unbekannter Allergene oder Isoformen wurde durch die Abschätzung des Beitrags der bekannten Kirschallergene zum IgE-Bindungsanteil von Kirschextrakt untersucht. Mit dem ImmunoCAP konnten die bereits veröffentlichten regional unterschiedlichen Sensibilisierungsmuster bestätigt werden. Die dominierende Rolle des Bet v 1-Homologen Pru av 1 in Patienten aus Mitteleuropa und damit die Bedeutung der Birkenpollenassoziation in dieser Region, konnte ebenso bestätigt werden wie die überragende Relevanz von Pru av 3 für Kirschallergiker aus Spanien. Der Vergleich der größten bisher publizierten und für statistische Untersuchungen ausreichend großen Gruppe LTP-sensibilisierter Patienten aus Mitteleuropa mit solchen Patienten aus Spanien, legte im Gegensatz zu früheren Studien keine ausschließlich auf die molekularen Eigenschaften von Pru av 3 beschränkte Assoziation von sys-temischen Reaktionen und einer Sensibilisierung gegen LTPs nahe. Die Assoziation scheint eher zwischen der Herkunft LTP-sensibilisierter Patienten und systemischen Reaktionen zu bestehen. Diese Schlussfolgerung konnte gezogen werden, da bei keinem der LTP-sensibilisierten Patienten aus Mitteleuropa systemische Reaktionen auftraten. Weder eine Co-Sensibilisierung gegen Pollen noch eine Allergie gegen andere Nahrungsmittel wie zum Beispiel Pfirsich korrelierten mit dem Auftreten sys-temischer Reaktionen. Eine Erklärung für dieses Phänomen konnte aus den vor-liegenden Daten daher nicht abgeleitet werden. Die Leistungsfähigkeit des rMix-ImmunoCAP mit rPru av 1, 3 und 4 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche war exzellent. Weder der kommerziell erhältliche Extrakt-ImmunoCAP noch der ImmunoCAP, der einen optimierten Extrakt an der Festphase trug konnte mit diesem Test konkurrieren. Die klinische Sensitivität des rMix-ImmunoCAP war mit ≥95% hervorragend, und der Test stimmte in 92% der Fälle mit dem SPT überein. Eine Unterscheidung zwischen Birkenpollenallergikern ohne Allergie gegen Süßkirsche und Kirschallergikern war hingegen weder mit dem rMix-ImmunoCAP noch mit dem SPT möglich. Die Spezifität beider Tests war von klinisch insignifikanter IgE-Reaktivität gegen Pru av 1 beeinträchtigt und auch die Konzentration spezifischen IgEs erlaubte keine Unterscheidung zwischen beiden Gruppen auf der Ebene einzelner Patienten. Der rMix-ImmunoCAP ist aber sehr gut geeignet eine Sensibilisierung bei einem Verdacht einer Allergie gegen Süßkirsche nachzuweisen, ohne auf weitere Allergene wie Pru av 2 oder Isoformen von Pru av 1 zurückgreifen zu müssen. Damit wurde zum ersten Mal ein diagnostischer Test ein-gesetzt, der einen Proteinextrakt aus Früchten vollständig ersetzen kann Die quantitative Abschätzung des Beitrages der bereits bekannten Allergene aus Süßkirsche zur IgE-Bindung mittel EAST-Inhibition hat gezeigt, dass bei einem Großteil der untersuchten Seren erhebliche Anteile des IgEs gegen Süßkirsche nicht erfasst werden. Die Ursache für dieses Phänomen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend aufgeklärt werden, aber es ist als sehr wahrscheinlich anzu-sehen, dass die neu identifizierte Isoform von Pru av 1 zumindest bei einem Teil der Seren hierfür verantwortlich ist. Darüber hinaus waren im Immunoblot bei Seren bei denen die IgE-Bindung nicht vollständig zu inhibieren war IgE-Reaktivität gegen noch unbekannte Strukturen zu erkennen. Neben der Beteiligung glykosilierter Proteine war auch eine Beteiligung von Pru av 2 nicht vollständig auszuschließen, wenngleich im Verlauf dieser Arbeit keine Hinweise auf eine Relevanz dieses Allergens in dem untersuchten Patientenkollektiv gefunden werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Grundlagen gelegt, um die Allergenität von Süßkirsche in einem in vitro Modell zu reduzieren. Es wurden Isoformen von Pru av 1 mit einer Kombination aus molekularbiologischen und proteinchemischen Methoden untersucht. Es wurden hierzu Techniken gewählt, die eine weitgehend um-fassende und zuverlässige Identifizierung von Isoformen ermöglichten. Ferner wurde der Gehalt an Pru av 1 von verschiedenen Kirschsorten verglichen, das Splice-Intron von Pru av 1 sequenziert, um die Herstellung eines spezifischen und wirksamen RNAi-Konstruktes zu ermöglichen, sowie die Eignung in vitro regenerierter Kirschpflanzen als Zielorganismus durch den Nachweis von Pru av 1 in den Blättern solcher Pflanzen geprüft. Die in dieser Arbeit verwendeten Methoden haben sich als geeignet erwiesen zuverlässig Isoformen von Allergenen zu identifizieren. Es konnte mit Hilfe einer syn-ergistischen Kombination aus einer cDNA-Bibliothek, PCR, und 2-D-PAGE / MS mit Pru av 1.02 eine neue Isoform von Pru av 1 identifiziert werden. Die mit den molekularbiologischen Methoden erzielten Ergebnisse stimmten dabei mit den Re-sultaten der proteinchemischen Untersuchungen sehr gut überein. In beiden Fällen wurden zwei Pru av 1 Isoformen nachgewiesen und lediglich die eine Variante von Pru av 1.02 mit sehr hoher Sequenzidentität konnte nicht als Protein nachgewiesen werden. Die auf Protein- und DNA-Ebene übereinstimmenden Ergebnisse bezüglich der beiden IgE-bindenden Isoformen, lassen darüber hinaus auf eine weitgehend vollständige Erfassung der Pru av1 Isoformen schließen. Pru av 1.02 besteht aus drei Varianten und zeigte ein anderes IgE-Bindungs-verhalten als das bereits bekannte Pru av 1.0101. Diese Isoform ist daher sowohl für eine zukünftige gentechnische Reduzierung der Allergenität von Süßkirsche als auch für diagnostische Zwecke bedeutsam. Für eine erfolgreiche Reduzierung der Aller-genität von Süßkirsche muss die Expression aller IgE-reaktiven Isoformen des in Mitteleuropa dominierenden Allergens Pru av 1 unterdrückt werden. Wenngleich Pru av 1.0201 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche nicht not-wendig erscheint, könnte sie jedoch sowohl einen Einfluss auf die Höhe der gemes-senen IgE-Werte und die Ausbildung von Symptomen haben, als auch besser ge-eignet sein zwischen Birkenpollenallergikern mit und ohne Allergie gegen Süßkirsche zu unterscheiden. Abschließend wurden dann die Grundlagen für die gentechnische Redu-zierung der Allergenität von Süßkirsche geschaffen. Der Gehalt an Pru av 1 war in allen elf Kirschsorten sehr ähnlich, und erlaubt daher alle untersuchten Kirschsorten als Ausgangsmaterial einzusetzen. Die Sequenzierung des Splice-Introns aus Pru av 1 ermöglicht es jetzt ein intron-spliced hairpin RNAi-Konstrukt herzustellen. Dieses Konstrukt könnte dann eingesetzt werden, um die Reduktion der Allergenität von Süßkirsche experimentell in einem in vitro Modell zu zeigen. Mit dem Nachweis von Pru av 1 in den Blättern in vitro regenerierter Kirschpflanzen konnte gezeigt werden, dass die Voraussetzungen hierzu gegeben sind.
Introduction: Despite the excellent anti-inflammatory and immunosuppressive action of glucocorticoids (GCs), their use for the treatment of inflammatory bowel disease (IBD) still carries significant risks in terms of frequently occurring severe side effects, such as the impairment of intestinal tissue repair. The recently-introduced selective glucocorticoid receptor (GR) agonists (SEGRAs) offer anti-inflammatory action comparable to that of common GCs, but with a reduced side effect profile.
Methods: The in vitro effects of the non-steroidal SEGRAs Compound A (CpdA) and ZK216348, were investigated in intestinal epithelial cells and compared to those of Dexamethasone (Dex). GR translocation was shown by immunfluorescence and Western blot analysis. Trans-repressive effects were studied by means of NF-κB/p65 activity and IL-8 levels, trans-activation potency by reporter gene assay. Flow cytometry was used to assess apoptosis of cells exposed to SEGRAs. The effects on IEC-6 and HaCaT cell restitution were determined using an in vitro wound healing model, cell proliferation by BrdU assay. In addition, influences on the TGF-β- or EGF/ERK1/2/MAPK-pathway were evaluated by reporter gene assay, Western blot and qPCR analysis.
Results: Dex, CpdA and ZK216348 were found to be functional GR agonists. In terms of trans-repression, CpdA and ZK216348 effectively inhibited NF-κB activity and IL-8 secretion, but showed less trans-activation potency. Furthermore, unlike SEGRAs, Dex caused a dose-dependent inhibition of cell restitution with no effect on cell proliferation. These differences in epithelial restitution were TGF-β-independent but Dex inhibited the EGF/ERK1/2/MAPK-pathway important for intestinal epithelial wound healing by induction of MKP-1 and Annexin-1 which was not affected by CpdA or ZK216348.
Conclusion: Collectively, our results indicate that, while their anti-inflammatory activity is comparable to Dex, SEGRAs show fewer side effects with respect to wound healing. The fact that SEGRAs did not have a similar effect on cell restitution might be due to a different modulation of EGF/ERK1/2 MAPK signalling.
Mukoviszidose oder zystische Fibrose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv Erbkrankheit in der westlichen Welt. Sie wird durch Mutationen in einem Gen verursacht, das den „Cystic Fibrosis Transmembran Conductance Regulator“ (CFTR) kodiert. Das CFTR-Protein ist zum einen ein epithelialer Chloridkanal, zum anderen aber auch ein Regulator zahlreicher anderer epithelialer Ionenkanäle und Transporter. Der Ausfall des CFTR-Proteins verursacht eine Multiorganerkrankung, bei der vorwiegend sekretorische Funktionen beeinträchtigt sind. Besonders betroffen sind Lunge und Pankreas, wobei die Beteiligung der Lunge maßgeblich für die Ausprägung der Erkrankung und deren Letalität ist. Die Mehrzahl der Patienten leidet unter rezidivierenden bronchopulmonalen Infektionen und einer exzessiven pulmonalen Inflammation. Einen wesentlichen Beitrag zur Zerstörung der Lunge liefern dabei jedoch körpereigene neutrophile Granulozyten, die in großer Zahl in die Lunge eindringen, ohne jedoch den Erreger beseitigen zu können. Neuere Studien lassen darauf schließen, dass neben den neutrophilen Granulozyten auch Lymphozyten eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Entzündungsmarker wie Zytokine und Eicosanoide sind nicht nur lokal in den Atemwegen erhöht, sondern auch systemisch, was auf einen generalisierten Entzündungsstatus hinweist. Die Ursache der gestörten Immunantwort bei CF sind immer noch unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Das Ziel unserer Studien war die vergleichende Untersuchung der Expression und Aktivität der Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs) sowie der 15-Lipoxygenase-1, einem Schlüsselenzym im Eicosanoidstoffwechsel, zwischen Patienten mit CF und gesunden Probanden. Da bekannt ist, dass PPARs sowie die 15-LO-1 in entzündlichen Prozessen regulatorische Funktionen besitzen, und man zudem annimmt, dass CF auf eine übermäßige Immunreaktion zurückzuführen ist, vermuten wir für PPARs bzw. 15-LO-1 ein verändertes Expressionsmuster. Eicosanoide sind wichtige Mediatoren und Modulatoren der inflammatorischen Antwort. Sie sind Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Eine wichtige Rolle spielen sie bei der Thrombozytenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Chemotaxis der Leukozyten, Zytokinproduktion, Schmerzübertragung sowie der Entstehung von Fieber. Einige Eicosanoide verursachen proinflammatorische, andere antiinflammatorische Aktionen, wiederum andere können beides verursachen. Arachidonsäure (AA), eine n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), ist der Vorläufer für potente proinflammatorische Eicosanoide wie Prostaglandin E-2, Thromboxan A2 und Leukotrien B4 und ist in der Phospholipidschicht der Zellmembran gebunden. n-3 PUFA’s wie Docosahexaenoicsäure (DHA) und Eicosapentaensäure werden zu Eicosanoiden wie Prostaglandin E-3, Thromboxan A3 und Leukotrien B5 metabolisiert. DHA besitzt antiinflammatorische Eigenschaften, indem es mit AA um die Aufnahme/Verbindung in die Zellmembran konkurriert, dabei werden die AA Spiegel herunterreguliert. Veränderungen beim Stoffwechsel der Fettsäuren und Eisosanoide wurden bei CF-Patienten von verschiedenen Gruppen beschrieben. Zusätzlich zu dem erhöhten Spiegel proinflammatorischer Leukotriene in Atemwegen, Urin und Serum, wurden erniedrigte Spiegel von DHA im Plasma und übermäßige Freisetzung von AA aus der Zellmembran für CF beschrieben. Desweiteren wurden erhöhte Mengen membrangebundener AA und erniedrigte Mengen membrangebundener DHA in den von CF betroffenen Organen beschrieben. Veränderungen des Fettsäure-Haushalts sind von besonderem Interesse, weil sie die bei CF vorliegender Fehlregulation inflammatorischer Prozesse erklären könnten. Sie sind auch natürliche Liganden von Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren und darüber hinaus an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei unterschiedliche PPAR-Isoformen identifiziert, PPAR alpha, beta und gamma. Sie sind Transkriptionsfaktoren, die zu der Superfamilie der nukleäreren Rezeptoren gehören, und werden durch endogene Liganden wie Fettsäuren und Eicosanoide aktiviert. Es wurde gezeigt, dass PPARalpha und –gamma antiinflammatorische Aktivität besitzen, die auf Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, glatte Muskelzellen und Endothellzellen wirkt. Ein Modell dazu ist eine durch PPARalpha und -gamma vermittelte Hemmung der proinflammatorischen Eigenschaften des nuklearen Faktor-kappaB (NF-kappaB) und des aktivierenden Proteins-1 (AP-1). Beides sind Transkriptionsfaktoren, die eine Schlüsselrolle bei der inflammatorischen Antwort spielen, indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren veranlassen. Die PPARs werden unter anderem in peripheren Blutzellen exprimiert. Da die Spiegel einiger endogener Aktivatoren der PPARs bei CF verändert zu sein scheinen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluss auf Expression und Funktion der PPARs untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Patienten mit CF untersucht, die sich in einem stabilen Zustand befanden und im Rahmen von Routineuntersuchungen in die Klinik kamen. Da die CF-Patienten in unserer Klinik nicht bronchoskopiert werden, konnte kein Versuchsmaterial aus den Atemwegen gewonnen werden. Dennoch gehen wir aufgrund der erhöhten Entzündungsmarker im Blut der CF-Patienten davon aus, dass die Entzündungsreaktionen nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Auch in unserer Studie zeigten sich erhöhte IL-8 Spiegel im Plasma von Patienten mit CF. Dies unterstützt die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und weist auf systemische proinflammatorische Vorgänge hin. Das Blut wurde über Venenpunktion erhalten. Monozyten, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten wurden isoliert und untersucht, da sie aufgrund der Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen und durch die Produktion von Antikörpern, wichtige Mediatoren in der Immunantwort sind. Die PPAR mRNA Expression wurde in Monozyten und Lymphozyten mittels RT-kompetitiver Multiplex PCR gemessen und mittels RT-Real-time PCR in neutrophilen Granulozyten. Die PPARgamma Spiegel in diesen Zellen lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Die statistische Analyse zeigte dass in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Gesunden PPARalpha mRNA, aber nicht PPARbeta mRNA, signifikant erniedrigt exprimiert wird (-37%). Die gleiche Differenz konnte auf Proteinebene mit Hilfe von Western Blots detektiert werden. Hinsichtlich der Expression von PPARalpha und PPARbeta zeigten sich in Monozyten und Neutrophilen zwischen CF-Patienten und Gesunden keine signifikanten Unterschiede. Unseren Daten werden von verschiedenen Studien unterstützt. Zum ersten gibt es Hinweise, dass PPARalpha mRNA- und Protein-Expression von ihren eigenen Liganden direkt reguliert werden. Bei Patienten mit CF zeigen sich für die natürlichen Liganden, Eicosanoide und Fettsäuren, veränderte Spiegel, was zu einer verringerten Expression von PPARalpha beitragen könnte. Zum zweiten, da bekannt ist, dass die PPARalpha-Expression in proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten herunterreguliert ist, wurde zusätzlich überprüft, ob die Lymphozyten von CF-Patienten aktiviert sind. Interleukin-2 Rezeptor im Serum (sIL-2 R) ist ein allgemein anerkannter Marker der Aktivierung von Lymphozyten. Tatsächlich zeigte sich, dass die Konzentration von sIL-2 R im Serum der vorliegenden CF Patienten erhöht ist, was mit den Erkenntnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt 128-130. Die verstärkte Aktivierung von Lymphozyten in CF-Patienten könnte eine Erklärung für die erniedrigten PPARalpha-Spiegel bieten. Der verantwortliche Mechanismus dafür ist bis jetzt noch nicht bekannt. Drittens wurde für die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-alpha und IL-1 gezeigt, dass sie eine Reduktion der PPARalpha Expression verursachen können. CF-Patienten zeigen erhöhte Spiegel von IL-2, TNF-alpha, IL-6 und IL-8 im Sputum und Serum. Konsequenterweise kann die PPARalpha Expression durch die erhöhten Zytokinspiegel im Serum herunter reguliert werden. Eine weitere Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse ergibt sich aus einem Kongressbeitrag von Andersson et al., die über eine epitheliale CF-Zelllinie berichten, die weniger PPARalpha-Protein exprimiert als eine normale epitheliale Zelllinie. Dieselbe Forschungsgruppe fand erniedrigte PPARgamma-Spiegel im CF-Maus-Modell in Geweben, die speziell durch CFTR reguliert werden und ihre Daten weisen darauf hin, dass CFTR eine Rolle bei der PPAR Expression spielen kann. Ein funktionales CFTR-Protein wird auch in Lymphozyten von Gesunden exprimiert. Folglich könnte ein defektes CFTR auch in CF-Lymphozyten für die veränderterte PPARalpha-Expression verantwortlich sein. Ob die beschriebene Veränderung der Menge an PPARalpha mRNA und Protein auch auf funktioneller Ebene zum Tragen kommt, wurde durch immunhistometrische Untersuchungen und die Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors überprüft. Die immunhistometrischen Untersuchungen zeigten, dass PPARalpha sowohl bei Gesunden als auch bei CF-Patienten hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist und dass sich nur ein kleiner Teil im Nukleus befindet. Eine Quantifizierung war hierbei nicht möglich. Über eine ähnliche zelluläre Verteilung wurde in humanen Makrophagen wie auch in Mäuselymphozyten berichtet. Die DNA-Bindungstudien zeigten, dass die PPARalpha DNA-Bindungsaktivität in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Kontrollpersonen um 36% signifikant erniedrigt war. Eine erniedrigte DNA-Bindungsaktivität bei CFTR knock-out Mäuse wurde auch für PPARgamma berichtet. Die Bindungsaktivität konnte wiederhergestellt werden, nachdem die Mäuse mit Troglitazon, einem PPARgamma Agonist, behandelt wurden. Darüber hinaus werden mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die Veränderungen des Eicosanoidhaushalts bei CF zu der Verminderung sowohl der Expression als auch der Aktivität von PPARalpha beitragen. Hier ist besonders die bei CF verminderter Menge des PPARalpha–Liganden DHA hervorzuheben. Eine ligandeninduzierte Aktivierung von PPARalpha führt zu einer Abnahme verschiedener proinflammatorische Zytokine in Lymphozyten. Dies geschieht vermutlich über eine Antagonisierung der Aktivität von NF-kappaB. PPARalpha hat einen signifikanten Einfluss auf die Immunantwort. Somit könnte die bei CF-Patienten verminderte PPARalpha-Expression und -Funktion ursächlich oder mitverantwortlich für die inflammatorischen Vorgänge bei CF sein. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Regulierung der Aktivität von PPARalpha durch die Zugabe von DHA oder andere Liganden eine sinnvolle Therapieoption sein kann. Es sollte in weiterführenden Versuchen geklärt werden, ob eine Therapie mit PPARalpha-Aktivatoren einen Einfluss auf die inflammatorischen Vorgänge bei CF haben kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht ob CF einen Defekt in der Expression von 15-Lipoxygenase-1 (15-LO-1) verursacht. 15-LO-1 ist ein Schlüsselenzym für die Synthese einiger Eicosanoide wie z.B. 15(S)-HETE und Lipoxin A4. Beide Eicosanoide spielen eine wichtige Rolle in inflammatorischen Vorgängen in der menschlichen Lunge. 15(S)-HETE ist ein von der Arachidonsäure abgeleitetes Eicosanoid, das sich in hoher Konzentration in eosinophilen Granulozyten und Atemwegsepithelien findet. 15(S)-HETE wirkt in den Atemwegen stark mukosekretolytisch und bronchokonstriktorisch. Zum anderen inhibiert 15(S)-HETE die durch die 5-Lipoxygenase katalysierte Konversion von Arachidonsäure zu proinflammatorischen Mediatoren wie LTB4 in neutrophilen Granulozyten. Dies führt zu einer Reduktion der neutrophilen Chemotaxis. Es liegen bisher keine Daten zu 15-HETE-Spiegel in der CF-Lunge vor. Lipoxin A4 verursacht ebenfalls eine Reduktion der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, supprimiert darüber hinaus aber schon deren Aktivierung. Neben einer direkten Wirkung auf die neutrophilen Granulozyten, sind dabei auch indirekte Effekte beteiligt, wie zum Beispiel die Reduktion der broncho-epithelialen Ausschüttung von IL-8, als einem potenten Chemoattraktor und Aktivator neutrophiler Granulozyten. Tatsächlich ist die Konzentration des anti-inflammatorisch wirksamen LXA4 in der Atemwegsflüssigkeit von CF-Patienten reduziert. Die Expression von15-LO-1 in peripheren Blutzellen ist im Wesentlichen auf die eosinophilen Granulozyten beschränkt. Deren Mukoviszidose oder zystische Fibrose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv Erbkrankheit in der westlichen Welt. Sie wird durch Mutationen in einem Gen verursacht, das den „Cystic Fibrosis Transmembran Conductance Regulator“ (CFTR) kodiert. Das CFTR-Protein ist zum einen ein epithelialer Chloridkanal, zum anderen aber auch ein Regulator zahlreicher anderer epithelialer Ionenkanäle und Transporter. Der Ausfall des CFTR-Proteins verursacht eine Multiorganerkrankung, bei der vorwiegend sekretorische Funktionen beeinträchtigt sind. Besonders betroffen sind Lunge und Pankreas, wobei die Beteiligung der Lunge maßgeblich für die Ausprägung der Erkrankung und deren Letalität ist. Die Mehrzahl der Patienten leidet unter rezidivierenden bronchopulmonalen Infektionen und einer exzessiven pulmonalen Inflammation. Einen wesentlichen Beitrag zur Zerstörung der Lunge liefern dabei jedoch körpereigene neutrophile Granulozyten, die in großer Zahl in die Lunge eindringen, ohne jedoch den Erreger beseitigen zu können. Neuere Studien lassen darauf schließen, dass neben den neutrophilen Granulozyten auch Lymphozyten eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Entzündungsmarker wie Zytokine und Eicosanoide sind nicht nur lokal in den Atemwegen erhöht, sondern auch systemisch, was auf einen generalisierten Entzündungsstatus hinweist. Die Ursache der gestörten Immunantwort bei CF sind immer noch unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Das Ziel unserer Studien war die vergleichende Untersuchung der Expression und Aktivität der Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs) sowie der 15-Lipoxygenase-1, einem Schlüsselenzym im Eicosanoidstoffwechsel, zwischen Patienten mit CF und gesunden Probanden. Da bekannt ist, dass PPARs sowie die 15-LO-1 in entzündlichen Prozessen regulatorische Funktionen besitzen, und man zudem annimmt, dass CF auf eine übermäßige Immunreaktion zurückzuführen ist, vermuten wir für PPARs bzw. 15-LO-1 ein verändertes Expressionsmuster. Eicosanoide sind wichtige Mediatoren und Modulatoren der inflammatorischen Antwort. Sie sind Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Eine wichtige Rolle spielen sie bei der Thrombozytenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Chemotaxis der Leukozyten, Zytokinproduktion, Schmerzübertragung sowie der Entstehung von Fieber. Einige Eicosanoide verursachen proinflammatorische, andere antiinflammatorische Aktionen, wiederum andere können beides verursachen. Arachidonsäure (AA), eine n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), ist der Vorläufer für potente proinflammatorische Eicosanoide wie Prostaglandin E-2, Thromboxan A2 und Leukotrien B4 und ist in der Phospholipidschicht der Zellmembran gebunden. n-3 PUFA’s wie Docosahexaenoicsäure (DHA) und Eicosapentaensäure werden zu Eicosanoiden wie Prostaglandin E-3, Thromboxan A3 und Leukotrien B5 metabolisiert. DHA besitzt antiinflammatorische Eigenschaften, indem es mit AA um die Aufnahme/Verbindung in die Zellmembran konkurriert, dabei werden die AA Spiegel herunterreguliert. Veränderungen beim Stoffwechsel der Fettsäuren und Eisosanoide wurden bei CF-Patienten von verschiedenen Gruppen beschrieben. Zusätzlich zu dem erhöhten Spiegel proinflammatorischer Leukotriene in Atemwegen, Urin und Serum, wurden erniedrigte Spiegel von DHA im Plasma und übermäßige Freisetzung von AA aus der Zellmembran für CF beschrieben. Desweiteren wurden erhöhte Mengen membrangebundener AA und erniedrigte Mengen membrangebundener DHA in den von CF betroffenen Organen beschrieben. Veränderungen des Fettsäure-Haushalts sind von besonderem Interesse, weil sie die bei CF vorliegender Fehlregulation inflammatorischer Prozesse erklären könnten. Sie sind auch natürliche Liganden von Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren und darüber hinaus an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei unterschiedliche PPAR-Isoformen identifiziert, PPAR alpha, bera und gamma. Sie sind Transkriptionsfaktoren, die zu der Superfamilie der nukleäreren Rezeptoren gehören, und werden durch endogene Liganden wie Fettsäuren und Eicosanoide aktiviert. Es wurde gezeigt, dass PPARalpha und –gamma antiinflammatorische Aktivität besitzen, die auf Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, glatte Muskelzellen und Endothellzellen wirkt. Ein Modell dazu ist eine durch PPARalpha und -gamma vermittelte Hemmung der proinflammatorischen Eigenschaften des nuklearen Faktor-kappaB (NF-kappaB) und des aktivierenden Proteins-1 (AP-1). Beides sind Transkriptionsfaktoren, die eine Schlüsselrolle bei der inflammatorischen Antwort spielen, indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren veranlassen. Die PPARs werden unter anderem in peripheren Blutzellen exprimiert. Da die Spiegel einiger endogener Aktivatoren der PPARs bei CF verändert zu sein scheinen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluss auf Expression und Funktion der PPARs untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Patienten mit CF untersucht, die sich in einem stabilen Zustand befanden und im Rahmen von Routineuntersuchungen in die Klinik kamen. Da die CF-Patienten in unserer Klinik nicht bronchoskopiert werden, konnte kein Versuchsmaterial aus den Atemwegen gewonnen werden. Dennoch gehen wir aufgrund der erhöhten Entzündungsmarker im Blut der CF-Patienten davon aus, dass die Entzündungsreaktionen nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Auch in unserer Studie zeigten sich erhöhte IL-8 Spiegel im Plasma von Patienten mit CF. Dies unterstützt die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und weist auf systemische proinflammatorische Vorgänge hin. Das Blut wurde über Venenpunktion erhalten. Monozyten, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten wurden isoliert und untersucht, da sie aufgrund der Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen und durch die Produktion von Antikörpern, wichtige Mediatoren in der Immunantwort sind. Die PPAR mRNA Expression wurde in Monozyten und Lymphozyten mittels RT-kompetitiver Multiplex PCR gemessen und mittels RT-Real-time PCR in neutrophilen Granulozyten. Die PPARgamma Spiegel in diesen Zellen lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Die statistische Analyse zeigte dass in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Gesunden PPARalpha mRNA, aber nicht PPARbeta mRNA, signifikant erniedrigt exprimiert wird (-37%). Die gleiche Differenz konnte auf Proteinebene mit Hilfe von Western Blots detektiert werden. Hinsichtlich der Expression von PPARalpha und PPARbeta zeigten sich in Monozyten und Neutrophilen zwischen CF-Patienten und Gesunden keine signifikanten Unterschiede. Unseren Daten werden von verschiedenen Studien unterstützt. Zum ersten gibt es Hinweise, dass PPARalpha mRNA- und Protein-Expression von ihren eigenen Liganden direkt reguliert werden. Bei Patienten mit CF zeigen sich für die natürlichen Liganden, Eicosanoide und Fettsäuren, veränderte Spiegel, wass zu einer verringerte Expression von PPARalpha beitragen könnte. Zum zweiten, da bekannt ist, dass die PPARalpha-Expression in proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten herunterreguliert ist, wurde zusätzlich überprüft, ob die Lymphozyten von CF-Patienten aktiviert sind. Interleukin-2 Rezeptor im Serum (sIL-2 R) ist ein allgemein anerkannter Marker der Aktivierung von Lymphozyten. Tatsächlich zeigte sich, dass die Konzentration von sIL-2 R im Serum der vorliegenden CF Patienten erhöht ist, was mit den Erkenntnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt 128-130. Die verstärkte Aktivierung von Lymphozyten in CF-Patienten könnte eine Erklärung für die erniedrigten PPARalpha-Spiegel bieten. Der verantwortliche Mechanismus dafür ist bis jetzt noch nicht bekannt. Drittens wurde für die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-alpha und IL-1 gezeigt, dass sie eine Reduktion der PPARalpha Expression verursachen können. CF-Patienten zeigen erhöhte Spiegel von IL-2, TNF-alpha, IL-6 und IL-8 im Sputum und Serum. Konsequenterweise kann die PPARalpha Expression durch die erhöhten Zytokinspiegel im Serum herunter reguliert werden. Eine weitere Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse ergibt sich aus einem Kongressbeitrag von Andersson et al., die über eine epitheliale CF-Zelllinie berichten, die weniger PPARalpha-Protein exprimiert als eine normale epitheliale Zelllinie. Dieselbe Forschungsgruppe fand erniedrigte PPARgamma-Spiegel im CF-Maus-Modell in Geweben, die speziell durch CFTR reguliert werden und ihre Daten weisen darauf hin, dass CFTR eine Rolle bei der PPAR Expression spielen kann. Ein funktionales CFTR-Protein wird auch in Lymphozyten von Gesunden exprimiert. Folglich könnte ein defektes CFTR auch in CF-Lymphozyten für die veränderterte PPARalpha-Expression verantwortlich sein. Ob die beschriebene Veränderung der Menge an PPARalpha mRNA und Protein auch auf funktioneller Ebene zum Tragen kommt, wurde durch immunhistometrische Untersuchungen und die Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors überprüft. Die immunhistometrischen Untersuchungen zeigten, dass PPARalpha sowohl bei Gesunden als auch bei CF-Patienten hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist und dass sich nur ein kleiner Teil im Nukleus befindet. Eine Quantifizierung war hierbei nicht möglich. Über eine ähnliche zelluläre Verteilung wurde in humanen Makrophagen wie auch in Mäuselymphozyten berichtet. Die DNA-Bindungstudien zeigten, dass die PPARalpha DNA-Bindungsaktivität in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Kontrollpersonen um 36% signifikant erniedrigt war. Eine erniedrigte DNA-Bindungsaktivität bei CFTR knock-out Mäuse wurde auch für PPARgamma berichtet. Die Bindungsaktivität konnte wiederhergestellt werden, nachdem die Mäuse mit Troglitazon, einem PPARgamma Agonist, behandelt wurden. Darüber hinaus werden mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die Veränderungen des Eicosanoidhaushalts bei CF zu der Verminderung sowohl der Expression als auch der Aktivität von PPARalpha beitragen. Hier ist besonders die bei CF verminderter Menge des PPARalpha–Liganden DHA hervorzuheben. Eine ligandeninduzierte Aktivierung von PPARalpha führt zu einer Abnahme verschiedener proinflammatorische Zytokine in Lymphozyten. Dies geschieht vermutlich über eine Antagonisierung der Aktivität von NF-kappaB. PPARalpha hat einen signifikanten Einfluss auf die Immunantwort. Somit könnte die bei CF-Patienten verminderte PPARalpha-Expression und -Funktion ursächlich oder mitverantwortlich für die inflammatorischen Vorgänge bei CF sein. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Regulierung der Aktivität von PPARalpha durch die Zugabe von DHA oder andere Liganden eine sinnvolle Therapieoption sein kann. Es sollte in weiterführenden Versuchen geklärt werden, ob eine Therapie mit PPARalpha-Aktivatoren einen Einfluss auf die inflammatorischen Vorgänge bei CF haben kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht ob CF einen Defekt in der Expression von 15-Lipoxygenase-1 (15-LO-1) verursacht. 15-LO-1 ist ein Schlüsselenzym für die Synthese einiger Eicosanoide wie z.B. 15(S)-HETE und Lipoxin A4. Beide Eicosanoide spielen eine wichtige Rolle in inflammatorischen Vorgängen in der menschlichen Lunge. 15(S)-HETE ist ein von der Arachidonsäure abgeleitetes Eicosanoid, das sich in hoher Konzentration in eosinophilen Granulozyten und Atemwegsepithelien findet. 15(S)-HETE wirkt in den Atemwegen stark mukosekretolytisch und bronchokonstriktorisch. Zum anderen inhibiert 15(S)-HETE die durch die 5-Lipoxygenase katalysierte Konversion von Arachidonsäure zu proinflammatorischen Mediatoren wie LTB4 in neutrophilen Granulozyten. Dies führt zu einer Reduktion der neutrophilen Chemotaxis. Es liegen bisher keine Daten zu 15-HETE-Spiegel in der CF-Lunge vor. Lipoxin A4 verursacht ebenfalls eine Reduktion der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, supprimiert darüber hinaus aber schon deren Aktivierung. Neben einer direkten Wirkung auf die neutrophilen Granulozyten, sind dabei auch indirekte Effekte beteiligt, wie zum Beispiel die Reduktion der broncho-epithelialen Ausschüttung von IL-8, als einem potenten Chemoattraktor und Aktivator neutrophiler Granulozyten. Tatsächlich ist die Konzentration des anti-inflammatorisch wirksamen LXA4 in der Atemwegsflüssigkeit von CF-Patienten reduziert. Die Expression von15-LO-1 in peripheren Blutzellen ist im Wesentlichen auf die eosinophilen Granulozyten beschränkt. Deren Funktion ist bei der zystischen Fibrose ebenfalls verändert: in CF Serum und Sputum misst man erhöhte Spiegel an eosinophilen granulären Proteinen, obwohl die Anzahl der Eosinophilen normal ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob im Rahmen der zystischen Fibrose Veränderungen der Expression der 15-LO vorliegen. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten nach der statistischen Auswertung, dass die intrazelluläre Expression der 15-LO-1 in eosinophilen Granulozyten von CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen keine Unterschiede aufweist. Dies schliesst nicht aus, dass Unterschiede der 15-LO-1 Expression zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im Atemwegsepithel zu finden wären, weil, eine erhöhte Expression der 15-LO-1 bei chronischer Bronchitis und Asthma bronchiale wurde beschrieben. Patientenmaterial für das Atemwegsepithel war jedoch nicht zugänglich und wurde von daher nicht untersucht.Funktion ist bei der zystischen Fibrose ebenfalls verändert: in CF Serum und Sputum misst man erhöhte Spiegel an eosinophilen granulären Proteinen, obwohl die Anzahl der Eosinophilen normal ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob im Rahmen der zystischen Fibrose Veränderungen der Expression der 15-LO vorliegen. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten nach der statistischen Auswertung, dass die intrazelluläre Expression der 15-LO-1 in eosinophilen Granulozyten von CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen keine Unterschiede aufweist. Dies schliesst nicht aus, dass Unterschiede der 15-LO-1 Expression zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im Atemwegsepithel zu finden wären, weil, eine erhöhte Expression der 15-LO-1 bei chronischer Bronchitis und Asthma bronchiale wurde beschrieben. Patientenmaterial für das Atemwegsepithel war jedoch nicht zugänglich und wurde von daher nicht untersucht.
Diese Dissertation befasst sich mit der massenspektrometrischen Analytik von Membranproteinen. Diese gestaltet sich aufgrund der hydrophoben Natur der Proteine und der damit verbundenen schlechten Löslichkeit in wässrigen Puffersystemen als deutlich schwieriger als die Untersuchung löslicher Proteine. Einige weitere Probleme entstehen durch die konsequente Verwendung der Referenzprotease Trypsin zur Hydrolyse der Proteine. Sie spaltet ausschließlich Peptidbindungen nach basischen Aminosäuren, die naturgemäß in den unpolaren Helixbereichen der Membranproteine nur vereinzelt anzutreffen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf weniger spezifischen Proteasen basierende Protokolle zur Analyse von ganzen Membranproteomen entwickelt, welche einige der ursprünglichen Probleme umgehen oder zumindest vermindern. Die Proteolysereaktion fand in Anwesenheit von Methanol statt, welcher die Membranstruktur destabilisiert und so die Zugänglichkeit der in die Membran eingebetteten Proteinteile für das Enzym erhöht. Zusätzlich erhöhte sich dadurch die Löslichkeit gebildeter hydrophober Peptide im Puffer. Das neue Protokoll wurde an Bacteriorhodopsin, einem geläufigen Modellsystem für α helikale Membranproteine, erfolgreich etabliert. Bei Verwendung der Proteasen Elastase und Pepsin konnten nach nLC-Trennung und MALDI-MS/MS deutlich mehr Peptide des Membranproteins signifikant identifiziert werden, als es mit Trypsin möglich gewesen ist. Auch qualitativ ergaben sich Unterschiede zwischen beiden Enzymen. Mit den alternativen Enzymen ließen sich nicht nur die hydrophilen peripheren Proteinabschnitte nachweisen, sondern auch zahlreiche Peptide aus den hydrophoben Transmembranbereichen. Das am Modellprotein etablierte Elastase-Protokoll konnte problemlos auf die Analyse des komplexeren Membranproteoms von Corynebacterium glutamicum transferiert werden. So konnten ca. 150 verschiedene Proteine identifiziert werden, darunter auch zahlreiche Membranproteine. Die erzeugten Peptidmischungen wurden nicht nur mittels nLC-MALDI-TOF/TOF sondern auch mit einer nLC-ESI-Orbitrap-Plattform analysiert. Anhand einer detaillierten Analyse der physikochemischen Eigenschaften der entstandenen Peptide konnte gezeigt werden, dass der dabei beobachtete Vorteil des ESI-Instrumentes zu großen Teilen auf die bessere Detektion aliphatischer Neutralpeptide zurückzuführen war. Diese werden bei der MALDI vornehmlich aufgrund der schlechteren Ionisation bei Verwendung der Standardmatrix α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure diskriminiert. Ein weiterer Vorteil des verwendeten ESI-Gerätes ist seine bessere Massengenauigkeit durch den hochauflösenden Orbitrap-Massenanlysator. Wurden die MALDI-TOF/TOF-Fragmentierungsdaten durch, auf einem zweiten Instrument gemessene, genaue MALDI-Orbitrap-Vorläufermassen supplementiert, konnten über 30% mehr Peptide signifikant identifiziert werden. Die gesammelten Daten konnten zur Erhebung einiger Statistiken über Elastase und Pepsin herangezogen werden. Erstmals wurde eine umfassende Untersuchung der Spaltspezifität von Elastase vorgenommen. Das Enzym hydrolysiert in ca. 82% der Fälle nach den kleinen hydrophoben Aminosäuren Ala, Val, Ile, Leu, Ser und Thr. Diese Spezifität ist für proteolytische Schnitte innerhalb der hydrophoben Helixbereiche von Membranproteinen äußerst vorteilhaft. Sie reicht aus, um Peptide Mass Fingerprinting an Einzelproteinen durchzuführen, wie exemplarisch am Modellprotein Bacteriorhodopsin gezeigt wurde. Die für Pepsin erhaltene Spezifität ist hingegen zu undifferenziert für solche Experimente, weshalb hier MS/MS-basierte Strategien vorzuziehen sind. Weitergehende Verbesserungen für Datenbanksuchen mit weniger spezifischen Proteasen wurden vorgeschlagen. Hierzu wurde erstmals eine größere Fragmentierungsstatistik eines nichttryptischen Datensatzes auf einem MALDI-Instrument erstellt, deren Aussage zur Verifizierung von Suchergebnissen in die Algorithmen implementiert werden kann. Beim Einsatz weniger spezifischer Proteasen erhöht sich im Vergleich zu Trypsin die entstehende Peptidkomplexität. Zur Kompensation dessen wurde eine Fraktionierung mittels Off-gel IEF vor der nLC-MALDI-Analyse etabliert. Zwecks direkter Kompatibilität zur nLC wurde ein Off-gel IEF-Protokoll ohne die Probeninjektion störendes Glycerol entwickelt. So ließ sich die dreifache Menge an Peptiden nachweisen, als mit ausschließlich eindimensionaler nLC-Trennung. In Verbindung mit den durch Trypsin erzielbaren Resultaten lassen sich mit den weniger spezifischen Enzymen viele Membranproteine umfassender charakterisieren, da zusätzlich die hydrophoben Transmembranbereiche und somit mehr Informationen für die Analytik zugänglich sind. Der gezielte Einsatz von alternativen Enzymen verbessert die momentane Situation in der Membranproteom-Analytik deutlich und führt diese einen weiteren Schritt an die Analytik löslicher Proteine heran.
Background: The oral administration of the gum resin extracts of Indian frankincense (Boswellia serrata Roxb. ex Colebr) results in very low plasma concentrations of boswellic acids (BAs), being far below the pharmacologically active concentrations required in vitro for anti-inflammatory activity. For that reason the use of Indian frankincense in clinical practice and pharmaceutical development has substantially lagged behind. Recently the application of new formulation technologies resulted in a formulation of frankincense extract with lecithin, which revealed improved absorption and tissue penetration of BAs in a rodent study, leading for the first time to plasma concentrations of BAs in the range of their anti-inflammatory activity.
Purpose: In order to verify these encouraging results in humans, the absorption of a standardized Boswellia serrata extract (BE) and its lecithin formulation (CSP) was comparatively investigated in healthy volunteers.
Study design: According to a randomized cross-over design with two treatments, two sequences and two periods, 12 volunteers alternatively received the lecithin-formulated Boswellia extract (CSP) or the non-formulated Boswellia extract (BE) at a dosage of 2 × 250 mg capsules.
Methods: The plasma concentrations of the six major BAs (KBA, AKBA, βBA, αBA, AβBA, AαBA) were determined using LC/MS.
Results: With the exception of KBA, a significantly higher (both in terms of weight-to-weight and molar comparison) and quicker absorption of BAs from the lecithin formulation was observed, leading to Cmax in the range required for the interaction with their molecular targets.
Conclusion: These findings pave the way to further studies evaluating the clinical potential of BAs, and verify the beneficial effect of lecithin formulation to improve the absorption of poorly soluble phytochemicals.
Life-saving pig-to-human xenotransplantation is a promising technology with the potential to balance the shortage of human organs in allotransplantation. Before this approach is applied on solid vascularized organs, several barriers must be overcome. Patient safety is menaced by infectious porcine endogenous retroviruses (PERV) which are able to infect human cell lines in vitro. Successful infection with PERV is associated with diverse life-threatening consequences including gene disruption, tumorigenicity, immune suppression as well as PERV proliferation throughout the whole human body. This could cause a catastrophic xenozonoosis leading to the emergence of new forms of pathogens and pandemic diseases similar to AIDS. However, in vivo, there is hitherto no incidence of any infection with PERV in preclinical xenotransplantations performed in the past.
PERV infection of human peripheral blood mononuclear cells (huPBMC) is a critical issue discussed controversially in several studies. It is essential to address the sensitivity of huPBMC to infection by PERV since it is generally one of the first retroviral targets upon viral invasion and infection of the human body. To assess definitely if huPBMC are infected productively by PERV, target cells were challenged with the highest infectious PERV class, recombinant PERV-A/C, in different assays. Modern and standard methods to detect PERV at different stages of viral cycles were used to monitor PERV development upon contact with host cells. Indeed, PERV-A/C in supernatants of producer cell lines failed to infect mitogen-activated huPBMC. Neither retroviral reverse transcriptase (RT) nor viral RNA packaged in virus particles were observed in supernatants of cells exposed to viral supernatants. In addition, provirus was not detected in huPBMC until 56 days p. i. with PERV-A/C. Independently of the virus load applied, culture conditions of huPBMC or administration of polybrene as enhancer, PERV was unable to infect huPBMC. Results suggest that PERV in supernatants lack sufficient infectious potential to be productively generated in huPBMC.
In order to approximate xenotransplantation scenarios, different PERV producing cells including PHA-activated porcine PBMC (poPBMC) were adopted as virus source in co-cultivation studies with huPBMC. In this case, expression of viral RNA was successfully measured. However, RT activity did not increase until 28 days p. e. with PERV producer cells which indicates that viral particles devoid of infectious capacity were released from non-productively infected cells.
On the other hand, co-cultivation of both virus producer and virus recipients increases the contact pressure between PERV and target cells. Consequently, PERV was able to be detected at least as provirus in huPBMC. Although virions produced were not functional, presence of provirus in infected cells will sooner or later provoke expression of provirus. This could lead to chromosomal rearrangements as well as virus reinfection and insertional mutagenesis.
Ecotropic PERV-C displays a restricted host range to porcine cells. Given its ability to serve as template to form recombinant xenotropic PERV-A/C, PERV-C represents a potent hazard in the course of xenotransplantation. Thus, isolation and functional characterization of PERV-C in the genome of pigs in use and intended for xenotransplantation is necessary to analyze the genetics of these virions as well as to select animals lacking proviral PERV-C or to generate transgenic PERV-C negative donors.
PERV-C was isolated from the genome of a female SLAd/d haplotype pig via screening of a bacteriophage library which was constructed from the genomic DNA of poPBMC extracted from this PERV non-transmitting sow. Upon genetic complementation of provirus using a PCR fragment infectious ability of full-length PERV-C clones was investigated in cell culture. PERV-C clones were successfully reproduced in susceptible porcine cells as RT activity as well as viral RNA were detected in supernatants of infected cells 56 days p. i. Furthermore, presence of proviruses in challenged cells was confirmed by nested PCR.
PERV-C clones were also isolated from a bacteriophage library generated on genomic DNA of an Auckland island pig of the DPF colony, whose individuals display a PERV-null phenotype and are already in use for xenotransplantation, and of a Göttingen minipig, whose relatives serve as animal models to study human diseases. In contrast to PERV clones isolated from the female SLAd/d haplotype sow PERV-C clones of the Auckland island pig as well as of the Göttingen minipig were not functional and therefore unable to infect target cells. This confirms the PERV-null phenotype which renders these animals putative candidates as donors in xenotransplantation. On the other hand, presence of functional PERV-C in SLAd/d haplotype pigs exerts a negative impact on patient safety in xenotransplantation. The suitability of these animals as potent organ donors should be intensively investigated.
In conclusion, PERV of all classes pose a virological risk in xenotransplantation which should not be ignored. Since exclusion of all PERV from donor herds is impossible, generation of transgenic humanized animals lacking genomic infectious PERV represents the best strategy to guarantee patient safety in future life-saving pig-to-human xenotransplantation.
Electrospinning is an advanced method for the generation of polymer-based fibers. This fabrication technique has gained great interest in the biomedical field in recent years due to its straightforward application and significant versatility of the resulting fiber mats. The process is carried out by dissolving a (biologically or synthetically derived) polymer or a combination of several polymers in a suitable inorganic or organic solvent and transferring these solutions into a syringe with a needle tip as a spinneret. The power source is connected to the syringe tip, allowing for the application of a high voltage to the polymer solution, and a metallic collector, often a rotating drum cylinder on which the yielded polymer fibers are deposited. The usual fiber diameters range between nano- and micrometers. The yielded fiber mats have distinct characteristics, such as a large surface area, mechanical stability, and good encapsulation efficiency. Therefore, the fiber mats can be used as a topical dosage form for a multitude of diseases (e.g., conjunctivitis, keratitis), as they can be easily applied on or into the human body to release the drug for a prolonged period of time. In addition, the fibers exhibit a high degree of resemblance with the human extracellular matrix, which consists predominantly of collagen fibrils. Therefore, the obtained fiber mats can also be employed as innovative substrates for the cultivation of cells. As a result, electrospinning is suitable for a wide range of applications in the biomedical context, specifically for the targeted, topical delivery of bioactives and also as a cell culture substrate for the cultivation of cells in an enhanced in vivo relevant situation.
One objective of this work was the development and characterization of drug-loaded electrospun fibers for application to the inflamed and infected eye to complement the existing therapy of eye drops as well as systemic administration of anti-infectives. In particular, the focus of the project was the development of ocular implants to treat a herpes simplex infection affecting the human cornea. Additionally, electrospun fibers, which immediately dissolve in the tear fluid upon application and prolong the contact time of the bioactives at the eye, were developed as a topical dosage form to treat bacterial conjunctivitis. An additional objective of this work was the development of electrospun fiber mats as an innovative substrate for the cultivation of human induced pluripotent stem cells to mimic the human blood-brain barrier in vitro. The final objective of the present work was establishing an analytical concept for the comprehensive characterization of electrospun fibers to obtain a greater comparability and reproducibility of data and results from different laboratories.
Herpes simplex keratitis is a viral disease of the cornea that can potentially lead to blindness. This disease commonly occurs after corneal transplantation. As the cornea is the most transplanted tissue worldwide, the incidence of this disease varies from 4.9% to 12.6% (high- and low-income countries). The current therapy involves the application of eye drops as many as six times a day, and in severe cases, the systemic use of antiviral agents is necessary but can cause serious side effects (e.g., renal failure). To prevent the occurrence of herpes simplex keratitis after transplantation, a biodegradable electrospun nanofiber mat with a sustained release of acyclovir was established. The rational development of the fibers was facilitated by correlating the surface wettability with the release kinetics of the individual polymers, which allowed for the successful generation of fiber mats releasing the bioactive acyclovir over three weeks. The molecularly dispersed drug is present as an amorphous solid dispersion within the PLGA-based polymer matrix. Evaluating the cell viability in in vitro models proved that neither acyclovir nor the polymers or the generated fiber mats caused any cytotoxicity. The mechanical stability of the fiber mats was evaluated to ensure adequate handling of the fibers during implantation. The findings demonstrated that the fiber mats exhibit direction-independent mechanical properties, and their mechanical load-bearing capacity is greater than that of an excised human cornea. As a result, the fiber mats are suitable for surgical implantation into the anterior chamber of the eye. An in vitro model of human keratinocytes was infected with herpes simplex virus to demonstrate the antiviral efficacy of the electrospun fiber mats. Immunostaining for two specific viral proteins demonstrated the spread of infection in the model. Hereby, it was found that the placebo- and drug-loaded fibers significantly slowed the spread of infection, which was quantified by plaque assay determination. This experiment revealed that the electrospun fibers exert a synergistic antiviral effect by simultaneously releasing acyclovir, which is a virustatic agent that inhibits the replication of the virus in infected cells, and adsorbing released viral particles onto the surface of the polymer fibers. This reduces the overall burden of released viral particles, which is associated with the severity of the infection outbreak. Thus, with the aid of electrospinning, an ocular implant was successfully generated, which is biodegradable over time and significantly reduces the viral particle burden in vitro. Hence, the fibers represent a potential alternative for the prevention of herpes simplex keratitis after corneal transplantation...
In dieser Arbeit wurde das Potential des rekombinant in E. coli hergestellten und unter Hochsalzbedingungen in-vitro assemblierten, murinen VP1-Kapsoids als Antisense-Oligonukleotid-Transfersystem in humane Brustkrebszellen untersucht. Die verwendeten Antisense-Oligonukleotide sind gegen den in 25-30 % aller Brustkrebsfälle überexprimierten Wachstumsfaktorrezeptor Pl85erbB-2 gerichtet, der zu einer verschlechterten Prognose in Bezug auf die Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit und das Wiederauftreten des Carcinoms führt. Die Charakterisierung der VP1-Kapsoide als Oligonukleotid-Transfersystem wurde zum einen in Bezug auf den Zelltransfer des Trägers und die mit ihm transportierten Antisense-Oligonukleotide durchgeführt. Zum anderen erfolgte die Überprüfung der resultierenden Antisense-Wirkung der Oligonukleotide sowohl in einem unspezifischen Proliferations- als auch in einem Antisense-Assay, das zwischen sequenzspezifischen und sequenzunspezifischen Oligonukleotid-Wirkungen differenzieren kann. Für die VP1-Kapsoide wurde in den untersuchten humanen Brustkrebszelllinien eine identische Lokalisierung detektiert wie sie für die murinen Targetzellen beschrieben ist. Es kommt zu einer cytosolischen Anreicherung mit perinukleären. vesikulären Strukturen ohne nachweisbare nukleäre Lokalisierung. Die durch VP1-Kapsoide transportierten Oligonukleotide dissoziieren intrazellulär in einem Zeitraum von 3 h nahezu vollständig vom Transfersystem und reichem sich cytosolisch und nukleär an. Zur Testung der biologischen Aktivität der Antisense-Oligonukleotide wurden liposomaltransportierte Oligonukleotide verwendet, da die Beladungsrate der VP1-Kapsoide unter Mediumbedingungen zu gering ist. Im Proliferationsassay wird die Oligonukleotid-Wirkung anhand der resultierenden Proteinreduktion charakterisiert. Die geringe Spezifität dieses Assays wurde durch die Einführung von einer Kontrollzelllinie und Kontroll-Oligonukleotid-Modifikationen verbessert. Die im Proliferationsassay mit Antisense-Oligonukleotiden detektierten Oligonukleotid-Wirkungen beweisen noch nicht, ob eine sequenzspezifische Antisense-Wirkung vorliegt. Deshalb wurde die Sequenzspezifität der verwendeten Antisense-Sequenzen zusätzlich im Antisense-Assay bestätigt. Die etablierten Testsysteme stellen alle Optionen zur umfassenden Charakterisierung eines innovativen Transfersystems zur Verfügung. Die Transfer-Assays untersuchen den verbesserten Zelltransfer des Trägers gegenüber freien Oligonukleotiden und alternativen Trägern. Das Proliferationsassay ermöglicht ein Vorscreening auf Antisense-Wirkungen und reduziert somit die Probenanzahl für das letztendlich notwendige Antisense-Assay.
Ca2+-aktivierte Kaliumkanäle mit großer Leitfähigkeit (MaxiK oder BK Kanäle) sind als Schlüsselelemente an der Regulation der elektrischen Aktivität vieler erregbarer Zellen beteiligt. Die duale Steuerung dieser Kanäle durch die intrazelluläre Kalziumkonzentration und das Membranpotential macht MaxiK Kanäle zu effektiven Integratoren multipler zellulärer Signalprozesse. Der MaxiK Kanal der glatten Gefäßmuskulatur ist entscheidend an der Repolarisierung von glatten Muskelzellen und der Terminierung des Kalziumeinstromes während der Vasokonstriktion beteiligt. Zahlreiche Arbeiten, u.a. an b1-Knock-out Mäusen (Brenner et al., 2000b) und humanen genetischen Variationen des b1-Gens (Amberg & Santana, 2003) belegen die wichtige Rolle des MaxiK Kanals für die Kontrolle des systemischen Blutdruckes in Säugern, einschließlich des Menschen (Nelson & Bonev, 2004; Amberg et al., 2003). Aktivierung des vaskulären MaxiK Kanals könnte somit ein neues therapeutisches Prinzip zur Behandlung des Bluthochdrucks und seiner Folgeerkrankungen darstellen. Als pharmakologische Zielstruktur besonders interessant wird der vaskuläre MaxiK Kanal durch seine gewebespezifische Zusammensetzung aus a- und b1-Untereinheit und die Möglichkeit diese Kombination selektiv zu aktivieren (Tanaka et al., 1997; McManus et al., 1993). In der vorliegenden Arbeit wurde ein induzierbares Zellmodell charakterisiert, welches die MaxiKa und -b1 Untereinheiten bicistronisch unter der Kontrolle eines Tetrazyklin-sensitiven Promotors exprimierte. Die Untersuchungen ergaben, dass in diesem System funktionelle MaxiK Kanäle, die sich äquivalent zu nativen vaskulären MaxiK Kanälen verhielten, detektiert werden konnten. Im Vergleich zu anderen heterologen Expressionsmodellen zeichneten sich die induzierbaren Zelllinien durch eine große Stabilität und Reproduzierbarkeit der MaxiK Expression aus. Beide Eigenschaften sind wichtige Voraussetzungen für den Einsatz dieser Zelllinien im Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung neuer MaxiK Aktivatoren. Die Nutzbarkeit dieses Testsystems zur Identifizierung von solchen Verbindungen wurde weiterhin durch die Untersuchung bekannter und neuer aktivierender Substanzen bestätigt. Dabei zeigte sich, dass insbesondere das Benzimidazolon CGS7181 sowie das Dehydroabietinderivat Pimarinsäure den Kanal potent aktivierten. Durch fluorimetrische Kalziummessungen konnte nachgewiesen werden, dass CGS7181 neben MaxiK-aktivierenden Eigenschaften auch einen potenten Ionophor für Ca2+ darstellt und damit wahrscheinlich keinen vielversprechenden Ausgangspunkt für die Entwicklung eines neuen Antihypertensivums darstellt. Unter Benutzung der CHO-Trex-MaxiK-a+b1-Zelllinie wurden inzwischen in der Screening- Abteilung von Sanofi-Aventis im Hochdurchsatzverfahren über 700 Strukturen mit aktivierender Wirkung auf den MaxiK Kanal identifiziert. Mit diesem Ergebnis ist eine solide Grundlage geschaffen, um im weiteren Verlauf des Projektes die Suche nach neuen blutdrucksenkenden Molekülen erfolgreich voranzutreiben. Zur weiteren molekularen Validierung der Zielstruktur MaxiK wurde eine bisher nicht beschriebene Spleißvariante, aDS8, die auch in kardiovaskulären Geweben exprimiert ist, untersucht. Die transiente Expression in HEK293-Zellen führte zu signifikanten, aber im Vergleich zum MaxiK-a-wt geringen Kaliumströmen. Immunfluoreszenz-Experimente zeigten eine Retention des Proteins im Zellinneren, ohne dass eine Translokation in die Plasmamembran oder in distinkte Kompartimente gezeigt werden konnte. Dies galt auch für die Expression in primären Glattmuskelzellen und der Endothelzelllinie EAhy926. Eine Beteiligung der S8-Domäne an der Assemblierung der neuen Spleißvariante konnte durch den biochemischen Nachweis von aDS8-Homomultimeren ausgeschlossen werden. Überraschenderweise wurde jedoch keine Interaktion von MaxiK-aDS8 und der Wildtyp-a-Untereinheit beobachtet. Man kann daher vermuten, dass die S8-Domäne eine Rolle beim Kanaltransport spielt und möglicherweise in distinkten Zelltypen eine Wechselwirkungsfläche für bislang unbekannte Interaktionspartner bildet.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des HIV-Protease-Inhibitors Saquinavir und seines Derivates Saquinavir-NO auf die ABC-Transporter vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Saquinavir-NO zeigte in drei verschiedenen Tumorentitäten stärkere zytotoxische Wirkung als Saquinavir. Weder die Expression der ABC-Transporter MDR1 oder BCRP1 noch der zelluläre p53-Status hatten einen Einfluss auf die Zellsensitivität. MDR1-exprimierende chemoresistente Tumorzellen wurden durch Saquinavir-NO stärker gegen ausgewählte Zytostatika resensitiviert als durch Saquinavir. An chemosensitiven MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Des Weiteren wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensiti-vität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Saquinavir-NO stärker erhöht als durch Saquinavir. Am Durchflusszytometer wurde der Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf die intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123 untersucht. In MDR1-exprimierenden Zelllinien führte Saquinavir-NO zu einer deutlich stärkeren Akkumulation von Rhodamin 123 als Saquinavir. In MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Mit Hilfe des MDR1-ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Saquinavir und Saquinavir-NO als Substrate oder als allosterische Inhibitoren für MDR1 fungieren. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass sowohl Saquinavir als auch Saquinavir-NO jeweils ein Substrat für MDR1 darstellen. Um den Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf den ABC-Transporter BCRP1 zu untersuchen, wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für BCRP1 transduziert. Die BCRP1-transduzierten Zellen wurden durch Saquinavir und Saquinavir-NO in vergleichbarem Ausmaß zu dem BCRP1-Substrat Mitoxantron sensibilisiert. Saquinavir-NO ist somit im Vergleich zu Saquinavir der deutlich potentere MDR1-Inhibitor, während beide Substanzen gleichermaßen BCRP1 beeinflussten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des MDM2-Inhibitors Nutlin-3 auf die ABC-Transporter-vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Nutlin-3 zeigte aufgrund seiner Funktion als MDM2-Inhibitor an Zellen mit Wildtyp-p53 stark zytotoxische Effekte. An Zellen mit einer p53-Mutation oder an Zellen, die p53-negativ sind, waren diese Effekte nicht zu beobachten. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte in p53-Wildtypzellen zur Induktion diverser p53-Zielgene (p21, MDM2, GADD). In Zellen mit mutiertem p53 blieb diese Induktion nach Nutlin-3-Behandlung aus. Chemoresistente MDR1-exprimierende Tumorzellen wurden durch Nutlin-3 stark gegen ausgesuchte Zytostatika resensitiviert. Des Weiteren wurde die chemosensitive, p53-mutierte (Nutlin-3-insensitive) und MDR1-negative Rhabdomyosarkomzelllinie RH30 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensitivität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Nutlin-3 stark erhöht. Am Durchflusszytomter zeigte sich in MDR1-exprimierenden Zellen durch Behandlung mit Nutlin-3 eine signifikant erhöhte intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123. In MDR1-negativen Zellen wurde dieser Effekt nicht beobachtet. Mit Hilfe des ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Nutlin-3 als Substrat oder als allosterischer Inhibitor für MDR1 fungiert. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass Nutlin-3 ein Substrat für MDR1 darstellt. Nutlin-3 ist ein Racemat und wurde in allen Versuchen als solches verwendet. Das Enantiomer Nutlin-3a hemmt die MDM2-p53-Interaktion als aktives Enantiomer ca. 150-fach stärker als Nutlin-3b. Im letzten Schritt der vorliegenden Arbeit wurde Nutlin-3 in seine Enantiomere Nutlin-3a und Nutlin-3b aufgetrennt und beide Enantiomere wurden im Hinblick auf ihre Wirkung auf MDR1 untersucht. Dabei wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Enantiomeren festgestellt. Nutlin-3a und Nutlin-3b interferieren demnach zu gleichen Teilen mit MDR1. Um den Einfluss von Nutlin-3 auf den ABC-Transporter MRP1 zu untersuchen, wurde mit zwei verschiedenen Zellmodellen gearbeitet. In beiden Zellmodellen zeigte sich, dass Nutlin-3 auch den MRP1-vermittelten Efflux der fluoreszierenden Substrate Rhodamin 123 und Calcein-AM inhibiert. Der Befund, dass Nutlin-3 mit der MDR1- und MRP1 vermittelten Chemoresistenz interferiert, ist neu und eine wichtige Information für die Bewertung der beginnenden klinischen Studien zur Untersuchung von Nutlin-3 als antitumorale Substanz.
G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute an important class of integral membrane proteins that are involved in several signaling pathways. About 50% of the currently available drugs are targeted against these receptors and high-resolution structures of these receptors will be of immense importance from the perspective of designing specific and potent drugs. However, structure determination of these receptors and of membrane proteins in general, has been a very challenging task till date. A major limitation in the structure determination of these proteins is that they are present in minute amounts in the native tissues and therefore, they must be produced heterologously. Additionally, crystallization of GPCRs is difficult owing to their flexible nature and limited hydrophilic surface area available for crystal contacts. The aim of my Ph.D. thesis work is two fold, first, to address the problem of GPCR crystallization by using a fusion protein complex approach and second, to tailor Rhodobacter sphaeroides as an expression system for the heterologous production of GPCRs. In the first approach, R. sphaeroides was used as an expression system to generate a fusion protein complex of the photosynthetic reaction center (RC) with a GPCR, expecting that such a complex would be easier to crystallize than the receptor alone. The notion behind this approach is that the RC will act as a scaffold in providing surface area to create crystal contacts and at the same time, it will also reduce the flexibility of the receptor, hopefully without perturbing the functionality of the receptor. Based on the computational modelling experiments, two ways to generate a fusion complex were assigned. Long linkers were inserted between the subunits of the RC and the GPCR. The linkers were designed with a possibility of straightforward alteration of their length as they contained a number of restriction enzyme sites. A series of these constructs were designed and expressed in R. sphaeroides deletion strain, which did not possess the chromosomal RC genes. Though most of these fusion constructs could be successfully expressed, as analyzed by western blot, majority of them were not functional in terms of ligand binding of the GPCR component of the fusion complex. Interestingly, one of these constructs, where the M subunit of RC was directly fused to the human angiotensin II type 1a receptor (AT1aR), exhibited significant functional expression. Based on saturation binding analysis using [125I] iodotyrosyl4Sar1Ile8-angiotensin II (an AT1aR subtype specific antagonist), an expression level of 40+5 pmol/mg of total membrane protein was calculated. This expression level corresponds to approximately 0.3 mg of functional receptor per liter culture and it is significantly higher than the AT1aR expression in native tissues. Additionally, the binding affinity of the recombinant receptor for its endogenous ligand angiotensin II was found to be 1±0.1 nM, which is similar to that observed for the AT1aR in native tissues. More interestingly, the RC part of the fusion complex was structurally assembled in other words, properly folded as judged by the presence of the characteristic peaks at 760 nm, 800 nm and 850 nm by absorption spectroscopy. However, a slight change in the intensity of the peak at 800 nm was observed while comparing the spectra of native RC with that in the fusion protein complex. This slight variation might be due to the change in the protein environment. The fusion protein complex RC-AT1aR was functionally solubilized and purified using a decahistidine tag fused at the c-terminus of the AT1aR. Subsequently, the monodispersity and integrity of the complex was confirmed by size exclusion chromatography, which revealed a homogeneous peak. Additionally, it was also possible to solubilize and purify this complex in the presence of a fluorescein tagged angiotensin II ligand which provides a nice tool to judge the functionality of the AT1aR and integrity of the complex at the same time. The purified RC-AT1aR fusion complex was then subjected to three-dimensional (3-D) crystallization trials and it was possible to obtain reproducible crystals of this complex. The crystals were fluorescent (as the complex was purified in presence of fluorescently labelled angiotensin II) and needle or tetragonal in shape, but produced a powdery diffraction pattern. Further attempts to improve the crystallization condition and to optimize the cryo-conditions are underway. In addition, attempts are also being made to obtain the crystals of this complex with the antagonist (e.g. losartan) bound to the receptor. In view of several limitations in the heterologous expression of GPCRs, as the second part of my Ph.D. thesis, I decided to explore the possibilities of developing a novel expression system based on R. sphaeroides for production of recombinant GPCRs. The notion behind using this host is that lack of inclusion bodies and high concentration of membranes in R. sphaeroides would result in efficient functional overexpression of recombinant membrane proteins. For this purpose, a R. sphaeroides strain, modified by the deletion of the genes encoding the RC and the light harvesting proteins LH1 and LH2, was used. The genes for RC and LHs constitute about 85-90% of total membrane proteins in a R. sphaeroides cell. These membranes are normally housed in special membrane vesicles called intracytoplasmic membranes (ICMs) that can fill almost the entire cell volume under certain growth conditions. Synthesis of a heterologous protein under the control of the moderately strong photosynthetic superoperonic promoter should be coordinated with the synthesis of new membranes to harbour these proteins, thus acting as a natural induction system. Moreover, as most of the native membrane proteins are absent in this deletion strain, heterologously produced protein should not experience a shortage of molecular chaperones for proper folding and insertion. Additionally, the absence of inclusion bodies in this host should enhance the functional and homogenous population of the recombinant proteins. Three human GPCRs, namely the adenosine A2a receptor (A2a), the angiotensin II type 1a receptor (AT1aR) and the bradykinin subtype 2 receptor (B2R) were tested for expression and functionality in this system. Two different constructs were used to determine the optimal position and ribosome-binding site (RBS) in the superoperon for the highest expression level. Of these three receptors, the AT1aR and B2R were successfully produced, while the A2aR failed to express, producing green carotenoid free R. sphaeroides mutants, for unknown reasons. For the recombinant B2R, [3H] bradykinin binding analysis revealed a low functional expression level of 0.7-0.8 pmol/mg of total membrane protein. This expression level corresponds to 0.01 mg functional receptor per liter of culture and is not sufficient for large-scale expression of this receptor. However, for the recombinant AT1aR, [125I] iodotyrosyl4Sar1Ile8- angiotensin II binding analysis revealed an expression level of 12±1 pmol/mg of total membrane protein. This expression level corresponds to approximately 0.1 mg functional receptor per liter culture and this is significantly higher than the AT1aR expression in native tissues. This expression system is still in the nascent stages of development and there are several parameters, which are still to be assessed for the optimal use of this system for the production of GPCRs and other membrane proteins. In conclusion, my Ph.D. work presents a novel fusion protein complex based approach for obtaining crystallizable GPCRs and a novel expression system for producing heterologous GPCRs. It was possible, for the first time, to produce a functional RC-GPCR complex that could easily be crystallized, though further finetuning of the system is required. R. sphaeroides based novel expression system was successfully used to produce functional human GPCRs under the control of a moderately strong photosynthetic superoperonic promoter. This expression system represents a naturally induced system where the expression of a heterologous protein is coordinated with the synthesis of new membranes to harbour the recombinant protein. The fusion protein complex approach and the expression system presented here can hopefully be used as a general method to facilitate the expression and crystallization of other membrane proteins.
Poster presentation at 5th German Conference on Cheminformatics: 23. CIC-Workshop Goslar, Germany. 8-10 November 2009 We demonstrate the theoretical and practical application of modern kernel-based machine learning methods to ligand-based virtual screening by successful prospective screening for novel agonists of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) [1]. PPARgamma is a nuclear receptor involved in lipid and glucose metabolism, and related to type-2 diabetes and dyslipidemia. Applied methods included a graph kernel designed for molecular similarity analysis [2], kernel principle component analysis [3], multiple kernel learning [4], and, Gaussian process regression [5]. In the machine learning approach to ligand-based virtual screening, one uses the similarity principle [6] to identify potentially active compounds based on their similarity to known reference ligands. Kernel-based machine learning [7] uses the "kernel trick", a systematic approach to the derivation of non-linear versions of linear algorithms like separating hyperplanes and regression. Prerequisites for kernel learning are similarity measures with the mathematical property of positive semidefiniteness (kernels). The iterative similarity optimal assignment graph kernel (ISOAK) [2] is defined directly on the annotated structure graph, and was designed specifically for the comparison of small molecules. In our virtual screening study, its use improved results, e.g., in principle component analysis-based visualization and Gaussian process regression. Following a thorough retrospective validation using a data set of 176 published PPARgamma agonists [8], we screened a vendor library for novel agonists. Subsequent testing of 15 compounds in a cell-based transactivation assay [9] yielded four active compounds. The most interesting hit, a natural product derivative with cyclobutane scaffold, is a full selective PPARgamma agonist (EC50 = 10 ± 0.2 microM, inactive on PPARalpha and PPARbeta/delta at 10 microM). We demonstrate how the interplay of several modern kernel-based machine learning approaches can successfully improve ligand-based virtual screening results.
Background Translocations of the Mixed Lineage Leukemia (MLL) gene occur in a subset (5%) of acute myeloid leukemias (AML), and in mixed phenotype acute leukemias in infancy - a disease with extremely poor prognosis. Animal model systems show that MLL gain of function mutations may contribute to leukemogenesis. Wild-type (wt) MLL possesses histone methyltransferase activity and functions at the level of chromatin organization by affecting the expression of specific target genes. While numerous MLL fusion proteins exert a diverse array of functions, they ultimately serve to induce transcription of specific genes. Hence, acute lymphoblastic leukemias (ALL) with MLL mutations (MLLmu) exhibit characteristic gene expression profiles including high-level expression of HOXA cluster genes. Here, we aimed to relate MLL mutational status and tumor suppressor gene (TSG) methylation/expression in acute leukemia cell lines. Results Using MS-MLPA (methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification assay), methylation of 24 different TSG was analyzed in 28 MLLmu and MLLwt acute leukemia cell lines. On average, 1.8/24 TSG were methylated in MLLmu AML cells, while 6.2/24 TSG were methylated in MLLwt AML cells. Hypomethylation and expression of the TSG BEX2, IGSF4 and TIMP3 turned out to be characteristic of MLLmu AML cell lines. MLLwt AML cell lines displayed hypermethylated TSG promoters resulting in transcriptional silencing. Demethylating agents and inhibitors of histone deacetylases restored expression of BEX2, IGSF4 and TIMP3, confirming epigenetic silencing of these genes in MLLwt cells. The positive correlation between MLL translocation, TSG hypomethylation and expression suggested that MLL fusion proteins were responsible for dysregulation of TSG expression in MLLmu cells. This concept was supported by our observation that Bex2 mRNA levels in MLL-ENL transgenic mouse cell lines required expression of the MLL fusion gene. Conclusion These results suggest that the conspicuous expression of the TSG BEX2, IGSF4 and TIMP3 in MLLmu AML cell lines is the consequence of altered epigenetic properties of MLL fusion proteins.
The liver as the biggest endocrine gland of the human body plays a central role in many metabolic pathways such as detoxification, storage of carbohydrates and distribution of lipids. As the liver receives blood supply from the gut by the portal vein, liver cells are often challenged with high concentrations of nutrients and components of our commensal microbiota. Therefore, the immune system of the liver induces a tolerant state, meaning no or low inflammatory reactions to those constant stimuli. Yet, as various pathogens target the liver, the hepatic immune system also needs the capability to induce strong immune responses quickly. Chronical damage to the liver, which can be caused by alcohol, pathogens or toxins, might lead to liver cirrhosis, where the amount of functional liver tissue is decreased dramatically. This pathology can worsen and lead to acute-on-chronic liver failure, whose high mortality is due to high inflammation and multi-organ failure. Interleukin-7 is a cytokine known for its pro-survival functions especially in lymphopoiesis. However, it is also very important for maintenance of mature immune cells in the liver. As mouse experiments have demonstrated an induction of Interleukin-7 in the liver as a response to bacterial lipopolysaccharide, we aimed to characterize the role of Interleukin-7 in hepatic immunoregulation in both health and disease.
The experiments were mostly based on in vitro approaches. Induction of Interleukin-7 in liver cells was analyzed using ELISA, quantitative PCR, and Immunoblotting. Knockdown of signal transduction components was performed by siRNA transfection. Primary immune cells isolated from healthy donor buffy coat were studied for their ability to respond to Interleukin-7. Activation of downstream signal transduction was assessed by Immunoblotting. Functional consequences of Interleukin-7 signaling, such as alterations in cellular metabolism, cellular survival and endotoxin tolerance, were studied in monocyte-derived macrophages. Finally, serum concentrations of Interleukin-7 and frequencies of Interleukin-7 receptor positive immune cells were quantified in patients with compensated or decompensated liver cirrhosis or acute-on-chronic liver failure.
Interleukin-7 expression could be observed in human hepatic cell lines and primary hepatic sinusoidal endothelial cells when stimulated with IFNα or IFNγ, but not IFNλ. IRF-1 was identified as a key regulator of Interleukin-7 expression, as its transcription, translation and nuclear translocation were induced and enhanced upon IFNα or IFNγ, but not IFNλ treatment. We identified LPS-primed macrophages as innate immune target cells of Interleukin-7, which responded by an inhibitory phosphorylation of GSK3. This signal transduction led to enhanced production of pro-inflammatory cytokines and abolished endotoxin tolerance. In parallel, cellular fitness was reduced as demonstrated by reduced intracellular ATP concentration and intracellular WST-1 staining. Finally, we could identify components of the in vitro signal transduction also in liver cirrhosis patients. However, Interleukin-7 serum concentrations were significantly in liver cirrhosis patients compared to healthy controls. In addition, the frequencies of Interleukin-7 receptor positive immune cell populations differed in patients and controls.
We identify Interleukin-7 as a pro-inflammatory cytokine in hepatic immunoregulation. It is part of a cascade where its induction is regulated by type I and type II Interferons and mainly restricted by the presence of IRF1. We demonstrate the importance of Interleukin-7 also for innate immune cells, where the abolishment of endotoxin tolerance may provide an interesting strategy of liver cirrhosis patients. In addition, reduced viability of macrophages in response to Interleukin-7 is a striking contrast to the well-described survival functions in lymphocytes. The decrease of serum Interleukin-7 levels and alterations of Interleukin-7 receptor positive immune cell populations suggest an important role for Interleukin-7 also in the diseased liver. Due to the identified mechanisms of action, Interleukin-7 may be an interesting candidate for immunotherapeutic approaches of liver cirrhosis and acute-on-chronic liver failure.
Taspase1 ist eine Threonin-Aspartase, die das MLL-Protein an zwei konservierten Erkennungssequenzen (CS1 und CS2) hydrolysiert. Die daraus entstehenden Spaltprodukte, p320N und p180C bilden ein stabiles Heterodimer und fügen sich mit zahlreichen Proteinen zu einem Multiproteinkomplex zusammen, der die epigenetischen Prozesse während der Embryogenese, Zellzyklus und Stammzell-Wachstum steuert. Der MLL-Komplex weist eine spezifische Histon-Methyltransferase-Aktivität für Lysin-4 des Histon 3 Proteins auf (H3K4me3). Diese spezifische Aktivität hält ein Muster der aktiven Gene während der Entwicklung und Zelldifferenzierung aufrecht. Das AF4-MLL Fusionsprotein, welches durch die chromosomale Translokation t(4;11) gebildet wird, ist ebenfalls ein Substrat von Taspase1. Die Hydrolyse dieses Fusionsproteins führt ebenfalls zu Spaltprodukten, die zunächst miteinander ein Heterodimer bilden, um anschliessend einen onkogenen Multiproteinkomplex auszubilden. Dieser Komplex scheint hämatopoietische Stammzellen zu "reprogrammieren" und den Ausbruch einer lymphoblastischen Leukämie auszulösen.
Die Aktivität der Taspase1 selbst wird durch Eigen-Proteolyse reguliert. Es wird zunächst als Proenzym (p50) hergestellt, das anschliessend durch Autoproteolyse in die enzymatisch aktive Form konvertiert wird. Taspase1 ist ein enzymatisch strikt kontrolliertes Enzym mit geringer Substratanzahl. Neben MLL gibt es nur wenige, bekannte Substrate; allerdings scheint Taspase1 in den Zellen solider Tumoren überexprimiert zu sein. Daraus kann postuliert werden, dass Taspase1/MLL-Aktivität für diese Tumorarten von bedeutung ist. Taspase1 ist die einzige bislang bekannte Protease in Säugerzellen, die dazu befähigt ist, das Leukämie-spezifische AF4-MLL proteolytisch zu spalten und damit seine onkogenen Eigenschaften zu aktivieren. Eine spezifische Inhibierung der Taspase1 könnte deshalb eine mögliche Methode zur Therapie von t(4;11)-Leukämie darstellen. Aus diesem Grund war Taspase1 als ein potentielles Wirkstoffziel interessant und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer untersucht.
Um die Funktionsweise von Taspase1 zu untersuchen, wurde die 2005 veröffentlichte Kristallstruktur der Taspase1 als Grundlage für alle weiteren Arbeiten verwendet. Da die Struktur allerdings nur unvollständig aufgelöst war, wurden die unaufgelösten Bereiche mittels bioinformatischer Tools in Kooperation mit Tim Geppert (Arbeitskreis von Prof. Dr. Gisbert Schneider) modelliert. Die Modellierung führte zu einem detaillierteren Modell des Taspase1-Proenzyms, also dem Zustand vor der autokatalytischen Aktivierung.
Taspase1 weist interessanterweise nur Homologien zu L-Asparaginasen-2 (Familie der Hydrolasen), darunter Glycosylasparaginase, auf. Glycosylasparaginase durchläuft ebenfalls einen Autokatalyse-Prozess, allerdings nach einem N-O-Acyl-shift-Mechanismus. Daher wurde Taspase1 zunächst anhand geeigneter Experimente daraufhin überprüft, ob hier ebenso ein solcher Mechanismus für die Autokatalyse in Betracht kommt. Allerdings widerlegten die durchgeführten Experimente diese Vermutung.
Um die molekulare Funktionsweise der Taspase1 zu eruieren, wurde nun das modellierte Taspase1-Proenzym verwendet. Dies erlaubte die Identifizierung von kritischen Aminosäuren. Durch Mutationsanalysen konnte so die Funktion von Taspase1 aufgeklärt werden. So wurde ein intrinsischer Serin-Protease-Mechanismus für den Prozess der Autokatalyse entdeckt. Dabei spielt Serin-291 - unmittelbar in der Nähe des katalytischen Zentrums - eine wesentliche Rolle.
Anhand weiterer Mutationsanalysen konnte dann schrittweise der Aktivierungsmechanismus von Taspase1 aufgeklärt werden. Dabei scheint die Homodimerisierung zweier Taspase1- Proenzyme der wesentliche Schlüssel für die vollständige Aktivierung der Taspase1 zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Aminosäuren Tryptophan-173, Arginin-262, und Glutaminsäure-295 als kritische Aminosäuren identifiziert.
Weiterhin konnte anhand der funktionellen Analyse aller Mutanten zuletzt eine trans-dominant-negative Taspase1-Variante (C163E-S291A; tdn-TASP1) hergestellt werden. Das proenzymatische Monomer dieser Mutante ist dabei befähigt, mit einem Wildtyp-Taspase1-Monomer zu heterodimerisieren und seine Aktivität vollständig zu inhibieren. Die Funktion dieser trans-dominant-negativen Mutante validierte den in dieser Arbeit postulierten Aktivierungsmechanismus der Taspase1, der nun zukünftig für ein rationales Wirkstoff-Design verwendet werden kann.
The results presented here strongly indicate that ubiquitination of the recombinant human alpha1 GlyR at the plasma membrane of Xenopus oocytes is involved in receptor internalisation and degradation. Ubiquitination of the human alpha1 GlyR has been demonstrated by radio-iodination of plasma membrane-boundalpha1 GlyRs, whose subunits differed in molecular weight by additional 7, 14 or 21 kDa, corresponding to the molecular weights of one, two and three conjugated ubiquitin molecules, respectively, and by co-isolation of the non-tagged human alpha1 GlyR through hexahistidyl-tagged ubiquitin. Ubiquitin conjugated GlyRs where prominent at the plasma membrane, but could be hardly detected in total cell homogenates, indicating that ubiquitination takes place exclusively at the plasma membrane. Ubiquitination of the alpha1 GlyR at the plasma membrane was no longer detectable when the ten lysine residues of the cytoplasmic loop between transmembrane segments M3 and M4 were replaced by arginines. Despite this proteolytic cleavage continued to take place at the same extent as with the wild type alpha1 GlyR, suggesting that removal of GlyRs from the plasma membrane and routing to lysosomes for degradation were not dependent on ubiquitination. Also replacing a tyrosine in position 339, which was speculated to be part of an additional endocytosis motif, did not lead to a significant reduction of cleavage of the GlyR alpha1 subunits. However, a mutant lacking both, ubiquitination sites and 339Y, was significantly less processed. These results may suggest that the GlyR alpha1 subunit harbors at least two endocytosis motifs, which may act independently to regulate the density of alpha1 GlyR. Apparently, each of the two signals may be capable of compensating entirely the loss of the other. Part two of this Dissertation demonstrates that the correct topology of the glycine receptor alpha1 subunit depends critically on six positively charged residues within a basic cluster, RFRRKRR, located in the large cytoplasmic loop following the C-terminal end of M3. Neutralization of one or more charges of this cluster, but not of other charged residues in the M3-M4 loop, led to an aberrant translocation into the endoplasmic reticulum lumen of the M3-M4 loop. However, when two of the three basic charges located in the ectodomain linking M2 and M3 were neutralized, in addition to two charges of the basic cluster, endoplasmic reticulum disposition of the M3-M4 loop was prevented. We conclude that a high density of basic residues C-terminal to M3 is required to compensate for the presence of positively charged residues in the M2-M3 ectodomain, which otherwise impair correct membrane integration of the M3 segment. Part three of this Dissertation describes my contribution (blue native PAGE analysis of metabolically labeled alpha7 and 5HT3A receptors and the examination of the glycosylation state of metabolically labeled alpha7 subunits) to a work on the limited assembly capacity of Xenopus oocytes for nicotinic alpha7 subunits. While 5HT3A subunits combined efficiently to pentamers, alpha7 subunits existed in various assembly states including trimers, tetramers, pentamers, and aggregates. Only alpha7 subunits that completed the assembly process to homopentamers acquired complex-type carbohydrates and appeared at the cell surface. We conclude that Xenopus oocytes have a limited capacity to guide the assembly of alpha7 subunits, but not 5HT3A subunits to homopentamers. Accordingly, ER retention of imperfectly assembled alpha7 subunits rather than inefficient routing of fully assembled alpha7 receptors to the cell surface limits surface expression levels of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. Part four of this Dissertation describes my contribution (the biochemical analysis of the human P2X2 and P2X6 subtypes) to studies on the quaternary structure of P2X receptors. Armaz Aschrafi, the main author of the paper showed that subsequent to isolation under non-denaturing conditions from Xenopus oocytes the His-rP2X2 protein migrated on blue native PAGE predominantly in an aggregated form. The only discrete protein band detectable could be assigned to homotrimers of the His-rP2X2 subunit. Because of the exceptional assembly-behaviour of the rP2X2 protein compared to the rP2X1, rP2X3, rP2X4 and rP2X5 proteins, its human orthologue was investigated in the same manner. In contrast to rP2X2 subunits, hP2X2 subunits migrated under virtually identical conditions in a single defined assembly state, which could be clearly assigned to a trimer. P2X6 subunits represent the sole P2X subtype that is unable to form functional homomeric receptors in Xenopus oocytes. The blue native PAGE analysis of metabolically labeled hP2X6 receptors and the examination of the glycosylation state revealed that hP2X6 subunits form tetramers and aggregates that are not exported to the plasma membrane of Xenopus oocytes.
The analysis of doxorubicin-loaded poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles in in vitro glioma models
(2005)
The use of doxorubicin for the treatment of glioma tumours would be an important approach in the chemotherapy treatment since doxorubicin is a very effective neoplastic agent. However, one problem faced by the use of doxorubicin for the treatment of brain tumours is the fact that doxorubicin is a substrate of an efflux pump protein, P-glycoprotein (P-gp), which is located on the luminal side of the brain capillary endothelium and in many tumour cells, which acts pumping out of the cell such substrate, and blocking its transport into the cell. A strategy to enhance the doxorubicin delivery into the brain would be the use of nanoparticles. This work showed, that the treatment of doxorubicin bound to poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles decreased the viability of the three glioma cell lines, the GS-9L, the RG-2, and the F-98 cell lines significantly in comparison to doxorubicin in solution, indicating an improvement of the nanoparticles-bound doxorubicin transport into the cells. The modification of the nanoparticles surface with different surfactants may even enhance the delivery of the drug into the cells. Searching for an improvement of the doxorubicin internalization, the nanoparticles surface was modified using polysorbate 80, poloxamer 188 and poloxamine 908 surfactants. The poloxamer 188 and polaxamine 908 surfactant modified nanoparticles did not show a significant enhancement of the doxorubicin internalization. Contrary, the treatment of polysorbate 80 surfactant modified nanoparticles led in some cases to a significant decrease of cancer cell viability. The use of doxorubicin in the three glioma cell lines allowed the measurement of different responses towards doxorubicin treatment. The different responses were due to the entry of various amounts of doxorubicin into the glioma cells, which express the P-glycoprotein in their cellular membrane. A higher level of the P-gp expression correlated with a weaker response towards the doxorubicin treatment. The GS-9L cell line showed a significant higher level of P-gp expression than the F-98, and RG-2 cell lines, and consequently, the GS-9L cell line presented the highest resistance to doxorubicin with the highest viability values after doxorubicin treatment. Due to the fact that the transport of doxorubicin is governed by the activity of the P-gp in the studied glioma cells, the use of poloxamer 185 as a P-gp inhibitor resulted in an enhancement of the uptake as well as of the accumulation of doxorubicin into the cells. The effect of poloxamer 185 on the doxorubicin uptake was significant marked in the case of doxorubicin-resistance cells, as the GS-9L cell line. In some cases, the presence of the nanoparticles formulation showed also an influence on such uptake improvement. The use of a P-gp inhibitor in combination with chemotherapeutic agents leads to encouraging results. Because of the wide spectrum of substances acting as P-gp inhibitors, the exact inhibitory mechanisms remain still unclear. For instance in our results the evaluation of a described P-gp inhibitor, polysorbate 80 did not show an important improvement in the doxorubicin uptake in the P-gp-expressing cell line, GS-9L. On the other hand, the Polysorbate 80-Dox-PBCA nanoparticles formulation decreased in greater extend the viability of the glioma cells than the poloxamer185-Dox-PBCA nanoparticles. Although, the P-gp inhibition was undoubtedly higher in the presence of poloxamer 185, polysorbate 80 showed a main effect on the disruption of the cellular membrane, resulting in an important cellular viability decrease. It seems that poloxamer 185 presents a direct effect on the functionality of the P-gp protein, which would be of great importance in the sensitization of resistant cancer cells. The range of concentration of poloxamer 185 is very important to yield an inhibitory effect on the P-gp-mediated transport mechanism. The accumulation of Rhodamine-123 (Rho-123), a known P-gp substrate, increased in a range of concentration from 0.001 % to 0.01, whereas at 0.1 % poloxamer 185 the accumulation significantly decreased. A maximal Rho-123 accumulation was reached at 0.01 % poloxamer 185.
Development and characterization of histamine H3 and H4 receptor ligands as pharmacological tools
(2010)
Histamin gilt seit seiner Entdeckung vor ungefähr 100 Jahren als ein wichtiger chemischer Botenstoff im Organismus. Der Transmitter vermittelt pleiotrope Effekte über vier bisher bekannte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (H1R-H4R), die in die Regulation vielfältiger physiologischer Funktionen involviert und an der Entstehung von Krankheiten beteiligt sind. Antagonisten der ubiquitär im Organismus exprimierten H1R und H2R werden weitreichend zur Therapie von allergischen Erkrankungen bzw. Geschwüren im Gastrointestinaltrakt eingesetzt. H3R und H4R sind die jüngsten Vertreter der Histamin-Rezeptor-Klasse (HR). Auf molekularer Ebene zeigen diese beiden Subrezeptoren einen hohen Verwandtschaftsgrad. Sie ähneln sich u.a. bezüglich ihrer Aminosäuresequenz, ihrer Struktur und der Bindungseigenschaften von Liganden. Beide sind funktionell an inhibitorische/olfaktorische G-Proteine gekoppelt. Negative Rückkopplungsmechanismen werden durch ein hohes Maß an konstitutiver Aktivität ermöglicht. Dies unterstreicht die modulierende Funktion beider Rezeptoren, die wichtige physiologische Prozesse im Gleichgewicht hält. Als Auto- und als Heterorezeptor kommt der H3R hauptsächlich im zentralen Nervensystem vor. Er kontrolliert die Synthese und Freisetzung seines endogenen Liganden, moduliert aber auch die Konzentration anderer Neurotransmitter im synaptischen Spalt, die aus ko-lokalisierten Neuronen freigesetzt werden. Aus diesem Grund nimmt das neuronale histaminerge System eine entscheidende Rolle in der Erhaltung physiologischer Prozesse, wie z.B. Erregung, Aufmerksamkeit und Ernährungsverhalten, ein. Ein Ungleichgewicht der Neurotransmitterkonzentrationen kann die Entstehung neuronaler Erkrankungen verursachen, z.B. neurodegenerative Erkrankungen, Aufmerksamkeitsstörungen oder Übergewicht. Pitolisant ist der erste inverse H3R-Agonist, der sich in Phase III der klinischen Prüfung befindet. Sein erfolgreicher Einsatz bei verschiedenen pathophysiologischen Zuständen kann als Beweis für das H3R-antagonistische Therapieprinzip angesehen werden. Im Gegensatz zum H3R wird der H4R hauptsächlich in der Peripherie exprimiert, wo er an der Modulation des Immunsystems und an der Entstehung entzündlicher Prozesse beteiligt ist. Ergebnisse aus ersten präklinischen Studien sind teilweise widersprüchlich,weisen aber darauf hin, dass H4R-Liganden potenziell zur Therapie von allergischen und entzündlichen Erkrankungen entwickelt werden könnten. In beiden Forschungsgebieten müssen fundamentale Fragen noch geklärt werden, z.B. die Bedeutung von Rezeptor-Isoformen, die Rolle von Rezeptor-Heterodimeren oder die Aufklärung therapeutischer Prinzipien. Zudem müssen Liganden-Bindundgsmodi charakterisiert werden, um in der Zukunft weitere Bindungsareale in den jeweiligen Bindetaschen optimal zu nutzen. Hierdurch können Affinität, Aktivität und Selektivität von Liganden gesteuert werden. Diese Fragestellungen verdeutlichen den Bedarf an neuen Leitstrukturen und pharmakologischen Werkzeugen, die im Rahmen dieser Arbeit synthetisiert wurden. Im Vordergrund des H3R-Projektes standen Prinzipien des bioisosteren Austauschs, um dadurch die Entwicklung verschiedener Vorstufen für Liganden zum Einsatz in bildgebenden Verfahren zu ermöglichen. Ziel des H4R-Projektes war die Etablierung einer neuen Leitstruktur sowie deren Modifikation und Optimierung, um eine für die Aufstellung von Struktur-Wirkungsbeziehungen geeignete Substanzbibliothek zu erhalten. Mit Hilfe verschiedener In-vitro- und In-silico-Experimente wurde diese Bibliothek zur Charakterisierung der H4R-Bindetasche herangezogen und kann zukünftig auch in-vivo verwendet werden. Zu Beginn der Arbeit wurde von wenigen bekannten H4R-Liganden ein Pharmakophormodell abgeleitet. In seinen Grundbausteinen zeigte es große Ähnlichkeit zu einem schon etablierten H3R-Antagonist-Modell, was den hohen Verwandtschaftsgrad der Zielstrukturen widerspiegelte und auf überlappende Struktur-Wirkungsbeziehungen hinwies. Für die Synthese der Liganden bedeutete dies, dass präparative Methoden von einem auf das andere Gebiet übertragen werden konnten. Aufgrund des unterschiedlichen Forschungsstandes werden beide Projekte im Folgenden getrennt behandelt. Die Synthese der nötigen Vorstufen zur Darstellung von H3R-Antagonisten/inversen Agonisten wurde mittels im Arbeitskreis evaluierter Methoden durchgeführt. Standardmethoden wie reduktive Aminierungs- oder Amidierungsreaktionen wurden herangezogen, um das 1-(3-Phenoxypropyl)piperidin-H3R-Pharmakophor (1) zu erweitern. Zusätzlich wurden Triazole als alternative verknüpfende Elemente erprobt, um ein zweites basisches Zentrum, das potenziell Nebenwirkungen hervorruft, zu vermeiden. Die Triazole wurden in einem Klick-Chemie-Ansatz mittels 1,3-dipolarer Zykloaddition nach HUISGEN dargestellt. Sowohl die Zyklisierung als auch die Synthese entsprechender Azid-Vorstufen wurden erfolgreich etabliert und für die Synthese von Liganden aminerger Rezeptoren optimiert. Phenyl- und Benzylgruppen wurden mit dem H3R-Pharmakophor 1 verknüpft, um eine strukturelle Basis zu erhalten, die den Vergleich mit weiteren Liganden ermöglicht. Im Folgenden wurden der zentrale Phenylether sowie die Arylreste im rechten Teil des Pharmakophors durch derartige Gruppen ersetzt, die komplexierende Eigenschaften besitzen und damit zur Darstellung von entsprechenden SPECT (dt. Einzelphotonen- Emissions-Tomografie)-Liganden geeignet sind. Der elektronenziehende und sterisch anspruchsvolle Charakter der Trifluormethylgruppen in Verbindungen 8–10 spiegelt sich sowohl in der reduzierten chemischen Aktivität der jeweiligen Edukte als auch in der nur moderaten H3R-Affinität wider. Daher wurden diese Elemente nicht weiter verfolgt. Mit den Ferrocen-Derivaten 11–15 wurden zum ersten Mal metallhaltige H3R-Liganden entworfen. Die pharmakologische Charakterisierung dieser Verbindungen zeigte, dass die Sandwichkomplexe sich hervorragend zum bioisosteren Ersatz der Phenylreste eignen. Die Affinitäten der analogen Verbindungen sind vergleichbar und liegen im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich. Der invers-agonistische Charakter des H3RPharmakophors wurde anhand der Verbindungen 11 und 15 bestätigt. Eine vorläufige invivo-Testung der hochaffinen Diamine 11 und 12 zeigte keine zufriedenstellenden Ergebnisse und muss durch weiterführende Untersuchungen ergänzt werden. Verbindung 15 wurde zur Weiterentwicklung zu einem potenziellen SPECT-Liganden ausgewählt. Die elektronenziehenden Eigenschaften des verknüpfenden Triazols erleichterten die Umkomplexierung des Ferrocens zu einem (Tricarbonyl)rhenium-Derivat, jedoch konnten Probleme bei der Aufreinigung einer nicht-radioaktiv markierten Analogverbindung mit den zur Verfügung stehenden chromatographischen Methoden nicht bewältigt werden. Gleichwohl wurden mit den Ferrocen-Verbindungen wertvolle bioisostere Analoga entsprechender SPECT-Liganden synthetisiert. Die Einführung von polaren Kojisäure-Derivaten stellte einen weiteren Ansatz zur Entwicklung von Liganden mit komplexierenden Eigenschaften dar. Außerdem sollten die Molekülgröße reduziert werden, um die Blut-Hirn-Gängigkeit zu erleichtern, und neue Leitstrukturen mit potenziell neuroprotektiven Eigenschaften entwickelt werden. In einem Nebenprojekt wurden Rac1-Inhibitoren dargestellt, die Kojisäure als zentrales Element aufwiesen. Die hier etablierten Synthesewege wurden zur Darstellung der H3RLiganden genutzt. Trotz erheblicher, für g-Pyranone typischer Nebenreaktionen konnte eine Reihe von H3R-Liganden synthetisiert werden (18–24). Die Affinitäten dieser Verbindungen zeigten eine auf den rechten Teil des H3R-Pharmakophors beschränkte bioisostere Potenz von Kojisäure-Derivaten. Besonders die Diamine aus dieser Serie sind als Leitstrukturen für die Entwicklung neuroprotektiver Liganden geeignet. Die neuen H3R-Liganden enthalten außergewöhnliche strukturelle Elemente, die in dieser Art zum ersten Mal am H3R getestet wurden. Die Ergebnisse aus den Bindungsstudien zeigten Grenzen und Möglichkeiten des bioisosteren Ersatzes im zentralen und im rechten Teil des Pharmakophors. Die Verbindungen sind wertvolle Modellsubstanzen, die zur Charakterisierung von lipophilen und hydrophilen Arealen in der H3R-Bindetasche verwendet werden können, und eignen sich als Leitstrukturen, um neue H3R-Liganden mit verschiedenen pharmakologischen Schwerpunkten zu entwickeln. Basierend auf einem von wenigen Referenzliganden abgeleiteten Pharmakophormodell wurde das H4R-Projekt mit verschiedenen Screening-Verfahren initiiert. In-silico wurde nach Fragmenten und neuen Pharmakophoren gesucht, um diese im Folgenden mit Hilfe von klassischen Verfahren der medizinischen Chemie zu modifizieren und zu optimieren. Innerhalb einer Strukturklasse wurden zunächst nur wenige Verbindungen synthetisiert. Zeigten diese ein unzureichendes Bindungsverhalten, wurde die Entwicklung eingestellt. In einem virtuellen Screening wurden zwei heterozyklische Strukturen mit Affinitäten im niedrigen mikromolekularen Konzentrationsbereich identifiziert, die zur Entwicklung einer Reihe von Aminopyrimidinen führten. Ähnliche Verbindungen wurden zeitgleich zu unserem Projekt von der pharmazeutischen Industrie untersucht und durch weitreichende Patente geschützt. Die neue Leitstruktur, N4-Benzyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)pyrimidin-2,4-diamin (46), wurde umfangreich derivatisiert. Prinzipien wie Heteroatom-Austausch, Rigidisierung und Modifikation des Substitutionsmusters am Benzylring nach TOPLISS wurden angewendet, um das Pharmakophor hinsichtlich Affinität, Funktionalität und Selektivität zu diversifizieren und zu optimieren. Die Synthese der Verbindungen 44–71 erfolgte hauptsächlich unter Mikrowelleneinstrahlung. Da konventionelle präparative Methoden keine Produktbildung ermöglichten, wurde eine sequentielle Mikrowellensynthese etabliert, mit Hilfe derer die gewünschte Umsetzung schnell und in hohen Ausbeuten erzielt wurde. Initialschritte zur Darstellung von Fluoreszenzliganden, die auf dem Aminopyrimidin-Pharmakophor basieren, wurden mit Verbindungen 72–75 erfolgreich realisiert. Bezüglich ihrer H4R-Affinität sollten diese Liganden in Zukunft weiter optimiert werden. Struktur-Wirkungsbeziehungen der Verbindung 46 und entsprechender Derivate zeigten, dass Affinitäten im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich durch die Einführung kleiner, lipophiler benzylischer Substituenten in ortho-Position erreicht werden (z.B. durch 2-Cl- und 2-CH3-Reste in Verbindungen 58 und 59). In Verdrängungsstudien wurde das Bindungsverhalten ausgewählter Verbindungen an anderen HR-Subtypen untersucht. Die Liganden zeigten Selektivität in Bezug auf H1R und H2R und eine Präferenz für den H4R gegenüber H3R. Das 2,6-Dichlor-Derivat 62 stellte eine der potentesten und selektivsten Verbindungen dieser Serie dar. Das Substitutionsmuster des Benzylrestes beeinflusste die Effektivität der Liganden in großem Maße: Ortho- und para-substituierte Verbindungen zeigten in [35S]GTPgS-Bindungsstudien Partialagonismus. Mit steigendem Radius der para-Substituenten wurde eine Verschiebung zum neutralen Antagonismus und zum schwachen inversen Agonismus beobachtet, während meta-Substituenten ausgeprägten inversen Agonismus verursachten. Dieser wurde durch die Rigidisierung der Benzylamin-Gruppierung weiter verstärkt. Verbindung 69 zeigte sogar eine höhere invers agonistische Potenz als der Referenzligand Thioperamid. Um Hinweise auf die strukturellen Voraussetzungen für Agonismus und Antagonismus zu erhalten, wurde eine Moleküldynamiksimulation durchgeführt. Nach der virtuellen Ligandenbindung nahmen der Partialagonist 49 und der inverse Agonist 69 gegensätzliche Bindemodi in der H4R-Bindetasche ein. Die Bindung des inversen Agonisten wurde durch einen scheinbaren „ionic lock“, der hier zum ersten Mal postuliert wurde, stabilisiert. Da in-silico-Experimente von anderen Forschergruppen teilweise gegensätzliche Ergebnisse zeigten, sollten zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden, um zu klären, ob unterschiedliche Bindemodi durch gegensätzlicher Effektivitäten oder verschiedene Pharmakophore hervorgerufen werden. Die Aminopyrimidine stellen exzellente pharmakologische Werkzeuge dar. Die große Diversität bezüglich der Effektivität, die innerhalb einer Strukturklasse vom Partialagonismus bis zum inversen Agonismus reicht, bietet eine geeignete Grundlage, um potenzielle therapeutische Anwendungsbereiche von H4R-Liganden zu untersuchen und zu klären, welche Effekte aus der Aktivierung, Blockade oder Hemmung des H4R resultieren. Klassische Methoden der medizinischen Chemie wurden zur Entwicklung von Liganden zweier eng verwandter Zielstrukturen, H3R und H4R, verwendet. Im H4R-Projekt wurden zusätzlich Computer-gestützte Methoden herangezogen. Die Modifizierung und Optimierung verschiedener Leitstrukturen führte zu der Synthese von 75 Endverbindungen. Das H3R-Projekt, aus dem 22 dieser Verbindungen resultierten, fokussierte auf Prinzipien des Bioisosterismus. Triazole, Ferrocene und Kojisäure-Derivate wurden zum ersten Mal in ein H3R-Pharmakophor integriert. Die Eignung dieser Elemente als bioisosterer Ersatz des zentralen Phenylethers oder der Arylreste im rechten Molekülteil wurde untersucht. Mit dem hieraus gewonnenen Wissen wurden SPECT-Ligand-Vorstufen optimiert. Neue Leitstrukturen mit außergewöhnlichen Elementen stellen zudem Modellsubstanzen dar, die zur anhaltenden Charakterisierung der H3R-Bindetasche dienen. Auf dem H4R-Gebiet gehören die Aminopyrimidine zu einer der am weitesten entwickelten Substanzklassen. Die Derivatisierung der 31 synthetisierten Verbindungen verspricht neue Kenntnisse über diese Stoffklasse. Vor allem inverse Agonisten sollten auf ihre therapeutische Anwendbarkeit als Immunmodulatoren untersucht werden. Eine solche Effektivität könnte strukturell durch die Modifikation der meta-substituierten Aminopyrimidine oder durch die Verzweigung der benzylischen Methylengruppe erreicht werden. Eine ausführliche Charakterisierung der in Bezug auf Affinität und Effektivität vielversprechendsten Derivate, z.B. des 2,6-Dichlor-Derivates 62 oder der inversen Agonisten 68-70, sollte in naher Zukunft durchgeführt werden. Um in-vitro-Daten auf präklinische Tierstudien übertragen zu können, sollten die Liganden zusätzlich an H4Rs unterschiedlicher Arten getestet werden, da Spezies-Unterschiede eine solche Extrapolation derzeit nicht zulassen. Anschließend können die Aminopyrimidine als pharmakologische Werkzeuge in grundlegenden pharmakologischen Experimenten eingesetzt werden, um die Untersuchung der (patho)physiologischen Bedeutung des H4R fortzuführen.
The development of novel drugs targeting GPCRs is of particular interest since modulation of subfamilies of this receptor class highly influences neurotransmission in the central nervous system. This study has focused on the development of ligands for the dopamine D3 receptor. The receptor belongs to the dopamine D2-like family among the biogenic amine binding GPCRs. The dopamine D3 receptor is involved in neurological and neuropsychiatric disorders such as Parkinson’s disease, schizophrenia and drug addiction. Due to its close structural similarity to the dopamine D2 receptor subtype, it is still a challenge to identify and further optimize new leads. Therefore an in vitro screening assay, which also allows elucidating comprehensive structure-affinity relationships, is required. In this investigation the implementation and evaluation of radioligand binding assays for human dopamine D2S and dopamine D3 receptors and for the related aminergic human histamine H1 receptor stably expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells has been performed. Saturation binding experiments with [³H]spiperone at dopamine D2S and D3 receptors and with [³H]mepyramine at histamine H1 receptors were carried out. The determined equilibrium dissociation constant of radioligands (Kd) and the total number of specific binding sites (Bmax) of the receptor membrane preparations were in good agreement with reference data. Inhibition constants (Ki) of reference ligands obtained in radioligand competition binding experiments at dopamine hD2S, hD3 and histamine H1 receptors validated the reliability and reproducibility of the assay. In order to discriminate agonists from antagonists, a GTP shift assay has been investigated for dopamine D2S and D3 receptors. In competition binding studies at dopamine D2S receptors the high- and low affinity state in the absence of the GTP analogue Gpp(NH)p has been recognized for the agonists pramipexole and the seleno analogue 54. In the presence of Gpp(NH)p a decrease in affinity, referred to as “GTP shift”, has been revealed for agonists at dopamine D2S and D3 receptors. An effect of Gpp(NH)p on dopamine D2S receptor binding has not been observed for the antagonists ST 198 and BP 897, while a reverse “GTP shift” has been noticed at the dopamine D3 receptor. For the development of novel ligands with high affinity and selectivity for dopamine D3 receptors, investigation in refined structure-affinity relationships (SAR) of analogues of the lead BP 897 has been performed. Replacement of the naphthalen-2-carboxamide of BP 897 by aryl amide residues (1 - 4) had a clear influence on affinity binding and selectivity for dopamine D3 receptors. Introduction of the benzo[b]thiophen-2-carboxamide (1) has markedly improved binding with subnanomolar affinity and enhanced selectivity for dopamine D3 receptors. Exchanging the aryl substituted basic alkanamine residue of 1 by a 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline moiety (6) emphasized the benefit of the 4-(2-methoxyphenyl) piperazine residue of BP 897 regarding dopamine D2 and D3 receptor affinities. The change of particular elements of BP 897 and the rearrangement of the amide functionality resulted in inverse amide compounds with new chemical properties. Moderate affinity binding data, as obtained for the isoindol-1-carbonyl compound 11, suggest that inverse amides provide a worthwhile new lead structure with a novel structural scaffold. A hybrid approach combining privileged scaffolds of histamine H1 receptor antagonists and fragments of dopamine D3 receptor-preferring ligands, related to BP 897and analogues has been investigated. Various benzhydrylpiperazine derivatives and related structures have shown moderate to high affinities for dopamine D3 receptors with the impressive enhancement of the cinnamide substituted bamipine-related hybrid 39, exhibiting the highest affinity and selectivity for dopamine D3 receptors. Improved affinity profiles of structural modified histamine H1 receptor antagonists for dopamine D2 and D3 receptors and a refined SAR has been achieved. A SAR of derivatives of the dopamine agonist pramipexole and the related etrabamine has been studied. The propargyl substituted etrabamine derivative 61 demonstrated highest affinity and selectivity. The ligand attracts attention since neuroprotective properties have been reported for the propargyl functionality. Further development resulted in the most promising compound 64, a cinnamide derivative with 4-fluoro substitution on the phenyl ring. Subnanomolar affinity and remarkable selectivity for dopamine D3 receptors has aroused particular interest in this ligand due to its development potential as a radioligand for PET studies. Radioligand binding studies in combination with virtual screening and different classification techniques of chemoinformatic methods resulted in further elucidation of SAR. New leads with novel chemical scaffolds have been found in the bicycle[2.2.1]heptane derivative 95 and the benzhydrylidene substituted pyrrolidindione 112 and can be further optimized by chemical modifications. The outcome of the studies provides the development of various novel high affine and dopamine D3 receptor selective ligands. Modifications of lead structures or application of chemoinformatic tools in combination with radioligand competition binding assays have resulted in new leads with different chemical scaffolds. Furthermore, a comprehensive insight into structure-affinity relationships of ligands at dopamine D3 receptors has been revealed. This refined SAR is valuable to develop more affine and selective drug candidates with a designed pharmacological receptor profile.
UPF1 regulates myeloid cell functions and S100A9 expression by the hnRNP E2/miRNA-328 balance
(2016)
UPF1 is a key player in nonsense mediated mRNA decay (NMD) but also involved in posttranscriptional gene regulation. In this study we found that UPF1 regulates the expression of genes with functions in inflammation and myeloid cell differentiation via hnRNP E2. The majority of the UPF1-regulated genes identified in monocytic cells contain a binding site for hnRNP E2 within 5′ UTR located introns with hnRNP E2 acting here as splicing regulator. We found that miRNA-328 which is significantly induced during monocytic cell differentiation acts independently from its gene silencing function as RNA decoy for hnRNP E2. One representative gene controlled by the hnRNP E2/miRNA-328 balance is S100A9 which plays an important role in cell differentiation and oxidative stress response of monocytes. Induction of miRNA-328 expression during cell differentiation antagonizes the blockade by hnRNP E2 which results in the upregulation of CD11b expression and ROS production in monocytic cells. Taken together, our data indicate that upregulation of miR-328 is responsible for the induction of hnRNP E2 target genes during myeloid cell differentiation.
Dopamin-D2- und -D3-Rezeptorliganden als pharmakologische Werkzeuge und potenzielle Arzneistoffe
(2007)
Mit der Identifizierung der D2-ähnlichen Rezeptoren D2, D3 und D4 um das Jahr 1990 herum, begann die Erforschung deren physiologischer Bedeutung und die Suche nach selektiv bindenden Liganden. Die einzelnen Rezeptorsubtypen unterscheiden sich in ihrer Struktur, chromosomalen Lokalisation, Expressionsrate, anatomischen Verteilung und intrazellulären Signalweiterleitung. Verglichen mit D2-Rezeptoren sind D3-Rezeptoren insgesamt geringer an ihrer Zahl, weisen aber ein charakteristisches Verteilungsmuster im ZNS auf. Um eine vorwiegende Wirkung über D3-Rezeptoren hervorrufen zu können, ist eine Bindungsselektivität der Liganden gegenüber D2-Rezeptoren erforderlich, durch die die unterschiedliche Häufigkeit der beiden Rezeptorsubtypen wieder ausgeglichen wird. In einer richtungsweisenden Arbeit wurde 2003 die Rolle der D3-Rezeptoren in der Therapie des Morbus Parkinson und der Entstehung von L-DOPA-induzierten Dyskinesien aufgezeigt. Neuste Untersuchungen geben valide Hinweise auf klinisch relevante neuroprotektive und neuroregenerative Effekte bei Behandlung der neurodegenerativen Erkrankung mit D3-Rezeptoragonisten. Das Rückfallrisiko ehemals Drogenabhängiger durch mit dem Suchtstoff in Zusammenhang gebrachte Umweltstimuli ist entscheidend mit dem gleichen Rezeptorsubtyp verbunden. Die mögliche Behandlung Drogenabhängiger mit D3-Rezeptorliganden wird gegenwärtig intensiv untersucht. Mangels geeigneter Tiermodelle bisher wenig erforscht ist die therapeutische Bedeutung der D3-Rezeptorliganden bei schizophrenen Erkrankungen.Möglicherweise liegt hier ein besonderes Potential in der Behandlung von Negativsymptomen. Der im Handel befindliche Arzneistoff Pramipexol (Sifrol®) diente als Leitstruktur für die Synthese zahlreicher Liganden an D2- und D3-Rezeptoren. Weitere Leitstrukturen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit identifiziert und variiert. In einem ersten Schritt wurde die Bedeutung der 2-Aminogruppe an der Thiazolstruktur des Pramipexols untersucht. Sollte diese entgegen der in der Literatur verbreiteten Ansicht für die Ligand-Rezeptorinteraktion entbehrlich sein, könnten Verbindungen mit höherer Lipophilie und damit optimierter ZNS-Gängigkeit geschaffen werden. Für das L-Etrabamin, einem 2-unsubstituierten Derivat des Pramipexols, wurde bereits 1978 in einem Patent eine dopaminerge Aktivität beschrieben. Entgegen der in der Literatur verbreiteten Auffassung konnten durch Austausch der Aminogruppe gegen verschiedene Substituenten affine Derivate des Pramipexols entwickelt werden. Darüber hinausgehende Veränderungen der Leitstruktur dienten dem Aufbau umfangreicher Struktur-Wirkungsbeziehungen. Die Entwicklung einer konvergenten Synthesestrategie ermöglichte die Darstellung einer größeren Anzahl komplexer zusammengesetzter Etrabaminderivate. Die Umsetzung von Pramipexolderivaten zu den entsprechenden Diazoniumsalzen und anschließende Reduktion mit Hypophosphoriger Säure verbesserte die Verfügbarkeit von Etrabamin und seinen Derivaten gegenüber in der Literatur beschriebenen Synthesen. Das resultierende Etrabaminderivat konnte mit Aldehyden unter Verwendung komplexer Hydride reduktiv alkyliert werden. Die Aldehyde wurden entweder durch Acetalhydrolyse oder durch SWERN-Oxidation von Alkoholen erhalten. ....
Lipidartige Formulierungen zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit schwer löslicher Arzneistoffe
(2002)
In dieser Arbeit wurde anhand der zwei schwerwasserlöslichen Modellsubstanzen EMD 57033 und Danazol untersucht, inwieweit sich (schwerpunktmäßig halbfeste) lipidartige Hilfsstoffe zur Verbesserung der Wirkstofffreigabe aus der Arzneiform eignen, um dadurch eine im Vergleich mit einer Standardrezeptur erhöhte Bioverfügbarkeit zu erhalten.
Ein gen-interner Transkriptionsstart koinzidiert mit einem Rekombinations-Hotspot imhumanen MLL-Gen
(2006)
Chromosomale Veränderungen des humanen MLL-Gens sind für 5-10% der akuten Leu-kämien im Säuglings- und Erwachsenenalter verantwortlich. Davon entstehen wiederum 5-10% der MLL-Aberrationen therapiebedingt. Das auf Bande 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homo-log of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Mittlerweile sind fast 90 cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40%), AF9 (27%), sowie ENL (7%), AF6 (6%), ELL (~5%) und AF10 (4%). Die Bruchpunkte von MLL-Translokationen sind nicht einheitlich über das 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in einer ca. 8.3 kb großen Bruchpunkts-clusterregion (bcr). Innerhalb dieser Region sind die Bruchpunkte nicht homogen verteilt. Bruchpunkte von Patienten mit de novo-Leukämien und einem Alter von über einem Jahr sind überwiegend in der 5’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster I (SCI), lokalisiert. Die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien sowie Säuglingen (<1 Jahr) liegen dagegen vornehmlich in der 3’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster II (SCII). Da DNA-Doppelstrangbrüche (DNA-DSB) auf zwei unterschiedlichen Chromosomen eine aus-reichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind, stellte sich die Frage, ob aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte innerhalb der MLL bcr, bestimmte Bereiche dieser Region für DNA-DSB besonders anfällig sind. Bisher konnte aufgeklärt werden, dass in SCII, durch Apoptose-auslösende Ereignisse oder cytotoxische Agenzien DNA-DSB sehr leicht induziert werden können. Durch Arbeiten in unserer Gruppe konnte im SCII ein ca. 200 bp großer Bereich um die MLL Intron 11/Exon 12-Grenze lokalisiert werden, in dem sich der größte Teil aller Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche konzentrierte. Dies galt jedoch nicht für eine perfekte TopoisomeraseII Konsensussequenz im Exon 12, die bisher mit einer Vielzahl Therapie-assoziierter Translokationsbruchpunkte in Verbindung gebracht wurde. Dieser Hotspot kolokalisiert außerdem mit einer scaffold/matrix attachment region (S/MAR), sowie einer DNaseI-hypersensitiven Stelle. Des Weiteren fanden sich in der Literatur Hinweise, dass SCII im Gegensatz zu SCI eine verstärkte Histonacetylierung besitzt. Die potentielle Anwesenheit eines Promotors wurde durch Computeranalysen bestätigt. In einer murinen embryonalen Fibroblasten-Zelllinie, die durch die Insertion einer LacZ/Neo-Kassette in Exon 4 des Mll-Gens einen Transkriptionsstop trug, wurden in anschließenden RT-PCR Experimenten sowohl alle Möglichkeiten des alternativen Spleißens ausge-schlossen, als auch der Start eines Transkripts unmittelbar vor Exon 12 detektiert. Zusätzlich durchgeführte Affymetrix-Chip-Experimente bestätigten die Anwesenheit von Mll-Transkript-signalen in der verwendeten Mll k.o.-Zelllinie. In nachfolgenden Versuchen konnte durch eine weitere Kartierung der Transkriptionsstart auf bis zu +/- 15 bp an der Intron 11/Exon12-Grenze festgelegt werden. Um nun die im Mausmodell gewonnenen Resultate auch im humanen System zu überprüfen, wurden die homologen Regionen des murinen und humanen Mll/MLL-Gens vor ein Luci-ferasereportergen kloniert. Durch RT-PCR konnte der gen-interne Transkriptionsstart im SCII des humanen MLL-Gens ebenfalls lokalisiert werden. Damit wurde gezeigt, dass genetische Instabilität und Transkriptionsinitiation im SCII des humanen MLL-Gens kolokalisieren. Durch die anfangs durchgeführten in silico-Analysen in Maus und Mensch, wurden Deletions-mutanten generiert, mit deren Hilfe die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotor-region ermittelt wurde. Hierbei zeigte sich, dass die Anwesenheit von zwei Retroelementen in der menschlichen Sequenz eine Enhancer-Funktion vermittelt. Dagegen zeigte die homologe murine Sequenz, für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-DSB bekannt ist, nur schwache Promotoraktivität. Da Histon Modifikationen beim Prozess der Transkription eine entscheidende Rolle spielen, wurde auch die nähere Umgebung des gen-internen Promotors in den murinen k.o.-Zellen untersucht. In der k.o.-Linie zeigte die Region stromaufwärts der putativen Transkriptionsinitiation die Signatur von inaktivem Chromatin (di-methyliertes H3 K9), wohingegen stromabwärts von Mll Exon 12 Chromatinstrukturen nachgewiesen wurden, die aktiv transkribiert werden (tri-methyliertes H3K4), und damit einen weiteren Beweis für die besondere Chromatinstruktur dieser Region lieferten. Durch Western-Blot Experimente wurde das Protein, das durch das Transkript des gen-internen Promotors kodiert wird, nachgewiesen. Das verkürzte murine Mll-Protein wird also, wie sein humanes Pendant, proteolytisch durch die Taspase1 gespalten, so dass sich ein MLL-Mini-Komplex ausbilden kann.
In der vorliegenden Arbeit wurde die mögliche Regulation verschiedener Ionenkanalgene bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit Hilfe von Northern Blots, der semiquantitativen RT-PCR- Technik und zum Teil durch elektrophysiologische Untersuchungen analysiert. Ziel war es, solche Gene zu identifizieren, deren mRNA-Spiegel hochreguliert oder herunterreguliert waren, da diese möglicherweise eine wichtige Rolle bei den kardiovaskulären Erkrankungen spielen könnten. Diese Untersuchungen sollten zu einem besseren Verständnis der renalen und kardialen Funktion dieser Ionenkanäle und der Pathogenese der untersuchten Krankheiten beitragen, aber auch helfen, neue Kandidatengene für diese Krankheiten zu identifizieren. Es wurden insgesamt fünf Tiermodelle mit Hypertonie, kardialer Hypertrophie, Herzinsuffizienz, Niereninsuffizienz und Vorhofflimmern untersucht. Ein Schwerpunkt dieser Untersuchungen waren die CLC-Chloridkanäle, deren kardiovaskuläre Funktionen noch wenig untersucht sind. Die Genprofile der Chloridkanäle CLC-2, CLC-3, CLC-4, CLC-5, CLC-6 und CLC-7 sowie CLC-K1 und CLC-K2 wurden in den Herzen und Nieren der folgenden Tiermodelle analysiert: (1) In spontan hypertensiven Ratten (SHR) und (2) in SH-stroke-prone-Ratten, die eine genetisch bedingte Hypertonie und Herzhypertrophie entwickeln. (3) In salz-sensitiven Dahl-Ratten, die Hypertonie und Herzhypertrophie erst nach einer salzhaltigen Diät, und (4) in Aortic-Banding-Ratten, die nach einem operativen Eingriff Bluthochdruck und kardiale Hypertrophie entwickeln. (5) Schließlich wurde noch ein Rattenmodell untersucht, in dem durch die Ligatur der Koronararterie ein Herzinfarkt induziert wurde, der letztlich zur Herzinsuffizienz führte. In keinem dieser Tiermodelle wurde jedoch eine auffällige Veränderung in der mRNA-Expression der acht untersuchten CLC-Chloridkanäle in den erkrankten Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren beobachtet. Die CLC-Chloridkanäle wurden ferner in einem Niereninsuffizienz-Modell untersucht, bei dem in Ratten durch Abklemmen der renalen Arterien und Venen ein akutes Nierenversagen und letztlich eine Niereninsuffizienz hervorgerufen wurde. In diesem Tiermodell war bereits eine Herunterregulation vieler anderer Ionenkanäle und Transporter beschrieben worden. In zwei unabhängigen Tierstudien wurde eine unterschiedlich starke Abnahme der mRNA-Expression für die einzelnen CLC-Chloridkanäle beobachtet. In einer weiteren Studie konnte die Behandlung von niereninsuffizienten Ratten mit einem bei Niereninsuffizienz wirksamen Inhibitor des NHE-3-Transports das Ausmaß der Reduktion einzelner CLC-Gene abschwächen. Weitere Studien mit höheren Dosen oder potenteren Substanzen sind notwendig, um diese vorläufigen Befunde zu bestätigen. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der kardialen Ionenkanaldichten bei einem neuen Kaninchenmodell für Vorhofflimmern, die in Zusammenarbeit mit der Universitätsklinik Tübingen durchgeführt wurde. Das Vorhofflimmern ist eine sehr häufige Herzerkrankung bei älteren Menschen, und anhand dieses Tiermodells sollten vor allem frühe Prozesse des elektrischen Remodelings, das für das Auftreten und die Aufrechterhaltung des Vorhofflimmerns von Bedeutung ist, untersucht werden. Mit Hilfe der semiquantitativen RT-PCR-Analyse konnte in diesem Tiermodell erstmals eine Reduktion der mRNA für die Kaliumkanalgene Kv1.4, Kv4.3 und Kv1.5 sowie für die Kalziumkanalgene alpha1, CaB2a, CaB2b und CaB3 im frühem Stadium des Vorhofflimmerns nachgewiesen werden. Diese Befunde konnten die Resultate von Patch-Clamp-Messungen erklären, die gleichzeitig an der Universität Tübingen an isolierten Vorhofzellen durchgeführt wurden. In diesen Studien wurde in Übereinstimmung mit den erzielten mRNA-Daten eine Abnahme des Ito-Kaliumstromes und des ICa,L-Kalziumstromes nachgewiesen. Mit diesen Untersuchungen konnten frühere Resultate, die auch an Patienten mit chronischem Vorhofflimmern erhoben wurden, bestätigt werden. Die gefundene Regulation zeigt, dass diese Ionenkanalgene eine wichtige Rolle bei dem frühen elektrischen Remodeling spielen und dass das Rapid-Pacing- Kaninchenmodell ein geeignetes Tiermodell für das Vorhofflimmern beim Menschen ist.
Das natürlich vorkommende Polyphenol Resveratrol (3,4‘,5-(E)-Trihydroxystilben) ist eine potente chemopräventive Substanz, die in vielen verschiedenen Krebszelllinien wirksam ist. Außerdem verfügt sie über anti-inflammatorische, anti-oxidative und pro-apoptotische Wirkungen. Da Resveratrol auch in Tiermodellen des Typ-2-Diabetes und der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung gute Effekte gezeigt hat, wird in Erwägung gezogen es zur Prävention und Behandlung von metabolischen Erkrankungen einzusetzen. Allerdings liegen, aufgrund von schneller Metabolisierung und geringer Bioverfügbarkeit, die wirksamen Konzentrationen im mikromolaren Bereich. Eine geeignete Strategie, um die anti-tumorale Wirkung und die Bioverfügbarkeit von Resveratrol zu verbessern, scheint die Methylierung der freien Hydroxylgruppen zu sein. Allerdings liefern einige Studien Hinweise darauf, dass diese strukturelle Modifikation der Stilbengrundstruktur zu einer Veränderung des antiproliferativen Wirkmechanismus der methylierten Substanzen führt. Daher führten wir im ersten Teil dieser Arbeit genauere Untersuchungen durch, um die Veränderungen der biologischen Wirkung, die durch die Methylierung der freien Hydroxylgruppen von (E)- und (Z)-Resveratrol verursacht werden, zu charakterisieren. Einen Schwerpunkt bildete die Bestimmung der metabolischen Effekte der methylierten Substanzen. Dabei sollte aufgeklärt werden, ob die Analoga noch immer in der Lage sind bekannte Resveratrol-Targets, wie AMPK, SIRT1 und Phosphodiesterasen, zu modulieren. Zunächst bestätigten wir, dass die methylierten Resveratrolanaloga ST911 (3,4‘,5-Z)-Trimethoxystilben) und ST912 (3,4‘,5-(E)-Trimethoxystilben) einen starken antiproliferativen Effekt auf verschiedene Krebszelllinien ausüben. Wie bereits zuvor beschrieben, konnten wir beobachten, dass ST911 und ST912 das Wachstum von Tumorzellen stärker beeinflussen, als die hydroxylierten Substanzen (E)- und (Z)-Resveratrol. Dies, in Verbindung mit einer vernachlässigbaren zytotoxischen Wirkung und einer deutlich geringeren antiproliferativen Wirkung auf Primärzellen, legt nahe, dass ST911 als potentielles neues Chemotherapeutikum weiter untersucht werden sollte. Zudem zeigten ST911 und ST912 signifikante pro-apoptotische Wirkungen in CaCo-2-Zellen. Auch Resveratrol konnte in diesen Zellen Apoptose auslösen, allerdings erst nach Behandlung mit deutlich höheren Konzentrationen, verglichen mit ST911 und ST912. Eine genauere Charakterisierung der antitumoralen Wirkung von ST911 in HT-29-Zellen zeigte, dass ST911 die Polymerisation von Tubulin zu Mikrotubuli beeinflusst und einen Arrest des Zellzyklus in der Mitose-Phase auslöst. Im Gegensatz dazu führt Resveratrol zu einem Zellzyklus-Arrest in der S-Phase und beeinflusst die Tubulinpolymerisation nicht. Diese Beobachtungen verstärkten die Annahme, dass ST911 ein Mitosehemmer ist und betonten noch einmal die mechanistischen Unterschiede zwischen Resveratrol und den methylierten Analoga. Interessanterweise konnte ST911 die hepatische Fettakkumulation in einem in-vitro-Steatosemodell nicht beeinflussen, während eine Behandlung mit Resveratrol zu einer signifikanten Reduktion der intrahepatischen Triglyzeride führte. Dieses Experiment lässt vermuten, dass die stärkere antiproliferative Wirkung von ST911, keine erhöhte Aktivität in metabolischen Krankheitsmodellen nach sich zieht. Die beobachteten Unterschiede im Steatosemodell führten zu der Frage, ob die methylierten Analoga noch immer in der Lage sind die gleichen metabolischen Targetgene zu modulieren, die in der Literatur für Resveratrol beschrieben sind. Vor kurzem wurden Phosphodiesterasen (PDEs) als direkte Targets von Resveratrol identifiziert. Die Inhibition von PDEs durch Resveratrol führt zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration. Diese wiederum aktiviert die bekannten Resveratrol-Targetgene AMPK und SIRT1. Unsere Experimente zeigten, dass ST911 und ST912 keinen Einfluss auf die intrazelluläre cAMP-Konzentration haben. Zusätzlich konnten wir keine AMPK- oder SIRT1-abhängigen Veränderungen der Genexpression beobachten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Substanzen ihre zellulären Effekte vermutlich nicht über eine Modulation von PDEs, AMPK oder SIRT1 vermitteln. Zusammenfassend liefert der erste Teil der Arbeit Beweise dafür, dass ST911 keine positiven Effekte in metabolischen Krankheitsmodellen ausübt. Dies liegt vermutlich in einem Aktivitätsverlust gegenüber den metabolischen Targetgenen von Resveratrol begründet. Des Weiteren unterstützen unsere Ergebnisse frühere Arbeiten, die zeigen konnten, dass ST911 an Tubulin bindet und die Polymerisation zu Mikrotubuli verhindert. Weiterhin bestätigen unsere Daten, dass die Methylierung von Resveratrol zu einer grundlegenden Veränderung des Wirkmechanismus dieser Substanzen führt, die von einem kompletten Verlust der metabolischen Aktivität begleitet wird. Dies sollte bei zukünftigen Leitstrukturoptimierungen mit Resveratrol berücksichtigt werden. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass Resveratrol die Gentranskription des nukleären Rezeptors SHP (aus dem Englischen: small heterodimer partner) stark induziert. Der Mechanismus dieser Induktion scheint von der Aktivität von AMPK und SIRT1 abhängig zu sein. Diese Ergebnisse konnten unser Verständnis der vielseitigen biologischen Wirkungen von Resveratrol erweitern. Dennoch sollte die Relevanz der SHP-Induktion für die Effekte von Resveratrol auf metabolische Krankheiten und Tumorwachstum noch weiter untersucht werden. Während der Experimente für den ersten Teil der Arbeit stellten wir fest, dass der AMPK-Inhibitor Compound C (CC) in der Lage war, die wachstumshemmende Wirkung von ST911 signifikant zu reduzieren. Die Untersuchung dieses sogenannten „Rescue-Effektes“ wird durch die Tatsache bestärkt, dass eine steigende Anzahl von Tumoren resistent gegenüber Chemotherapeutika ist. Außerdem fehlen spezifische Antidota für akute Intoxikationen mit Mitosehemmern. Daher zielten die folgenden Experimente darauf ab den Rescue-Effekt näher zu charakterisieren und die zugrundeliegenden Wirkmechanismen aufzuklären. Zunächst zeigten Knockdown-Experimente, dass der Rescue-Effekt unabhängig von der AMPK-inhibierenden Wirkung von CC vermittelt wird. Da CC ein ATP-kompetitiver Inhibitor der AMPK ist und zuvor bereits gezeigt wurde, dass es auch eine große Zahl anderer Kinasen inhibieren kann, vermuteten wir, dass der Rescue-Effekt mit diesen Off-Target-Effekten von CC zusammenhängt. Als nächstes testeten wir, ob die wachstumshemmenden Effekte von anderen Mitosehemmern auch durch CC aufgehoben werden können. Wir wählten verschiedene etablierte Substanzen, die dafür bekannt sind mit Mikrotubuli zu interagieren: Colchicin, das Vinca-Alkaloid Vinblastin, Disorazol A und das aus Taxus-Arten isolierte Paclitaxel. Die ersten drei dieser Substanzen haben eine depolymerisierende Wirkung auf die Mikrotubuli, während Paclitaxel zu einer stärkeren Polymerisierung führt. Zudem binden diese Substanzen an drei verschiedenen Bindestellen am Tubulin. Interessanterweise zeigten unsere Versuche, dass CC die antiproliferative Wirkung aller getesteten Mitosehemmer auf HT-29-Zellen, unabhängig von der Bindestelle, abschwächen kann. Des Weiteren konnte CC die Wirkung der pro-apoptotischen Substanz Staurosporin nicht reduzieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eher die tubulinbindenden, als die pro-apoptotischen Eigenschaften, von ST911 für den Rescue-Effekt verantwortlich sind. Um zu untersuchen, ob der Rescue-Effekt mit einer kompetitiven Bindung von CC und Mitosehemmern an Mikrotubuli erklärt werden kann, führten wir eine Immunfluoreszenzfärbung von ?-Tubulin durch. Wir konnten beobachten, dass die Tubulinpolymerisation und die Funktion des Spindelapparates in Zellen, die mit Mitosehemmern behandelt wurden, deutlich eingeschränkt waren. Außerdem stellten wir fest, dass CC nicht in der Lage ist die Zerstörung des Tubulingerüstes durch die Mitosehemmer zu verhindern. Eine Einzelbehandlung mit CC hatte keine Wirkung auf die Polymerisation des Tubulin zu Mikrotubuli. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass CC nicht direkt an Mikrotubuli binden kann, um mit den Mitosehemmern um eine Bindung zu kompetitieren. Um diese Hypothese zu stärken, führten wir, in Kooperation mit Dr. Jennifer Herrmann (Helmholtz Institut für Pharmazeutische Forschung, Saarbrücken) SPR-Experimente mit Chips durch, auf denen Tubulin immobilisiert wurde. Die Messungen zeigten, das CC nicht in der Lage war gebundenes Disorazol A von der Bindestelle am Tubulin zu verdrängen. Dies zeigte nun deutlich, dass der Rescue-Effekt nicht auf einer Kompetition von CC und Mitosehemmern um Tubulinbindestellen beruht. Zellzyklusanalysen zeigten, dass die kombinierte Behandlung mit ST911 und CC zu einer Abschwächung des durch ST911 verursachten G2/M-Arrestes führt. Da wir zuvor bereits eine Beeinflussung der direkten Targets von CC und Mitosehemmern, AMPK oder Tubulin, ausgeschlossen hatten, schlussfolgerten wir, dass CC vermutlich mit anderen zellulären Signalwegen interagiert, die zu den beschriebenen Veränderungen des Zellwachstums und der Zellzyklusprogression führen. Eine Literaturrecherche ergab, dass ein erhöhter intrazellulärer Polyaminspiegel, die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges oder eine erhöhte Aktivität des Transkriptionsfaktors c-Myc zu einer Abschwächung eines G2/M-Arrestes führen können. Daher fokussierten wir die weiteren Experimente auf die Untersuchung einer möglichen Beteiligung dieser Targets an der Vermittlung des Rescue-Effektes. Wir zeigten, dass CC die Expression der Spermidin/Spermin-N1-Acetyltransferase (SSAT) erhöhen kann. Die SSAT ist ein Enzym, das an der Biosynthese der Polyamine beteiligt ist. Zusätzlich beobachteten wir, dass die Behandlung mit CC nach 4 h zu einer Erhöhung von phosphoryliertem und damit aktiviertem Akt (pAkt) führt. Die zusätzliche Behandlung mit Wortmannin, einer Substanz, welche die Phosphorylierung von Akt hemmen kann, führte zu einer Abschwächung des Rescue-Effektes. Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass eine Aktivierung von Akt-Signalwegen und ein Einfluss auf die Polyaminbiosynthese, zumindest teilweise, mit dem Rescue-Effekt zusammenhängen können. Die Überexpression von c-Myc, einem Transkriptionsfaktor, der eng mit dem Akt-Signalweg und der Biosynthese von Polyaminen zusammenhängt, ist oft mit einer erhöhten Zellproliferation verbunden. Wir untersuchten die zellulären Proteinmengen von c-Myc mittels Western Blot und entdeckten, dass nach der Behandlung mit Mitosehemmern zusätzliche Banden für c-Myc auf den Blots auftauchten. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis auf eine posttranslationale Modifikation von c-Myc nach der Behandlung mit Mitosehemmern. Durch Kombination mit CC wurden die zusätzlichen Banden abgeschwächt und die Gesamtmenge an c-Myc-Protein nahm nach längeren Inkubationszeiten rapide ab. Dies legt nahe, dass die posttranslationale Modifikation von c-Myc zum Abbau des Proteins führt und, dass CC dies abschwächen kann. Verschiedene Arbeiten zeigten bereits, dass c-Myc phosphoryliert wird und nach Konjugation mit Ubiquitin vom Proteasom abgebaut wird. Daher überprüften wir, ob eine Inhibition des Proteasoms mit MG-132 zu einem ähnlichen Rescue-Effekt führt wie mit CC. Tatsächlich führte die Behandlung mit ST911 in Kombination mit MG-132 zu einer Zunahme der Zellproliferation, wie sie vorher bereits für CC beobachtet wurde. Dies bestärkte die Theorie, dass der proteasomale Abbau von c-Myc eine Rolle beim Rescue-Effekt spielen kann. Als nächstes untersuchten wir die Phosphorylierungen von c-Myc am Ser62 und Thr58. Diese Phosphorylierungen spielen eine wichtige Rolle beim Abbau von c-Myc, indem Sie das Protein für die Konjugation mit Ubiquitin markieren. Die densitometrische Auswertung der Western Blots ergab, dass die Behandlung mit ST911 initial zu einem Anstieg von phospho-c-Myc führt, dem eine schnelle Abnahme zu späteren Zeitpunkten folgt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass dieser Anstieg von phospho-c-Myc durch Kombination mit CC reduziert wurde. Dies unterstützt die Hypothese, dass ST911 den proteasomalen Abbau von c-Myc begünstigt und CC dies verhindern kann. Dies ist eine mögliche Erklärung für die erhöhte Zellproliferation, die für die durch CC „geretteten“ Zellen beobachtet wurde. Allerdings konnte das direkte Target, das für die Vermittlung des Rescue-Effektes durch CC verantwortlich ist, bisher nicht identifiziert werden. DYRKs (aus dem Englischen: Dual-specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinases) sind wichtige Regulatoren von Proteinstabilität und –abbau während der Zellzyklusprogression. Vor kurzem wurde gezeigt, dass DYRK1A und DYRK2 c-Myc am Ser62 phosphorylieren können und es dadurch für den proteasomalen Abbau markieren. Interessanterweise wurde CC bereits in einer früheren Publikation als potenter Inhibitor verschiedener DYRKs beschrieben. Allerdings wurde die Hemmung der DYRKs durch CC in diesem Artikel nur in einer einzelnen Konzentration getestet. Daher bestimmten wir in einem in-vitro-Kinaseassay in Kooperation mit Dr. Matthias Engel (Universität des Saarlandes, Saarbrücken) die IC50-Werte für CC gegenüber DYRK1A, DYRK1B und DYRK2. Unsere Ergebnisse zeigten deutlich, dass CC ein bevorzugter Inhibitor von DYRK1A und DYRK1B (IC50-Wert von etwa 1 µM) ist, aber auch DYRK2 hemmen kann (IC50-Wert von etwa 5 µM). Da sich die vermutete Bindestelle von CC in der stark konservierten Kinasedomäne befindet, ist eine unspezifische Inhibition verschiedener DYRKs nicht überraschend. Genexpressionsanalysen zeigten, dass HT-29 und HepG2 vergleichbare Mengen an DYRK1A exprimieren, während DYRK1B und DYRK2 deutlich weniger in HepG2 vorhanden sind. Vorige Experimente hatten gezeigt, dass HepG2 weniger sensitiv für ST911 und den durch CC vermittelten Rescue-Effekt waren. Wir schlussfolgerten, dass die unterschiedliche Expression der DYRK-Formen eine mögliche Erklärung für diese Unterschiede sein könnte. Daher entschieden wir uns für eine nähere Untersuchung von DRK1B und DYRK2. Experimente mit verschiedenen Inhibitoren der DYRKs zeigten, dass diese Substanzen, ähnlich wie CC, in der Lage waren die antiproliferative Wirkung von ST911 abzuschwächen. Diese Ergebnisse wurden in nachfolgenden Knockdown-Experimenten bestätigt. Dies legt nahe, dass die DYRKs zumindest teilweise für die Vermittlung des Rescue-Effektes verantwortlich sind. Zusammenfassend man kann sagen, dass der Rescue-Effekt vermutlich mit der Biosynthese von Polyaminen, dem Akt-Signalweg und dem proteasomalen Abbau von c-Myc zusammenhängt. Des Weiteren scheint die direkte Inhibition von DYRKs durch CC ein vielversprechender Ansatz für die Erklärung des Effektes zu sein. Allerdings konnte in keinem der Experimente eine kompletten Aufhebung des Rescue-Effektes durch CC gezeigt werden. Daher gehen wir davon aus, dass verschiedene Targets in die Vermittlung des Rescue-Effektes involviert sind. Dies ist höchstwahrscheinlich auf eine unspezifische, ATP-kompetitive Hemmung verschiedener Kinasen durch CC zurückzuführen. Nichtsdestotrotz, sind eine nähere Untersuchung von DYRKs im Rahmen der Therapieresistenz von Tumoren und eine genauere Aufklärung der am Rescue-Effekt beteiligten Signalwege eine interessantes Feld für weitere Untersuchungen.
The relevance of physiological immune aging is of great interest with respect to determining disorders with pathologic immune function in aging individuals. In recent years, the relevance of changes in peripheral lymphocytes in age-associated neurologic diseases has become more evident. Due to the lack of immunological studies, covering more than one event after mitogenic activation, we envisaged a new concept in the present study, aiming to investigate several events, starting from T cell receptor (TCR) ligation up to T cell proliferation. In addition, we addressed the question whether changes are present in the subsets (CD4, CD8) with aging. Phosphorylation of tyrosine residues declines with increasing age in CD4+ cells. Fewer levels of CD69 positive cells after 4 h mitogenic activation, altered expression of cytokines (IL2, IFN-gamma and TNF-alpha; 22 h) and lower proliferation (72 h) were determined in aging. Moreover, it could be shown that CD8+ lymphocytes react more effectively to mitogenic stimulation with reference to CD69 expression and proliferation in both age groups (<35 and >60 years old). These data indicate that T cell activation, mediated by TCR engagement, is significantly impaired in aging and both subsets are affected. However, bypassing the TCR does not fully restore T cell function, indicating that there are more mechanisms involved than impaired signal transduction through TCR only. The results will be discussed in relation to their relevance in neurodegenerative and psychiatric disorders.
The identification of specific genetic (presenilin-1 [PS1] and amyloid precursor protein [APP] mutations) and environmental factors responsible for Alzheimer's disease (AD) has revealed evidence for a shared pathway of neuronal death. Moreover, AD-specific cell defects may be observed in many other nonneuronal cells (e.g., lymphocytes). Thus, lymphocytes may serve as a cellular system in which to study risk factors of sporadic, as well as genetic AD in vivo. The aim of our present study was to clarify whether lymphocytes bearing genetic or sporadic risk factors of AD share an increased susceptibility to cell death. Additionally we examined whether a cell typespecific vulnerability pattern was present and how normal aging, the main risk factor of sporadic AD, contributes to changes in susceptibility to cell death. Here, we report that lymphocytes affected by sporadic or genetic APP and PS1 AD risk factors share an increased vulnerability to cell death and exhibit a similar cell type-specific pattern, given that enhanced vulnerability was most strongly developed in the CD4+ T-cell subtype. In this paradigm, sporadic risk factors revealed the highest impact on cell type-specific sensitivity of CD4+ T cells to apoptosis. In contrast, normal aging results in an increased susceptibility to apoptosis of both, CD4+ and CD8+ T cells.
Enhanced apoptosis and elevated levels of reactive oxygen species (ROS) play a major role in aging. In addition, several neurodegenerative diseases are associated with increased oxidative stress and apoptosis in neuronal tissue. Antioxidative treatment has neuro-protective effects. The aim of the present study was to evaluate changes of susceptibility to apoptotic cell death by oxidative stress in aging and its inhibition by the antioxidant Ginkgo biloba extract EGb761. We investigated basal and ROS-induced levels of apoptotic lymphocytes derived from the spleen in young (3 months) and old (24 months) mice. ROS were induced by 2-deoxy-D-ribose (dRib) that depletes the intracellular pool of reduced glutathione. Lymphocytes from aged mice accumulate apoptotic cells to a significantly higher extent under basal conditions compared to cells from young mice. Treatment with dRib enhanced this difference, implicating a higher sensitivity to ROS in aging. Apoptosis can be reduced in vitro by treatment with EGb761. In addition, mice were treated daily with 100mg/kg EGb761 per os over a period of two weeks. ROS-induced apoptosis was significantly reduced in the EGb761 group. Interestingly, this effect seemed to be more pronounced in old mice.
Apoptosis seems to be involved in immunosenescence associated with aging. Moreover, in lymphocytes (PBL) of patients with Alzheimer's disease, an increased susceptibility to the apoptotic pathway has been described possibly due to impaired protection of oxidative stress. Accordingly, it seemed to be of particular interest to investigate the contribution of normal aging to the susceptibility from human lymphocytes to programmed cell death. We could show that PBL from elderly individuals (>60 years) accumulate apoptosing cells to a significant higher extent in spontaneous and activation-induced cell death compared to younger controls (<35 years). Treatment with the oxidative stressor 2-deoxy-D-ribose or with agonistic-CD95-antibody pronounced this effect even more implicating a higher sensitivity to reactive oxygen species and a higher functional CD95 expression, respectively. In addition, expression of the activation markers HLA-DR and CD95 was significantly increased in CD3+-cells of aged subjects, while expression of CD25 did not seem to be affected by age. Expression of Bcl-2 was increased in aging and correlated with the number of apoptotic cells.
Pharmazeutische Proteomics
(2006)
Die vorliegende Arbeit setzt sich mit der Implementierung, Validierung und Anwendung der 2-dimensionalen Gelelektrophorese und der MALDI-TOF Massenspektrometrie unter pharmazeutischen Gesichtspunkten auseinander. Es wurde ein breites Spektrum aus dem Bereich der Pharmazeutischen Proteomics bearbeitet, beginnend mit einer detaillierten Methodenentwicklung für 2-DE, um die Methode zu optimieren, ihre Robustheit zu evaluieren und die Grenzen der Methode kennen zu lernen. Daran schließt sich eine Validierung für 2-DE / Silberfärbung an. Der Validierungsansatz orientiert sich an den üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie bei der Validierung analytischer Methoden untersuchten Parametern. Hierzu zählen Präzision, Linearität, Richtigkeit und Spezifität. Ferner wurden Untersuchungen angestellt, inwiefern Daten aus unterschiedlichen Labors zusammengefasst werden können. Zur Dokumentation wurde ein auf MS Access® basierendes Laborinformationssystem erstellt. Hiermit können die von verschiedenen Mitarbeitern erzeugten Daten einheitlich und nachvollziehbar erfasst werden. Nach der Etablierung der methodischen Grundlagen wurden unterschiedliche, pharmazeutisch relevante Fragestellungen mittels 2-DE und MALDI-TOF-MS bearbeitet. Proben unterschiedlicher Komplexität wurden untersucht, die Milch eines transgenen Kaninchens, welches bovines FSH exprimiert, wurde analysiert. Über diese Versuche wurde der Einstieg in die Analytik rekombinanter Arzneistoffe geschaffen. Die 2-DE eignet sich sehr gut um die bei posttranslational modifizierten rekombinanten Proteinen auftretende Mikroheterogenität abzubilden. 2-DE und MALD-TOF MS sind alternative Methoden zu denen, die im europäischen Arzneibuch für die Analytik rekombinanter Arzneistoffe beschriebenen werden. Erythropoietin, einer der weltweit umsatzstärksten rekombinanten Arzneistoffe, zu dem auch eine Monographie im EuAB existiert, wurde näher untersucht. Bei diesem Protein wurden die Zuckerseitenketten selektiv abgespalten und es wurde untersucht, welche Auswirkung die Zucker auf das eletrophoretische Verhalten des Erythropoietins haben. Eine MALDI-TOF-MS Analytik von Erythropoietin war auch erst nach Abspaltung der Zuckerseitenketten möglich. Die Sequenzabdeckung konnte durch Verdau mit unterschiedlichen Enzymen gesteigert werden. Eine Technologie zur Sequenzierung von Proteinen mittels MALDI-TOF-MS wurde mit CAFTM für rekombinantes Chicken Annexin V etabliert. Weitere rekombinante Proteine, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden, sind Interferon-alfa-2a, Interferon-alf-2b, rh-HCG, Trastuzumab und Rituximab. Das anti-apoptotischen Bcl-xL ist ein Zielprotein für den Einsatz von Antisense Oligonucleotiden in der Tumortherapie. Für dieses Protein wurde eine 2-DE / Western blot-Methode entwickelt, die als in vitro Testsystem für das Screening von Oligonucleotiden genutzt werden kann. Aus dem Bereich der klinischen Proteomics wurden Serum, CSF und Urinproben von Patienten mit Bence Jones Proteinämie untersucht und mit den üblicherweise in der Klinik verwendeten CE-Analysen verglichen. In einzelnen Fällen konnten in vermeintlich Bence Jones negativen Proben mittels 2-DE doch noch Bence Jones Proteine nachgewiesen werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass 2-DE und MALDI-TOF-MS vielseitig in der Pharmazie angewendet werden können. Die Komplexität eines jeden Proteoms und die physikochemische Heterogenität von Proteinen muss beachtet werden. In komplexen Proteinmischungen sind aufgrund sehr unterschiedlicher Konzentrationen, Löslichkeiten und der Heterogenität durch posttranslationale Modifikationen viele Proteine einem globalen 2-DE Ansatz nicht zugänglich, nichtsdestotrotz ist die 2-DE derzeit eine der leistungsfähigsten Methoden in der Proteomanalytik.
Dihydrocodein wird im wesentlichen zu Dihydrocodein-6-O-43-ß-glucuronid (DHC6G), Dihydromorphin (DHM), Dihydromorpbin-3-O-ß-D-glucuronid (DHM3G), Dihydromorphin-6-O-ß-D-glucuronid (DHM6G) und Nordihydrocodein (NDHC) biotransformiert. In Analogie zu Codein wird vermutet, dass die Metaboliten DHM und DHM6G pharmkologisch deutlich aktiver als die Muttersubstanz sind und somit zur Wirkung von DHC wesentlich beitragen können, auch wenn sie nur in geringen Mengen gebildet werden. Da die O-Demethylierung von Dihydrocodein zu Dihydromorphin durch das polymorphe Cytochrom P450-Enzym CYP2D6 katalysiert wird, sind in EM (schnelle Metabolisierer) und PM (langsame Metabolisierer, weisen kein funktionelles CYP2D6-Enzym auf) unterschiedliche Metabolitenprofile zu beobachten. In etwa 5-10% der Kaukasier, die PM für CYP2D6 sind, könnte sich somit ein Therapiemisserfolg nach Gabe von therapeutisch empfohlenen Standarddosen an DHC einstellen. Es war daher Ziel der vorliegenden Arbeit, die Bedeutung der Biotransformation für die Wirkung von Dihydrocodein beim Menschen zu untersuchen. Im Rahmen dieser Untersuchung wurden Affinitätsprofile an Hirnmembranpräparationen und Affinitäts- und Aktivitätsprofile an humanen Neuroblastomzellen für DHC und seine Metaboliten erstellt. Des weiteren wurden pharmakokinetische und pharmakodynamische Parameter (und deren Zusammenhang) von Dihydrocodein und seinen Metaboliten beim gesunden Menschen unter Berücksichtigung des CYP2D6-Phänotyps mit Hilfe einer Pilot-Probandenstudie bestimmt. Zuletzt wurden die Ergebnisse der Affinitäts- und Aktivitätsversuche mit den Ergebnissen der Probandenstudie unter Berücksichtigung der verfügbaren Literaturdaten in Zusammenhang gebracht. Di in vitro-Untersuchungen zeigten, dass alls Prüfsubstanzen mit Ausnahme des unwirksamen DHM3G vorwiegend u-selektive Agonisten waren und dass das prinzipielle Verhältnis der Affinitäten bzw. Aktivitäten der einzelnen aktiven Prüfsubstanzen zueinander in allen Untersuchungen annähernd gleich war. Auf Grundlage dieser Daten konnte folgender Grundsatz formuliert werden; Die Affinitäten/Aktivitäten von DHM und DHM6G waren etwa um den Faktor 100 größer als die von DHC, während die anderen Metaboliten (mit Ausnahme des unwirksamen DHM3G) vergleichbare Affinitäten/Aktivitäten besaßen. Die im Rahmen der Probandenstudie ermittelten pharmakokinetischen Werte bestätigten verfügbare Literaturdaten, insbesondere dass CYP2D6 wesentlich für die Bildung von DHM war. So konnten weder DHM, DHM3G noch DHM6G in Plasma und Urin von PM detektiert werden. Die pharmakodynamischep Untersuchungen mittels Pupillometrie zeigten einen signifikanten Unterschied im ursprünglichen Pupillendurchmesser an den Zeitpunkten 1 bis 6 Stunden zwischen Placebo einerseits und EM bzw. PM andererseits. Damit konnte zunächst eine eigene in vivo-Wirkung von DHC beim Menschen nachgewiesen werden. Jedoch ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen EM und PM. Im zweiten pharmakodynamischen Modell (Schmerzmodell) konnten bezüglich der Parameter R-III-Reflexschwelle und VAS-EC30 keine Unterschiede sowohl zwischen EM und PM als auch zwischen Placebo und EM bzw. PM festgestellt werden, so dass 60 mg DHC keine analgetische Wirkung hatte oder das Modell für die Ermittlung der analgetischen Potenz von 60 mg DHC ungeeignet war. Einschränkend muss jedoch hier erwähnt werden, dass die Studie aufgrund der kleinen Fallzahl nur Pilotcharakter aufwies. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit in Zusammenhang mit den verfügbaren Literaturdaten lassen die Schlussfolgerung zu, dass die pharmakologisch wesentlich aktiveren Metaboliten DHM und DHM6G nicht oder nur geringfügig zur Wirkung von DHC nach oraler Einzelgabe von 60 mg DHC beitragen. Gründe hierfür könnten die geringe Bildung von DHM und seinen Metaboliten (ca. 9%) und/oder durch Verteilung und Ausscheidung bedingte niedrige Konzentrationen am Rezeptor in vivo sein. Somit scheint die Biotransformation keine Bedeutung für die Wirkung von DHC zu haben. Entsprechend sind keine Unterschiede in der Therapie von EM und PM mit niedrigen therapierelevanten DHC-Dosen zu erwarten.
LC-MS/MS-Systeme haben sich in den vergangenen Jahren trotz der hohen Anschaffungskosten von mehreren hunderttausend Euro zu einer Standardmethode in analytischen Laboratorien entwickelt und bieten im Vergleich zu herkömmlicher HPLC mit UV- und Fluoreszenz-Detektoren eine höhere Sensitivität und bessere Selektivität. Aufgrund dieser Vorteile war es das Ziel dieser Arbeit, verschiedene LC-MS/MS-Methoden zu entwickeln, mit der Eicosanoide sensitiv und selektiv in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten quantifiziert werden können und diese Assays dann in biologischen Fragestellungen einzusetzen. Ein Problem der Eicosanoidanalytik mittels LC-MS/MS besteht in der Strukturähnlichkeit vieler Prostaglandine, die große Schwierigkeiten während einer Methodenentwicklung verursachen. Zwei sehr wichtige Prostaglandine, PGE2 und PGD2, besitzen das gleiche Fragmentspektrum und können nicht über das Selektionsprinzip des Tandem-Massenspektrometers quantifiziert werden, sondern müssen vor der Detektion chromatographisch getrennt werden. Die chromatographischen Bedingungen, die für eine Trennung von PGE2 und PGD2 nötig sind, gehen allerdings mit einem erheblichen Empfindlichkeitsverlust des Massenspektrometers einher. Die beste Empfindlichkeit wurde mit einem neu entwickelten Säulenmaterial, Synergi Hydro-RP, erreicht, was in allen entwickelten Methoden verwendet wurde. Zur Quantifizierung von PGE2 und PGD2 in Mikrodialysaten (max. Volumen 75 µl) musste eine Empfindlichkeit von mindestens 40 pg/ml PGE2 erreicht werden. Nach der Validierung des Systems konnte eine Quantifizierungsgrenze von PGE2 und PGD2 von 25 pg/ml bzw. 50 pg/ml erreicht werden. Bei Formalin-behandelten Ratten stieg PGE2 innerhalb von 15 Minuten auf 380 pg/ml an, womit frühere Ergebnisse, die auf der Verwendung von Immunoassays basieren, bestätigt werden konnten. Für PGD2 konnte kein Unterschied zu Kontroll-Ratten festgestellt werden und ist deswegen im Gegensatz zu PGE2 nicht an der Nozizeption im untersuchten Modell beteiligt. Mit Hilfe des mPGES-1-Enzym-Assays wurde mPGES-1 als ein weiteres Target für die drei COX-Inhibitoren Celecoxib, R- und S-Flurbiprofen identifiziert. Da mit Celecoxib ab einer Konzentration von 100 µM keine weitere Hemmung der mPGES-1 erreicht werden kann, hemmt Celecoxib die mPGES-1 wohl nicht kompetitiv und bindet nicht im katalytischen Zentrum der mPGES-1. Für Rofecoxib und Paracetamol konnte keine Hemmung der mPGES-1 festgestellt werden. Während der Methodenentwicklung wurde ein Störpeak zwischen PGE2 und PGD2 beobachtet, der in den Versuchen immer im gleichen Verhältnis zu PGE2 gebildet wurde. Mit Hilfe eines Fingerprints wurde dieser Störpeak als 5-trans-PGE2 identifiziert, welches ein bisher nicht beschriebenes Nebenprodukt der mPGES-1 zu sein scheint. In der letzten Methode sollte eine Methode entwickelt werden, mit der PGE2, PGD2, PGF2alpha, 6-keto-PGF1alpha und TXB2 in Humanplasma bestimmt werden können. Im direkten Vergleich war die validierte LC-MS/MS-Methode einem handelsüblichen Immunoassay überlegen. Zum einem waren die Standardabweichungen der LC-MS/MS-Methode wesentlich niedriger und zum anderen waren die Basalwerte des Immunoassays unphysiologisch hoch. In einer Studie wurde der Einfluss einer Mutation (-765G -> C) im Promotor der COX-2 auf die COX-2-Aktivität untersucht, für die eine reduzierte COX-2-Expression um den Faktor 2 in Monozyten beschrieben wurde. Zwischen den 2 Gruppen konnten weder in den Prostaglandin-Konzentrationen, der COX-2-mRNA-Expression noch in der COX-2-Protein-Expression statistische Unterschiede festgestellt werden und stehen damit im Widerspruch zu bisherigen Veröffentlichungen. Die entwickelten LC-MS/MS-Methoden ermöglichen eine bessere Sensitivität und schnellere Analysenzeiten im Vergleich zur HPLC und durch ihre gute Sensitivität kann der Einsatz von problematischen Immunoassays vermieden werden. Im Falle der Mikrodialysemethode, wo PGE2 in einer relativ einfachen Matrix bestimmt werden sollte (ACSF), liefert die LC-MS/MS-Methode die gleichen Ergebnisse. Im Falle von Humanplasma ist der Immunoassay allerdings unbrauchbar. Ein weiterer Vorteil der LC-MS/MS-Methoden gegenüber Immunoassays besteht darin, dass mehrere Prostaglandine in einer einzigen Probe bestimmt werden können. Gegenüber GC-MS und GC-MS/MS-Methoden fehlt den LC-MS/MS-Methoden zwar einiges an Empfindlichkeit, allerdings wird hierfür keine Derivatisierung benötigt.
Die NO/cGMP-Kaskade spielt bei der nozizeptiven Transmission im Hinterhorn des Rückenmarks eine wichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden bekannte cGMP-Targets (PKG-1, CNG-Kanäle, PDE-2 und -3) sowie synaptische Vesikelproteine (Synapsin 2, Rabphilin) als potentielle Targets der NO/cGMP-Kaskade mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden und nozizeptiven Verhaltensstudien hinsichtlich einer Beteiligung an der nozizeptiven Transmission im Rückenmark untersucht. Im Formalintest reduzierte der PKG-1-Inhibitor Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,5 µmol i.t.) die nozizeptive Antwort, während der PKG-1-Aktivator 8-Br-cGMP in hoher Dosis (2,5 µmol i.t.) einen gegenteiligen Effekt zeigte. Überraschenderweise wirkte 8-Br-cGMP in niedriger Dosis (0,1 - 0,25 µmol i.t.) antinozizeptiv, was durch die gleichzeitige Applikation des PKG-Inhibitors weiter verstärkt wurde. Im Gegensatz zu Rp-8-Br-cGMPS oder 8-Br-cGMP beeinflussten weder der CNG-Kanal-Inhibitor L-cis-Diltiazem (0,5 mg i.t.), noch die PDE-Inhibitoren EHNA (0,25 µmol i.t.) oder Milrinon (5 - 10 mg/kg i.p.) die nozizeptive Antwort im Formalintest. Mit Western Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Formalininjektion in eine Hinterpfote im Lumbalmark nach 48 - 96 h eine Steigerung der PKG-1-Proteinkonzentration zur Folge hat. Dies wurde durch Vorbehandlung der Versuchstiere mit Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,5 µmol i.t.) oder Morphin (2,5 - 5 mg/kg i.p.) verhindert, während 8-Br-cGMP (2,5 µmol i.t.) die Formalin-induzierte Steigerung der PKG-1-Konzentration im Lumbalmark verstärkte. Die Formalininjektion in eine Hinterpfote veränderte auch die Synapsin 2b-Konzentration im Lumbalmark: 10 min bis 8 h nach der Injektion wurde die Synapsin 2b-Proteinkonzentration gesenkt, nach 48 h war jedoch eine Zunahme zu beobachten. Diese späte Zunahme der Synapsin 2b-Proteinkonzentration wurde durch eine Steigerung der Genexpression hervorgerufen, denn mit quantitativer Realtime RT-PCR wurden erhöhte mRNA-Konzentrationen 24 - 48 h nach der Formalininjektion gemessen. Die rasche Formalin-induzierte Abnahme der Synapsin 2b-Proteinkonzentration ging jedoch weder mit Änderungen der mRNA-Konzentration, noch mit veränderten Solubilisierungseigenschaften bei der Proteinaufbereitung einher, und wurde durch Vorbehandlung der Versuchstiere mit Morphin (10 mg/kg i.p.), Diclofenac (10 mg/kg i.p.), Metamizol (1 g/kg i.p.) oder dem NOS-Inhibitor L-NAME (10 - 100 mg/kg i.p.) verhindert. Demgegenüber führte die Vorbehandlung mit dem NO-Donor NOC-5 (4 - 20 µg i.t.), 8-Br-cGMP (0,1 - 2,5 µmol i.t.), Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,25 µmol i.t.) oder der Kombination von 8-Br-cGMP und Rp-8-Br-cGMPS (0,1 + 0,1 und 0,5 + 0,5 µmol i.t.) zu einer Verstärkung der Formalin-induzierten raschen Senkung der Synapsin 2b-Konzentration. Die funktionelle Relevanz dieser Befunde wurde in mehreren nozizeptiven Tiermodellen überprüft. Durch eine kontinuierliche i.t. Infusion von Antisense-Oligonukleotiden wurde die Synapsin 2-Konzentration im Lumbalmark der Ratte gesenkt, was eine Reduktion der nozizeptiven Antwort im Formalintest zur Folge hatte. Bei Synapsin 2-Knockout-Mäusen war im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine verminderte nozizeptive Antwort im Formalintest und eine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie bei Zymosan-induzierter Pfotenentzündung zu beobachten. Im Hot-Plate-Test zeigten die Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen kürzere Latenzzeiten. Im Gegensatz zu Synapsin 2b wurde die Rabphilin-Konzentration im Lumbalmark durch Formalininjektion in eine Hinterpfote nicht beeinflusst. Allerdings führte die Verabreichung von Metamizol (500 mg/kg i.p.) oder Diclofenac (5 mg/kg i.p.) nach 1 h zu einer Steigerung der Rabphilin-Proteinkonzentration, welche nicht von Änderungen der mRNA-Expression begleitet war. Eine Senkung der Rabphilin-Proteinkonzentration wurde durch Applikation von NOC-5 (4 - 20 µg i.t.), 8-Br-cGMP (0,5 - 2,5 µmol i.t.), oder Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,25 µmol i.t.) hervorgerufen. Zusammenfassend bestätigen diese Ergebnisse die Hypothese, dass im Rückenmark PKG-1 einen Effektor der NO-induzierten Hyperalgesie darstellt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass NO/cGMP über noch unbekannte Mechanismen die Verfügbarkeit bestimmter synaptischer Vesikelproteine moduliert, die vor allem bei starker oder anhaltender nozizeptiver Erregung für die Transmitterausschüttung und damit für die nozizeptive Transmission notwendig sind. Interessanterweise führt NO/cGMP über diese Mechanismen eher zur Hemmung der Nozizeption, was die bei niedrigen intrathekalen Dosen beobachteten antinozizeptiven Effekte von 8-Br-cGMP erklären kann. Die These der NO-induzierten Hyperalgesie kann aufgrund der Untersuchungen in dieser Arbeit und früherer Studien um eine insbesondere in niedriger Dosis auftretende NO/cGMP-vermittelte Antinozizeption erweitert werden.
Oral presentation from 4th International Conference of cGMP Generators, Effectors and Therapeutic Implications ; Regensburg, Germany. 19–21 June 2009 Background: An exaggerated pain sensitivity is the dominant feature of inflammatory and neuropathic pain both in the clinical setting and in experimental animal models. It manifests as pain in response to normally innocuous stimuli (allodynia), increased response to noxious stimuli (hyperalgesia) or spontaneous pain, and can persist long after the initial injury is resolved. Research over the last decades has revealed that several signaling pathways in the spinal cord essentially contribute to the pain sensitization. To test the contribution of cGMP produced by NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) to pain sensitization, we investigated the localization of NO-GC in the spinal cord and in dorsal root ganglia, and we characterized the nociceptive behavior of mice deficient in NO-GC (GC-KO mice). Results: We show that NO-GC (β1 subunit) is distinctly expressed in neurons of the mouse spinal cord, while its distribution in dorsal root ganglia is restricted to non-neuronal cells. GC-KO mice exhibited a considerably reduced nociceptive behavior in models of inflammatory or neuropathic pain, but their responses to acute pain were not impaired. Moreover, GC-KO mice failed to develop pain sensitization induced by spinal administration of drugs releasing NO. Surprisingly, during spinal nociceptive processing cGMP produced by NO-GC may activate signaling pathways different from cGMP-dependent protein kinase I (cGKI), while cGKI can be activated by natriuretic peptide receptor-B (NPR-B) dependent cGMP production. Conclusion: Taken together, our results provide evidence that NO-GC has a dominant role in the development of exaggerated pain sensitivity during inflammatory and neuropathic pain. Furthermore, beside the NO-mediated cGMP synthesis, cGMP produced by NPR-B contributes to pain sensitization by activation of cGKI.
The experience of pain is mediated by a specialized sensory system, the nociceptive system. There is considerable evidence that the cGMP/cGMP kinase I (cGKI) signaling pathway modulates the nociceptive processing within the spinal cord. However, downstream targets of cGKI in this context have not been identified to date. In this study we investigated whether cysteine-rich protein 2 (CRP2) is a downstream effector of cGKI in the spinal cord and is involved in nociceptive processing. Immunohistochemistry of the mouse spinal cord revealed that CRP2 is expressed in superficial laminae of the dorsal horn. CRP2 is colocalized with cGKI and with markers of primary afferent C fibers. Importantly, the majority of CRP2 mRNA-positive dorsal root ganglion (DRG) neurons express cGKI and CRP2 is phosphorylated in a cGMP-dependent manner. To elucidate the functional role of CRP2 in nociception, we investigated the nociceptive behavior of CRP2-deficient (CRP2-/-) mice. Touch perception and acute thermal nociception were unaltered in CRP2-/- mice. However, CRP2-/- mice showed an increased nociceptive behavior in models of persistent pain as compared to wild type mice. Intrathecal administration of cGKI activating cGMP analogs increased the nociceptive behavior in wild type but not in CRP2-/- mice, indicating that the presence of CRP2 was essential for cGMP/cGKI-mediated nociception. These data indicate that CRP2 is a new downstream effector of cGKI-mediated spinal nociceptive processing and point to an inhibitory role of CRP2 in the generation of inflammatory pain.
First paragraph (this article has no abstract) Persistent stimulation of nociceptors results in sensitization of nociceptive sensory neurons, which is associated with hyperalgesia and allodynia. The release of NO and subsequent synthesis of cGMP in the spinal cord are involved in this process. cGMP-dependent protein kinase I (PKG-I) has been suggested to act as a downstream target of cGMP, but its exact role in nociception hadn't been characterized yet. To further evaluate the NO/cGMP/PKG-I pathway in nociception we assessed the effects of PKG-I inhibiton and activaton in the rat formalin assay and analyzed the nociceptive behavior of PKG-I-/- mice. Open access article.
Neuropathic pain is a debilitating and commonly treatment-refractory condition requiring novel therapeutic options. Accumulating preclinical studies indicate that the potassium channel Slack (KNa1.1) contributes to the processing of neuropathic pain, and that Slack activators, when injected into mice, ameliorate pain-related hypersensitivity. However, whether Slack activation might reduce neuropathic pain in humans remains elusive. Here, we evaluated the tolerability and analgesic efficacy of loxapine, a first-generation antipsychotic drug and Slack activator, in neuropathic pain patients. We aimed to treat 12 patients with chronic chemotherapy-induced, treatment-refractory neuropathic pain (pain severity ≥ 4 units on an 11-point numerical rating scale) in a monocentric, open label, proof-of-principle study. Patients received loxapine orally as add-on analgesic in a dose-escalating manner (four treatment episodes for 14 days, daily dose: 20, 30, 40, or 60 mg loxapine) depending on tolerability and analgesic efficacy. Patient-reported outcomes of pain intensity and/or relief were recorded daily. After enrolling four patients, this study was prematurely terminated due to adverse events typically occurring with first-generation antipsychotic drugs that were reported by all patients. In two patients receiving loxapine for at least two treatment episodes, a clinically relevant analgesic effect was found at a daily dose of 20–30 mg of loxapine. Another two patients tolerated loxapine only for a few days. Together, our data further support the hypothesis that Slack activation might be a novel strategy for neuropathic pain therapy. However, loxapine is no valid treatment option for painful polyneuropathy due to profound dopamine and histamine receptor-related side effects.
Clinical Trial Registration: www.ClinicalTrials.gov, identifier NCT02820519.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die möglichen positiven Effekte mediterraner Pflanzenextrakte auf oxidative Stress-Parameter im Gehirn zu untersuchen. Die Extrakte wurden im Rahmen eines EU-Projektes durch in vitro-Screenings aus einer Vielzahl, in Italien, Griechenland und Spanien gesammelten nicht-kulivierten Pflanzen, ausgesucht und hinsichtlich ihres Potentials verschiedene antioxidative Faktoren zu beeinflussen in einem in vivo-Mausmodell geprüft. Insgesamt sind 127 Pflanzen, die von der lokalen Bevölkerung mediterraner Länder traditionell verzehrt werden in 12 in vitro-Test untersucht worden. Darunter waren radikal- und Enzym-beeinflussende Tests und Versuchsansätze um antikanzerogene oder DNA-schädigende Eigenschaften zu überprüfen. Nach Auswahl von 12 potentiellen Extrakten für die Fütterungsexperimente, wurden auf Grund von weiteren Screenig-Tests wie z.B. das Potential der Extrakte eine Rigidisierung der Membranen oder Lipidperoxidation zu verhindern, die möglichen Kandidaten für die in vivo-Versuche weiter eingegrenzt. Zur Auswahl der drei Extrakte Reichardia picroides, Urospermum picroides und Thymus piperella kam es letztendlich durch die guten Ergebnisse in den Vorversuchen und durch den Ausschluss von ebenfalls positiven Extrakten, die toxische Eigenschaften im MTT-Test gezeigt hatten. Zur in vivo-Untersuchung der drei Extrakte wurden weibliche NMRI-Mäuse für drei Monate mit jeweils einem der Pflanzenextrakte gefüttert. Danach wurden sämtliche Parameter in jungen (6 Monate) und alten (21 Monate) NMRI-Mäusen untersucht, um altersbedingte Unterschiede hinsichtlich der Wirkung der Extrakte festzustellen. Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen an Hirnhomogenaten und dissoziierten Neuronen von NMRI-Mäusen, dass es mit zunehmendem Alter zur Aktivierung verschiedener antioxidativer Abwehrmechanismen kommt. Diese dienen dazu ROS-Level auf einem möglichst unschädlichen Niveau zu halten. Hier spielen vor allem die erhöhten Enzym-Aktivitäten eine wichtige Rolle, die die reaktiven Spezies zu einem relativ frühen Zeitpunkt abfangen und so z.B. eine vermehrte Schädigung der Lipidmoleküle verhindern. Bei den in Fütterungsexperimenten untersuchten Extrakten handelte es sich um die mit Ethanol extrahierten Inhaltsstoffe aus den Pflanzen (Reichardia picroides, Urospermum picroides und Thymus piperella). Die drei Extrakte wiesen variierende Polyphenolgehalte und eine unterschiedliche Zusammensetzung ihre Inhaltsstoffe, die Flavonoide betreffend auf. Alle drei Pflanzenextrakte zeigten unterschiedlich starke Effekte auf die gemessenen Parameter und machten deutlich wie wenig eine positive Wirkweise von pflanzlicher Ernährung verallgemeinert werden kann. Die besten Ergebnisse zeigte dabei der Reichardia-Extrakt.
Dysregulation of lysophosphatidic acids in multiple sclerosis and autoimmune encephalomyelitis
(2017)
Bioactive lipids contribute to the pathophysiology of multiple sclerosis. Here, we show that lysophosphatidic acids (LPAs) are dysregulated in multiple sclerosis (MS) and are functionally relevant in this disease. LPAs and autotaxin, the major enzyme producing extracellular LPAs, were analyzed in serum and cerebrospinal fluid in a cross-sectional population of MS patients and were compared with respective data from mice in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, spontaneous EAE in TCR1640 mice, and EAE in Lpar2 -/- mice. Serum LPAs were reduced in MS and EAE whereas spinal cord LPAs in TCR1640 mice increased during the ‘symptom-free’ intervals, i.e. on resolution of inflammation during recovery hence possibly pointing to positive effects of brain LPAs during remyelination as suggested in previous studies. Peripheral LPAs mildly re-raised during relapses but further dropped in refractory relapses. The peripheral loss led to a redistribution of immune cells from the spleen to the spinal cord, suggesting defects of lymphocyte homing. In support, LPAR2 positive T-cells were reduced in EAE and the disease was intensified in Lpar2 deficient mice. Further, treatment with an LPAR2 agonist reduced clinical signs of relapsing-remitting EAE suggesting that the LPAR2 agonist partially compensated the endogenous loss of LPAs and implicating LPA signaling as a novel treatment approach.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes, converting arachidonic acid to 5-HPETE, and in a second step 5-HPETE to leukotriene A4. Although the 5-LO promoter possesses characteristics of so called housekeeping genes, such as lack of TATA/CCAAT boxes and existence of several Sp1 binding sites, the 5 -LO gene is tissue specifically expressed in primarily immune competent cells of myeloid origin including granulocytes, monocytes, macrophages, mast cells and B-lymphocytes. 5-LO gene expression in MM6 and HL-60 cells is strongly induced after differentiation of the cells with TGF-beta and 1,25(OH)2D3. In some monocytic cancer cell lines, such as HL-60 TB and U937, TGF-beta and 1,25(OH)2D3 treatment are not able to activate 5-LO gene transcription. It was demonstrated, that in these cell lines the 5-LO core promoter is heavily methylated and that only demethylation by the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2 deoxycytidine (Adc) upregulated the 5-LO mRNA levels. It was also shown that the histone deacetylase inhibitor TsA could induce 5-LO mRNA levels, but only in 1,25(OH)2D3/TGF-beta inducible MM6 cells. Interestingly the 1,25(OH)2D3/TGF-beta effect on 5-LO expression is reduced, when combined with TsA. Reporter gene assays revealed that 5-LO promoter activity is strongly induced after 24 h treatment with 330 nM TsA (construct N10 up to 35 fold in HeLa cells). The effect is dependent on the presence of the proximal Sp1 binding site GC4 (-53 bp to –48 bp in relation to the major TIS) in both HeLa and MM6 cells. In vitro binding of the transcription factor Sp1 to this site has been demonstrated in gel shift assays and DNase I footprints. Mutation of the binding site resulted in a loss of basal promoter activity in both 5-LO negative HeLa cells and in 5-LO positive MM6 cells, as well as in the loss of TsA inducibility. The mutational study of different Sp1 binding sites in a larger promoter context revealed the interaction or respectively the additive effect of the multiple Sp1 binding sites of the 5-LO promoter on basal as well as on TsA upregulated promoter activity. However, GC4 seems to be of special relevance for both the basal promoter activity, possibly recruiting the basal transcription machinery, as well as for the TsA induced upregulation of 5-LO promoter activity. TsA does not alter the protein expression levels of Sp1 and Sp3 as investigated in Western blot analysis, neither in HeLa nor in MM6 cells. DNA affinity purification assays revealed that TsA had no effect on the DNA affinity of Sp1 or Sp3. In vitro binding of both Sp1 and Sp3 to the 5-fold GC box, GC4 and GC5 was demonstrated by DAPA analysis, but histone deacetylase inhibition did not change the associated protein amounts. Finally, in vivo binding of Sp1 and Sp3 was investigated in chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) in MM6 cells. TsA clearly induced the association of both proteins to the promoter area surrounding the TIS. Upon TsA treatment also RNA polymerase II binding to the area surrounding the TIS (-318 to +52 bp) was increased and even initiated in the more distal promoter parts –1049 to –292 bp, which are negatively regulated in reporter gene assays. Interestingly histone H4 is already highly acetylated without TsA treatment and the acetylation status of H4 remains unchanged after histone deacetylase inhibition, indicating an open chromatin structure of the 5-LO gene in MM6 cells. In a cotransfection study with Sp1 and Sp3, the transactivating potential of factors was investigated and in accordance with the ChIP data, Sp1 and Sp3 increased the promoter activity, but only after TsA treatment. In gel shift assays, the influence of DNA methylation on Sp1 binding was investigated. The results indicate different roles for the three proximal promoter sites. Whereas Sp1 binding to the 5-fold GC box and GC4 is impaired by DNA methylation, binding to GC5 is even increased. A cotransfection study with methylated 5-LO promoter constructs and the murine methyl-CpG binding proteins suggest MBD1 involvement in the regulation of the 5-LO promoter. Since in gel shifts Sp1 binding is inhibited by DNA methylation, at least to the 5-fold GC box and the activating element GC4, and similarly the mutation/deletion of the same sites strongly reduces or inhibits promoter activity, it is likely to assume, that the loss of promoter activity after in vitro methylation is in the first place due to impaired Sp1/Sp3 binding. Together the data underline the importance and complexity of Sp1/Sp3 binding to the GC rich sites in the regulation of 5-LO promoter activity in response to the histone deacetylase inhibitor TsA as well as in respect to DNA methylation.
Die Transkription ist ein entscheidender Schritt in der Transition der genetischen Information, welche durch die DNA codiert und im Genom hinterlegt ist, zu dreidimensionalen Funktionseinheiten in der Zelle, den Proteinen. Während der Transkription wird die Information von der Ebene der DNA in RNA umgewandelt, welche in der Zelle zusätzlich zu dessen Rolle als Informationsmediator in Form der mRNA eine Vielzahl von Funktionen ausübt. Die Transkription benötigt in Hinblick auf ihre essentielle Rolle in der Errichtung des Proteoms und der notwendigen Adaption von Genexpressionsprogrammen an externe zelluläre Stimuli, den Zellzyklus etc. eine präzise und gleichzeitig flexible Regulation. Besonders für die Transkription von mRNA dient die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAP II) in diesem Prozess als eine zentrale Einheit, die einer Vielzahl regulativer Mechanismen wie post-translationaler Modifikationen und der Assemblierung dynamischer Proteinkomplexe unterliegt. Während Komponenten dieser Regulation wie die Zusammensetzung und Dynamik des Prä-Initiationskomplex bereits seit Jahrzehnten beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAP II-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAP II bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Initiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieser Blockade wird durch den positiven Transkriptions-elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAP II und assoziierter Faktoren die produktive Elongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch eine inaktivierende Assoziation mit Speicherkomplexen. P-TEFb wurde abseits dieser Komplexe in einer Vielzahl von Elongations-assoziierten Proteinkomplexen identifiziert, der Mechanismus der Transition aus dem inaktiven Speicherkomplex zur aktiven Form an der RNAP II war jedoch unbekannt.
Ein zentrales Element aller aktiven Komplexe ist die Anwesenheit von Proteinen der AF4/FMR2-Familie, darunter das AF4 Protein. Bemerkenswerterweise war die genaue Rolle dieses Proteins in den Komplexen bisher unbekannt oder wurde lediglich auf die strukturelle Integrität der Komplexe beschränkt. AF4 und speziell dessen N-Terminus ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die t(4;11)(q21;q23) chromosomalen Translokation bedingter, akuter lymphoblastischer Leukämie assoziiert.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das AF4 Protein und im Speziellen sein N-Terminus in der Lage ist, die zelluläre Transkription durch die Aktivierung und Rekrutierung von P-TEFb zu aktivieren. In Anwesenheit von AF4 wird die Kinase-Untereinheit CDK9 des P-TEFb post-translational an Lysinresten modifiziert und damit aktiviert sowie die C-terminale Domäne der RNAP II im Kontext stärker phosphoryliert. Gleichzeitig wurde das P-TEFb inaktivierende Protein HEXIM1 stärker exprimiert. AF4 und AF4-MLL waren weiterhin in der Lage ein Elongations-kontrolliertes Reportergen zu aktivieren. Gleichzeitig führte die Überexpression des AF4 zu einer Erhöhung der zellulären RNA Menge. Zur genaueren Untersuchung der AF4-abhängigen Mechanismen wurden zwei Zelllinien erstellt, die zum Einen eine induzierbare und reproduzierbare Überexpression und Reinigung des AF4 erlaubten (TCZP-AF4ST) und zum Anderen durch lentiviralen knock-down eine an AF4-Mangelsituation nachstellten (AF4kd V100). Es konnte so gezeigt werden, dass AF4 über P-TEFb hinaus eine regulative Funktion gegenüber Transkription-assoziierten Faktoren wie CDK7, MENIN und NF?B besitzt und dass diese Faktoren vorrangig, analog zu P-TEFb, mit dem N-Terminus des AF4 interagieren. Die Überexpression von AF4 führte über die Bindung an die 7SK snRNA und deren Degradation zur Rekrutierung des P-TEFb aus den Speicherkomplexen in distinkte AF4-assoziierte Komplexe und zu einer Umverteilung des Faktors auf distinkte Loci im Zellkern, wobei der AF4 N-Terminus für sich alleine jedoch nicht in der Lage war, diese Funktion auszuüben. Im Falle eines Mangels an AF4 kam es zur Wachstumsretardierung der Zellen sowie zu einem völligen Aktivitätsverlust in Reportergenversuchen.
Die Tatsache, dass AF4 ein zentrales Element in der Elongationskontrolle darstellt führte zu der weitergehenden Vermutung, dass virale immediate early (IE) Proteine zur Kontrolle viraler Genexpression auf der Ebene der Elongation ebenfalls auf dieses Wirtsprotein zugreifen können. Es konnte vor diesem Hintergrund gezeigt werden, dass AF4 tatsächlich mit den IE-Proteinen IE1 (HCMV) und Zta (EBV) aus der Familie der Herpesviren interagiert und durch die Stabilisierung des AF4 Proteins eine kooperative, transaktivierende Funktion auf ein ALOX5 Reportergen ausgeübt wurde. Es wurde gezeigt, dass die viralen IE-Proteine dabei Komponenten der AF4 Komplexe sind und in der Zelle zur epigenetischen Regulation des ALOX5 Gens führen. Weiterhin konnte in diesen Experimenten dargestellt werden, dass AF4 über seine Rolle in der Elongationskontrolle hinaus auch distinkte Effekte in der Aktivierung von Promotoren und damit in der Initiation der Transkription zeigt. Damit konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal die essentielle Rolle des AF4 Proteins in der Elongationskontrolle und der Initiation der Transkription als auch in der Infektion durch Herpesviren gezeigt werden.
Die vorliegende Arbeit setzt sich mit den Auswirkungen der Blutkomponenten (neutrophile Granulozyten und Seren) von mit HLM operierten Patienten auf die interzellulären Kontakte in cerebralen mikrovaskulären Zellverbänden auseinander. Dabei wurden Blutkomponenten sowohl von Patienten mit langen (> 80 min) als auch mit kurzen (< 80 min) HLM-Zeiten isoliert. Das Ziel war herauszufinden, welche der Blutkomponenten für die Veränderungen der Integrität und der Morphologie der Zell-Zell-Kontakte verantwortlich sind und dadurch pathologische Störungen der Blut-Hirn-Schranke verursachen können. Die Untersuchungen wurden mit einem BHS-Modell aus cerebralen mikrovaskulären Endothelzellen [BCEC] vom Schwein durchgeführt. Dabei wurde in vitro nach Behandlung des BHS-Modells mit den entsprechenden Blutkomponenten die Integrität der interzellulären Kontakte durch TEER-Messungen untersucht und die morphologischen Veränderungen sowie die Expression der zellkontaktbildenden Moleküle (VE-Cadherin, β-Catenin und Occludin) beobachtet. Es stellte sich heraus, dass Patientenseren, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Herzoperationen isoliert wurden, keinen Einfluss auf die interzellulären Kontakte der BCEC-Kulturen ausüben. Dagegen führten die Kokultivierungen der BCEC mit den neutrophilen Granulozyten [PMN], die zu den gleichen Operationszeitpunkten isoliert wurden wie die Seren, zu Veränderungen innerhalb der Zell-Zell-Kontakte sowohl auf funktioneller (TEER-Abnahme) als auch auf morphologischer Ebene. Unabhängig von der Dauer der HLM-Zeiten und den PMNEntnahmezeitpunkten wirkte sich die Zugabe von PMN herzchirurgischer Patienten durch die TEER-Reduktion negativ auf die Integrität der BCEC-Kulturen aus, wobei PMN, die während des herzschirurgichen Eingriffes isoliert wurden, zu etwas stärkeren aber nicht signifikanten TEER-Abnahmen führten als die preoperativ (vor Narkose) isolierten. Auf morphologischer Ebene konnte man ebenfalls durch die Zugabe von PMN herzchirurgischer Patienten verschiedene Veränderungen der interzellulären Kontakte in BCEC-Kulturen beobachten. Die Patienten-PMN führten unabhängig von den Operationszeitpunkten, an denen sie isoliert wurden, und der Länge der HLM-Zeiten zu einer Ausstreckung der BCEC und somit zu einer Zellformveränderung sowie zu einer Verminderung des membranassoziierten β-Catenin- und Occludin-Anteils und einer Umwandlung des „zickzack“ Membranmusters in ein glattes, fast linienförmiges Muster. Zusätzlich konnte man mit Hilfe der Western-Blot-Analyse eine Abnahme der β-Catenin-Expression (AJ-Protein) in BCEC-Kulturen feststellen, die mit während und nach HLM-Einsatz isolierten PMN kokultiviert wurden. Dabei stammten die isolierten PMN von herzchirurgischen Patienten mit langen HLM-Zeiten aber auch von älteren (77 und 79 Jahre) mit kurzen HLM-Zeiten, was auf eine Abhängigkeit des durch die Patienten PMN verursachten negativen Expressionseffektes vom Patientenalter und der Dauer der HLM-Einsatzzeit deutete. Einen Einfluss der Patienten PMN auf die Expression von VE-Cadherin und Occludin konnte nicht festgestellt werden. Durch die Charakterisierung der Konzentrationsverläufe von neurologischen Markern in herzchirurgischen Patientenseren konnte eine Korrelation zwischen der Dauer der HLM-Einsätze und der NSE- und S-100B-Konzentration in Patientenseren fesgestellt werden. Pathologische Werte der beiden neurologischen Marker konnten jedoch nur bei Patienten mit HLM-Zeiten von mehr als 80 Minuten gemessen werden. Im tierexperimentellen Modell wurde dann die Modifikation der Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität im Rahmen von herzchirurgischen Eingriffen mit HLM untersucht. Durch quantitativen Nachweis im Hirngewebe von intravenös appliziertem Evan's-Blue Farbstoff konnte eine erhöhte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke bei den mit HLM operierten Tieren festgestellt werden. Eine Hirnödembildung war jedoch 6 Stunden nach Experimentende mit Hilfe von MRT-Untersuchungen in keinem der untersuchten Fällen zu beobachten. Zusätzlich zu den oben genannten Experimenten wurde die stabilisierende Eigenschaft von Interferon-β [FN-β] gegenüber dem Blut-Hirn-Schranke-Modell untersucht. Dabei führte die Behandlung der konfluenten BCEC-Kulturen mit IFN-β verschiedener Konzentrationen zu hohen TEER-Anstiegen, was auf eine Stabilisierung der interzellulären Kontakte und somit der Integrität und der Barriereeigenschaften der konfluenten BCEC-Kulturen hinwies.
Rationale und traditionelle Johanniskrautextrakt-Präparate : pharmazeutische Qualität im Vergleich
(2003)
Durch die zunehmende Bedeutung der Selbstmedikation wird die Beratungskompetenz der Apotheker immer wichtiger. Johanniskrautextrakt-Präparate sind in Deutschland nicht nur in der Apotheke, sondern auch in Drogerien und Supermärkten erhältlich. Sie besitzen einen unterschiedlichen Zulassungsstatus und damit verbunden Unterschiede in den qualitativen Anforderungen, die an sie gestellt werden. Nur durch eine kritische Bewertung von Erkenntnismaterial ist es möglich, aus einer sehr inhomogenen Gruppe qualitativ gute Johanniskrautextrakt-Präparate hervorzuheben. Bei den nach AMG zugelassenen und dem aktuellen Wissensstand entsprechenden Johanniskrautextrakt-Präparaten handelt es sich ausschließlich um Monopräparate, die als Wirkstoff Johanniskraut-Trockenextrakt enthalten. Für den Einsatz von gepulverter Droge fehlen bis heute klinische Belege. Auch für die Anwendung von fixen Kombinationen von mehreren pflanzlichen Extrakten steht eine rationelle Begründung bislang aus. Der Trockenextrakt muss durch ein Droge-Extrakt-Verhältnis und durch das verwendete Extraktionsmittel charakterisiert sein. Als Extraktionsmittel zur Herstellung der Extrakte sollte Methanol oder Ethanol verwendet werden. Als therapeutisch wirksame Tagesdosis gelten 2 – 4 g Drogenäquivalente. Die eingangs gestellte Frage, ob sich apothekenpflichtige Johanniskrautextrakt- Präparate von den Johanniskrautprodukten aus dem Drogerie-Segment abgrenzen, kann an Hand der vorliegenden Datenlage beantwortet werden. Untersuchungen hinsichtlich des Inhaltstoffspektrums zeigen, dass die Gehalte an wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffen, besonders die Hyperforin Werte, bei apothekenpflichtiger Ware deutlich höher sind, als dies bei nicht apothekenpflichtigen Präparaten der Fall ist. Die nicht apothekenpflichtigen Johanniskraut-Präparate sind dadurch charakterisiert, dass die mit der empfohlenen Tagesdosis zugeführte Wirkstoffmenge zum Teil erheblich unter jener liegt, die heute als erforderlich für eine Depressionsbehandlung angesehen wird. Bei den nicht apothekenpflichtigen Präparaten kam es zu erheblichen Schwankungen im Wirkstoffgehalt einzelner Chargen. Im pharmakologischen in vitro Assay schnitten die nicht apothekenpflichtigen Produkte bezüglich ihrer Wirkstärke, die Serotoninwiederaufnahme zu hemmen, deutlich schlechter ab als die apothekenpflichtigen Präparate. Es konnte eine sehr gute Korrelation der erotoninwiederaufnahmehemmung mit den jeweiligen Hyperforin-Gehalten der untersuchten Fertigarzneimittel aufgestellt werden. Die Wirksamkeit von Johanniskrautextrakt-Präparaten bei leichten bis mittelschweren Formen der Depression gilt heute als gesichert, sofern qualitativ hochwertige Extrakte in ausreichend hoher Dosierung eingesetzt werden. Die apothekenpflichtigen Präparate werden dem Anspruch, der an rationale Phytopharmaka gestellt wird, gerecht und sind daher als qualitativ besser einzustufen als nicht apothekenpflichtige Produkte. Die Untersuchung des Freisetzungsverhaltens von Hyperforin aus Jarsin® Präparaten macht deutlich, wie wichtig die Galenik von Johanniskrautextrakt-Präparaten im Hinblick auf die Bioverfügbarkeit der Inhaltstoffe ist. Jarsin®300 zeigt lediglich in 4 von 18 untersuchten Prüflingen eine 90-prozentige Freisetzung. Die Ursache hierfür liefert das Ergebnis der Untersuchungen der Dragee-Kerne. Zu hohe Presskräfte bei der Herstellung und ein Fehlen von Sprengmitteln in der Formulierung führen dazu, dass die Dragees in der vorgeschriebenen Versuchsdauer nicht zerfallen und Hyperforin nur unzureichend freigesetzt wird. Jarsin® 450 Tabletten entsprechen den Anforderungen, die an ein rationales Johanniskrautextrakt-Präparat gestellt werden. Bei dem Präparat Jarsin®750 müsste die Galenik dahingehend verbessert werden, dass die Freisetzung nicht vom Lösen des Überzugs und vom Zerfall der Tablettenkerne abhängig ist. Chargenkonformität ist bei allen untersuchten Jarsin® Präparaten gewährleistet. Untersuchungen zur Löslichkeit und zum Freisetzungsverhalten von Biapigenin aus Johanniskrautextrakt-Präparaten zeigen eine deutliche Abhängigkeit vom erwendeten Freisetzungsmedium. Wie schon für die Inhaltstoffe Hyperforin und Hypericin festgestellt werden konnte, besitzt nur das Medium FeSSIF diskriminierende und zugleich lösungsvermittelnde Eigenschaften. Um eine vollständige Freisetzung aller pharmazeutisch relevanten Inhaltstoffe zu gewährleisten, sollte die Einnahme von Johanniskrautextrakt-Präparaten nur mit einer Mahlzeit erfolgen. Durch den Vergleich der Freisetzungsprofile unterschiedlicher Johanniskrautextrakt-Präparate konnte deutlich gemacht werden, dass sie nicht vergleichbar und damit nicht ohne weiteres austauschbar sind. Für die Entscheidung, ob ein Johanniskrautextrakt-Präparat im Sinne der „aut idem Regelung“ durch ein anderes ausgetauscht werden kann, genügt es nicht, dass beide Produkte dieselbe Menge Extrakt derselben Ausgangsdroge aufweisen. Es muss zunächst sichergestellt werden, dass die beiden Präparate pharmazeutische Äquivalenz aufweisen. Die Untersuchungen von vermeintlich äquivalenten Johanniskrautextrakt-Präparaten zeigten deutlich, dass sie sich sowohl im Gehalt an pharmazeutisch relevanten Inhaltstoffen als auch im Freisetzungsverhalten erheblich unterscheiden. Die „autidem Regelung“ ist für Phytopharmaka somit nicht anwendbar. Die Möglichkeit, zwei Märkte zu beliefern, den apothekenpflichtigen und den nicht apothekenpflichtigen Arzneimittelmarkt, bietet der Industrie die Möglichkeit, sehr ähnliche Produkte mit allerdings erheblich unterschiedlichen Anforderungen anzubieten. Dies stellt für die rationalen Phytopharmaka in sofern eine Gefahr dar, als dass der Laie im Zweifelsfall eher zu den günstigen nicht apothekenpflichtigen Präparaten greift. Zusätzlich wird dem Patienten durch gezielte Werbekampagnen in Bezug auf die nicht apothekenpflichtige Ware gute Qualität durch traditionelle Anwendung suggerieren. Nicht apothekenpflichtige Präparate dürften nach heutigem Kenntnisstand jedoch gar nicht wirksam sein. Rechtlich gesehen erheben sie auch keinen Anspruch auf Wirksamkeit, da sie sich durch Hinweise in der Packungsbeilage von den apothekenpflichtigen Präparaten abgrenzen müssen. Das Problem liegt in der für den Laien fehlenden Transparenz. Nur Fachleuten sind die Unterschiede im Zulassungsstatus und den damit verbundenen Anforderungen an Qualität und Wirksamkeit der Johanniskrautextrakt-Präparate bekannt. Auf europäischer Ebene ist der Phytopharmakamarkt nicht einheitlich geregelt. Phytopharmaka zählen in vielen Ländern zu den Nahrungsergänzungsmitteln. Um zu verhindern, dass auch seriöse Phytopharmaka durch Harmonisierungsverfahren der EU aus dem Arzneimittelsegment herausgenommen werden, ist es notwendig, dass die rationalen Phytopharmaka den Anforderungen die an chemisch synthetische Arzneimittel gestellt werden, gewachsen sind. In diesem Zusammenhang ist die seit diesem Jahr gültige USP Monographie „Powdered St. Johns Wort Extract“ zu begrüßen, da sie hohe Anforderungen bezüglich des Gehaltes an Inhaltstoffen stellt. Nur wenn gesetzlich vorgeschrieben wird, welche Kriterien rationelle Phytopharmaka erfüllen müssen, wird einheitliche Qualität gewährleistet. Auf europäischer Ebene wäre die Einführung einer Johanniskrautextrakt-Monographie mit definierten Anforderungen nach dem Vorbild der USP wünschenswert. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Wirksamkeit von Johanniskrautextrakt-Präparaten bei leichten bis mittelschweren Formen der Depression heute als gesichert gilt. Vorraussetzung ist allerdings, dass qualitativ hochwertige Extrakte mit gleich bleibender Qualität in ausreichend hoher Dosierung eingesetzt werden. Da mit Veränderungen in der Zusammensetzung eines Fertigarzneimittels auch Veränderungen in der Wirksamkeit entstehen können, ist die reproduzierbare Qualität aus pharmazeutischer Sicht eine elementare Forderung. Apothekenpflichtige Arzneimittel sind auf Grund ihrer Überlegenheit bezüglich ihres Gehalts an pharmazeutisch relevanten Inhaltsstoffen, Chargenkonformität sowie ihrer Wirksamkeit im pharmakologischen Sinne, den nicht apothekenpflichtigen Arzneimitteln vorzuziehen. Vor dem Hintergrund, dass die Droge Johanniskraut auf der Indikationsliste nach § 109a Absatz 3 AMG des BfArM lediglich in Form von öligen Zubereitungen aus Johanniskrautflüssigextrakt, äußerlich angewandt, zur Unterstützung der Hautfunktion geführt wird, sollte die Freiverkäuflichkeit von nicht apothekenpflichtigen Johanniskrautextrakt-Präparaten bereits aufgehoben sein. In wirksamer Dosierung handelt es sich bei Johanniskrautextrakt-Präparaten um Arzneimittel, die nicht ohne die kompetente Beratung des Apothekers bzw. des pharmazeutischen Fachpersonals eingenommen werden sollten.