Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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1. Das Genom von A. woodii konnte sequenziert und annotiert werden. Der Organismus besitzt ein Chromosom von 4050521 Bp und keine Plasmide. Es sind 3495 ORFs kodiert. 2. Die Gene, die die Enzyme des Wood-Ljungdahl-Weges kodieren, konnten identifiziert werden. Sie sind hauptsächlich in drei Clustern organisiert, wobei für Cluster II gezeigt werden konnte, dass es ein Operon bildet und dort ungewöhnlicherweise ein RnfC-ähnliches Protein kodiert ist. 3. Gene für Proteine der Hexose-Verwertung konnten ebenfalls identifiziert werden. A. woodii besitzt sowohl PTS-Systeme als auch einen Na+/Zucker-Symporter zur Aufnahme von Hexosen. Die Enzyme der Glykolyse sind vollständig im Genom vorhanden und liegen im gesamten Genom verstreut vor. 4. Neben den Genen für die bereits charakterisierte Hydrogenase existieren im Genom weitere Gene, die potentielle Hydrogenasen oder Untereinheiten dieser kodieren. 5. Lange wurde für Methyltransferasen in A. woodii vermutet, dass es sich um energiekonservierende Enzyme handelt. Die Genomsequenz zeigte, dass das Genom Gene für 20 Methyltransferasen 1, 10 Methyltransferasen 2 und 22 Corrinoid-Proteine enthält. Die Methyltransferase und das Corrinoid-Protein des Wood-Ljungdahl-Weges konnten identifiziert werden. Allerdings konnte für keines der korrespondierenden Proteine eine Membranständigkeit vorhergesagt werden, was eine Beteiligung der Methyltransferasen an der Energiekonservierung ausschließt. Die Vielzahl der Methyltransferasen passt aber zu der Vielzahl von methylierten Verbindungen, die der Organismus verstoffwechseln kann. 6. Neben den gut charakterisierten etf-Genen aus dem car-Operon, das bei der Caffeat-Reduktion eine wichtige Rolle spielt, gibt es ein weiteres etf-Paar, welches mit den Genen für eine Laktat-Dehydrogenase und eine Laktat-Permease kolokalisiert ist. Welche Rolle die Proteine spielen bleibt noch aufzuklären. 7. Außer den Genen für die gut charakterisierte F1F0-ATP-Synthase finden sich Gene für eine V-Typ ATPase. Diese Gene bilden ein Operon. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Untereinheit VatA auch produziert wird. Die physiologische Rolle konnte allerdings noch nicht geklärt werden. 8. Basierend auf den genomischen Daten konnte ein Modell des Flagellums erstellt werden. Desweiteren wurde eine Vielzahl von Genen für chemotaktische Proteine identifiziert. Zur Verarbeitung von Umweltsignalen besitzt A. woodii Komponenten des Che-Systems, die zum einen aus E. coli und zum anderen aus B. subtilis bekannt sind. 9. In Proteomanalysen konnte festgestellt werden, dass die Enzyme des Wood- Ljungdahl-Weges beim Wachstum auf H2 + CO2 im Vergleich zum Wachstum auf Fruktose induziert werden, die Enzyme der Glykolyse werden dagegen reprimiert. Desweiteren ist die Hydrogenase (HydAB) auf H2 + CO2 induziert. Das am stärksten induzierte Protein ist eine Alanin-Dehydrogenase, deren Rolle im Stoffwechsel unbekannt ist. 10. Die Untersuchung des genomischen Kontextes der für die Na+-translozierende Ferredoxin:NAD+-Oxidoreduktase (Fno/Rnf) kodierenden Gene rnfCDGEAB ergab keine weiteren Gene, die mit Rnf in Verbindung stehen. Experimentelle Befunde zeigen, dass die Gene rnfCDGEAB ein Operon bilden. 11. Nach der Generierung von Antikörpern gegen die Untereinheiten des Rnf-Komplexes, die große lösliche Anteile besitzen, konnte nachgewiesen werden, dass RnfB, C und G in der Membran lokalisiert sind. Desweiteren wurde nachgewiesen, dass deren Produktion unabhängig von der An- oder Abwesenheit von Caffeat und den getesteten C-Quellen ist. 12. RnfG konnte in E. coli überproduziert und anschließend gereinigt werden, allerdings fehlte der vorhergesagte, kovalent gebundene Flavin-Cofaktor. 13. RnfC konnte ebenfalls in E. coli überproduziert und anschließend gereinigt werden. Nach Rekonstitution mit Eisen und Schwefel konnte ein Fe-Gehalt von 8 nmol/ nmol Protein und ein Schwefel-Gehalt von 5 nmol/nmol Protein bestimmt werden. Die im UV/Vis-Spektrum sichtbaren Maxima wiesen auf die Anwesenheit von FeS-Zentren hin. EPR-Analysen deuten darauf hin, dass die FeS-Zentren nur unvollständig assembliert sind. 14. Im Genom von A. woodii ist ein Cluster von Genen, das Proteine zur Umsetzung von 1,2-Propandiol kodiert, zu finden. Elektronenmikroskopisch konnte nachgewiesen werden, dass der Organismus in Gegenwart von 1,2-Propandiol Mikrokompartimente bildet. 15. In Zellsuspensionsversuchen konnte nachgewiesen werden, dass 1,2-Propandiol nicht zu Propionat und Acetat, sondern zu 1-Propanol und Propionat über das Intermediat Propionaldehyd umgesetzt wird. 16. Rohextrakte 1,2-Propandiol-gezogener Zellen katalysierten die Reduktion von NAD+ mit Propionaldehyd als Reduktant. Die Reaktion benötigte CoA, NAD+ (Km 0,35 mM) und Propionaldehyd (Km 1,3 mM). Das Temperaturoptimum betrug 30°C und das pH-Optimum lag zwischen pH 8 und 10. 17. Ein Antikörper gegen die Propionaldehyd-Dehydrogenase (PduP) aus S. enterica reagierte mit einem ca. 50 kDa-Protein 1,2-Propandiol-gezogener Zellen. Dies zeigt, dass PduP aus A. woodii und PduP aus S. enterica immunologisch verwandt sind. Western-Blot-Analysen zeigten, dass PduP nur in 1,2-Propandiol-, 2,3-Butandioloder Ethylenglykol-gezogenen Zellen nachweisbar war, aber nicht in Zellen die auf Fruktose, Ethanol oder H2 + CO2 gezogen waren. 18. Die Aktivität der Propionaldehyd-Dehydrogenase war in Zellen gezogen auf 1,2-Propandiol am höchsten. Nach Wachstum auf Fruktose oder H2 + CO2 war die Aktivität sehr niedrig. Genau gegensätzlich verhielten sich die Aktivitäten der Formiat-Dehydrogenase, einem Enzym des Wood-Ljungdahl-Weges, der ATPHydrolyse und des Rnf-Komplexes. 19. In Gegenwart von Caffeat und 1,2-Propandiol konnte A. woodii nicht wachsen. Das Wachstum auf 2,3-Butandiol oder Ethylenglykol in Gegenwart von Caffeat war möglich.
The NS5B protein of the hepatitis C virus (HCV) is a RNA-dependent RNA polymerase, which is the key enzyme for viral replication. It is recognized as one of the promising targets for antiviral intervention within the new HCV treatment approach of direct-acting antivirals (DAA). However, several of the known non-nucleoside HCV polymerase inhibitors (NNIs) identified by screening approaches show limitations in the coverage of all six major HCV genotypes (GT). Genotypic profiling therefore has to be implemented early in the screening cascade to discover new broadly active NNIs. This implies knowledge of the specific individual biochemical properties of polymerases from all GTs which is to date limited to GT 1 only. The work submitted here gives a comprehensive overview of the biochemical properties of HCV polymerases derived from all major GTs 1 - 6. Biochemical analysis of polymerases from 38 individual sequences revealed that the optima for monovalent cations, pH and temperature were similar between the GTs, whereas significant differences concerning concentration of the preferred cofactor Mg2+ were identified. Implementing the optimal requirements for the polymerases from each individual GT led to significant improvements in their enzymatic activities. However, the specific activity was distributed unequally across the GTs and could be ranked in the following descending order: 1b, 6a > 2a, 3a, 4a, 5a > 1a. Furthermore, the optimized assay conditions for GT profiling were confirmed by testing the inhibitory activity of four known prototype NNIs, each addressing one of the four NNI binding sites. Additionally, a novel NNI chemotype - identified by screening - is described, the substituted N-phenyl-benzenesulphonamides (SPBS). This inhibitor class showed reversible inhibition of NS5B from HCV 1b Con1 with IC50 values up to 39 nM. Based on the decreased inhibitory activity against a recombinant NS5B protein carrying the mutation L419M, it was assumed that the SPBS inhibitors bound to the thumb site II as it has been described for the carboxy thiophene inhibitors. The postulated binding site was consequently confirmed by analysing a provided co-crystal structure of NS5B in complex with a SPBS analogue. Notably, the two SPBS analogues SPBS-1 and SPBS-2 reported here revealed significant differences in addressing the NH-group of the main chain Y477 by hydrogen-bonds, watermediated or directly, which provoked a shift of the carboxyphenyl group of the inhibitors towards the H475 position for the water-mediated binding mode. Interestingly, the differences observed in the binding mode led to a different cross resistance profile at positions M423 and I482. Using the previously optimized biochemical primer-dependent transcription assay, inhibitory activity of the SPBS could be demonstrated against polymerases from HCV GTs 1a and 1b whereas the inhibitor class failed to inhibit any of the non-GT 1 polymerases. Furthermore, initial antiviral activity for SPBS was demonstrated against the subgenomic replicons of HCV GTs 1a and 1b, respectively, and no considerable cytotoxic potential against a panel of ten different cell types. Finally, concerning a possible future treatment without PEG-IFN α or ribavirin, the SPBS analogues were found to display additive to synergistic effects in combination with the benzothiadiazine, the benzofuran and the indole - representative inhibitors for the binding sites palm I, palm II and thumb I, repectively - in the biochemical assay. Within the same binding site as the SPBS, the reference compound hydroxydihydropyranone displayed additive interactions only with the benzothiadiazine (palm I) in the biochemical assay as well as in cell culture. Hence it could be concluded that, having characterized one individual NNI, no universal predication is possible concerning the combinatory behaviour of NNIs binding to the same binding site. As synergistic, antagonistic or additive interactions are inhibitor-dependent (not binding sitedependent) each novel NNI has to be characterized individually in one-to-one combinations.
Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.
This thesis is based on the following publications (in chronological order): 1. Biegel, E., S. Schmidt & V. Müller (2009) Genetic, immunological and biochemical evidence for a Rnf complex in the acetogen Acetobacterium woodii. Environ. Microbiol. 11: 1438-1443. My contribution: Amplification, sequence determination and analysis of Rnf homologues, enrichment of the Rnf complex 2. Biegel, E. & V. Müller (2010) Bacterial Na+-translocating ferredoxin:NAD+ oxidoreductase. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 107: 18138-18142. My contribution: I designed and performed all experiments shown and interpreted the data. 3. Biegel, E., S. Schmidt, J. Gonzáles & V. Müller (2010) Biochemistry, evolution and physiological function of the Rnf complex, a novel ion-motive electron transport complex in prokaryotes. Cell. Mol. Life Sci., in press. DOI: 10.1007/s00018-010-0555-8. My contribution: I was involved in writing all chapters except chapters: „phylogenetic analyses of rnf genes“ and „distribution of rnf genes“. 4. Biegel, E. & V. Müller (2010) A Na+-translocating pyrophosphatase in the acetogenic bacterium Acetobacterium woodii. J. Biol. Chem., in press. DOI: 10.1074/jbc.M110.192823. My contribution: I designed and performed all experiments shown and interpreted the data.
Die Translokation von gelösten Stoffen über zelluläre Membranen ist ein essentieller biologischer Prozess, der durch eine Vielfalt an integralen Membranproteinen vermittelt wird. Diese sind in den selektiven Austausch verschiedenster Stoffe bzw. Teilchen involviert und ermöglichen somit die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellkompartimenten untereinander bzw. mit der extrazellulären Umgebung. Eine der größten Familien paraloger Proteine, die den vektoriellen Transport von Substanzen über Zellmembranen katalysieren, stellen die ATP‐binding cassette (ABC)‐Transporter dar. Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen bisher untersuchten Organismen von Prokaryoten bis hin zu höheren Eukaryoten vertreten und übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Abläufen. ABC‐Transporter zeichnen sich durch eine breite Substratdiversität aus, d.h. sie energetisieren unter ATP‐Verbrauch die Translokation zahlreicher, strukturell und chemisch unterschiedlicher Substanzen wie Zucker, Lipide, Ionen, Aminosäuren, Proteine oder auch zelltoxische Stoffe. In Bakterien können sie sowohl als Importproteine fungieren, welche hauptsächlich die Aufnahme von Nährstoffen vermitteln, als auch als Exportproteine, deren Hauptaufgabe es ist, zelltoxische Substanzen aus der Zelle heraus zu schleusen. Eukaryotische ABC‐Transporter sind sowohl in der Plasmamembran als auch in den intrazellulären Membranen zu finden – beispielsweise in denen des Endoplasmatischen Retikulums, des Golgi Apparats, der Lysosomen, der Peroxisomen und der Mitochondrien. Sie fungieren als Exportproteine und sind z.B. an der Ionen‐Homöostase, der Antigenprozessierung, der Insulinfreisetzung oder am Cholesterol‐ und Lipidtransport beteiligt. ...
Protein translocation across the chloroplast membrane is mediated by molecular machinery composed of protein complexes termed the TOC/TIC (the outer/inner envelope chloroplasts translocases). This translocation process is regulated by metabolic energy in form of GTP and ATP and is influenced by the lipid composition of the membrane. The ability to study the function of a single complex “TOC” in vitro using purified protein or purified chloroplast outer envelope vesicles has been instrumental for our understanding of the mechanism underlying this process.
Indeed, the TOC complex has been purified by previously established procedures. However its functional and structural analyses are impaired by the limited yield of purified protein. Therefore, protocols for native TOC complex purification are described here. The complex isolation is achieved by direct biochemical treatment of biological membrane hosting this complex or by tandem affinity purification of modified protein complex components from generated transgenic plants.
Furthermore, in this thesis, radioactive based in vitro import assays are described, namely those that allow monitoring translocation activity across the outer envelope of chloroplast. Based on the analysis of knock-out plants and isolated complexes it was previously suggested that lipid dependence of protein translocation might exist. Thus, the question was raised whether the lipid composition of the membrane has a direct influence on the behavior and functionality of the TOC translocon, or whether additional components of the chloroplast membrane account for the observed effect in vivo. To answer this question, a technique for vesicle fusion was developed. The principal aim was to explore the effect of an exchange of the lipid environment surrounding the complex translocon. This method helped to demonstrate that the SQDG and PI act stimulatory on the translocation across the outer envelope of chloroplast, whereas DGDG exhibits an inhibitory effect on TOC complex functionality.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht der humane β2-adrenerge Rezeptor, ein intrinsisches Membranprotein und Mitglied der Superfamilie G Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs).
Es wurden im Wesentlichen zwei Themenschwerpunkte bearbeitet. Den ersten Schwerpunkt bildeten die heterologe Produktion des β2-adrenergen Rezeptors in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris sowie dessen chromatographische Reinigung und Charakterisierung. Hierbei konnten in allen wesentlichen Punkten signifikante Verbesserungen im Vergleich zu früheren Arbeiten erzielt werden: Die Ausbeute an heterolog produziertem, funktionellem Rezeptor konnte um das bis zu Fünffache gesteigert werden; Die Gesamtausbeute nach chromatographischer Reinigung wurde um 60% erhöht; Es gelang die Darstellung reiner, monodisperser Rezeptorpräparationen mit einer spezifischen Ligandenbindungsaktivität von 94% und einer Halbwertszeit der Ligandenbindungsaktivität von >50 Tagen bei 4 °C. Eine pharmakologische Charakterisierung des Rezeptors erfolgte sowohl in Membranen als auch in solubilisiert-gereinigter Form. Ferner konnte die in vitro-Interaktion des solubilisiert-gereinigten Rezeptors mit einer konstitutiv aktiven β-Arrestin Variante nachgewiesen werden.
Ziel des zweiten Themenschwerpunkts der vorliegenden Arbeit war die Auffindung und Charakterisierung von rezeptorspezifischen, nicht auf Immunglobulinen basierenden Bindeproteinen, um diese später vorrangig zur Kokristallisation einsetzen zu können. Mit der zellfreien Selektionsmethode des ribosome display ist es hierbei gelungen, aus einer naiven, auf Ubiquitin als Gerüstprotein basierenden Bibliothek hochaffine, spezifische Bindeproteine gegen den β2-adrenergen Rezeptor zu isolieren. Für Monomere dieser sog. Affiline® wurden Dissoziationskonstanten bis etwa 450 nM gefunden, die durch Homodimerisierung auf etwa 70 nM verringert werden konnten. Zusätzlich wurde mit einer Affinitätsmaturierung ausgewählter Varianten begonnen.
Die Superfamilie der G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet die größte und auch diverseste der vier Hauptgruppen membranständiger Rezeptoren. Im Rahmen der Signaltransduktion vermitteln diese die Umwandlung eines extrazellulären Signals in eine spezifische intrazelluläre Reaktion und nehmen so eine Schlüsselposition bei der Kommunikation zwischen Zellen ein. Bei GPCRs erfolgt die Weitergabe der ligandeninduzierten Konformationsänderung vorwiegend über Kopplung an und Aktivierung von Guanin-Nukleotidebindenden Proteinen (G Proteine), die dann ihrerseits mit verschiedenen Effektorsystemen in Wechselwirkung treten. Da ein Großteil aller zurzeit auf dem Markt befindlichen Medikamente ihre Wirkung durch Bindung an einen GPCR entfaltet, ist diese Proteinfamilie von besonders großem pharmakologischem Interesse. Auch der humane β2-adrenerge Rezeptor (β2AR) zählt zu den kommerziell wichtigen drug targets und ist zudem nach bovinem Rhodopsin der erste GPCR, für dessen Struktur experimentell bestimmte, atomare Modelle vorgelegt werden konnten.
Zur funktionellen Überproduktion des β2AR hatte sich bereits die methylotrophe Hefe Pichia pastoris bewährt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch Anwendung hier erarbeiteter, optimierter Bedingungen das Produktionsniveau aller acht für dieses Expressionssystem zur Verfügung stehenden bzw. in dieser Arbeit hergestellten Konstrukte gegenüber früheren Ergebnissen deutlich gesteigert werden konnte. Hierbei wurde, je nach Konstrukt, eine Verdopplung bis Verfünffachung der Produktion an aktivem, bindungsfähigem Rezeptor erzielt. Bei drei der acht Konstrukte konnte das Produktionsniveau auf ≥ 50 pmol/mg Membranprotein gesteigert werden, was bis zu 1,1 mg aktivem Rezeptor in Membranen pro Liter Schüttelkultur entspricht. Die im Rahmen der Produktionsoptimierung der verschiedenen Konstrukte gewonnenen Erkenntnisse über den Einfluss sowohl von Art als auch Lokalisation eines bestimmten Anhängsels innerhalb der Expressionskassette auf das zu erwartende Produktionsniveau konnten genutzt werden, um bei einem mit bestimmten Eigenschaften neu zu erstellenden Konstrukt – einem Baukastensystem gleich – jene Anhängsel mit den gewünschten (und bekannten) Auswirkungen zu kombinieren. Auf dies Weise konnten auf Anhieb sehr gute Produktionsniveaus für neu erstellte Konstrukte erzielt werden.
Durch Optimierung einer zweischrittigen affinitätschromatographischen Reinigung konnte zum einen die Gesamtausbeute an gereinigtem β2AR um 60% gegenüber früheren Ergebnissen gesteigert werden. Zum anderen gelang es, für derartige, nach SDS-PAGE und analytischer Gelfiltration als homogen und frei von jeglichen Aggregationen befundenen Präparationen, die spezifische Aktivität (Radioligandenbindung) auf 94 ± 4% zu steigern. Die Halbwertszeit der spezifischen Aktivität derartiger Präparationen bei 4 °C lag bei über 50 Tagen. Im Rahmen einer alternativen Reinigungsstrategie konnte der praktische Nutzen proteolytisch abspaltbarer Affinitätsanhängsel in Fällen mit inhomogener posttranslationaler Prozessierung des rekombinanten Proteins durch das Expressionssystem nachgewiesen werden.
Durch Integration einer inversen Affinitätschromatographie in das Reinigungsschema konnte bei bestimmten Konstrukten die Homogenität und Dispersität der Präparation verbessert werden, bei gleichzeitiger vollständiger Entfernung sowohl der abgetrennten Anhängsel als auch der verwendeten Protease.
Die Ligandenbindung des β2AR wurde sowohl in Membranen als auch in solubilisiertgereinigter Form charakterisiert. Die hierbei für den Rezeptor in Membranen mit dem tritiierten Liganden [5,7-3H]-(-)-CGP-12177 erhaltene Dissoziationskonstante (KD) von 4,1 ± 0,2 nM befindet sich in guter Übereinstimmung mit den Literaturwerten für dieses Expressionssystem.
Bei der Charakterisierung der Ligandenbindung des β2AR in solubilisiert-gereinigter Form wurde ein stark modulierender Effekt von Lipiden auf die KD beobachtet: Die Dissoziationskonstante des soubilisiert-gereinigten Rezeptors wurde zu 8 ± 0,6 nM bestimmt, ließ sich jedoch durch gleichzeitige Verwendung von solubilisiertem Phosphatidylcholin und Cholesterinhemisuccinat im Bindungstest auf ein Viertel (2,13 ± 0,2 nM) diese Wertes reduzieren. Der Effekt der Affinitätsmodulation war voll reversibel und die Gesamtmenge (Bmax) an bindungsfähigem Rezeptor blieb praktisch unbeeinflusst.
Des weiteren konnte die spezifische Interaktion des solubilisiert-gereinigten β2AR mit rekombinantem, konstitutiv aktivem β-Arrestin in vitro nachgewiesen werden. Dies ist sowohl für die Etablierung etwaiger funktioneller Assays als auch für Ansätze zur Kokristallisation des β2AR mit einem physiologischen Bindungspartner für von Interesse.
Im Rahmen des zweiten Themenkomplexes wurde die Methode des ribosome display (RD) erfolgreich eingesetzt, um Bindeproteine gegen den β2AR zu selektieren. Ziel war es hier, diese später zur Kokristallisation mit dem Zielprotein einsetzen zu können. Das RD als zellfreie (in vitro) Selektionsmethode findet für lösliche Proteine bereits seit längerem breite Anwendung.
Für Membranproteine wurde es bisher hingegen nur sehr selten erfolgreich verwendet und der Einsatz bei GPCRs ist als neu zu bezeichnen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine hochdiverse (theoretische Diversität: 1013, funktionelle Größe 1010 – 1011), naive Bibliothek verwendet, die auf Ubiquitin als Gerüstprotein basiert und von SCIL Proteins, Halle unter der Bezeichnung Affilin® entwickelt wurde. Es handelt sich somit um alternative, d. h. nicht auf Antikörpern oder deren Fragmenten beruhenden Bindeproteine. Zielprotein der in dieser Arbeit durchgeführten Selektionen war solubilisiert-gereinigter β2AR. Sämtliche Arbeiten unter Beteiligung des Zielproteins fanden zur Bewahrung dessen Aktivität in Anwesenheit von Detergenz statt. Die verschiedenen Schritte des RD mussten daher zunächst an die speziellen Erfordernisse des Zielproteins angepasst und geeignete Bedingungen zur Durchführung einer Selektion gefunden werden. Durch entsprechende Vorversuche wurde dann verifiziert, dass der Rezeptor unter den gewählten Selektions- und Immobilisierungsbedingungen seine Ligandenbindugsaktivität beibehält. Es wurden insgesamt sechs RD-Selektionsrunden durchgeführt und der abschließend vorliegende Bindeprotein-Subpool war noch divers (keine Reduktion auf eine Konsensus-Sequenz). Zur Charakterisierung der angereicherten Varianten wurde eine Abfolge von Hochdurchsatzverfahren sowie abschließenden Einzelanalysen eingesetzt. Hierbei gelang es, hochaffine, spezifische Bindeproteine gegen den β2AR zu isolieren. Die beobachteten Dissoziationskonstanten (KD) der detailliert charakterisierten Affilin-Monomere reichen von etwa 15 μM bis hin zu 450 nM. Nach Homodimerisierung ausgewählter, zuvor charakterisierter Varianten wurde eine Verringerung der Dissoziationskonstanten bis auf etwa 70 nM beobachtet. Damit decken die selektierten Bindeproteine einen Affinitätsbereich ab, der verschiedenartige Anwendungsgebiete eröffnet: Vom Einsatz zur affinitätschromatographischen Reinigung des Zielproteins, über dessen immunologischen Nachweis bzw. dem Einsatz in Assaysystemen bis hin zur Kokristallisation mit dem Zielprotein. Die Spezifität der Bindeproteine wurde gegenüber verschiedenen Negativkontrollen wie etwa dem verwendeten Immobilisierungssystem aber auch gegenüber anderen GPCRs mit homologer Auswahl an Affinitätsanhängseln verifiziert. Durch geeignete Konditionierung (prepanning) der in den eigentlichen Selektionsprozess eingehenden ternären Komplexe war es gelungen, die Anreicherung unerwünschter, gegen das zur Immobilisierung verwendete Biotin/Streptavidin-System gerichteter Varianten wirkungsvoll zu verhindern.
Die selektierten Bindeproteine konnten in verschiedenen Maßstäben (von 1 ml bis 1 l) mit sehr hohen Ausbeuten in E. coli produziert werden. Nach Affinitätschromatographie und präparativer Gelfiltration wurden hochreine, monodisperse Präparationen erhalten. Die Gesamtausbeuten an gereinigtem Bindeprotein lagen bei etwa 15 mg/l Kulturvolumen.
Neben der Affinitätsbestimmung wurde die Bindung einzelner Affilin-Varianten an den β2AR sowohl mittels pull-down Assay als auch analytischer Gelfiltration verifiziert. Parallel zur Homo- und Hetero-Dimerisierung wurde eine Affinitätsmaturierung ausgewählter Varianten begonnen. Diese Affinitätsmaturierung der Monomere erfolgte in einem evolutiven Ansatz bestehend aus Zufallsmutagenese zuvor charakterisierter Varianten und anschließender Selektion im Rahmen eines erneuten RD.
Systematische Ansätze zur Kokristallisation des β2AR mit mehreren der aus der Selektion hervorgegangenen alternativen Bindeproteine wurden durchgeführt.
Das onkogene Fusionsprotein AML1/ETO entsteht durch die chromosomale
Translokation t(8;21), die in etwa 12 % aller primären akuten myeloischen Leukämien (AML)
auftritt. Die DNA-Bindedomäne des hämatopoetischen Transkriptionsfaktors AML1 wird
hierbei mit fast dem gesamten ETO-Protein fusioniert, das als transkriptioneller Repressor
wirkt. In den transformierten Zellen kommt es somit zur Blockierung der myeloischen
Differenzierung und zur verstärkten Proliferation. Entscheidend für das leukämische Potential
von AML1/ETO ist die Fähigkeit zur Oligomerisierung, die durch die Nervy-Homologie-Region-2
(NHR2)-Domäne im ETO-Anteil vermittelt wird.
Durch lentivirale Transduktion konnte bereits gezeigt werden, dass Proteine, welche die
NHR2-Domäne enthalten, die Oligomerisierung von AML1/ETO inhibieren und damit den
leukämischen Phänotyp AML1/ETO-exprimierender myeloischer Zellen aufheben. In der
vorliegenden Arbeit sollten nun alternative Wege zur Einbringung der therapeutischen
Proteine in t(8;21)-positive AML-Zellen untersucht werden. Dafür wurde sowohl die
Möglichkeit der Proteintransduktion als auch die Verwendung nicht-integrierender viraler
Vektoren analysiert.
Im ersten Projekt wurden durch Fusion mit der HIV-1 TAT-Domäne zellpermeable
NHR2-Proteine generiert. Zunächst wurde ein Protokoll zur Expression und Reinigung der
rekombinanten Proteine etabliert. Durch eine ausführliche biochemische Charakterisierung
konnte gezeigt werden, dass die aus Bakterien aufgereinigten NHR2-Proteine funktionell und
sehr rein waren. Sie wiesen den erwarteten hohen alpha-helikalen Anteil auf und behielten ihre
Fähigkeit zur Bildung von Tetrameren in vitro bei. Die TAT-NHR2-Fusionsproteine sind in der
Lage, in humane Zellen einzudringen und konnten erfolgreich in den Lysaten nachgewiesen
werden. Mikroskopische Studien zeigten, dass der Großteil der internalisierten Proteine in
Endosomen-ähnlichen Vesikeln lokalisiert war. Die Zugabe des Endosomeninhibitors
Chloroquin oder eines endosomolytischen, zellpermeablen Peptides ermöglichte eine erhöhte
intrazelluläre Stabilität der zellpenetrierenden Proteine. Co-Immunpräzipitations-Experimente
konnten bestätigen, dass die aufgenommenen NHR2-Proteine spezifisch an das ETO-Protein
in transfizierten, adhärenten Zellen binden können. Die Proteintransduktion in die myeloische,
AML1/ETO-wachstumsabhängige Zelllinie Kasumi-1 ist unter serumfreien Bedingungen
ebenfalls möglich. Die konsekutive Behandlung der AML-Zellen mit den TAT-NHR2-
Fusionsproteinen führte zu einer Reduktion der Expression des Stammzellmarkers c-kit
(CD117) in 26 % der behandelten Zellen. Die Anwendung zellpermeabler NHR2-Proteine ist
demnach prinzipiell möglich, bedarf aber weiterer Optimierung, um die notwendige hohe
Bioverfügbarkeit zu erreichen.
In einem zweiten Projekt wurden Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren verwendet,
um die NHR2-Proteine in den hämatopoetischen Zellen zu exprimieren. Mit Hilfe mehrerer
Methoden konnte gezeigt werden, dass sich mit den generierten Vektoren, die auf dem AAV-
Serotyp 2 basierten, erfolgreich eine transiente Genexpression induzieren ließ. Der CMV-
Promoter vermittelte jedoch nur eine schwache Expression in den hämatopoetischen Zellen.
Unter Verwendung des stärkeren SFFV-Promoters konnte die Expressionsstärke deutlich
gesteigert werden. Die von den optimierten AAV-Vektoren vermittelte Expression der NHR2-
Proteine führte in den beiden AML1/ETO-positiven Zelllinien Kasumi-1 und SKNO-1 zu den
erwarteten, spezifischen Effekten. So wurde das Wachstum verlangsamt und gleichzeitig die
Apoptoserate erhöht. AML1/ETO-unabhängige Zellen wurden dagegen von den AAV-NHR2-
Vektoren nicht beeinflusst. Obwohl die Proteinexpression in SKNO-1 Zellen stärker war,
zeigten die Kasumi-1 Zellen deutlichere Effekte. Die NHR2-Proteine bewirkten in den
transduzierten t(8;21)-positiven Zellen außerdem eine Reduktion der Expression der
Stammzellmarker CD34 bzw. c-kit. Dies deutet auf eine partielle Differenzierung der beiden
AML1/ETO-abhängigen Zelllinien hin. Damit ließen sich durch AAV-vermittelte Transduktion
in den AML-Zellen dieselbe Wirkung in Hinblick auf Wachstum, Differenzierbarkeit und
Apoptoserate erzielen wie dies mit den lentiviralen Vektoren zuvor beschrieben wurde. In
einem abschließenden Vergleich wurde aber deutlich, dass nicht-integrierende
Vektorsysteme generell eine schwächere NHR2-Proteinexpression induzieren und
demzufolge auch schwächere Effekte als integrierende Vektoren in den AML1/ETO-positiven
Zellen auslösen.
NK cells are part of the innate immune system, and are important players in the body’s first defence line against virus-infected and malignantly transformed cells. While T cells recognize neoplastic cells in an MHC-restricted fashion, NK cells do not require prior sensitization and education about the target. In leukemia and lymphoma patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation not only T cells but also NK cells have been found to mediate potent graft-versus-tumor effects. Hence, autologous or donor-derived NK cells hold great promise for cancer immunotherapy. Since the generation of highly purified NK cell products for clinical applications is labor-intensive and time consuming, established human NK cell lines such as NK-92 are also being considered for clinical protocols. NK-92 cells display phenotypic and functional characteristics similar to activated primary NK cells. While NK-92 cells are highly cytotoxic towards malignant cells of hematologic origin, they do not affect healthy human tissues. NK-92 cells can be expanded under GMP-compliant conditions, and can therefore be provided in sufficient numbers with defined phenotypic characteristics for clinical applications. Safety of NK-92 cells for adoptive immunotherapy was already shown in two phase I/II clinical trials...
In dieser Arbeit wurden zwei Schlüsselenzyme des Energiestoffwechsels in Archaeen im Hinblick auf ihre funktionellen, spektroskopischen und strukturellen Eigenschaften untersucht. Die Heterodisulfid-Reduktase (Hdr) katalysiert die Reduktion des terminalen Elektronenakzeptors CoM-S-S-CoB zu CoM-SH (Coenzym M) und CoB-SH (Coenzym B) und spielt eine Schlüsselrolle im zentralen Energie-konservierenden Prozess von methanogenen Archaeen. Hdr existiert in Form von zwei unterschiedlichen Enzymen: HdrDE und HdrABC. Beide weisen ein charakteristisches Cystein-reiches Sequenzmotiv (CCG-Domäne) auf, welches als Bindestelle für ein ungewöhliches [4Fe-4S]-Zentrum dient. Frühere Studien zeigten, dass das [4Fe-4S]-Zentrum in der Untereinheit HdrB lokalisiert ist und als zentraler Bestandteil des aktiven Zentrums die Fähigkeit besitzt, ein Thiyl-Radikal zu binden. Darauf aufbauend wurden genetische, spektroskopische und strukturelle Untersuchungen überwiegend am H2:Heterodisulfid-Oxidoreduktase-Komplex (Mvh:Hdr) aus Methanothermobacter marburgensis oder an der heterolog produzierten Untereinheit HdrB durchgeführt. Das Reinigungsprotokoll des Mvh:Hdr-Komplexes wurde für Kristallisationsexperimente und für ENDOR- und Mössbauer-spektroskopische Studien optimiert. Eine Kristallisation des Mvh:Hdr-Komplexes gelang nicht; doch konnten Kristalle der Heterodisulfid-Reduktase-assoziierten Hydrogenase (Mvh) bis zu einer Auflösung von 3.34 Å vermessen und mit Hilfe der anomalen Information der Elektronentransferweg zwischen den [Fe-S]-Clustern definiert werden. Ergänzende elektronenmikroskopische Studien zeigten einen unsymmetrischen Aufbau des Komplexes. DesWeiteren wurde die Untereinheit HdrB aus M. marburgensis in Methanosarcina acetivorans heterolog produziert und seine Funktionalität kinetisch und spektroskopisch nachgewiesen. Ferner wurde HdrB in Escherichia coli heterolog produziert und gereinigt, um Kristallisationsexperimente durchzuführen und es für ENDOR- und Mössbauer-Studien verfügbar zu machen. Um HdrB spektroskopisch zu vergleichen, wurde eine Untereinheit der Succinat:Chinon Oxidoreduktase (SdhE) aus Sulfolobus solfataricus ebenfalls heterolog in E. coli produziert und mittels ENDOR-Spektroskopie charakterisiert. Ein grundlegender Prozess des biogeochemischen Schwefelkreislaufes ist die dissimilatorische Sulfat-Reduktion, in der Sulfat (SO4 2􀀀) zu Schwefelwasserstoff (H2S) umgewandelt wird. Die dissimilatorische Sulfit-Reduktase (dSir), das Schlüsselenzym im Energiestoffwechsel der Sulfat-Reduzierer, besitzt einen einzigartigen Sirohäm-[4Fe-4S]-Cofaktor, der die Reduktion von Sulfit (SO3 2􀀀) zu H2S in einem 6-Elektronen-Schritt katalysiert. Um diesen Mechanismus zu untersuchen, wurden kinetische, spektroskopische und röntxi Zusammenfassung genkristallographische Methoden angewandt. Die Kristallstrukturen von dSir aus Archaeoglobus fulgidus wurden im Komplex mit Sulfit, Sulfid (S2􀀀), Kohlenmonoxid (CO), Cyanid (CN􀀀), Nitrit (NO2􀀀), Nitrat (NO3 􀀀) und Phosphat (PO4 3􀀀) gelöst. Aktivitätstest und analytische Studien zeigten, dass dSir von A. fulgidus neben Sulfit und Nitrit auch Thiosulfat und Trithionat reduziert und Letztere auch als Intermediate entstehen. Auf dieser Basis wurde ein 3-Stufen-Mechanismus postuliert, wobei jede Stufe aus einem 2-Elektronentransfer, einer Aufnahme von zwei Protonen und einer Dehydrationsreaktion besteht. Im Vergleich zur assimilatorischen Sulfit-Reduktase (aSir) aus E. coli zeigt die dSir-Struktur einen veränderten Substratkanal, eine Rotation des Sulfits um 60° und beträchtliche Konformationsänderungen der katalytischen Reste Arga170 und Lysa211. Aufgrund dieser Änderungen kann ausschließlich in dSir ein weiteres Sulfit-Molekül in van-der-Waals-Kontakt zum an das Sirohäm-gebundene Sulfit oder Schwefel-Sauerstoff-Zwischenprodukt platziert werden, das nötig ist, um Thiosulfat und Trithionat zu synthetisieren.