Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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NK cells are part of the innate immune system, and are important players in the body’s first defence line against virus-infected and malignantly transformed cells. While T cells recognize neoplastic cells in an MHC-restricted fashion, NK cells do not require prior sensitization and education about the target. In leukemia and lymphoma patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation not only T cells but also NK cells have been found to mediate potent graft-versus-tumor effects. Hence, autologous or donor-derived NK cells hold great promise for cancer immunotherapy. Since the generation of highly purified NK cell products for clinical applications is labor-intensive and time consuming, established human NK cell lines such as NK-92 are also being considered for clinical protocols. NK-92 cells display phenotypic and functional characteristics similar to activated primary NK cells. While NK-92 cells are highly cytotoxic towards malignant cells of hematologic origin, they do not affect healthy human tissues. NK-92 cells can be expanded under GMP-compliant conditions, and can therefore be provided in sufficient numbers with defined phenotypic characteristics for clinical applications. Safety of NK-92 cells for adoptive immunotherapy was already shown in two phase I/II clinical trials...
Der programmierte Zelltod (Apoptose) ist ein wichtiger Mechanismus zur Eliminierung von beschädigtem Gewebe und entarteten Zellen. Die Deregulierung der Apoptose führt zu zahlreichen Erkrankungen wie neuro-degenerativen Störungen und Krebs. Insbesondere in Tumoren wird der programmierte Zelltod mit Hilfe von hochregulierten, anti-apoptotischen Proteinen umgangen und es entstehen Resistenzen gegen Chemotherapien. Um innovative therapeutische Ansätze zu finden, wurden in diesem Projekt mit Hilfe eines Hefe-Survival-Screens neue, potentiell anti-apoptotische Proteine im Pankreaskarzinom identifiziert. Von den insgesamt 38 identifizierten Genprodukten wurden zwei für eine weiterführende Analyse ausgewählt.
Eins der näher untersuchten Proteine ist die Pyruvoyl-tetrahydrobiopterin-Synthase (PTS), ein wichtiges Enzym für die Biosynthese von Tetrahydrobiopterin (BH4). BH4 ist ein Kofaktor, der von mehreren Enzymen der Zelle für ihre Funktionen benötigt wird. In Zellkultur-Experimenten konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von PTS die Zellen vor Apoptose schützen kann, während eine Herunterregulation durch genetischen knockdown die Zellen gegenüber Apoptose-Stimuli sensibilisiert und ihr Wachstum beeinträchtigt. In Xenograft-Experimenten mit NOD/SCID-Mäusen konnte zudem gezeigt werden, dass Tumore mit einem PTS-Knockdown signifikant langsamer wachsen als die der Kontrollgruppe. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf eine Rolle von PTS bei der Apoptose-Regulation und beim Tumorwachstum hin, was das Protein zu einem attraktiven Target für die Krebstherapie macht.
Als zweites wurde ein Protein analysiert, das eine Untereinheit des respiratorischen Komplex I bildet: NDUFB5 (NADH-Dehydrogenase 1 beta Subcomplex, 5). Das besondere an diesem Protein sind die verschiedenen Isoformen, die durch alternatives Splicing zustandekommen. Eine Isoform, der die Exone 2 und 3 fehlen, wurde im Hefe-Survival-Screen identifiziert. Bei Überexpression in Zelllinien konnte sie im Gegensatz zum Volllänge-Protein die Apoptoserate reduzieren. Und auch Ergebnisse aus Versuchen mit Isoformen-spezifischem knockdown deuten an, dass hauptsächlich die verkürzte Isoform sNDUFB5 für die Regulation von Apoptose und Proliferation verantwortlich ist. Diese Beobachtungen konnten mit denselben Zellen im Xenograft-Tiermodell jedoch nicht bestätigt werden. Die Ursachen dafür blieben unklar. Zusätzlich wurden immunhistochemische Analysen von Pankreaskarzinomen und normalem Pankreasgewebe durchgeführt. Sie ergaben, dass die kurze Isoform sNDUFB5 im Tumor stark überexpremiert ist, während die Expression des Volllänge-Proteins in normalem und Tumorgewebe ähnlich hoch ausfällt. Dieser Befund macht NDUFB5 zu einem interessanten therapeutischen Target.
Die näher untersuchten Kandidaten-Gene zeigen beide Potential als neue Angriffspunkte für eine molekulare Krebstherapie. Andere in dem Hefe-Survival-Screen identifizierte Proteine wurden bereits als anti-apoptotisch und/oder in Krebszellen überexprimiert beschrieben. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass ein funktionelles, Hefe-basiertes Screeningsystem geeignet ist, neue bisher unbekannte Proteine mit anti-apoptotischer Funktion zu identifizieren. Auch zeigen die Befunde, dass bereits bekannte Proteine weitere bisher unbekannte Funktionen wie z.B. die Inhibition von Apoptose aufweisen können. Basierend auf solchen mehrfachen Proteinfunktionen lassen sich weitere therapeutische Möglichkeiten ableiten.
Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.