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The hypothesis that oxidative stress plays a role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD) was tested by studying oxidative damage, acitvities of antioxidant enzymes and levels of reactive oxygen species (ROS) in several models. To this end, mouse models transgenic for mutant presenilin (PS1M146L) as well as mutant amyloid precursor protein (APP) and human post mortem brain tissue from sporadic AD patients and age-matched controls were studied. Aging leads to an upregulation of antioxidant enzyme activities of Cu/Zn-superoxide dismutase (Cu/Zn-SOD), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) in brains from C57BL/6J mice. Simultaneously, levels of lipid peroxidation products malondialdehyde MDA and 4-hydroxynonenal HNE were reduced. Additionally, pronounced gender effects were observed, as female mice display better protection against oxidative damage due to higher activity of GPx. Hence, antioxidant enzymes provide an important contribution to the protection against oxidative damage. In PS1M146L transgenic mice oxidative damage was only detectable in 19-22 months old mice, arguing for an additive effect of aging and the PS1 mutation. Both HNE levels in brain tissue as well as mitochondrial and cytosolic levels of ROS in splenic lymphocytes were increased in PS1M146L mice. Antioxidant defences were unaltered. In PDGF-APP and PDGF-APP/PS1 trangenic mice no changes in any of the parameters studied were observed in any age group. In contrast, Thy1-APP transgenic mice display oxidative damage as assessed by increased HNE levels. Reduced activity of Cu/Zn-SOD may explain this observation. Additionally, gender modified this effect, as female APP transgenic mice display higher b-secretase cleavage of APP and simultaneously increased HNE levels and reduced Cu/Zn-SOD activity earlier than male mice, i.e. from an age of 3 months and before the formation of Ab plaques. Reduced Cu/Zn-SOD activity was also found in another APP transgenic mouse model, in APP23 mice. In post mortem brain tissue from sporadic AD patients activities of Cu/Zn-SOD and GPx were however increased, and changes were most pronounced in temporal cortex. Simultaneously, levels of HNE but not MDA were elevated. Additionally, in vitro stimulation of lipid peroxidation led to increased MDA formation in samples from AD patients, indicating that increased activity of Cu/Zn-SOD and GPx are insufficient to protect against oxidative damage. Furthermore, the observed changes were subject to a gender effect, as samples from female AD patients showed increased activities of Cu/Zn-SOD and GPx as well as increased HNE levels, indicating that brain tissue from females is more sensitive towards oxidative damage. Levels of soluble Ab1-40 were positively correlated with with MDA levels and activities of Cu/Zn-SOD and GPx. Additionally, levels of lipid peroxidation products MDA and HNE are gene-dose-dependently modulated by the Apolipoprotein E4 allele, the most important genetic risk factor for AD known so far. While MDA levels were negatively correlated with MMSE scores, a measure for cognitive function, HNE levels were highest in AD patients with moderate cognitive impairment. Hence, increased HNE levels may play an important role in neurodegenerative events at an early disease stage. In summary, oxidative damage, as assessed by increased HNE levels, could be detected in sporadic AD patients and in different transgenic mouse models. The results of this thesis therefore support the further research of pharmacological targets aiming at augmentation of antioxidant defences for therapy or prophylaxis of Alzheimer’s disease.
In large models of neuronal cell death, there is a tight correlation between Cdk5 deregulation and cell-cycle dysfunction. However, pathways that link Cdk5 to the cell cycle during neuronal death are still unclear. We have investigated the molecular events that precede p25/Cdk5-triggered neuronal death using a neuronal cell line that allows inducible p25 expression. In this system, no sign of apoptosis was seen before 24 hours of p25 induction. Thus, at that time, cell-cycle-regulatory proteins were analysed by immunoblotting and some of them showed a significant deregulation. Interestingly, after time-course experiments, the earliest feature correlated with p25 expression was the phosphorylation of the retinoblastoma protein (Rb). Indeed, this phosphorylation was observed 6 hours after p25 induction and was abolished in the presence of a Cdk5 inhibitor, roscovitine, which does not inhibit the usual Rb cyclin-D kinases Cdk4 and Cdk6. Furthermore, analyses of levels and subcellular localization of Cdk-related cyclins did not reveal any change following Cdk5 activation, arguing for a direct effect of Cdk5 activity on Rb protein. This latter result was clearly demonstrated by in vitro kinase assays showing that the p25-Cdk5 complex in our cell system phosphorylates Rb directly without the need for any intermediary kinase activity. Hence, Rb might be an appropriate candidate that connects Cdk5 to cell-cycle deregulation during neuronal cell death.
The transcription factor Tal1 is a critical activator or repressor of gene expression in hematopoiesis and leukaemia. The mechanism by which Tal1 differentially influences transcription of distinct genes is not fully understood. Here we show that Tal1 interacts with the peptidylarginine deiminase IV (PADI4). We demonstrate that PADI4 can act as an epigenetic coactivator through influencing H3R2me2a. At the Tal1/PADI4 target gene IL6ST the repressive H3R2me2a mark triggered by PRMT6 is counteracted by PADI4, which augments the active H3K4me3 mark and thus increases IL6ST expression. In contrast, at the CTCF promoter PADI4 acts as a repressor. We propose that the influence of PADI4 on IL6ST transcription plays a role in the control of IL6ST expression during lineage differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells. These results open the possibility to pharmacologically influence Tal1 in leukaemia.
"Protein Associated with Myc" (PAM) hat aufgrund seiner enormen Größe von 510 kD und der Vielzahl an Proteinbindungsstellen das Potential viele regulatorische und physiologische Prozesse zu regulieren. Mit der Funktion als E3-Ubiquitinligase und davon unabhängigen Proteininteraktionen reguliert es beispielsweise Prozesse der Synaptogenese und der spinalen Schmerzverarbeitung, wie auch die Regulation des Pteridin Stoffwechsels und des cAMP-Signalweges. Im Gegensatz zur spinalen Schmerzverarbeitung war eine Beteiligung von PAM an der peripheren Nozizeption bisher unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Dazu wurden konditionale PAM-Knockout Mäuse generiert und charakterisiert. Zum einen wurde PAM in Vorläuferzellen von Neuronen und Gliazellen und zum anderen in allen nozizeptiven und thermorezeptiven Neuronen der Dorsalganglia und der Ganglia trigeminale deletiert. Der Knockout in Neuronen und Gliazellen führte zu einer pränatalen Letalität und unterstreicht so die Bedeutung von PAM während der Neuronenentwicklung. Mit Hilfe des spezifischen Knockouts in nozizeptiven Neuronen konnte eine Rolle von PAM bei der Regulation der thermischen Hyperalgesie gezeigt werden. Keinen Einfluss hatte die Deletion von PAM auf basale thermische und mechanische Schmerzschwellen, sowie auf Formalin-induzierte akute Schmerzen. Als potentieller Mechanismus wurde der mTOR- und der p38 MAPK-Signalweg untersucht. Dabei konnte eine Vermittlung der S1P-induzierten mTOR-Aktivierung durch PAM nachgewiesen werden und Rheb als eine Komponente dieser Aktivierung ermittelt werden. Der p38 MAPK Signalweg war in Abwesenheit von PAM konstitutiv aktiviert und einige Proteine des Rezeptortraffickings waren verstärkt exprimiert. Als ursächlich für die beobachtete verlängerte Hyperalgesie in PAM-defizienten Mäusen konnte die Unterbindung der Internalisierung des TRPV1-Rezeptors nachgewiesen werden. Dieser Effekt ist spezifisch für TRPV1, da der verwandte Ionenkanal TRPA1 durch die PAM-Deletion nicht beeinträchtigt wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte so zum ersten Mal gezeigt werden, dass PAM in peripheren nozizeptiven Neuronen über die p38 MAPK-vermittelte Internalisierung von TRPV1 die Dauer der thermischen Hyperalgesie reguliert.
Purpose: The Action Plan for Medication Safety by the German Federal Ministry of Health introduced a standardized medication plan (MP), a printable document for the patient. The practical handling needs to be tested before the nationwide implementation in Germany. Therefore, the aims of our study were 1) to develop an instrument to evaluate the usage of the standardized MP, 2) to assess if patients can locate, and 3) understand important information. Moreover, we explored patients’ opinion and suggestions regarding the standardized MP template.
Patients and methods: We conducted a cross-sectional study to evaluate the practical handling of the standardized MP. We interviewed 40 adult patients in seven community pharmacies in Germany, who took at least five medicines regularly and gave their written informed consent. The interview consisted of questions regarding finding and understanding information provided on a mock-up MP, patients’ opinion and the execution of the information on the MP by filling pill boxes. We eventually developed a new evaluation method to quantify the practical handling of the MP by rating the pill boxes filled by the patients.
Results: Overall, the participants rated the MP positively. Thirty-nine (98%) participants found important information on a mock-up standardized MP. Patients were questioned to identify if they understood information on medical intake as it relates to meals. In particular, they were questioned about medicine intake "1 hour before a meal", which 98% (n=39) interpreted correctly, and "during a meal", which 100% (n=40) interpreted correctly. The less precise advice of "before a meal" was interpreted correctly by 73% (n=29), and only 15% (n=6) correctly interpreted the term "after the meal". The evaluation of the filled pill boxes resulted in the "Evaluation Tool to test the handling of the Medication Plan" (ET-MP) – a weighted scoring system.
Conclusion: The standardized MP is clearly arranged, and patients are able to find important information. The findings of this study resulted in minor but important revisions of the standardized MP template. The developed evaluation tool ET-MP may serve as an objective instrument to assess patients’ ability to transfer written information on the MP into practical handling of medicines.
Boswellia serrata gum resin extracts (frankincense) have been used for centuries in folk medicine in Asia and Africa. They have shown beneficial therapeutic effects, particularly in the treatment of chronic inflammatory diseases. Clinical studies on humans confirmed an anti-inflammatory and anti-cancer potential of Frankincense preparations. Boswellic acids (BAs) are the major ingredients, responsible for the pharmacological action of the extracts. Molecular and cellular studies with BAs revealed a number of targets including 5-lipoxygenase (LO), topoisomerases and the NF-κB pathway. Since there is little information on the modulation of cellular physiology by BAs, this work was designed to provide a detailed investigation of the cellular and molecular effects of BAs in several cell types related to inflammation. We report that 11-keto-BAs are potent activators of functional responses in human neutrophils, a type of leukocytes mediating acute inflammatory processes. Neutrophil activation by 11-keto-BAs is reflected by enhanced generation of oxygen radicals, release of arachidonic acid (AA) and the subsequent transformation of AA to pro-inflammatory eicosanoids. Investigation of the participating signalling pathways identified Ca2+, phosphoinositide-3 kinase, and members of the MAP kinase family (ERKs) as mediators. Second, we present a detailed study of the modulation of human platelet physiology and intracellular signalling events by BAs. Intriguingly, we discovered an inverse structure-activity relationship of BAs regarding platelet activation, with 11-methylene-BAs being superior over 11-keto-BAs. Thus, 11-methylene-BAs stimulated platelet Ca2+ mobilisation, MAP kinase and Akt activation, AA release, 12-LO and cyclooxygenase product formation, and thrombin generation. Novel Ca2+-independent activation pathways of platelet lipid metabolism were discovered. In contrast, 11-keto-BAs were inactive but found to inhibit platelet (p)12-LO directly. Interaction with p12-LO was confirmed in a pulldown assay using immobilised BAs as bait. Finally, BAs were shown to attenuate the activation of monocytes, a cell type responsible for the maintenance of chronic inflammatory states. Impairment of Ca2+ homeostasis is likely conferred by inhibition of Ca2+ influx channels. Taken together, our results shed light on the modulation of intracellular physiology of inflammatory cells by BAs, contributing to a better understanding of the anti-inflammatory effects exerted by frankincense preparations.
More than 70 years ago, the effects of extracellular adenosine 5'-triphosphate (ATP), a newly identified and purified biomolecule at that time (Fiske and Subbarow, 1925; Lohmann, 1929) were observed by Drury and Szent-Györgyi (1929). Since then, many pharmacological studies were carried out with extracellular adenine nucleotides in various intact organ systems, isolated tissues, and purified cell preparations. Yet it was not until 1972 that Burnstock introduced the concept of "purinergic nerves" and suggested that ATP might fulfil the criteria generally regarded as necessary for establishing a substance as a neurotransmitter, summarised by Eccles (1964):
• synthesis and storage of transmitter in nerve terminals
Strips of guinea-pig taenia coli (GPTC) were shown to take up large amounts of tritium-labelled adenosine when incubated with tritium-labelled adenosine, adenosine 5'-monophosphate (AMP), adenosine 5'-diphosphate (ADP) and ATP. The nucleoside was rapidly converted into and retained largely as [ 3 H]-ATP (Su et al., 1971).
• release of transmitter during nerve stimulation
Spontaneous relaxation of GPTC as well as relaxations induced by nerve stimulation or nicotine, respectively, in the presence of compounds which block adrenergic and cholinergic responses were accompanied by a remarkable increase in release of tritium-labelled material from taenia coli incubated in [ 3 H]-adenosine (Su et al., 1971).
• postjunctional responses to exogenous transmitters that mimic responses to nerve stimulation
Burnstock et al. (1966) characterised ATP and ADP as the most potent inhibitory purine compounds in the gut and observed that the effects of ATP mimic more closely the inhibitory response of the taenia to non-adrenergic nerve-stimulation than to adrenergic nerve stimulation (Burnstock et al., 1970).
enzymes that inactivate the transmitter and/or uptake systems for the transmitter or its breakdown products
When ATP was added to a perfusion fluid recycled through the vasculature of the stomach, very little ATP remained, but the perfusate contained substantially increased amounts of adenosine and inosine, as well as some ADP and AMP (Burnstock et al., 1970).
• drugs that can produce parallel blocking of potentiating effects on the responses of both exogenous transmitter and nerve stimulation
Tachyphylaxis to ATP produced in the rabbit ileum resulted in a consistent depression of responses to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation, whereas responses to adrenergic nerve stimulation remained unaffected (Burnstock et al., 1970). Lower concentrations of quinidine reduced and finally abolished relaxation of GPTC induced by noradrenaline (NA) and by adrenergic nerve stimulation. Using higher concentrations of the compound, relaxant responses of GPTC to ATP as well as to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation were abolished (Burnstock et al., 1970). ...
Die Beschäftigung mit Muskarinrezeptoren reicht bis in das vergangene Jahrhundert zurück als, in Folge der verschiedenen Wirkungen des Neurotransmitters Acetylcholin, einerseits Nikotin- und andererseits Muskarinrezeptoren sowie deren Subtypen entdeckt und charakterisiert werden konnten. Aufgrund der weiten Verbreitung von Muskarinrezeptoren innerhalb des zentralen und peripheren Nervensystems sowie in entsprechend innervierten Organen sind diese nach wie vor als Target für bestimmte klinische Indikationen von großem Interesse. Besonders im Bereich der chronisch obstruktiven Atemwegserkrankungen (COPD) sind Bronchodilatoren Mittel der Wahl. Obwohl die derzeitige Behandlungsstrategie im wesentlichen auf dem Einsatz des unselektiven muskarinischen Antagonisten Ipratropiumbromid, allein oder in Kombination mit einem kurzwirksamen b2-Sympathomimetikum, beruht, ist ihr Einsatz aufgrund der dabei auftretenden unerwünschten Nebenwirkungen limitiert. Neben M3- Rezeptoren findet man in der menschlichen Lunge auch präsynaptische M2- Rezeptoren, deren Blockade zu einem Anstieg der Acetylcholinfreisetzung führt. Demzufolge würde die Entwicklung eines hochselektiven und/oder langwirksamen muskarinischen M3-Rezeptorantagonisten einen großen Fortschritt für die Behandlung von Patienten mit COPD und auch Asthma bedeuten. Untersuchung der Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids und der entsprechenden tertiären Analoga: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die vier reinen Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids als auch die entsprechenden vier tertiären Analoga untersucht. Bislang wird das Diastereomerengemisch (RS/SR), das als RobinulÒ im Handel ist, vorwiegend als Antisialagogum in der Prämedikation der Narkose oder als Spasmolytikum therapeutisch eingesetzt. Die molekulare Struktur des Glycopyrroniumbromids weist zwei Chiralitätszentren auf, woraus sich vier stereoisomere Verbindungen ergeben. Die pharmakologische Untersuchung sowohl der quartären als auch der korrespondierenden tertiären Isomere in den funktionellen Standardmodellen, Kaninchen-Vas-deferens für M1-Rezeptoren, linker Vorhof des Meerschweinchenherzens für M2-Rezeptoren und die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum für M3-Rezeptoren, ergab, dass sich alle Verbindungen an den untersuchten Muskarinrezeptorsubtypen als potente Antagonisten verhielten. Ihre Rezeptorselektivität war jedoch relativ gering, wobei im Allgemeinen die niedrigste Affinität zum M2-Rezeptor beobachtet wurde. Innerhalb der Stereoisomeren zeigten die (R/R')- und (S/R')-konfigurierten Verbindungen den stärksten, die (S/S')-konfigurierten Isomere hingegen den geringsten antagonistischen Effekt. Diese Ergebnisse konnten durch Radioligand- Bindungsstudien bestätigt werden. Bemerkenswert war jedoch, dass insbesondere am M3-Rezeptor eine extrem langsame Dissoziation der Substanzen vom Rezeptor festgestellt wurde. Verbunden mit der hohen Affinität und der in Bindungsstudien ermittelten Dissoziationshalbwertszeit von 120 min könnte das quartäre (R/R')-konfigurierte Stereoisomer des Glycopyrroniumbromids eine geeignete Alternative zur Behandlung der COPD darstellen: Die lange Halbwertszeit sollte eine Einmalgabe pro Tag erlauben und somit die Patientencompliance erhöhen, die hohe Affinität eine geringe Dosierung ermöglichen und die kinetische Selektivität' sowie die quartäre Struktur könnten zur Minimierung unerwünschter Nebenwirkungen führen. Aufgrund dieser Vorteile wurde die Substanz patentiert und der pharmazeutischen Industrie für weiterführende Untersuchungen zur Verfügung gestellt. Untersuchungen an der Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum in Hinblick auf die Verteilung von P2-Rezeptoren: Aufgrund der Pionierarbeit, die Ende der 70er Jahre von Burnstock und seinen Mitarbeitern geleistet wurde, wandelte sich das Bild von ATP als einer Energiequelle der Zelle zu einem Neurotransmitter ubiquitären Vorkommens mit entsprechenden Zielstrukturen, den P2-Rezeptoren. Inzwischen ist allgemein anerkannt, dass zwischen metabotropen P2Y-Rezeptoren und ionotropen P2X- Rezeptoren unterschieden werden kann. Mit Hilfe von Klonierungstechniken konnte diese Klassifizierung validiert und außerdem eine Vielzahl unterschiedlicher Subtypen identifiziert werden. Bis heute wurden sieben P2X- (P2X1-7) und sechs P2Y- Rezeptorsubtypen (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12) kloniert und pharmakologisch charakterisiert. Sie gelten unumstritten als Vertreter der P2-Rezeptorfamilie. Heute besteht eine der größten Herausforderungen auf diesem sich explosionsartig expandierendem Gebiet darin, die geklonten P2-Rezeptoren mit den verschiedenen physiologischen Antworten, die durch native P2-Rezeptoren vermittelt werden, in Einklang zu bringen. Da die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum ein bekanntes Modell, z.B. für Untersuchungen an Muskarinrezeptoren, darstellt, war das Ziel der vorliegenden Arbeit, dieses Modell in Bezug auf die Verteilung von P2-Rezeptoren hin zu untersuchen. Neben Agonisten, die eine Präferenz für entweder ionotrope (a,b-meATP) oder metabotrope (ADPbS) P2-Rezeptoren aufweisen, wurden im wesentlichen eine Reihe gut untersuchter Antagonisten mit zum Teil hoher Affinität für einen Rezeptorsubtyp für die funktionellen Untersuchungen verwendet. Die neuronale Lokalisation des P2X-Rezeptors konnte durch die komplette Aufhebung der durch a,b-meATP-vermittelten Kontraktionen nach Zugabe von TTX charakterisiert werden. Die ebenfalls fast vollständige Hemmung der Kontraktion nach Einsatz von Atropin wies auf einen indirekten, durch Acetylcholin vermittelten Effekt hin. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden sämtliche Versuche mit P2-Antagonisten unter Zusatz von 70 µM Physostigmin in der Nährlösung durchgeführt. Die eingesetzten Antagonisten Suramin, NF023 und NF279 erwiesen sich als kompetitive Antagonisten, während PPADS neben der Rechtsverschiebung einen Maximumabfall der Agonistenkurven bewirkte. Ein Vergleich der funktionell ermittelten pA2-Werte mit den Wirkstärken an rekombinanten P2-Rezeptoren von Ratte und Mensch lässt vermuten, dass es sich hierbei um einen P2X3- Rezeptorsubtyp handelt, der über die Freisetzung von Acetylcholin eine Kontraktion der glatten Muskulatur über einen indirekten Mechanismus auslöst. Da sich P2X-Rezeptoruntereinheiten neben homomeren auch zu heteromeren, funktionell aktiven Kanälen vereinen können, könnte es sich bei dem vorliegenden soma-dendritischen P2X-Rezeptor aber auch um ein Heteromer handeln, bei dem der P2X3-Rezeptor den Phänotyp bestimmt. Solange noch keine eindeutige Identifizierung dieses Rezeptors speziesspezifisch auf molekularer Ebene erfolgt ist, sollte man deshalb die Bezeichnung P2X3(-ähnlicher)-Rezeptor verwenden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation des präsynaptischen P2X3(- ähnlichen)-Rezeptors zur Ausschüttung von Acetylcholin führt, das wiederum postsynaptisch einen kontraktionsvermittelnden Muskarinrezeptor aktiviert. Um zu beweisen, dass es sich dabei um denselben Muskarinrezeptorsubtyp handelt, der bereits auf direktem Weg durch APE oder mittels EFS als M3-Rezeptor charakterisiert werden konnte, wurden die Affinitäten muskarinischer Antagonisten als Kriterien herangezogen. Die erhaltenen Korrelationen wiesen eindeutig darauf hin, dass dieser postsynaptisch im GPI lokalisierte Muskarinrezeptor dem nativen und rekombinanten, kontraktionsvermittelnden M3-Rezeptorsubtyp entspricht. Durch Zugabe von ADPbS konnten im GPI Kontraktionen ausgelöst werden, die allerdings mit TTX und Atropin nur zum Teil gehemmt wurden. Diese Beobachtungen führten zu der Erkenntnis, dass postsynaptisch P2Y-Rezeptoren lokalisiert sind. Ihre Subtypcharakterisierung erfolgte unter Zusatz von 0.3 µM Atropin in der Nährlösung, um den Einfluss der neuronalen P2X3-Rezeptoren zu unterbinden. Suramin, NF023 und NF279 zeigten wiederum einen kompetitiven Antagonismus gegen ADPbS, während PPADS auch hier eine Rechtsverschiebung mit Maximumdepression der Agonistenkurve hervorrief. Ein erneuter Vergleich mit beschriebenen Affinitätswerten von rekombinanten P2- Rezeptoren ließ den Schluss zu, dass der im GPI postsynaptisch gefundene P2Y- Rezeptor Eigenschaften des P2Y1-Rezeptorsubtyps aufweist. Eine Bestätigung dafür gaben außerdem die P2Y1-selektiven Bisphosphate A3P5P und MRS2179, obgleich sie geringere pIC50-Werte aufzeigten als in der Literatur beschrieben. Mit der Charakterisierung des neuronalen P2X3-Rezeptors und des postsynaptischen P2Y1-Rezeptors ist das GPI ein bisher einzigartiges funktionelles pharmakologisches Modell, in dem beide P2-Rezeptorsubtypen durch Einsatz des jeweiligen Agonisten, a,b-meATP oder ADPbS, pharmakologisch isoliert werden können. Charakterisierung von P2-Rezeptoren in der Längsmuskulatur des Rattenileum: Eine im Vergleich zum GPI gänzlich andere Situation zeigte sich im RI. Die getesteten P2-Agonisten ADPbS, a,b-meATP, a,b-meADP und ATPgS erzeugten Kontraktionen im untersuchten Gewebe, wobei sich a,b-meATP als effektivster Agonist erwies. Im Unterschied zum GPI führte eine wiederholte Gabe von a,b- meATP allerdings nicht zu einer Desensibilisierung des Rezeptors. Die durch Zugabe von TTX und Atropin erreichte Kontraktionshemmung lässt auf das Vorhandensein von sowohl prä- als auch postsynaptischen P2X-Rezeptoren schließen. Eine Trennung der durch diese Rezeptoren hervorgerufenen Effekte war im funktionellen Experiment jedoch nicht durchführbar. Keinerlei Effekt zeigte allerdings der Zusatz von TTX und Atropin auf die durch ADPbS ausgelösten Kontraktionen. Suramin, NF023 und PPADS erwiesen sich als sehr schwache Antagonisten an diesem Präparat. Auffällig war hingegen, dass die durch den Antagonisten verschobenen Kurven jeweils steiler und im Maximum höher waren als die Kontroll-Agonistenkurve. Man kann also hier nur spekulieren, dass durch die Antagonisten zunächst ein relaxationsvermittelnder Rezeptor geblockt wurde und in Folge nur noch der Effekt des kontraktionsvermittelnden Rezeptors sichtbar war. Obwohl Gewebe der Ratte häufig als funktionelle Modelle in der experimentellen Pharmakologie eingesetzt werden, konnten auf Grund fehlender subtypselektiver Agonisten und Antagonisten die kontraktionsvermittelnden P2-Rezeptorsubtypen im RI nicht identifiziert werden. Des weiteren zeigt ein Vergleich mit dem GPI, dass bedeutende Unterschiede bei der Verwendung gleichen Gewebes zweier verschiedener Spezies existieren können, die bei der vergleichenden Betrachtung von Affinitätswerten von Agonisten und Antagonisten zur Charakterisierung von Rezeptorsubtypen beachtet werden müssen.
To understand neurodegenerative diseases is one of the major challenges of the 21st century. This also includes Alzheimer´s disease (AD), which represents a chronic neurodegenerative disorder, with long preclinical and prodromal phases (approx. 20 years) and an average clinical duration of 8–10 years. In the early phase of this disease, patients show deterioration of memory, difficulties in finding the right words for everyday objects or mood swings. The risk of AD grows exponentially with age, doubling approximately every 5 to 6 years. AD may contribute to 60–70% of all dementia cases, being the most common cause of this disease. Dementia is one of the major causes of disability and dependency among older people worldwide. The causes of the sporadic form of AD with late onset (LOAD) are not yet known, but it seems to be a result of multiple factors. Neuropathological features are extracellular senile plaques, containing beta-amyloid peptides (Aβ) and intracellular neurofibrillary tangles, containing paired helical tau proteins, which have been associated with neuronal loss and atrophy of the cerebral cortex. Thus, misfolded proteins seem to contribute to the pathogenesis, but are not the only players in the disease process. Developing feasible therapies is difficult due to the multifactorial pathology of AD. Currently approved drugs only attenuate symptoms, but do not cure the disease. Research into AD also has had several failures in terms of developing disease-modifying therapies. Thus, new therapeutic targets in order to develop a causal therapy are desperately needed. Since AD starts many years far before the first symptoms occur, new scientific approaches focus on the early stage, which are discussed to be important in aging and the onset of AD. Today, the hypothesis of the advanced mitochondrial cascade becomes more and more the leading model for LOAD, integrating physiological aging as the main risk factor. Thus, new interventions targeting mitochondrial dysfunction are of substantial interest. Accordingly, the efficacy of Dimebon and TRO19622 to ameliorate mitochondrial dysfunction in cellular and murine models of AD were investigated. Dimebon (Latrepirdine) was, originally developed in Russia as an H1-antiallergic drug. It might specifically interfere with mechanisms relevant for the cognitive decline, especially by improving impaired mitochondrial function and/or dynamics in AD. TRO19622 (Olesoxim) has been identified in a phenotypic screening approach to promote the survival of primary motor neurons. Olesoxim is easily absorbed by cells and accumulates in mitochondria. Olesoxim’s mode of action is not fully understood, however it has been shown to modulate mitochondrial membranes and interact with the voltage-dependent anion channel (VDAC) and the translocator protein (TSPO; also known as PBR). Thereby it inhibits mitochondrial permeability transition. In this study, the effects of Aβ overproduction on mitochondrial function were investigated. The effects of Dimebon and Olesoxim were examined, using a HEK cell line stably transfected with the Swedish APP double mutation (HEKsw) and un-transfected control cells (HEKut). Mitochondrial membrane potential, ATP concentrations, and respirometry were measured. Western Blot analysis of marker proteins for fission & fusion, autophagy, mitogenesis and mPTP formation were performed. Confocal laser scanning microscopy was introduced as a novel method to visualize mitochondrial dynamics. Olesoxim was also tested in Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice representing a murine model of AD. For the in vivo model mitochondria from brain tissue were isolated and dissociated brain cells were prepared to determine respiration, lipid peroxidation, MMP, and ATP-levels. Both, the in vitro and in vivo models were compared and discussed in relation to human post-mortem data. The research was conducted in frame of the EU-project entitled „MITOTARGET“ (Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases: towards new therapeutics) funded under FP7-Health (http://cordis.europa.eu/result/rcn/54471_en.html). HEKsw cells showed an overall reduction in the mitochondrial respiration, a significant lower MMP, and significantly reduced ATP levels compared to HEKut cells. Mitochondrial mass was equal in both cell lines. In addition most mitochondria in HEKsw cells showed truncated morphology, followed by punctuated mitochondria. Levels of the fission related protein Drp were significantly elevated in HEKsw cells whereas protein levels of fusion related OPA were strongly reduced, leading to a shift in the distribution pattern towards shorter mitochondria. Moreover, HEKsw cells showed reduced mitochondrial density. Protein levels of the translocase of the inner mitochondrial membrane (TIMM50) were strongly diminished in HEKsw cells. The OXPHOS machinery is located in the inner membrane, where the MMP is build up and ATP is generated. Reduced TIMM50 levels in HEKsw indicated a reduction of the inner mitochondrial membrane, which could explain the described deficits in OXPHOS, MMP, ATP and mitochondrial morphology and density. Concentration of both mPTP markers, the voltage-depended anion channel (VDAC) and the peripheral benzodiazepine receptor (PBR), were broadly increased in HEKsw cells. Thy1-APPSL transgenic mice were characterized as in vivo model of AD. Those mice are modified to express the human form of APP, containing both, the Swedish (KM670/671NL) and the London (V717L) double mutations under the murine Thy1 promotor. Beginning at the age of 3 months, Thy1-APPSL mice develop elevated Aβ levels and mitochondrial dysfunction. Mitochondria isolated from brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice showed significant impaired respiration, resulting in a reduced MMP. However, ATP levels in dissociated brain cells did not differ compared to controls. Protein levels of FIS were unchanged, whereas Drp levels were significantly increased. Levels of the mitochondrial fusion marker optic atrophie-1 (Opa) protein were significantly reduced. Peroxisome proliferation-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC1) is a transcription factor, which represents a master regulator of mitochondrial biogenesis. PGC1 expression was significantly elevated in brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice. However, mitochondrial mass seemed to be equal in both mouse lines. Both LC3-Isoforms, the cytosolic and the autophagosomal form, were not changed in brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice, which indicates equal mitophagic activity. In brain homogenates, isolated from Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice, both mPTP marker, VDAC and PBR, were considerably increased, which is in accordance with the findings in HEKsw cells. In conclusion, both, the cellular (HEKsw) and the animal model of AD (Thy1-APPSL) broadly match pathophysiological features, which have been found in post-mortem samples from AD patients. Thus, HEKsw cells and Thy1-APPSL mice seem to be suitable models to study new treatments against AD. Incubation of HEKsw cells with Dimebon resulted in a remarkable increase in respiratory activity and restored the MMP after impairing the cells with rotenon. Dimebon had no effects on ATP levels in both cell lines, neither after challenging cells with rotenon, nor under basal conditions. By adding Dimebon, citrate synthase (CS) activity in HEKsw cells was increased and mitochondrial morphology was shifted to a tubular shape. Dimebon further enhanced protein levels of Drp and resulted in the compensation of reduced OPA levels. Moreover, Dimebon restored the increased expression levels of the mPTP markers VDAC and PBR. Aβ1-40 levels were significantly decreased in HEKsw cells. However, changes in Aβ1-40 levels seemed to be too small, to solely explain the much larger effects of Dimebon on impaired mitochondrial function. In conclusion, Dimebon treatment restored diverse defects in Aβ overexpressing cells: Aβ levels were reduced, autophagy marker were increased, mitophagy as repair and renewal mechanism was elevated, mitochondrial mass and density were increased, OXPHOS capacity was restored, mitochondrial dynamics were balanced, mitochondrial shape showed a normal distribution, expression levels of the mPTP constituents were reduced, TIMM50 levels augmented to control levels and stress induced MMP and ROS levels were reduced. All these effects were observed after incubation of cells with a rather low concentration of 100 nmol/L. Based on these findings and in addition to already existing literature, Dimebon presents a potential therapeutic option for diseases with accompanied mitochondrial dysfunction. Although, clinical findings published so far are inconsistent. Olesoxim induced a general increase in respiratory activity and enhanced the electron transport (ETS) capacity in HEKsw cells. In addition it normalized the OXPHOS activity almost to control levels. However, incubation using different Olesoxim concentrations led to a dose independent decline in the MMP and decreased ATP levels. Adding Olesoxim caused a dose-dependent change in the length of mitochondria strongly shifting the pattern towards longer mitochondria. In HEKsw cells a reduced mitochondrial density was observed which was reversed by Olesoxim dose-dependently. Olesoxim completely compensated the severely reduced expression levels of TIMM50, but had no effects on TOMM22 levels. An unexpected finding was that 10 µM Olesoxim significantly increased Aβ1-40 levels. Effects of Olesoxim were also tested in vivo. Treatment of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice with Olesoxim restored the impaired MMP in dissociated brain cells, but had no effects on ATP-levels. Olesoxim increased the respiratory activity in isolated brain mitochondria and restored impaired respiration complex activities almost to control levels, without having an effect on CS activity. However, treatment with Olesoxim caused an increase of PGC1 protein levels in brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice,beyond basal levels of littermate controls. The mPTP marker proteins voltage-depended anion channel (VDAC) and peripheral benzodiazepine receptor (PBR) were significantly reduced. As well as in the cell models, treatment of Thy-1-C57 BJ/6-APPSL mice with Olesoxim significantly enhanced total human, soluble human and soluble mouse Aβ1-40 levels. Further investigation needs the observation that Olesoxim caused partly negative effects in controls. For instance, Olesoxim reduced the OXPHOS capacity and enhanced protein levels of VADAC and PBR in brains of C57BJ/6 littermate control mice, which could limit the applicability of Olesoxim in further preclinical studies.
Pharmacology: the pharmacodynamics of nutrients and nutrient interactions in biological functions
(2015)
Epidemiological studies and randomized controlled trials (RCTs) have shown that nutrition and nutritional habits may play a critical role in the optimal functioning of biological systems from conception to old age. Epidemiological studies, due to their methodology, can only provide correlations between consumption of nutrient(s) and biological outcomes, whereas RCTs normally study just one dose of a certain nutrient. Both study types are therefore ill-suited to study the mechanisms by which nutrients exert their benefits. Moreover, the nutrients’ functions may depend on each other. For example, B-vitamins’ functions are known to be interdependent. While the exact mechanisms are unclear, the course and severity of conditions such as obesity, cellular aging, cancer, and neurological disorders can be affected by nutritional approaches. Thus, food and nutrition play an intimate and inextricable role in human health. Despite growing interest in adequate nutrition, the effects of nutrient interaction, the possible varying effects on different organs, and the dependency of such effects on age or health status are complicated topics that deserve careful examination. ...
Most molecular cancer therapies act on protein targets but data on the proteome status of patients and cellular models for proteome‐guided pre‐clinical drug sensitivity studies are only beginning to emerge. Here, we profiled the proteomes of 65 colorectal cancer (CRC) cell lines to a depth of > 10,000 proteins using mass spectrometry. Integration with proteomes of 90 CRC patients and matched transcriptomics data defined integrated CRC subtypes, highlighting cell lines representative of each tumour subtype. Modelling the responses of 52 CRC cell lines to 577 drugs as a function of proteome profiles enabled predicting drug sensitivity for cell lines and patients. Among many novel associations, MERTK was identified as a predictive marker for resistance towards MEK1/2 inhibitors and immunohistochemistry of 1,074 CRC tumours confirmed MERTK as a prognostic survival marker. We provide the proteomic and pharmacological data as a resource to the community to, for example, facilitate the design of innovative prospective clinical trials.
Das R( )-Enantiomer der rac-a-Liponsäure ist als Coenzym wichtiger Multienzymkomplexe (Pyruvatund a-Ketoglutarat-Dehydrogenase) essentiell für die Zell- und Stoffwechselfunktion. Gerade in den wichtigen Prozessen der Zelle, die Substrate für die Atmungskette bereitstellen (Glykolyse, Citratcyclus), spielt die R( )-a-Liponsäure eine entscheidende Rolle. Zusätzlich besitzt dieser Wirkstoff die Eigenschaft als Chelatkomplex-Bildner, Radikalfänger und Antioxidans zu wirken, und er kann damit den Organismus vor "oxidativem Stress" schützen. Klinische und präklinische Studien geben Hinweise, daß R( )-a- Liponsäure einen positiven Effekt auf die Insulinsensitivität, die Insulin stimulierte Glukoseaufnahme und die Glukoseoxidation hat, weiterhin die Glukoneogenese hemmt und damit eine positive Wirkung auf den Krankheitsverlauf des Typ II - Diabetes hat. Das Ziel dieser Arbeit war es, die in der Literatur beschriebenen lang anhaltenden Wirkungen (Pharmakodynamik) der R( )-a-Liponsäure (12 - 24 h nach Gabe des Wirkstoffes) mit meßbaren Konzentrationen dieser Substanz im Organismus in Zusammenhang zu bringen, um erste Ansätze für die Korrelation zwischen Pharmakokinetik und Pharmakodynamik, also für die Konzentrations-(Dosis)- Wirkungsbeziehung, zu geben. Außerdem sollte geklärt werden, weshalb die Mehrfachgabe zu einer deutlichen Absenkung der nach Einfachgabe wirksamen Dosis führte. Eine wichtige Grundlage dazu ist die genaue Kenntnis der Pharmakokinetik der Wirksubstanz und ihrer wichtigsten Stoffwechselprodukte. Bisher ist nur die Pharmakokinetik der R( )- und S(-)-a-Liponsäure nach Gabe der razemischen a-Liponsäure untersucht worden. Da noch keine Erkenntnisse über die Pharmakokinetik der Metaboliten oder der R( )-a-Liponsäure nach Gabe des reinen R-Enantiomers bestanden, lag der Schwerpunkt der Arbeit auf den Untersuchungen der Pharmakokinetik des R( )- Enantiomers und der Metaboliten nach Gabe von R( )-a-Liponsäure als Trometamolsalz (Dexlipotam) und rac-a-Liponsäure am Tier (Einfach- und Mehrfachgabe) und am Menschen (Einfachgabe). Untersuchungsmodell Ratte: Erster Ausgangspunkt der kinetischen Untersuchungen war das zentrale Kompartiment, abgebildet durch den Blutkreislauf. Die resultierende Plasmakonzentrations-Zeitkurve nach oraler (p.o.), intravenöser (i.v.) oder intraperitonealer (i.p.) Gabe von Dexlipotam konnte mathematisch, basierend auf einem Zwei-Kompartiment-Modell, beschrieben werden. Charakteristisch für die Pharmakokinetik der R( )-a-Liponsäure war die kurze terminale Halbwertszeit (0,6 - 1,6 h) und die hohe, mit dem hepatischen Blutfluß vergleichbare, totale Plasma-Clearance. Diese Eigenschaften führten zu einem schnellen Absinken der Plasmakonzentration auf Werte unterhalb der Nachweisgrenze (6 h nach Gabe des Wirkstoffes). Mit Hilfe der Mikrodialyse wurde nach 1-stündiger Infusion von Dexlipotam die freie ungebundene R( )-a-Liponsäure-Konzentration im Interstitium des Muskels bestimmt. Der zeitliche Verlauf der Gewebekonzentration konnte basierend auf der physiologischen Grundlage eines peripheren Kompartiments (Zwei-Kompartiment-Modell) beschrieben werden. Es zeigte sich, daß nur der freie ungebundene Anteil der im Plasma vorliegenden Konzentration (20 %) für die Distribution in das Gewebe zur Verfügung steht. Die ermittelten Halbwertszeiten der Muttersubstanz im Plasma und im Muskel lagen in vergleichbarer Größenordnung und gaben keinen Hinweis auf eine unterschiedliche Kinetik im Plasma und im Gewebe. Sowohl nach p.o. als auch nach einmal täglicher i.v. Mehrfachgabe über 3 - 4 Wochen konnte keine Anreicherung im Plasma bestimmt werden. Dieser Befund erklärte somit nicht die nach Mehrfachgabe erforderliche Dosisreduktion. Die in weiteren Untersuchungen bestimmten Gewebekonzentrationen in der Leber, in der Niere, im Muskel und im Herzen, die sich aus dem freien ungebundenen und dem reversibel gebundenen Anteil der extrazellulären und intrazellulären Konzentration zusammensetzten, zeigten einen zur Plasmakinetik korrespondierenden Zeitverlauf. Nur einzelne spezifische Geweberegionen zeigten nach p.o. (Aorta) und nach i.v. (Nerven) Mehrfachgabe eine Anreicherung des Wirkstoffes. In in-vitro Testmodellen wurde weiterhin die Pharmakokinetik auf zelluläre Ebene untersucht. Es zeigte sich, daß Hepatozyten in der Lage sind, R( )-a-Liponsäure aufzunehmen und die durch b-Oxidation entstandenen Metaboliten Bisnorliponsäure (BNLA) und Tetranorliponsäure (TNLA) zu bilden und aus der Zelle heraus zu transportieren. Im Hinblick auf die Konzentrations-Wirkungsbeziehung rückten die Metaboliten Tetranorliponsäure und Bisnorliponsäure in das Interesse, da diese Stoffwechselprodukte wie die Muttersubstanz über einen aktiven Dithiolan-Ring verfügen, der möglicherweise das für die Wirkung verantwortliche Strukturelement darstellt. Im Interstitium des Muskels wurde der Metabolit TNLA in vergleichbaren Konzentrationen wie die Muttersubstanz gemessen, der Metabolit BNLA war dort nur in Spuren meßbar. Im Plasma hingegen waren die maximalen TNLA-Konzentrationen um den Faktor 3 geringer als die Muttersubstanz- Konzentrationen. Der Metabolit BNLA war im Plasma nur in geringem Ausmaß, um den Faktor 15 geringer als die Muttersubstanz, meßbar. Untersuchungsmodell Mensch: Im Menschen wurden die Metaboliten TNLA, BNLA, 6,8-Bis(methylmercapto)octansäure (BMOA), 4,6- Bis(methylmercapto)hexansäure (BMHA) und 2,4-Bis(methylmercapto)butansäure (BMBA) im Plasma und im Urin pharmakokinetisch untersucht. Die Metaboliten BMOA, TNLA und BNLA zeigten Halbwertszeiten in vergleichbarer Größenordnung wie die Muttersubstanz (0,5 - 0,9 h). Für die Metaboliten BMBA und BMHA wurden höhere terminale Halbwertszeiten (2 h) ermittelt. Aufgrund der insgesamt kurzen Halbwertszeiten konnte eine Kumulation der Metaboliten nach Mehrfachgabe ausgeschlossen werden. Mit Hilfe eines pharmakokinetischen Modells (Zwei-Kompartiment-Modell) war es möglich, die Bildung der Stoffwechselprodukte BNLA, TNLA, BMOA, BMHA und BMBA im Plasma zeitlich simultan zu beschreiben. Dadurch konnte der Metabolisierungsweg der a-Liponsäure im Organismus genauer erklärt und die resultierenden Konzentrationen der Metaboliten auf Basis der Muttersubstanz-Konzentrationen errechnet werden. Es war nicht möglich, die gemessenen Konzentrationen, weder von der Muttersubstanz noch von den möglichen wirksamen Metaboliten, in den verschiedenen Kompartimenten (Blutkreislauf, Gewebe oder Zelle) mit der lang anhaltenden Wirkung in einen zeitlichen Zusammenhang zu bringen. Weitere Untersuchungen mit empfindlicheren Meßmethoden und weitergehende zusätzliche Konzentrationsbestimmungen in den Kompartimenten in der Zelle (z.B. Mitochondrien) sind erforderlich, um die Korrelation zwischen der Pharmakokinetik und der Pharmakodynamik der R( )-a-Liponsäure oder möglicher wirksamer Metaboliten zu beschreiben.
Pharmakokinetische Charakterisierung der Terpenlaktone aus Ginkgo biloba im ZNS am Tiermodell
(2010)
Ginkgo biloba (Gb), eine der am besten untersuchten pharmazeutisch-medizinisch genutzten Pflanzen, wird heute in Form von Spezialextrakten im Sinne einer evidenzbasierten Phytopharmakatherapie eingesetzt. Grundlage hierfür sind die genaue Spezifikation der Zusammensetzung des Spezialextraktes in Bezug auf die wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe, balstbare klinische Daten, das Erforschen des molekularen Wirkmechanismus‘ des Gesamtextraktes aber auch der Einzelbestandteile und die Pharmakokinetik im Targetgewebe. Heute werden im Sinne einer evidenzbasierten Phytopharmakatherapie lediglich Extrakte verwendet, die der Monographie der Komission E entsprechen (22 - 27% Flavonoide, 5 - 7% Terpenlaktone und weniger als 5 ppm Ginkgolsäuren). Der am besten klinisch und pharmakologisch untersuchte Gb-Spezialextrakt ist EGb 761® (Tebonin®), der im zentralen Fokus der vorliegenden Arbeit steht. Die im Jahr 2008 vom IQWiG veröffentlichte Metaanalyse zur Klinik von EGb 761® hat in äußerst detaillierter Form belastbare Daten zur Wirksamkeit dieses Extraktes beschrieben. Es kann festgehalten werden, dass ein Einsatz dieses Spezialextraktes im Rahmen der Therapie einer beginnenden Demenz zu befürworten ist. Basis des klinischen Einsatzes des EGb 761® sind in vitro und in vivo pharmakologische Untersuchungen. Es werden unterschiedliche Gesamtkonzepte zur Wirkung von EGb 761® bzw. Einzeleffekte der Inhaltsstoffe im ZNS diskutiert. Konsensfähig sind heute sicher die Mitochondrien-stabilisierende Wirkung der Terpenlaktone und ein antioxidativer Effekt der Flavonoide. Bb zeigt zusätzlich deutlich protektive Effekte in Bezug auf durch zerebrovaskuläre Ereignisse geschädigte Hirnareale. Darüber hinaus ist die Wirkung der Flavonoide auf die monoaminerge Neurotransmission aktueller Gegenstand der Forschung. Basis jeglicher pharmakologischen Betrachtung ist das pharmakokinetische Verhalten der wirksamen Inhaltsstoffe im Target-Gewebe. Nachdem die ZNS-Bioverfügbarkeit der Flavonoide nachgewiesen wurde, hat die vorliegende Arbeit das zentrale Ziel, die pharmakokinetische Charakteristik der Terpenlaktone aus Gb im ZNS zu untersuchen. Zur quantitativen Analyse der Terpenlaktone (GKA, GKB, GKC und Bb) in biologischen Matrices (Hirn-Homogenat, Plasma) und Hirn-Dialysat-Pufferlösung (aCSF-Puffer) wurde eine LC-MS-Analytik-Methode entwickelt und validiert. Unter Verwendung einer 250x4 mm, Multo High 100 RP18, 5 μm (CS-Chromatographie Service GmbH)-Säule und einer isokratischen Auftrennung mittels einer mobilen Phase bestehend aus 60% 0,1%-iger Ameisensäure und 40%-igem Methanol konnten alle vier genannten Terpenlaktone simultan innerhalb von 20 Minuten analysiert werden. Die beschriebene LC-MS(TOF)-Methode verfügt über eine ausreichende Sensitivität, um die Analyten im nanomolaren Bereich zu quantifizieren (z.B. LOQ Bb in aCSF-Puffer: 0,25 pg/μl; LOQ Bb in Hirnhomogenat: 1 ng/ml). Die Aufarbeitung der Plasma- bzw. Hirn-Homogenat-Proben erfolgte durch eine flüssig-flüssig-Extraktion mit Hilfe von Extrelut®-Säulen; die Hirn-Dialysat-Proben bedurften keiner Probenaufarbeitung. Mit Hilfe der beschriebenen Analytik-Methode war es möglich, GKA, GKB, GKC und Bb in Plasma und Hirnhomogenat von Ratten nach oraler Gabe von 600 mg/kg Körpergewicht EGb 761® bzw. einer vergleichbaren Menge der Reinsubstanzen zu bestimmen. Im Rahmen dieses Projektes wurde ein direkter Vergleich der erhalten Plasma-Konzentrationen nach Extrakt- bzw. Reinsubstanzgabe gezogen, wobei der Extrakt die höhere AUC (für GKA u. Bb) und daher bessere Bioverfügbarkeit aufwies. Es konnten in Plasma und Gehirngewebe sowohl GKA als auch GKB und Bb in nativer nicht metabolisierter Form nachgewiesen werden. GKC konnte weder in Plasma noch in Hirngewebe bestimmt werden, was die in der Literatur diskutierte These einer schnellen Metabolisierung (Methylierung) stärkt. Die Terpenlaktone sind im Plasma sehr schnell angeflutet und zeigten ein ebenfalls zügiges Abfallen, so dass 24 Stunden nach oraler Applikation keine Konzentrationen mehr zu detektieren waren. Bei der Untersuchung der Hirn-Gewebspiegel von GKA, GKB und Bb zeigten sich keine Unterschiede nach Gabe von Extrakt bzw. Reinsubstanz. Die Substanzen fluteten im Vergleich zum Plasma etwas verzögert an, fielen aber auch bis 24 Stunden nach Applikation wieder unter die Nachweisgrenze. Die Konzentrations-Zeit-Kurven ähnelten in ihrer Form stark denen aus Plasma, waren jedoch zeitlich nach rechts verschoben, so dass ausgeschlossen werden kann, dass es sich im Hirngewebe um Artefakt aus Restblut handelt. Wesentliches Resultat dieser Untersuchungen war, dass erstmalig nach oraler Gabe von EGb 761® gezeigt wurde, dass deutliche Gewebespiegel im Gehirn von Ratten zu erzielen sind und damit diese Substanzen im Target-Gewebe die postulierten pharmakologischen Wirkungen ausüben können. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden mit Hilfe der Mikrodialyse-Technik und der bereits beschriebenen LC-MS-Analytik-Methode weitere pharmakokinetische Untersuchungen am Maus-Modell durchgeführt. Es konnte zunächst rein technisch im Rahmen von Wiederfindungsuntersuchungen gezeigt werden, dass die im Dialysat bestimmte Menge Bb ca. 6% der tatsächlich im Extrazellularraum des Maus-Hirns vorliegenden Bb-Konzentration entspricht. Weiterhin zeigten diese Versuche, dass Bb kaum an Plasma-Proteine bindet, da keine signifikanten Unterschiede bei der Dialyse von Bb aus Puffer, Blut oder Plasma zu sehen waren. In einem ersten Tierversuch an gesunden Mäusen konnten die pharmakokinetischen Charakteristika von Bb, die in der Fütterungsstudie an Ratten bestimmt wurden, reproduziert werden, obwohl es sich um einen völlig divergenten Versuchsaufbau, unterschiedliche Tierspezies und nicht um die gleichen Applikationsformen handelt. Diese Tatsache unterstreicht die Aussage beider Studien. Als zusätzliche Aussage ergibt sich aus dem Versuchsaufbau, dass Bb frei und biologisch aktiv im Extrazellularraum vorliegt und nicht z.B. in Membranen gebunden ist. Die Möglichkeit mittels Mikrodialyse und LC-MS-Technik Bb im Extrazellularraum definierter Hirnregionen nachzuweisen, erlaubte eine pharmakokinetische Charakterisierung von Bb in vom Schlaganfall geschädigten Hirngewebe. Es zeigte sich, dass bei Gabe von 10 mg/Kg Bb eine Stunde vor dem Schlaganfall die Bb-Konzentrationen zwar deutlich abfallen, aber dann relativ konstant bleiben, was durch einen fehlenden Abtransport durch die unterbrochene Blutversorgung zu erklären ist.
Eine große Herausforderung auf dem Forschungsgebiet der P2-Rezeptoren stellt die Entwicklung von potenten und selektiven Antagonisten für die einzelnen Rezeptorsubtypen dar, um die P2-Rezeptoren in nativen Geweben zu identifizieren und ihre physiologische und pathophysiologische Funktion aufzuklären. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Entwicklung solcher P2-Antagonisten und zum anderen der Vergleich der pharmakologischen Befunde, die an nativen P2-Rezeptoren humaner Thrombozyten und isolierter Organe der Ratte sowie des Meerschweinchens ermittelt wurden, mit Ergebnissen an rekombinanten Rezeptoren, um somit Aussagen über P2-Rezeptoren verschiedener Spezies sowie nativer und rekombinanter P2-Rezeptoren treffen zu können. Mit Hilfe der P2Y1- und P2Y12-Standardantagonisten MRS2179, A3P5P und 2-meSAMP konnte gezeigt werden, dass für die ADP-induzierte Aggregation von in Puffer suspendierten Thrombozyten die gleichzeitige Aktivierung von P2Y1- und P2Y12-Rezeptoren zwingend erforderlich ist. Dagegen handelt es sich bei ADP- bzw. abmeATP-induziertem „shape change“ und Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration um rein P2Y1- bzw. P2X1-vermittelte Effekte humaner Thrombozyten, die zur Charakterisierung von Antagonisten an diesen Rezeptoren geeignet sind. Weiterhin wurden Untersuchungen am P2X1-Rezeptor des Ratten-Vas-deferens sowie am P2X3- und P2Y1-Rezeptor des Meerschweinchen-Ileum durchgeführt. Ausgehend von den Leitstrukturen Suramin und PPADS wurden Strukturmodifikationen vorgenommen mit dem Ziel, die Wirkstärke und die Selektivität zu erhöhen. Bei PPADS ist es durch Variation des Restes am Pyridoxalphosphat gelungen, sowohl P2X1- wie auch P2Y1-selektive Antagonisten zu entwickeln. Mit dem Ersatz des Phenylrestes durch einen Naphthylrestes beim PPNDS wurde die größte P2X1-versus P2Y1-Selektivität erreicht, wohingegen das Heterodimer SB9, bestehend aus Pyridoxalphosphat und einem Suraminmonomer, eine P2Y1-versus P2X1-Präferenz aufweist. Die einzelnen PPADS-Analoga unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Kinetik und des antagonistischen Mechanismus. Bei einigen Substanzen wurde ein kompetitiver, bei anderen ein „pseudoirreversibler“ oder nichtkompetitiver Antagonismus beobachtet. Im Gegensatz zu den P2-Rezeptoren glattmuskulärer Organe zeigen alle untersuchten PPADS-Analoga an P2-Rezeptoren der Thrombozyten einen nichtkompetitiven Antagonismus. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Strukturmodifikationen einen wesentlich geringeren Einfluss auf die Wirkstärke an P2-Rezeptoren der Thrombozyten haben als an den Rezeptoren glattmuskulärer Organe. Bei den Suraminanaloga ist es gelungen durch Strukturmodifikationen potente und selektive Antagonisten für humane P2X1-Rezeptoren zu entwickeln. Es zeigte sich, dass die tetravalenten Verbindungen NF449, NF110 und NF864 eine wesentlich höhere Affinität zum P2X1-Rezeptor humaner Thrombozyten aufweisen als ihre bivalenten Analoga. Die größte P2X1- versus P2Y1-Selektivität wurde bei NF110 erreicht, die größte Wirkstärke am P2X1-Rezeptor dagegen ist beim NF864 zu finden. Bei der Substanz NF864 handelt es sich um den derzeit potentesten P2X1-selektiven Antagonisten humaner Thrombozyten. Somit sollte sich NF864 zur Untersuchung der Beteiligung des P2X1-Rezeptors an der Hämostase als nützlich erweisen. Korrelationen der Ergebnisse des abmeATP-induzierten „shape change“ mit denen des abmeATP-induzierten Calciumeinstroms in Thrombozyten zeigten, dass beide Vorgänge allein durch den P2X1-Rezeptor vermittelt werden und wahrscheinlich über den gleichen Transduktionsweg ablaufen. Intrazellulärer Calciumanstieg und „shape change“, die durch ADP ausgelöst werden, sind ausschließlich P2Y1-vermittelt, verlaufen aber unter Umständen über unterschiedliche Transduktionswege. Vergleicht man die Ergebnisse, die an humanen Thrombozyten ermittelt wurden mit denen der isolierten Organe so ist weder bei der Wirkstärke noch beim antagonistischen Mechanismus eine völlige Übereinstimmung festzustellen. Auch der Vergleich der Ergebnisse, die an nativen P2X1-Rezeptoren ermittelt wurden, mit Daten an rekombinanten Rezeptoren ergaben weder bei den Thrombozyten, noch bei den isolierten Vasa deferentia der Ratte eine klare Korrelation. Struktur-Wirkungs-Beziehungen von P2X1-Antagonisten sind somit scheinbar nur innerhalb eines Modells möglich. Die Interpretation auf antagonistische Potenzen von Verbindungen zwischen nativen P2X1-Rezeptoren unterschiedlicher Spezies sowie zwischen nativen und rekombinanten P2X1-Rezeptoren einer Spezies müssen nach dem heutigen Stand der Wissenschaft mit Vorsicht betrachtet werden.
Pharmakologische Charakterisierung zentraler cholinerger Dysfunktionen in transgenen Mausmodellen
(2013)
Die cholinerge Dysfunktion steht in Zusammenhang mit der Ätiologie der Alzheimer-Krankheit (AD). Das Absterben cholinerger Neurone führt zu einer verminderten cholinergen Neurotransmission im Gehirn. Die Abnahme der Acetylcholinesterase-(AChE)-Aktivität und eine leichte Zunahme der Butyrylcholinesterase-(BChE)-Aktivität zählen zu den charakteristischen Merkmalen der AD. Acetylcholinesterase-Inhibitoren (AChEI) sollen Acetylcholin (ACh)-Konzentrationen im Gehirn steigern, um cholinerge Defizite auszugleichen. Allerdings zeigen AChEI in der Klinik nur einen mäßigen Erfolg. Zur Optimierung der Therapie mit Esterasehemmern, wurden im Rahmen dieser Arbeit drei transgene Mausmodelle mit cholinergen Veränderungen untersucht.
Zunächst wurde die AChE-heterozygote (AChE +/-) Maus analysiert. Die Maus weist bei einer 60-prozentigen AChE-Restaktivität (60,6 U/mg in AChE +/- versus 100,0 U/mg in WT-Mäusen) nur sehr leicht erhöhte ACh-Konzentrationen im Gehirn (9,0±5,1 fmol/5 µl in AChE+/- versus 5,0±3,6 fmol/5 µl in der WT-Maus) auf, die mithilfe der in vivo Mikrodialyse bestimmt wurden. PET-Studien haben gezeigt, dass die zerebrale AChE-Restaktivität in AD-Patienten, die mit Donepezil behandelt wurden, immer noch 70 bis 90% beträgt. Vom AChE +/- Modell kann abgeleitet werden, dass eine bis zu 50-prozentige AChE-Hemmung durch AChEI nicht genügt, um ACh-Konzentrationen im Gehirn von Patienten deutlich zu erhöhen. Leider ist eine Dosiserhöhung der AChEI durch das Auftreten von unerwünschten Wirkungen (Diarrhö, Übelkeit, Erbrechen) begrenzt.
Hippocampale ACh-Konzentrationen in der AChE +/- Maus steigen nach intrazerebraler und intraperitonealer Gabe von selektiven AChEI signifikant stärker an als in WT Mäusen. AChEI können ACh-Konzentrationen also auch noch bei einer verminderten AChE-Aktivität steigern. Die Cholinacetyltransferase-Aktivität ist in AChE +/- Mäusen unverändert, während der hochaffine Cholintransport signifikant um 58% erhöht ist. Veränderungen der kognitiven Leistungsfähigkeit der AChE +/- Maus sind in Verhaltenstests nicht zu erkennen. Es folgte die Untersuchung der PRiMA (Prolin-reicher Membrananker) defizienten Maus und der AChE del5 6-Maus. PRiMA ist ein transmembranäres Protein, das zur Prozessierung der AChE und ihrer Verankerung in der Membran verantwortlich ist. PRiMA kommt hauptsächlich im Gehirn vor, daher kann die PRiMA-KO-Maus dort keine AChE-Verankerung ausbilden. Die AChEdel5 6-Maus kann weder im Gehirn noch in der Peripherie AChE-Verankerungen formen, da eine Domäne fehlt, die essentiell für die Wechselwirkung mit Anker-Proteinen ist. Beide Mausmodelle weisen geringe AChE-Restaktivitäten (< 10 %) und drastisch erhöhte ACh-Konzentrationen im Gehirn auf. Die ACh-Konzentrationen im Striatum der PRiMA-KO-Maus sind circa 350 fach erhöht (4±3 fmol/5 µl in WT-Mäusen versus 1450±700 fmol/5 µl in PRiMA-KO-Mäusen). Allerdings zeigt die PRiMA-KO-Maus keinen Phänotyp, während die AChE del5 6 Maus krank aussieht (Tremor, geringes Körpergewicht, stumpfes Fell). Beide Modelle bestätigen, dass ACh-Spiegel im Gehirn nur dann stark ansteigen, wenn die AChE immens gehemmt ist. Ferner kann aus der PRIMA-KO-Maus gefolgert werden, dass die Interaktion zwischen AChE und PRiMA ein geeignetes Target für die Therapie der cholinergen Dysfunktion darstellen könnte.
Nach intrazerebraler Applikation eines selektiven AChE-Inhibitors (BW284c51 1 µM), steigen die ACh-Spiegel im Gehirn beider transgener Mäuse signifikant an. Eine Veränderung der ACh-Konzentrationen nach BChEI Gabe ist weder bei der AChE +/-, der PRiMA-KO, noch bei der AChE del5 6 Maus zu sehen. Die BChE trägt bei einer AChE-Restaktivität (10 bis 40 %) nicht zum hydrolytischen Abbau von ACh bei. Daraus lässt sich ableiten, dass bei stark verminderten AChE-Aktivitäten, der Einsatz von BChEI vermutlich keinen weiteren Nutzen erbringt. Um die Adaptionsmechanismen der PRiMA-KO-Maus aufzuklären, wurde die M2-Rezeptor Funktion (negativer Feedback-Mechanismus) getestet. Da die striatalen ACh-Konzentrationen in der PRiMA-KO-Maus nach Behandlung (lokal und i.p.) mit M2-Agonisten und -Antagonisten kaum verändert sind, lässt dies einen nicht-funktionalen M2 vermuten.
Aus den Ergebnissen können wichtige Erkenntnisse über die Therapie der Alzheimer-Krankheit gewonnen werden. Die Bestimmung der ACh-Konzentrationen, in Gegenwart unterschiedlicher AChE-Aktivitäten der verschiedenen Mausmodelle, zeigt den Zusammenhang zwischen ACh und AChE im Säugerhirn und erklärt die limitierte klinische Wirksamkeit der AChE-Inhibitoren. Die Hemmung der Interaktion zwischen PRiMA und der AChE stellt eine denkbare Interventionsmöglichkeit dar, um ACh-Konzentrationen im Gehirn zu steigern, ohne dabei periphere Nebenwirkungen auszulösen. Ziel der weiteren Forschung sollte sein, PRiMA bzw. die Interaktion zwischen PRiMA und AChE als Target für die Therapie der Alzheimer-Krankheit weiter zu erforschen.
Pharmazeutische Proteomics
(2006)
Die vorliegende Arbeit setzt sich mit der Implementierung, Validierung und Anwendung der 2-dimensionalen Gelelektrophorese und der MALDI-TOF Massenspektrometrie unter pharmazeutischen Gesichtspunkten auseinander. Es wurde ein breites Spektrum aus dem Bereich der Pharmazeutischen Proteomics bearbeitet, beginnend mit einer detaillierten Methodenentwicklung für 2-DE, um die Methode zu optimieren, ihre Robustheit zu evaluieren und die Grenzen der Methode kennen zu lernen. Daran schließt sich eine Validierung für 2-DE / Silberfärbung an. Der Validierungsansatz orientiert sich an den üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie bei der Validierung analytischer Methoden untersuchten Parametern. Hierzu zählen Präzision, Linearität, Richtigkeit und Spezifität. Ferner wurden Untersuchungen angestellt, inwiefern Daten aus unterschiedlichen Labors zusammengefasst werden können. Zur Dokumentation wurde ein auf MS Access® basierendes Laborinformationssystem erstellt. Hiermit können die von verschiedenen Mitarbeitern erzeugten Daten einheitlich und nachvollziehbar erfasst werden. Nach der Etablierung der methodischen Grundlagen wurden unterschiedliche, pharmazeutisch relevante Fragestellungen mittels 2-DE und MALDI-TOF-MS bearbeitet. Proben unterschiedlicher Komplexität wurden untersucht, die Milch eines transgenen Kaninchens, welches bovines FSH exprimiert, wurde analysiert. Über diese Versuche wurde der Einstieg in die Analytik rekombinanter Arzneistoffe geschaffen. Die 2-DE eignet sich sehr gut um die bei posttranslational modifizierten rekombinanten Proteinen auftretende Mikroheterogenität abzubilden. 2-DE und MALD-TOF MS sind alternative Methoden zu denen, die im europäischen Arzneibuch für die Analytik rekombinanter Arzneistoffe beschriebenen werden. Erythropoietin, einer der weltweit umsatzstärksten rekombinanten Arzneistoffe, zu dem auch eine Monographie im EuAB existiert, wurde näher untersucht. Bei diesem Protein wurden die Zuckerseitenketten selektiv abgespalten und es wurde untersucht, welche Auswirkung die Zucker auf das eletrophoretische Verhalten des Erythropoietins haben. Eine MALDI-TOF-MS Analytik von Erythropoietin war auch erst nach Abspaltung der Zuckerseitenketten möglich. Die Sequenzabdeckung konnte durch Verdau mit unterschiedlichen Enzymen gesteigert werden. Eine Technologie zur Sequenzierung von Proteinen mittels MALDI-TOF-MS wurde mit CAFTM für rekombinantes Chicken Annexin V etabliert. Weitere rekombinante Proteine, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden, sind Interferon-alfa-2a, Interferon-alf-2b, rh-HCG, Trastuzumab und Rituximab. Das anti-apoptotischen Bcl-xL ist ein Zielprotein für den Einsatz von Antisense Oligonucleotiden in der Tumortherapie. Für dieses Protein wurde eine 2-DE / Western blot-Methode entwickelt, die als in vitro Testsystem für das Screening von Oligonucleotiden genutzt werden kann. Aus dem Bereich der klinischen Proteomics wurden Serum, CSF und Urinproben von Patienten mit Bence Jones Proteinämie untersucht und mit den üblicherweise in der Klinik verwendeten CE-Analysen verglichen. In einzelnen Fällen konnten in vermeintlich Bence Jones negativen Proben mittels 2-DE doch noch Bence Jones Proteine nachgewiesen werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass 2-DE und MALDI-TOF-MS vielseitig in der Pharmazie angewendet werden können. Die Komplexität eines jeden Proteoms und die physikochemische Heterogenität von Proteinen muss beachtet werden. In komplexen Proteinmischungen sind aufgrund sehr unterschiedlicher Konzentrationen, Löslichkeiten und der Heterogenität durch posttranslationale Modifikationen viele Proteine einem globalen 2-DE Ansatz nicht zugänglich, nichtsdestotrotz ist die 2-DE derzeit eine der leistungsfähigsten Methoden in der Proteomanalytik.
We developed the Pharmacophore Alignment Search Tool (PhAST), a text-based technique for rapid hit and lead structure searching in large compound databases. For each molecule, a two-dimensional graph of potential pharmacophoric points (PPPs) is created, which has an identical topology as the original molecule with implicit hydrogen atoms. Each vertex is coloured by a symbol representing the corresponding PPP. The vertices of the graph are canonically labelled. The symbols associated with the vertices are combined to a so-called PhAST-Sequence beginning with the vertex with the lowest canonical label. Due to the canonical labelling the created PhAST-Sequence is characteristic for each molecule. For similarity assessment, PhAST-Sequences are compared using the sequence identity in their global pairwise alignment. The alignment score lies between 0 (no similarity) and 1 (identical PhAST-Sequences). In order to use global pairwise sequence alignment, a score matrix for pharmacophoric symbols was developed and gap penalties were optimized. PhAST performed comparably and sometimes superior to other similarity search tools (CATS2D, MOE pharmacophore quadruples) in retrospective virtual screenings using the COBRA collection of drugs and lead structures. Most importantly, the PhAST alignment technique allows for the computation of significance estimates that help prioritize a virtual hit list.
BACKGROUND: Human SAMHD1 is a triphosphohydrolase that restricts the replication of retroviruses, retroelements and DNA viruses in noncycling cells. While modes of action have been extensively described for human SAMHD1, only little is known about the regulation of SAMHD1 in the mouse. Here, we characterize the antiviral activity of murine SAMHD1 with the help of knockout mice to shed light on the regulation and the mechanism of the SAMHD1 restriction and to validate the SAMHD1 knockout mouse model for the use in future infectivity studies.
RESULTS: We found that endogenous mouse SAMHD1 restricts not only HIV-1 but also MLV reporter virus infection at the level of reverse transcription in primary myeloid cells. Similar to the human protein, the antiviral activity of murine SAMHD1 is regulated through phosphorylation at threonine 603 and is limited to nondividing cells. Comparing the susceptibility to infection with intracellular dNTP levels and SAMHD1 phosphorylation in different cell types shows that both functions are important determinants of the antiviral activity of murine SAMHD1. In contrast, we found the proposed RNase activity of SAMHD1 to be less important and could not detect any effect of mouse or human SAMHD1 on the level of incoming viral RNA.
CONCLUSION: Our findings show that SAMHD1 in the mouse blocks retroviral infection at the level of reverse transcription and is regulated through cell cycle-dependent phosphorylation. We show that the antiviral restriction mediated by murine SAMHD1 is mechanistically similar to what is known for the human protein, making the SAMHD1 knockout mouse model a valuable tool to characterize the influence of SAMHD1 on the replication of different viruses in vivo.
Physiologically based pharmacokinetic/pharmacodynamic (PBPK/PD) models can serve as a powerful framework for predicting the influence as well as the interaction of formulation, genetic polymorphism and co-medication on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of drug substances. In this study, flurbiprofen, a potent non-steroid anti-inflammatory drug, was chosen as a model drug. Flurbiprofen has absolute bioavailability of ~95% and linear pharmacokinetics in the dose range of 50–300 mg. Its absorption is considered variable and complex, often associated with double peak phenomena, and its pharmacokinetics are characterized by high inter-subject variability, mainly due to its metabolism by the polymorphic CYP2C9 (fmCYP2C9 ≥ 0.71). In this study, by leveraging in vitro, in silico and in vivo data, an integrated PBPK/PD model with mechanistic absorption was developed and evaluated against clinical data from PK, PD, drug-drug and gene-drug interaction studies. The PBPK model successfully predicted (within 2-fold) 36 out of 38 observed concentration-time profiles of flurbiprofen as well as the CYP2C9 genetic effects after administration of different intravenous and oral dosage forms over a dose range of 40–300 mg in both Caucasian and Chinese healthy volunteers. All model predictions for Cmax, AUCinf and CL/F were within two-fold of their respective mean or geometric mean values, while 90% of the predictions of Cmax, 81% of the predictions of AUCinf and 74% of the predictions of Cl/F were within 1.25 fold. In addition, the drug-drug and drug-gene interactions were predicted within 1.5-fold of the observed interaction ratios (AUC, Cmax ratios). The validated PBPK model was further expanded by linking it to an inhibitory Emax model describing the analgesic efficacy of flurbiprofen and applying it to explore the effect of formulation and genetic polymorphisms on the onset and duration of pain relief. This comprehensive PBPK/PD analysis, along with a detailed translational biopharmaceutic framework including appropriately designed biorelevant in vitro experiments and in vitro-in vivo extrapolation, provided mechanistic insight on the impact of formulation and genetic variations, two major determinants of the population variability, on the PK/PD of flurbiprofen. Clinically relevant specifications and potential dose adjustments were also proposed. Overall, the present work highlights the value of a translational PBPK/PD approach, tailored to target populations and genotypes, as an approach towards achieving personalized medicine.
Phytochemical analysis of Ficus carica L. active compounds possessing anticonvulsant activity
(2018)
The anticonvulsant potential of Ficus carica methanol-extract (Fc) has been studied. It was found that Fc most active fraction is rich in oligosaccharides (OFG). 1H, 13C NMR and Nano-ESI, MALDI MS, and LC-MS techniques proved that OFG contains alpha-glucopyranoside oligomer in high amounts. Both Fc and OFG reduced strychnine (STR) convulsion-action. Fc and OFG fully protected the experimental-animals from STR-lethality. The intracerebroventricular-administration (ICV) of Fc or OFG in combination with glycine in ethanol-treated mice caused a dose-dependent returning to a 2nd-loss of righting-reflex (LORR), and was antagonized by STR. FC and OFG ICV injection counteracted STR-inhibition, confirming that Fc/OFG anticonvulsant mechanism of action was mediated by potentiation of glycine receptor. These results support Fc and OFG potential anticonvulsant-activity with good safety-profile. Keywords: Ficus carica, Moraceae, Nano-ESI MS, MALDI MS, Intracerebroventricular, Anticonvulsant activity.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere Zielrichtungen verfolgt: 1. Vergleichende Testung von Kavainhaltsstoffen, Kava-Fertigarzneimitteln und chemischen Anxiolytika auf Hepatotoxizität Mit Hilfe der Hepatocarcinom-Zelllinie Hep-G2 wurden alle noch verfügbaren Kava-Fertigarzneimittel einem Cytotoxizitätstest unterzogen, durch die Herkunft der Zelllinie aus der Leber handelt es sich um eine spezifische Cytotoxizität – um Hepatotoxizität. Ebenso wurden isolierte, reine Inhaltsstoffe von Piper methysticum, Strukturverwandte und chemische Anxiolytika diesen Hepatotoxizitätstests unterzogen. Da alle Tests unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurden und bei jedem Test auf den microtiter-plates Kontrollen mitgeführt wurden, erlauben die Ergebnisse eine vergleichende Aussage zur Cytotoxizität. Besonders die Kava-Fertigarzneimittel, weniger die reinen Kava-Inhaltsstoffe (Kava-Lactone) fallen durch eine gewisse Cytotoxizität bei Hep-G2 auf. Die mit getesteten, handelsüblichen, chemischen Anxiolytika waren deutlich weniger cytotoxisch im Hep-G2-Assay. 2. Aufklärung der möglichen Ursache für die Fälle von Hepatotoxizität in Zusammenhang mit Kava Parallel zu den Hep-G2-Tests wurde eine Arbeit über die starke Hepatotoxizität des Kava-Alkaloids Pipermethystin publiziert. Nach Extraktion und Synthese von Pipermethystin wurden noch zwei weitere Kava-Alkaloide synthetisiert und Strukturverwandte mit in die Tests aufgenommen. Die starke Hepatotoxizität des Pipermethystins konnte bestätigt werden. Durch weitere Versuche mit Abbauprodukten und Strukturverwandten des Pipermethystins konnte ein Dihydropyridon-Heterocyclus als toxisches Prinzip des Pipermethystins bestimmt werden. 3. Vergleichende Untersuchung der Ergebnisse mit Primärzellen, humanen Hepatocyten Durch Kooperation mit der Universität Mainz war es möglich, die in den Hep-G2-Tests aufgefallenen Substanzen an humanen Hepatocyten zu testen. Teilweise gab es bei diesen Untersuchungen Parallelen, teilweise variierten die Ergebnisse erheblich. Der Grund liegt in den unterschiedlichen enzymatischen Ausstattungen der Hep-G2-Zellen bzw. der humanen Hepatocyten und den daraus resultierenden unterschiedlichen metabolischen Fähigkeiten.
The most frequently used parameters to describe the barrier properties of endothelial cells (ECs) in vitro are (i) the macromolecular permeability, indicating the flux of a macromolecular tracer across the endothelium, and (ii) electrical impedance of ECs grown on gold-film electrodes reporting on the cell layer's tightness for ion flow. Due to the experimental differences between these approaches, inconsistent observations have been described. Here, we present the first direct comparison of these assays applied to one single cell type (human microvascular ECs) under the same experimental conditions. The impact of different pharmacological tools (histamine, forskolin, Y-27632, blebbistatin, TRAP) on endothelial barrier function was analyzed by Transwell(®) tracer assays and two commercial impedance devices (xCELLigence(®), ECIS(®)). The two impedance techniques provided very similar results for all compounds, whereas macromolecular permeability readings were found to be partly inconsistent with impedance. Possible reasons for these discrepancies are discussed. We conclude that the complementary combination of both approaches is highly recommended to overcome the restrictions of each assay. Since the nature of the growth support may contribute to the observed differences, structure-function relationships should be based on cells that are consistently grown on either permeable or impermeable growth supports in all experiments.
Many diseases have been described to be associated with inflammatory processes. The currently available anti-inflammatory drug therapy is often not successful or causes intolerable side effects. Thus, new anti-inflammatory substances are still urgently needed. Plants were the first source of remedies in the history of mankind. Since their chemical characterization in the 19th century, herbal bioactive compounds have fueled drug development. Also, nowadays, new plant-derived agents continuously enrich our drug arsenal (e.g., vincristine, galantamine, and artemisinin). The number of new, pharmacologically active herbal ingredients, in particular that of anti-inflammatory compounds, rises continuously. The major obstacle in this field is the translation of preclinical knowledge into evidence-based clinical progress. Human trials of good quality are often missing or, when available, are frequently not suitable to really prove a therapeutical value. This minireview will summarize the current situation of 6 very prominent plant-derived anti-inflammatory compounds: curcumin, colchicine, resveratrol, capsaicin, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), and quercetin. We will highlight their clinical potential and/or pinpoint an overestimation. Moreover, we will sum up the planned trials in order to provide insights into the inflammatory disorders that are hypothesized to be beneficially influenced by the compound.
Background: In rat, deafferentation of one labyrinth (unilateral labyrinthectomy) results in a characteristic syndrome of ocular and motor postural disorders (e.g., barrel rotation, circling behavior, and spontaneous nystagmus). Behavioral recovery (e.g., diminished symptoms), encompassing 1 week after unilateral labyrinthectomy, has been termed vestibular compensation. Evidence suggesting that the histamine H3 receptor plays a key role in vestibular compensation comes from studies indicating that betahistine, a histamine-like drug that acts as both a partial histamine H1 receptor agonist and an H3 receptor antagonist, can accelerate the process of vestibular compensation. Results: Expression levels for histamine H3 receptor (total) as well as three isoforms which display variable lengths of the third intracellular loop of the receptor were analyzed using in situ hybridization on brain sections containing the rat medial vestibular nucleus after unilateral labyrinthectomy. We compared these expression levels to H3 receptor binding densities. Total H3 receptor mRNA levels (detected by oligo probe H3X) as well as mRNA levels of the three receptor isoforms studied (detected by oligo probes H3A, H3B, and H3C) showed a pattern of increase, which was bilaterally significant at 24 h post-lesion for both H3X and H3C, followed by significant bilateral decreases in medial vestibular nuclei occurring 48 h (H3X and H3B) and 1 week post-lesion (H3A, H3B, and H3C). Expression levels of H3B was an exception to the forementioned pattern with significant decreases already detected at 24 h post-lesion. Coinciding with the decreasing trends in H3 receptor mRNA levels was an observed increase in H3 receptor binding densities occurring in the ipsilateral medial vestibular nuclei 48 h post-lesion. Conclusion: Progressive recovery of the resting discharge of the deafferentated medial vestibular nuclei neurons results in functional restoration of the static postural and occulomotor deficits, usually occurring within a time frame of 48 hours in rats. Our data suggests that the H3 receptor may be an essential part of pre-synaptic mechanisms required for reestablishing resting activities 48 h after unilateral labyrinthectomy.
Disruption of the complex gastrointestinal ecosystem between the resident microflora and the colonic epithelial cells has been associated with increased inflammation and altered cell growth. Possible endpoints of this disturbance are IBD and CRC. The data presented in this thesis, entitled "PPARgamma as molecular target of epithelial functions in the gastrointestinal tract", shed further light on the underlying molecular mechanisms contributing to the well ordered homeostasis of this gastrointestinal ecosystem. Except for elucidating important roles for mesalazine and the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN in a) the modulation of cellular growth, b) the induction of APs, and c) the control of NFkappaB signalling in CRC cells, the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma und VDR as "gatekeepers" in these intricate regulatory mechanisms were established. Future work will be engaged in analysing whether these in vitro findings are also physiologically relevant in regard to prevention and therapy of gastrointestinal diseases. Within the scope of this work, in Paper I and II it could be demonstrated that butyrate and mesalazine act via PPARgamma to induce their anti-proliferative and pro-apoptotic actions along the caspase signalling pathway. Activation of the intrinsic and extrinsic signalling trail and the down-regulation of anti-apoptotic proteins are responsible for increased caspase-3 activity caused by butyrate. In contrast, mesalazine merely activates this cascade via the extrinsic trail and the IAPs. Moreover, a signal transduction pathway leading to increased cell death via p38 MAPK - PPARgamma - caspase-3 in response to butyrate was unveiled. In addition, there is strong evidence that mesalazine-mediated pro-apoptotic and growth-inhibitory abilities are controlled by PPARgamma-dependent and -independent mechanisms which appear to be triggered at least in part by the modulation of the tumor suppressor gene PTEN and the oncoprotein c-myc, respectively. In Paper III and IV the induction of the APs HBD-2 and LL-37 in response to the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN was pinpointed. Regarding the molecular events of this regulation, the data presented in this thesis provide strong evidence for the involvement of VDR in HBD-2- and LL-37-induced gene expression, while the participation of PPARgamma was excluded. Moreover, the role for p38 MAPK and TGF-beta1 in the up-regulation of LL-37 caused by butyrate was established. In contrast, SFN-mediated induction of HBD-2 is modulated via ERK1/2 signalling. The findings in Paper V clearly refer to the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma and VDR in butyrate-mediated suppression of inducible NFkappaB activation dependent on the stimulated signalling pathway caused by LPS or TNFalpha. Moreover, an inhibitory role for VDR in the regulation of basal NFkappaB activation was revealed. On the contrary, a modulating role for PPARgamma on basal NFkappaB could be debarred. Altogether the data presented in this thesis not only provide new insights in the understanding of the fundamental gastrointestinal physiology regulated by nuclear hormone receptors, but also may offer opportunities for the development of potential drug targets and therapeutic strategies in the treatment of IBD and CRC.
Synaptic long-term potentiation (LTP) at spinal neurons directly communicating pain-specific inputs from the periphery to the brain has been proposed to serve as a trigger for pain hypersensitivity in pathological states. Previous studies have functionally implicated the NMDA receptor-NO pathway and the downstream second messenger, cGMP, in these processes. Because cGMP can broadly influence diverse ion-channels, kinases, and phosphodiesterases, pre- as well as post-synaptically, the precise identity of cGMP targets mediating spinal LTP, their mechanisms of action, and their locus in the spinal circuitry are still unclear. Here, we found that Protein Kinase G1 (PKG-I) localized presynaptically in nociceptor terminals plays an essential role in the expression of spinal LTP. Using the Cre-lox P system, we generated nociceptor-specific knockout mice lacking PKG-I specifically in presynaptic terminals of nociceptors in the spinal cord, but not in post-synaptic neurons or elsewhere (SNS-PKG-I−/− mice). Patch clamp recordings showed that activity-induced LTP at identified synapses between nociceptors and spinal neurons projecting to the periaqueductal grey (PAG) was completely abolished in SNS-PKG-I−/− mice, although basal synaptic transmission was not affected. Analyses of synaptic failure rates and paired-pulse ratios indicated a role for presynaptic PKG-I in regulating the probability of neurotransmitter release. Inositol 1,4,5-triphosphate receptor 1 and myosin light chain kinase were recruited as key phosphorylation targets of presynaptic PKG-I in nociceptive neurons. Finally, behavioural analyses in vivo showed marked defects in SNS-PKG-I−/− mice in several models of activity-induced nociceptive hypersensitivity, and pharmacological studies identified a clear contribution of PKG-I expressed in spinal terminals of nociceptors. Our results thus indicate that presynaptic mechanisms involving an increase in release probability from nociceptors are operational in the expression of synaptic LTP on spinal-PAG projection neurons and that PKG-I localized in presynaptic nociceptor terminals plays an essential role in this process to regulate pain sensitivity.
Conjugated vaccines consisting of flagellin and antigen activate TLR5 and induce strong innate and adaptive immune responses. Objective of the present study was to gain further insight into the mechanisms by which flagellin fusion proteins mediate their immune modulating effects. In a mouse model of Ova-induced intestinal allergy a fusion protein of flagellin and Ova (rflaA:Ova) was used for intranasal and intraperitoneal vaccination. Aggregation status of flaA, Ova and flaA:Ova were compared by light scattering, uptake of fluorescence labeled proteins into mDC was analyzed, processing was investigated by microsomal digestion experiments. Mechanism of DC-activation was investigated using proteasome and inflammasome inhibitors. Immune responses of wildtype, IL-10−/−, TLR5−/− mDCs and Ova-transgenic T cells were investigated. Mucosal and i.p.-application of rflaA:Ova were able to prevent allergic sensitization, suppress disease-related symptoms, prevent body weight loss and reduction in food uptake. Intranasal vaccination resulted in strongest suppression of Ova-specific IgE production. These protective effects were associated with increased aggregation of rflaA:Ova and accompanied by tenfold higher uptake rates into mDC compared to the mixture of both proteins. Microsomal digestion showed that stimulation with rflaA:Ova resulted in faster degradation and the generation of different peptides compared to rOva. rflaA:Ova-mediated activation of mDC could be suppressed in a dose-dependent manner by the application of both inflammasome and proteasome inhibitors. Using TLR5−/− mDC the rflaA:Ova induced IL-10 secretion was shown to be TLR5 dependent. In co-cultures of IL-10−/− mDC with DO11.10 T cells the lack of rflaA:Ova-mediated IL-10 secretion resulted in enhanced levels of both TH2 (IL-4, IL-5) and TH1 (IL-2 and IFN-y) cytokines. In summary, mucosal vaccination with flaA:Ova showed strongest preventive effect. Stimulation with rflaA:Ova results in strong immune modulation mediated by enhanced uptake of the aggregated fusion protein, likely resulting in a different processing by DC as well as stronger TLR5 mediated cell activation.
G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest membrane protein family and play an essential role in signal transduction through the cell membrane. They are currently the targets of approximately 50 % of the pharmaceuticals on the market (Klabunde and Hessler, 2002). However, only one high-resolution GPCR structure has been determined up to now, that of bovine rhodopsin (Palczewski et al., 2000). The GPCR activation and regulation mechanisms are still unknown and other GPCR structures are thus required. MePNet (Membrane Protein Network) was a European consortium dedicated to structural studies of GPCRs. The approach was to produce 100 GPCRs in three expression systems (Escherichia coli, Pichia pastoris and Semliki Forest Virus infected mammalian cells) in order to select at each step of the process (production, solubilization, purification) the constructs that fulfilled quantity and quality (functionality) requirements for crystallization trials. In our team, we screened 38 of the 100 targets in P. pastoris. For each receptor, the clone with the highest production level was identified by dot-blot. The size and homogeneity of each receptor were then analyzed by Western-blot. The human adenosine A2A receptor showed a well-defined and pronounced single band and was thus selected for further characterization. The adenosine A2A receptor is a GPCR mainly localized in the central nervous system and, as it antagonizes dopaminergic activity, it has great potential as a drug target for the treatment of Parkinson’s disease. Functional characterization by binding assays with the specific antagonist [3H]-ZM241385 demonstrated a Bmax of 56 +/- 3 pmol/mg i.e. pmol of binder per milligram of total membrane protein, and a KD of 0.40 +/- 0.02 nM. Receptor production was then improved by lowering the induction temperature, decreasing the induction time and adding DMSO to the medium. For large-scale production, fermention reached around 300 g cells (wet weight)/L culture, which provided 43 mg of functional receptor in membranes per liter of culture. Functional solubilization was achieved with dodecyl-β-D-maltoside and the soluble yield was increased to 70-80 % of the membrane content by addition of cholesteryl hemisuccinate and increasing the ionic strength. The receptor was successfully purified via Ni-NTA and monomeric avidin chromatography in the presence of the antagonist ZM241385. This strategy produced a pure, homogeneous and stable receptor preparation with functionality demonstrated by radioligand binding assays. The total receptor yield after purification was routinely around 20 % of the membrane functional receptor content and 2 g of membranes provided 4 mg of pure receptor for crystallization trials. GPCRs are very difficult targets for crystallization, and co-crystallization with antibody fragments has been shown to be a successful method for crystallization of membrane proteins. In order to develop such a tool for the adenosine A2A receptor, a single-chain Fv (scFv) fragment specific to the purified receptor was selected by phage display. The receptor was functionally immobilized on the surface of streptavidin beads and after two rounds of selection, 6 different phages were identified several times. After production in E. coli and purification via Ni-NTA affinity chromatography, 4 out of the 6 scFv fragments were sufficiently enriched to be tested by ELISA. For the ELISA, the receptor was functionally immobilized via the biotinylation domain of the construct in a 96-well streptavidin-coated plate. The antibody fragments binding to the receptor were identified based on interaction with HRP-conjugated protein L. One scFv fragment gave a positive ELISA signal 10 fold above background and titration of the scFv fragment binding to the receptor was specific and saturable. However no complex of scFv fragment and receptor was observed on gel filtration. In order to have a more sensitive detection method, the scFv fragment was labeled with fluorescein: a complex was then observed up on gel filtration but the binding appeared to be non-specific. A pull-down assay with immobilized non-labeled scFv fragment finally confirmed the specificity of the binding, but also the low affinity of the interaction. Affinity maturation of this specific scFv fragment by a random mutagenesis and selection process should improve this parameter in order to obtain an adapted tool for co-crystallization.
Protein kinases are highly tractable targets for drug discovery. However, the biological function and therapeutic potential of the majority of the 500+ human protein kinases remains unknown. We have developed physical and virtual collections of small molecule inhibitors, which we call chemogenomic sets, that are designed to inhibit the catalytic function of almost half the human protein kinases. In this manuscript we share our progress towards generation of a comprehensive kinase chemogenomic set (KCGS), release kinome profiling data of a large inhibitor set (Published Kinase Inhibitor Set 2 (PKIS2)), and outline a process through which the community can openly collaborate to create a KCGS that probes the full complement of human protein kinases.
Die 2-DE-Technik wurde in der Mitte der 70er Jahre von O` Farrelle und Klose vorgestellt, die schon damals die Inhalte ganzer Zellen unter denaturierenden Bedingungen in hunderte bzw. tausende Proteinspots auftrennen konnten. Mangelnde Reproduzierbarkeit und fehlende Auswertungsmöglichkeiten verhinderten jedoch zu diesem Zeitpunkt eine breite Anwendung und damit größeres Interesse an der Methode. In den 80er Jahren erreichte die Methode mit der Einführung immobilisierter pH-Gradienten und der MALDI-Massenspektrometrie einen entscheidenden Wendepunkt. Seit dem Ende der 80er Jahren wird die Methode aufgrund der Möglichkeit der gleichzeitigen Proteinidentifizierung und Quantifizierung auch zunehmend in der Krebsforschung in der Suche nach neuen Markerproteinen eingesetzt. Das Uterusgewebe ist ein Organ, das während der reproduktiven Phase im Leben einer Frau ständig zyklisch verlaufenden physiologischen Änderungen unterworfen ist. Das Leiomyom, ein gutartiger monoklonaler Tumor aus den glatten Muskelzellen des menschlichen Uterus, ist eine der häufigsten gynäkologischen Erkrankung in der westlichen Welt, über deren Ursachen trotz intensiver Forschung nach wie vor fast nichts bekannt ist. Die 2-DE-Technik eignet sich in hervorragender Weise zur Untersuchung derartiger Abweichungen in der Proteinexpression während eines Krankheitsprozesses. Bezüglich der Methodenetablierung und ihrer Reproduzierbarkeit im speziellen Fall des Uterusgewebes bildet der Zellaufschluss der Probe, insbesondre aus harten Geweben, einen zentralen Punkt in der Erarbeitung der Methodik der 2-DE, da ein hohes Risiko besteht, einen großen Teil der Proteine schon während der ersten Probenbearbeitung zu verlieren. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue Aufschlussmethode für die Aufarbeitung des zähen Muskelgewebes ohne größere Proteinverluste entwickelt, indem das Uterusgewebe zunächst mechanisch (Ultra-Turrax) und anschließend mit Ultraschall homogenisiert wird. Die Solubilisierung der Proteinprobe bildet den zweiten wichtigen Punkt der 2-DE-Methodik. Die Solubilisierung während der Proteinextraktion und des Eintritts der Proteinprobe in die fokussierende Gel-Matrix, die aufgetragene Proteinmenge, die Fokussierungsparameter und die zweite Dimension wurde so optimiert, dass die Proteinauflösung eine konstant hohe Qualität auf den Gelen erreichte und damit eine semiquantitative Auswertbarkeit gesichert wurde. Bezüglich der Reproduzierbarkeit der Methode wurden die methodeninhärenten Probleme wie Gelfärbung, Probenpräparation und Auswertungsverfahren untersucht. Die Methodenvalidierung bezüglich der Gelfärbung zeigte, inwieweit die Auswertung, insbesondre bei schwachen Spots, beeinflusst werden kann. Im allgemeinen wurde die angewendete 2-DE-Technik für die Proteinanalyse des Uterus für gut reproduzierbar gefunden. Die Bestimmung der HKP lieferte die Grundlage einer gewebetypischen Proteindatenbank und erlaubt es außerdem, über die Gele ein Koordinationssystem zu legen, mit dem nachfolgende Proteinidentifizierungen erleichtert werden können. In dieser Arbeit konnten 48 Spots als HKP identifiziert werden. Als thematischer Schwerpunkt der Dissertation wurden die Abweichungen der Proteinexpression im Fall des Uterus myomatosus im Vergleich zu einem Kollektiv ohne muskuläre Pathologie des Uterus untersucht. Die Analyse der 2-DE von Patientenproben ergab gegenüber einer schwachen Expression bei den Vergleichsproben eine Überexpression von Prohibitin (PHB1), alpha-2-Aktin und human Growth Hormon Rezeptorprotein (hGhRP) im Endometrium bzw. im darunter liegenden subendometrialen Myometrium und eine hohe Expression im Tumorgewebe (Myomgewebe). Weiteres zeigte die 2-DE-Analyse bei Patientenproben eine Downregulation von zwei Proteinen (beta-4-Proteasom und Fibrinogen) im Gegensatz zur Expression bei den Gesunden. Die analytischen Ergebnisse aus Tumorgeweben verglichen mit den SE-und SS-Geweben derselben Patientinnen zeigten eine deutliche Expression von einigen Proteinen (Desmin, F-Actin, Transaldolase, Thioredoxin-Peroxidase und mutative Glutathion-Transferase), deren Expression in den morphologisch unauffälligen Geweben aller Schichten des Uterus nicht zu beobachten war.
Die heutige moderne Toxikologie ist dem 3-R-Prinzip (Russel und Burch, 1959), einem Konzept zur Verminderung und Verkürzung von Tierversuchen, verpflichtet. Allerdings stellt insbesondere die für die Zulassung und Registrierung neuer Arzneistoffe oder Chemikalien behördlich geforderte Prüfung von Substanzen auf kanzerogene Eigenschaften immer noch einen langwierigen Prozess mit einem hohen Bedarf an Versuchstieren dar. Daher sollte unter dem Einsatz von Methoden der Proteomforschung eine Identifizierung und Charakterisierung neuer Protein-Biomarker erfolgen, die eine verbesserte Vorhersage von Prozessen der chemisch induzierten Leberkanzerogenese erlauben. Motivation für diese Arbeiten war die Annahme, dass durch chemische Substanzen angestoßene molekulare Prozesse mit proteinanalytischen Methoden früher detektierbar sind als dies mit konventionellen toxikologischen Methoden möglich ist, welche vor allem die Prüfung von Substanzen im Tierversuch mit anschließender histopathologischer und klinisch-biochemischer Bewertung der toxischen Effekte vorsehen. Die Untersuchungen sollten Aufschluss darüber geben, ob Proteomstudien die traditionelle Toxikologie mit einer verbesserten, insbesondere verkürzten Erkennung und Aufklärung toxischer Wirkmechanismen unterstützen können. In der Zukunft würde dies eine signifikante Verkürzung und Verbesserung von Tierversuchen bedingen, verbunden mit einer Verringerung der Anzahl an Versuchstieren und letztlich einer Einsparung von Kosten und Zeit. N-Nitrosomorpholin (NNM), ein bekanntes Leberkanzerogen, diente als Modellsubstanz zur Abbildung des Kanzerogeneseprozesses. Zur Induktion von Lebertumoren sowie frühen präneoplastischen Veränderungen wurden Ratten in zwei Tierstudien über definierte Zeiträume mit zwei unterschiedlichen Dosierungen NNM behandelt. Das nach verschiedenen Behandlungszeitpunkten gewonnene Lebergewebe diente als Ausgangsmaterial für die nachfolgenden proteomischen Analysen. Dazu kam vor allem die zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) zum Einsatz, gefolgt von MALDI-Massenspektrometrie (MS) zur Identifizierung differentiell exprimierter Proteine. Ausserdem wurden aus den Leberproteinextrakten unter Einsatz der SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption and Ionisation)-Technologie Proteinprofile erstellt und für die verschiedenen durch NNM-Behandlung aufgetretenen Leberveränderungen charakteristische Signalmuster ermittelt. Das Potential der iTRAQ-Technologie, einer MS-basierten Quantifizierungsstrategie wurde in einem weitergehenden Schritt ermittelt. Mittels 2-DE/MS-Analyse konnten einerseits Proteine identifiziert werden, deren vermehrte Expression die nach einem Tag der Behandlung mit NNM ausgelösten akut toxischen Effekte der Chemikalie in der Leber reflektierten. Andererseits lieferte die Analyse von Proben, in denen nach 25 Wochen Lebertumore diagnostiziert wurden, differentiell exprimierte Proteine, die als Tumor-spezifische Markerproteine charakterisiert werden konnten. Im Hinblick auf das vorrangige Ziel der Arbeit, neue Biomarker zu identifizieren, die schon zu einem frühen Zeitpunkt des Tierversuchs bereits einsetzende kanzerogene Prozesse aufzeigen und damit in der Zukunft einen Beitrag leisten könnten, konventionelle toxikologische Prüfmethoden zu unterstützen oder gar zu verkürzen, erfolgte eine Fokussierung der Analyse auf Proben von Tieren, die drei Wochen lang mit NNM behandelt wurden. Bereits zu diesem Zeitpunkt wurden Proteine detektiert, deren Deregulation mit frühen Prozessen der Leberkanzerogenese in Einklang gebracht werden konnte. Vor allem 18 Proteine, die sich in den Proben nach drei Wochen der NNM-Behandlung wie auch in dem Gewebe von Tieren mit Tumoren als dereguliert erwiesen, wurden als potentielle frühe Biomarker mit einem enormen Potential zur verbesserten Vorhersage von Leberkanzerogenese charakterisiert. Um die durch 2-DE/MS-Analyse ermittelten potentiellen frühen Biomarker in ihrem detektierten Regulationsmuster zu bestätigen und damit das Vertrauen in die 2-DE/MS-Ergebnisse zu erhöhen, erfolgte eine Prävalidierung der Markerproteine mit unabhängigen Methoden. Hierfür wurde der immunologische Nachweis der Proteine in Form des Western Blottings sowie eine MS-basierte Quantifizierung unter Anwendung der iTRAQ-Technik herangezogen. Des Weiteren eröffnete die Integration der Arbeit in ein Verbundprojekt die Möglichkeit zum Vergleich der Proteinexpressionsdaten mit den Ergebnissen der globalen Genexpressionsanalyse, die bei einem Projektpartner durchgeführt wurde. Während durch Western Blotting nur wenige der 18 potentiellen frühen 2-DE/MS-Biomarker in ihrer nach drei Wochen Behandlung beobachteten Regulation bestätigt werden konnten, wurden durch Einsatz der iTRAQ-Technik 11 der Biomarker verifiziert und damit der Wert dieser Quantifizierungsstrategie für den Ansatz der Prävalidierung unterstrichen. Der Abgleich mit den Genexpressionsdaten legte für 63% der Proteine eine übereinstimmende Deregulation auf Genniveau offen. Insgesamt wurden 13 der 18 potentiellen frühen 2-DE/MS-Biomarker durch mindestens eine weitere unabhängige Technologie in ihrer im 2-DE-Gel beobachteten Expressionsveränderung bestätigt. Zusammenfassend lieferte die 2-DE/MS-Analyse des durch NNM veränderten Lebergewebes zahlreiche Protein-Biomarker, die auf molekularer Ebene sowohl frühe als auch späte Stadien der Leberkanzerogenese reflektieren. Vor allem die charakterisierten potentiellen frühen Biomarkern weisen ein signifikantes Potential auf, in der Zukunft konventionelle toxikologische Prüfsysteme zu unterstützen und möglicherweise einen Beitrag zur Verkürzung von Tierstudien und damit zur Einsparung von Versuchstieren zu leisten. Durch Prävalidierung der meisten der frühen Markerproteine durch unabhängige Methoden wurde dieses Potential als auch der Wert von Methoden der Proteomforschung zur allgemeinen Unterstützung der prädiktiven Toxikologie noch einmal unterstrichen.
Nanopartikuläre Arzneistoffsysteme sind ein viel versprechender Ansatz die speziellen Anforderungen, die an eine Arzneiform gestellt werden, zu erfüllen. Mit ihnen scheint das lang verfolgte Ziel der Pharmaforschung, das gezielte Transportieren ("Drug-Targeting") und das kontrollierte Freisetzen des Arzneistoffs am Wirkort ("Controlled Release") und damit das Minimieren unerwünschter Nebenwirkungen, in greifbare Nähe zu rücken. In der vorliegenden Arbeit konnte durch verschiedene Versuchsansätze in der präklinischen Testung der gezielte Wirkstofftransport zielgerichtet-modifizierter Nanopartikel (NP) auf humanem Serumalbumin (HSA)-Basis sowohl für das spezifische Tumor-Targeting als auch für die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) gezeigt werden. Die NP für das spezifische Tumor-Targeting waren mit dem Zytostatikum Doxorubicin beladen und mit dem tumorspezifischen Liganden Trastuzumab für ein Mammakarzinom-Zellen-Targeting oder DI17E6 für ein Melanom-Zellen-Targeting modifiziert. Ihre zielgerichtete Funktionalität konnte an verschiedenen Target-exprimierenden-Zelllinien gezeigt werden. Dabei konnte ihre spezifische zelluläre Bindung, Aufnahme und subzellulären Verteilung verifiziert werden. Die Ligand-modifizierten NP wurden bei diesen Untersuchungen spezifisch in die Zielzellen aufgenommen, während die unmodifizierten Kontroll-Partikel unspezifisch an der Zellmembran klebten. Die Freisetzung des Doxorubicins in einer biologisch aktiven Form konnte anhand entsprechender Zellviabilitäts-Assays gezeigt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der nanopartikulär transportierte Wirkstoff über den Rezeptor-internalisierenden Aufnahmeweg nicht in den Endosomen oder Lysosomen akkumulierte und damit inaktiv war, sondern dass er in wirksamer Form freigesetzt wurde. Als Besonderheit wurde mit DI17E6 für das spezifische Melanom-Zellen-Targeting ein Antikörper als ziel-orientierter Ligand eingesetzt, der zusätzliche anti-tumorale Eigenschaften hat, die bei der Ankopplung an die NP-Oberfläche erhalten werden sollten. Durch speziell entwickelte in vitro Assays, die auf diese Eigenschaften abzielten, konnte der Erhalt der biologischen Wirksamkeit des Antikörpers bestätigt werden. Mit derartigen nanopartikulären Formulierungen, basierend auf biologisch abbau¬barem HSA, modifiziert mit entsprechenden zielgerichteten Liganden und anti-tumoralen Wirkstoffen, sollte aufgrund der hier gezeigten präklinischen Daten eine spezifische Tumortherapie möglich sein. Zum Überwinden der BHS wurden NP getestet, die mit Apolipoprotein E (ApoE) modifiziert waren. Dabei handelte es sich zum einen um leere NP für Aufnahmemechanismus-Studien und zum anderen um Obidoxim-beladene NP für Transportstudien. Bei Obidoxim handelt es sich um einen Vertreter der Stoffklasse der Oxime. Diese werden als Antidote bei Organophosphat (OP)-Vergiftungen eingesetzt. Oxime können die nach einer OP-Vergiftung inhibierte lebensnotwendige Acetylcholinesterase (AChE) reaktivieren. Da Oxime die BHS aber kaum überwinden können, wird die in den zentralnervösen Kompartimenten inhibierte AChE nicht in therapeutisch ausreichendem Maß erreicht. Daher sollte beispielhaft Obidoxim nanopartikulär-vermittelt über die BHS transportiert werden. Für beide Formulierungen konnte die spezifische zelluläre Bindung, Aufnahme und die subzelluläre Verteilung sowie ihre für ein BHS-Targeting kompatiblen, untoxischen Eigenschaften gezeigt werden. Mit den ApoE-modifizierten unbeladenen NP konnte durch verschiedene Koinkubations- und Hemmexperimente eindeutig die Beteiligung der "Low Density Lipoprotein" (LDL)-Rezeptor-Familie, und besonders des "Low Density Lipoprotein Receptor Related Protein" (LRP), bei der spezifischen ApoE-vermittelten NP-Aufnahme gezeigt werden. Dabei ließ sich die NP-Aufnahme auf zwei Wegen hemmen. Zum einen konnte von der zellulären Seite aus der beteiligte Aufnahme-Rezeptors mit dem "Receptor Associated Protein" gehemmt werden, wodurch eine spezifische ApoE-vermittelte NP-Aufnahme über eine Rezeptor-Bindung verhindert wurde. Zum anderen konnte aber auch, durch Blockade des ApoE auf der Partikeloberfläche mittels löslicher Fragmente des LRP, die ApoE-vermittelte NP-Aufnahme von nanopartikulärer Seite gehemmt werden. Durch die Kenntnis des Aufnahmemechanismus der nanopartikulären Formulierungen sollte es für zukünftige Entwicklungen im breiten Feld der BHS-Forschung möglich sein, sehr spezifische und effektivere Carrier maßzuschneidern. Zu Untersuchungen des Wirkstofftransports wurden frisch isolierte porcine Gehirnkapillarendothel-Zellen im Transwell-System als adäquates in vitro BHS-Modell etabliert und eingesetzt. Für den Nachweis des tatsächlichen Obidoxim-Transports wurde ein biologischer Assay entwickelt, der gemäß der therapeutischen Funktion von Oximen nach OP-Vergiftungen auf die Reaktivierung OP-vergifteter AChE abzielte. Es konnte gezeigt werden, dass nanopartikuläre Formulierungen tatsächlich einen verbesserten Transport von Obidoximen gegenüber freiem Obidoxim in einem in vitro BHS-Modell vermitteln. Diese nanopartikulären Transportsysteme stellen daher ein bisher einzigartiges, viel versprechendes Hilfsmittel zum Transport von Oximen über die BHS dar. Durch die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen konnte insgesamt gezeigt werden, dass NP auf HSA-Basis für einen zielgerichteten Wirkstofftransport geeignet sind und aufgrund ihrer biokompatiblen, bioabbaubaren Eigenschaften einen viel versprechenden Ansatz für die zukünftige Pharmaforschung darstellen.
Allergy against birch pollen is among the most common causes of spring pollinosis in Europe and is diagnosed and treated using extracts from natural sources. Quality control is crucial for safe and effective diagnosis and treatment. However, current methods are very difficult to standardize and do not address individual allergen or isoallergen composition. MS provides information regarding selected proteins or the entire proteome and could overcome the aforementioned limitations. We studied the proteome of birch pollen, focusing on allergens and isoallergens, to clarify which of the 93 published sequence variants of the major allergen, Bet v 1, are expressed as proteins within one source material in parallel. The unexpectedly complex Bet v 1 isoallergen composition required manual data interpretation and a specific design of databases, as current database search engines fail to unambiguously assign spectra to highly homologous, partially identical proteins. We identified 47 non-allergenic proteins and all 5 known birch pollen allergens, and unambiguously proved the existence of 18 Bet v 1 isoallergens and variants by manual data analysis. This highly complex isoallergen composition raises questions whether isoallergens can be ignored or must be included for the quality control of allergen products, and which data analysis strategies are to be applied.
Over the last years there has been an increasing interest in the involvement of the MVA-pathway and of members of the small GTPases, in the development and progression of AD. Earlier investigations mainly focused on the role of cholesterol in disease pathology. This research was supported by retrospective cohort studies, initially showing beneficial effects of the long-term intake of cholesterol lowering statins, on the incidence of the development of sporadic AD. However, in more recent literature increasing attention has been paid to the isoprenoids, FPP and GGPP, due to their crucial role in the post-translational modifications of members of the superfamily of small GTPases. In AD, these proteins were amongst others shown to be involved in mechanisms affecting APP processing, ROS generation and synaptic plasticity. A major factor impeding the clarification of the role of the MVA-pathway intermediates in these mechanisms was the lack of a sensitive and accurate method to determine FPP and GGPP levels in brain tissue. Hence, a state of the art HPLC-FLD method for the quantification of the isoprenoids FPP and GGPP in brain tissue was successfully developed. After the introduction of a double clean-up step from complex brain matrix samples and the synthesis of an appropriate IS (DNP), the method was fully validated according to the latest FDA guideline for bioanalytical method validation. Furthermore, this method was transferred to a faster and more sensitive, state of the art UHPLC-MS/MS application. Additionally, the method was shown to be applicable for mouse brain tissue and data was generated from an in vivo mouse simvastatin study and for different mouse models. According to the aims of the thesis, the current work describes for the first time absolute isoprenoid concentrations in human frontal cortex white and grey matter. Furthermore, this is the first report of isoprenoid levels in the frontal cortex of human AD brains. Further results were shown from mouse brains originating from different mouse models, including the Thy-1 APP mouse model mimicking AD pathology in terms of Aβ formation or C57Bl/6 mice at different ages. AD prevalence can be clearly correlated with increasing age. Therefore, three different generations of mice were investigated. The study demonstrated constant isoprenoid and cholesterol levels in the first half of their life followed by a significant increase of FPP and GGPP in the second half (between 12 and 24 month of age). Cholesterol levels were also elevated in the aged group, but again the effect was less pronounced than shown for the isoprenoids. These results lead to the tentative conclusion that cerebral isoprenoid levels are elevated during aging and that this accumulation is amplified during AD leading to accelerated neuronal dysfunction. In a different mouse study, using the C57Bl/6 mice, in vivo drug intervention with the HMG-CoA reductase inhibitor simvastatin revealed strong inhibition of the rate limiting step of the mevalonate/isoprenoid/cholesterol pathway and resulted in the first report of significantly reduced FPP and GGPP levels in brain tissue of statin treated mice. These results open for the first time the possibility to monitor drug effects on cerebral isoprenoid levels and correlate these data with a modulation of APP processing, which was shown by our group in previous studies. Interestingly, apart from the isoprenoid reduction following statin treatment the reduction of brain cholesterol was also significant but to a lesser extent. These findings support the notion that isoprenoid levels are more susceptible to statin treatment than cholesterol levels. Furthermore, this suggests a strong cellular dependence on FPP and GGPP, as the pool seems to be easily depleted, which finally could lead to cell death. The first investigations of farnesylated Ras and geranylgeranylated Rac protein levels by means of immuno-blotting, substantiated the notion of a decreased abundance of prenylated small GTPases under statin influence as a consequence of reduced isoprenoid levels. These findings demonstrate for the first time a correlation of FPP and GGPP levels with the abundance of small GTPases. These findings together with the results from the AD study prove that isoprenoid levels are not strictly subject to the same regulation as cholesterol levels. To further understand the physiological regulation in the cell, in vitro experiments with different inhibitors of the mevalonate/isoprenoid/cholesterol pathway were conducted. These results confirmed the isoprenoid and cholesterol reducing effects of statin treatment as observed in the aforementioned in vivo mouse study. Interestingly, cholesterol synthesis inhibition targeted after FPP as the branch point, led to significantly elevated FPP levels. FTase inhibition led to significantly reduced FPP levels, whereas inhibition of the GGTase I did not show a significant change of either isoprenoid levels.
Background: A delta and C fibers are the major pain-conducting nerve fibers, activate only partly the same brain areas, and are differently involved in pain syndromes. Whether a stimulus excites predominantly A delta or C fibers is a commonly asked question in basic pain research but a quick test was lacking so far. Methodology/Principal Findings: Of 77 verbal descriptors of pain sensations, "pricking", "dull" and "pressing" distinguished best (95% cases correctly) between A delta fiber mediated (punctate pressure produced by means of von Frey hairs) and C fiber mediated (blunt pressure) pain, applied to healthy volunteers in experiment 1. The sensation was assigned to A delta fibers when "pricking" but neither "dull" nor "pressing" were chosen, and to C fibers when the sum of the selections of "dull" or "pressing" was greater than that of the selection of "pricking". In experiment 2, with an independent cohort, the three-descriptor questionnaire achieved sensitivity and specificity above 0.95 for distinguishing fiber preferential non-mechanical induced pain (laser heat, exciting A delta fibers, and 5-Hz electric stimulation, exciting C fibers). Conclusion: A three-item verbal rating test using the words "pricking", "dull", and "pressing" may provide sufficient information to characterize a pain sensation evoked by a physical stimulus as transmitted via A delta or via C fibers. It meets the criteria of a screening test by being easy to administer, taking little time, being comfortable in handling, and inexpensive while providing high specificity for relevant information.
GPCRs and ligand-gated ion channels mediate a great variety of physiological effects within the human brain and periphery. The search for selective ligands at these target sites as pharmacological tools or new drug candidates is of great interest. With increasing knowledge of the great diversity of some receptor families, compounds formerly considered to be selective, turned out to be non-selective with regard to recently identified subtypes, splice variants or additional receptor subunits. This work provides SAR studies by means of radioligand binding experiments at serotonergic h5-HT3A and h5-HT4(b) receptors, histamine hH1 receptors and muscarinic hM1-5 receptors. ...
The mTOR kinase inhibitor rapamycin (sirolimus) is a drug with potent immunosuppressive and antiproliferative properties. We found that rapamycin induces the TGF/Smad signaling cascade in rat mesangial cells (MC) as depicted by the nuclear translocation of phospho-Smads 2, -3 and Smad-4, respectively. Concomitantly rapamycin increases the nuclear DNA binding of receptor (R)- and co-Smad proteins to a cognate Smad-binding element (SBE) which in turn causes an increase in profibrotic gene expression as exemplified by the connective tissue growth factor (CTGF) and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1). Using small interfering (si)RNA we demonstrate that Smad 2/3 activation by rapamycin depends on its endogenous receptor FK-binding protein 12 (FKBP12). Mechanistically, Smad induction by rapamycin is initiated by an increase in active TGF1 as shown by ELISA and by the inhibitory effects of a neutralizing TGF antibody. Using an activin receptor-like kinase (ALK)-5 inhibitor and by siRNA against the TGF type II receptor TGF-RII) we furthermore demonstrate a functional involvement of both types of TGF receptors. However, rapamycin did not compete with TGFfor TGF-receptor binding as found in radioligand-binding assay. Besides SB203580, a specific inhibitor of the p38 MAPK, the reactive oxygen species (ROS) scavenger N-acetyl-cysteine (NAC) and a cell-permeable superoxide dismutase (SOD) mimetic strongly abrogated the stimulatory effects of rapamycin on Smad 2 and 3 phosphorylation. Furthermore, the rapid increase in Dichlorofluorescein (DCF) formation implies that rapamycin mainly acts through ROS. In conclusion, activation of the profibrotic TGFSmad signaling cascade accompanies the immunosuppressive and antiproliferative actions of rapamycin. Keywords: FK506 binding protein; p38 MAP kinase; rapamycin; renal fibrosis; Smads; TGFβ
Over the past two decades the “one drug – one target – one disease” concept became the prevalent paradigm in drug discovery. The main idea of this approach is the identification of a single protein target whose inhibition leads to a successful treatment of the examined disease. The predominant assumption is that highly selective ligands would avoid unwanted side effects caused by binding to secondary non-therapeutic targets. In recent years the results of post-genomic and network biology showed that proteins rarely act in isolated systems but rather as a part of a highly connected network [1]. In addition this connectivity leads to more robust systems that cannot be interfered by the inhibition of a single target of that network and consequently might not lead to the desired therapeutic effect [2]. Furthermore studies prove that robust systems are rather affected by weak inhibitions of several parts than by a complete inhibition of a single selected element of that system [3]. Therefore there is an increasing interest in developing drugs that take effect on multiple targets simultaneously but is concurrently a great challenge for medicinal chemists. There has to be a sufficient activity on each target as well as an adequate pharmacokinetic profile [4]. Early design strategies tried to link the pharmacophors of known inhibitors, however these methods often lead to high molecular weight and low ligand efficacy. We present a new rational approach based on a retrosynthetic combinatorial analysis procedure [5] on approved ligands of multiple targets. These RECAP fragments are used to design a large combinatorial library containing molecules featuring chemical properties of each ligand class. The molecules are further validated by machine learning models, like random forests and self-organizing maps, regarding their activity on the targets of interest.