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Life-attenuated measles virus (MV) vaccines have revealed their capacity to routinely induce life-long immunity against MV after just a single or two low-dose injections. Moreover, MV vaccines have been shown to be extensively safe and well tolerated, in general. Thus, MV is a prime candidate for a recombinant vaccine platform to protect also against other pathogens after vaccination. For this purpose, foreign genes can be inserted into additional transcription units (ATU) in recombinant MV genomes so that the encoded foreign proteins are co-expressed with MV proteins in infected cells. These so-called bivalent MV should protect against infection by MV or the pathogen, which the encoded foreign protein had been derived from. Bivalent MVs have already been shown to be effective vaccines against e.g. dengue virus or hepatitis B virus infections by inducing humoral and sometimes also cellular immune responses. In most of these studies, soluble or soluble versions of the pathogens' antigens were used for generation of bivalent MVs.
We hypothesized that the form of the antigen expressed by bivalent MVs is crucial for the potency and constitution of the induced immune responses. Therefore, three different forms of an antigen expressed by bivalent MVs were analyzed, here. The model antigen chosen for this purpose has been the envelope protein (Env) of SIVsmmPBj1.9. In its natural mature form, Env is composed of the surface unit gp120 and the transmembrane unit gp41, which stay non-covalently linked after proteolytic processing of the common precursor protein gp160. However, gp120 can be shed by infected cells or virus particles. Therefore, natural gp160 antigen was used as shedding form. Furthermore, stabilized covalently-linked gp160 variants and soluble gp140 variants were used in this thesis. These different antigen forms were inserted either behind the P or behind the H expression cassettes into the MV genome. The respective bivalent MVs were rescued and characterized. Expression of SIVsmmPBj1.9 Env variants by the bivalent MVs was confirmed by immuno blot and in situ immunoperoxidase assays. Replication curves of bivalent MV showed that growth of MVs expressing the different Env variants was slightly delayed by approximately 24 h compared to control viruses.
For immunization of transgenic, MV-susceptible IFNAR-/--CD46Ge mice, which are the current standard to analyze MV vaccines in a small animal model, an optimal dose of 1x105 TCID50 was determined. For the evaluation of humoral immune responses in transgenic mice, two ELISA systems for the detection of total α-MV and α-SIV antibodies and neutralization assays for detection of neutralizing antibodies against MV and SIV in sera of immunized mice were established. Mice immunized with any of the bivalent MVs showed significant humoral immune responses against MV comparable to those elicited by the parental MV vaccine strain without further genetic modifications. Mice immunized with MVvac2-gp140(P) expressing the soluble gp140 variant revealed highest α-SIV titers with a maximal OD of up to 0.4. Second highest levels of α-SIV antibodies were detected in mice that were immunized with the shedding variants or soluble Env in other positions. MVs expressing the stabilized variants induced only very low α-SIV antibody titers. Neutralizing antibodies directed against SIV could be detected in sera of mice immunized with MVs expressing the soluble or shedding variants, but not in sera of mice immunized with MVs expressing the stabilized variants. In sera of control mice immunized with PBS no antibodies could be detected, as expected. Thus, soluble and shedding antigens induced humoral immune responses, whereas stabilized antigens induced only weak humoral immune responses but no neutralizing antibodies. Analysis of cellular immune responses is still ongoing.
Besides Env, further SIV antigens could be tested for their potency to induce humoral as well as cellular immune responses.
Besides being used as a vaccine platform, recombinant MVs are evaluated as future agent for cancer therapy due to their significant inherent tumor-lytic, so-called oncolytic activity. Currently, the anti-tumoral activity of MV is analyzed in clinical phase I trials. MV strains with high fusion activity are used as oncolytic agents. The fusion protein F of MV strain NSe is highly fusogenic, in contrast to e.g. F of MVwt323, a clone of the pathogenic strain IC-B. Sequence analysis of these two proteins identified one coding nucleotide difference at aa 94 in the F2 domain: a valine (V) in FNSe and a methionine (M) in Fwt323. To evaluate impact of this difference, residues at aa 94 were exchanged. After transient-transfection of MV F and H expression plasmids in receptor-positive cells, V94 in the F2 subunit of FNSe or Fwt323 led to about 6-fold higher fusion activity compared to F proteins with M94. The co-expressed H protein (HNSe or Hwt323) did not influence fusion activity, indicating that the receptor (CD46 or SLAM) bound by H does not quantitatively affect the F proteins' activation. Analysis of F and H showed that formation and transport of MV glycoprotein complexes are not altered by substitution in aa 94 of FNSe or Fwt323.
Furthermore, recombinant MVNSe, MVNSe-F-M94, MVwt323, or MVwt323-F-V94 were rescued. Viral replication revealed slightly higher titers for recombinant MVs expressing M94 in F after 96 h of replication, compared to MVs expressing V94. MVs expressing V94 in F2 showed 2.5-fold higher fusion activity on CD46- and SLAM-positive Vero-hSLAM cells and 2-fold higher fusion activity on B95a cells expressing only SLAM compared to MVs expressing F with M94. Fusion activity of recombinant MVs can thus be modulated by substituting a single aa. V94 in the F protein results in highly fusion active MVs with possibly increased direct cytotoxicity in infected tumors, whereas M94 in F could be associated with decreased fusion activity for therapies, where higher virus titers are required.
Parvulustat ist ein kleines Protein (8,2 kDA), das aus dem Bodenbakterium Streptomyces
parvulus sekretiert wird. Es ist ein saures Polypeptid mit einem isoelektrischen Punkt von 4,49
und inhibiert spezifisch α-Amylasen (Ki = 9 x 10-12).
In der vorliegenden Arbeit sollen neben der Isotopenmarkierung des Parvulustats PL-Mutanten
mittels PCR-Mutagenese und DNA Rekombinationstechnick hergestellt werden.
Zur Charakterisierung und Strukturbestimmung der Mutanten werden größere Mengen des
jeweiligen Proteins benötigt, wofür wiederum ein effektives Expressionssystem bereitstehen
muß. Ein Expressionssystem besteht aus einem Wirtsorganismus der seinen Protein-Biosynthese-
Apparat zur Verfügung stellt und einem Vektor (Plasmid) der das Zielgen trägt. Im Falle des
Parvulustats und seiner Mutanten bietet sich der gut charakterisierte Stamm Streptomyces
lividans TK 24 (Hopwood et al, 1985) als Wirtsorganismus an. Der Inhibitor wird in ihm als
Vorläuferprotein mit Signalpeptid als Transportsignal (Leader) gebildet. Da dieses Bakterium
keine äußere Membran besitzt, wird der Inhibitor direkt ins Kulturmedium ausgeschleust. Dabei
wird das Signalpeptid durch die Signalpeptidase abgespalten.
Das Strukturgen wird zuerst im Klonierungsplasmid pSH09 in E. coli vervielfältigt, bevor es mit
den Enzymen EcoRI und SpeI geschnitten wird, um in den Expressionsvektor pSH017 integriert
zu werden. Dieser Shuttlevektor trägt genauso die gewünschten Restriktionsschnittstellen, SpeI
und EcoRI, die die paßgenaue Ligation des rekombinanten Strukturgens mit den funktionellen
Elementen erlauben.
Nach erfolgtem Einbau des Zielgens in das neue Vektorkonstrukt kann dieser Expressionsvektor
leicht in den Wirtsorganismus eingebracht werden und sich dort vermehren. Nach Klonierung der
mutierten Parvulustatsgene in den Expressionsvektor werden die damit transformierten Zellen auf
R2YE-Platten aufgebracht und bei einer Temperatur zwischen 20 und 28°C je nach PL-Mutanten
inkubiert. Zur Selektion wird Thiostrepton verwendet. Nach Transformation und Vermehrung
geeigneter Wirtszellen wird das klonierte Gen transkribiert. Durch anschließende Translation der
gebildeten mRNA in der Wirtszelle entsteht das gewünschte Protein in großen Mengen. Zur
Überprüfung der Aktivität der einzelnen Mutanten steht der qualitative α-Amylase-Plattentest zur
Verfügung, wobei die aktiven Mutanten einen blauen Hemmhof bilden (siehe Abbildung 24). Der
blaue Jod-Stärke-Komplex weist, bei gleichzeitigem Vorhandensein von α-Amylase, auf nicht
abgebaute Stärke und damit indirekt auf die Produktion des α-Amylase-Inhibitors hin.
Da das Parvulustat von den Bakterien ins Medium abgegeben wird, besteht die Abtrennung der
Zellen durch Zentrifugation des Kulturmediums. Es folgen Ammoniumsulfatfällung des
Überstandes, Auftragung auf PAGE und präparative HPLC, nach der reines, einheitliches Protein
isoliert werden konnte.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene proteomanalytische Methoden untersucht und evaluiert, die, basierend auf der Verwendung 2D-gelelektrophoretischer, 2D-chromatographischer und massenspektrometrischer Techniken, die differentielle, quantitative Proteinanalyse zweier unterschiedlicher muriner Fibroblasten-Zelllinien ermöglichen. Hierfür wurden zunächst unterschiedliche Methoden für die 2D-elektrophoretische Proteinauftrennung analysiert. Im Hinblick auf eine größtmögliche Auflösung und Gel-zu- Gel-Reproduzierbarkeit wurden innerhalb der ersten Dimension (IEF) die Lademethode, die Fokussierungszeiten und der Reduktionsschritt (DTT oder HED) optimiert. Desweiteren wurde eine auf isoelektrischer Fokussierung basierende Vorfraktionierungsmethode auf ihre Anwendbarkeit bei einer quantitativen Proteomanalyse getestet. Für die Proteingelfärbung wurde unter anderem ein selbst synthetisierter Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt, der hinsichtlich Färbesensitivität und MS-Kompatibilität mit etablierten Protokollen verglichen wurde. Eine Doppelfärbungs-Methode von Proteingelen (Silberfärbung nach Fluoreszenzfärbung) wurde auf ihre MS-Kompatibilität nach tryptischen Verdau untersucht. Desweiteren wurden manuelle und automatisierte Verdauprotokolle für eine möglichst hohe Peptide Recovery optimiert. Die zunächst durch die Anwendung von klassischen Färbe- und Quantifizierungsmethoden nach 2DE gewonnenen Ergebnisse wurden mit neueren Labelling-Methoden zur relativen Proteinquantifizierung verglichen. Dabei kamen zwei unterschiedliche Multiplexing-Verfahren zum Einsatz, die sich in der Proteinquantifizierung grundlegend unterscheiden (DIGE: gelbasierte Proteinquantifizierung; iTRAQ: LC-MS/MS basierte Peptidquantifizierung). Die für diese beiden Methoden bestehenden Protokolle wurden für die Anwendbarkeit auf die Fibroblasten-Proteinextrakte angepasst. Es konnte gezeigt werden, daß diese beiden Labelling-Methoden in Bezug auf Reproduzierbarkeit und quantitativer Aussagekraft dem klassischen 2DE-Experiment (Proteinfärbung nach der Auftrennung auf einzelnen Gelen) überlegen sind. Die statistische Absicherung der analysierten relativen Quantitätsunterschiede verbesserte sich durch die zusätzliche Anwendung der beiden neuen Labelling-Methoden erheblich. Dabei stützt sich die Signifikanz der quantitativen Bestimmung sowohl auf die große statistische Sicherheit, die innerhalb dieser beiden Multiplexing-Methoden erreicht wird, als auch auf die Wiederholbarkeit in unterschiedlichen Experimenten (21 Proteine wurden in unterschiedlichen Ansätzen bestätigt). Die beiden Labelling-Methoden DIGE und iTRAQ unterscheiden sich außer in der Quantifizierungsstrategie auch grundsätzlich in dem Ansatz der Auftrennung (DIGE: Proteine, 2DElektrophorese; iTRAQ: Peptide, 2D-Flüssigchromatographie). Damit besitzen sie unterschiedliche Limitierungen in Bezug auf die physiko-chemischen Eigenschaften der Peptide/Proteine, die mit der jeweiligen Methode aufgetrennt werden können. Der daraus resultierende komplementäre Charakter beider Methoden konnte anhand mehrerer Proteine verdeutlicht werden. Durch die relative Quantifizierung konnten insgesamt 30 Proteine identifiziert werden, die aufgrund der An- oder Abwesenheit des MLL-Proteins in den beiden murinen Zelllinien differentiell reguliert sind. Die alleine schon durch die unterschiedliche Morphologie der untersuchten murinen Fibroblasten vermutete Deregulation von Struktur- und Stressproteinen (Actin, HSP27, HSP70) konnte bestätigt werden. Weitere Expressionsunterschiede zwischen Mll-/-- und Mll+/+-Fibroblasten zeigten sich vor allem bei Proteinen, die funktionell der Gruppe RNA-prozessierender Proteine (Polyadenylate Binding Protein, PTB-associated Splicing Factor, hnRNPs) zugeordnet werden können. Ein Vergleich der quantitativen Proteomdaten dieser Arbeit mit den mRNA-Expressionsprofilen der gleichen Zellen zeigt nur eine sehr geringe Korrelation bezüglich der Regulationen einzelner Gene/Proteine. Die meisten der bisherigen Studien, die eine Untersuchung des mRNA/Protein-Verhältnisses zum Gegenstand haben, bestätigen das Fehlen einer Korrelation. Diese Tatsache unterstreicht die Wichtigkeit der Kombination genomischer und proteinanalytischer Daten zur Aufklärung zellulärer molekularer Prozesse.
The universal biological energy currency adenosine triphosphate (ATP) is synthesized by the F1Fo-ATP synthase in most living organisms. The overall structure and function of F-type ATPases is conserved in the different organisms. The F1Fo-ATP synthase consist of two domains; the soluble F1 complex has the subunit stoichiometry α3β3γδε and the membrane embedded Fo complex consists of subunits ab2c10-15 in its simplest form found in bacteria. F1 and Fo both function as reversible rotary motors that are connected by a central stalk (γε) and a peripheral stalk (b2δ).
For ATP synthesis, the electrochemical energy formed by a proton or sodium ion gradient is required. The ion translocation across the Fo subcomplex induces torque in the motor part of the enzyme (cnγε), which causes conformational changes in the α3β3 domain leading to ATP synthesis from ADP and inorganic phosphate (Pi) catalyzed in the β-subunits. ATP hydrolysis causes a reverse torque in the Fo subcomplex triggering uphill ion translocation from cytoplasm to periplasm, and the enzyme functions as an ion pump.
The ATP synthesis mechanism is well understood, since several high-resolution structures of F1 are available. In contrast, the ion translocation mechanism across the membrane, mediated by the Fo subcomplex, is not understood in its structural detail.
Subunit a and the c-ring form an ion pathway, but subunit b is needed to form an active ion translocation pathway in both H+- and Na+-dependent systems. Several high-resolution structures of c-rings have provided insights in the ion translocation mechanism. The different ion translocation models based on biochemical, biophysical and structural analysis are in agreement in the fact that ions are translocated through a periplasmic ion access pathway in subunit a to the middle of the membrane and there to the binding site of a c-subunit. After almost a whole rotation of the c-ring the ion returns into the a-c interface, where it can be released to the cytoplasm. In the different models the cytoplasmic access pathway has been proposed to be located in subunit a, at the a-c interface or within the c-ring. The driving force of torque generation has been proposed to be the pH gradient or membrane potential. Several biochemical studies show that a conserved arginine in helix four of subunit a (R226 in Ilyobacter tartaricus or R210 in Escherichia coli)plays a critical role in the ion translocation. The arginine has been proposed to function as an electrostatic separator between the cytoplasmic and periplasmic pathways and as a mediator of the ion exchange into the c-ring ion-binding site.
Structural data of a related enzyme (V1Vo-ATPase from Thermus thermophilus) has provided insight into the helical arrangement of the ion translocating subunits I and Lring (related to subunit a and the c-ring). These structures indicated a small interface between subunit I and the L-ring, and two four-helix bundles in the N-terminal domain of subunit I were proposed to build the periplasmic and cytoplasmic ion pathways. To comprehend the ion-translocation and torque generation mechanism in F1Fo-ATP synthase, structural data of an intact a-c complex is needed.
The goal of this work was to obtain structural data of subunit a, most preferably in a complex with the c-ring or additionally with subunit b. Therefore, a new purification procedure for the I. tartaricus Fo-subcomplex, heterologously expressed in E. coli cells, was established. The purified Fo was characterized biochemically and by Laserinduced liquid bead ion desorption mass spectrometry (LILBID-MS). These analyses showed that pure and completely assembled Fo containing all its subunits in the correct stoichiometry (ab2c11) was obtained. The purified Fo complex was stable at 4°C for several months and at room temperature in the presence of lipids for several weeks. A lipid analysis was performed by thin-layer chromatography (TLC) to investigate the qualitative lipid composition of I. tartaricus whole lipid extract and various I. tartaricus F1Fo isolates. The whole lipid extract contained PC, PG and PE lipids and probably cardiolipin. PC, PG and PE lipids were bound to wild type I. tartaricus F1Fo, whereas recombinant I. tartaricus F1Fo did not have any bound lipids, but was able to bind the synthetic lipids POPC and POPG if they were provided during the purification.
For subsequent structural studies the purified Fo was subjected to two-dimensional (2D) crystallization trials. Vesicles and sheets tightly packed with protein and crystals with a rare plane group for I. tartaricus c11 (p121) were obtained. The c-ring was visible in the CCD images, and immunogold-labeling revealed the presence of the His-tagged a-subunit in the reconstituted vesicles. Furthermore, atomic force microscopy (AFM) imaging showed protein densities next to the c-rings, which protruded less from the membrane (0.4±0.1 nm) than the c-ring (0.7±0.1 nm). These protein densities presumably belonged to subunit a.
Cryo-electronmicroscopy (cryo-EM) was used to collect data of the p121 crystals and a merged projection density map was calculated to 7.0 Å resolution. The unit cell of the crystals (81 × 252 Å) contained two asymmetric units with three c-rings in each and next to the c11-rings new prominent densities were visible. In each extra density up to 7 transmembrane helices were visible, belonging to the stator subunit a and/or subunit b. To elucidate whether there are conserved elements in the three extra densities non-crystallographic averaging was applied using a single-particle approach.
Six possible arrangements for the c-rings and the extra densities were identified and used for the averaging. The extra densities were enhanced only in one of the possible arrangements. The average showed a four-helix bundle and a fifth helix in close proximity to the c-ring. Two more helices were present in each position but their position was ambivalent. The data obtained in this work provides the first insight in the helical arrangement in the a-c interface of F1Fo-ATP synthase.
The TolC protein of E. coli is a versatile OMF which is involved in secretion of antibiotics, heavy metal ions, secondary metabolites and proteins. These individual tasks are accomplished by a dynamic formation of different secretion complexes which comprising a plasma membrane transporter, a Membrane Fusion Protein and TolC as the outer membrane channel-tunnel. The TolC-like protein HgdD of the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 was previously described as an indispensable OMF involved in formation of the heterocyst-specific glycolipid layer which is needed to sustain the microoxic environment that allows nitrogen fixation in heterocysts of filamentous cyanobacteria. Here I show that HgdD is involved in macrolide antibiotic resistance and ethidium efflux, which is used as a model substrate for cytotoxic compounds and secondary metabolites. It can be shown that ethidium uptake is a passive and porin-dependent process, while multidrug efflux is performed together with the RND efflux pump All3143 (and the MFP All3144). In contrast to HgdD, All3143 can complement the function of its homologue AcrB in E. coli and was suggested to be named anaAcrB. Multidrug efflux is assisted by SmsA and SchE, two secondary transporters of the MFS-type, which facilitate the transport of cytoplasmatic ethidium to the periplasmic space prior to the All3143- and HgdD-dependent efflux. Moreover, it can be demonstrated that SchE and HgdD are involved in secretion of the metal ion-chelating siderophore schizokinin, which functions in iron(III) acquisition. However, a physical interaction of SchE and HgdD is unlikely since SchE does not possess an OMF interacting domain. In addition, both RND efflux pumps All3143 and Alr1656 are needed for the homeostasis of the photosystems during diazotrophic growth. Although a direct involvement in heterocyst development or metabolism cannot be discounted at this stage, it is speculated that both RND transporters are involved in detoxification of reactive nitrogen species, similar to the function of MexF and MdtF of P. aeruginosa and E. coli respectively. In addition to its function in multidrug efflux, HgdD has been shown to be involved in protein secretion. By comparative analysis of the Anabaena sp. wild type and hgdD mutant secretome it was possible to identify eight putative HgdD protein substrates. The localization of four proteins was exemplary demonstrated by secretome isolation and cell fractionation of hemagglutinin-tagged mutant strains. The absence of detectable protein in the hgdD mutant strain suggests a highly efficient secretion system which is quality controlled by proteolysis of mislocalized proteins.
One of the key functions of blood vessels is to transport nutrients and oxygen to distant tissues and organs in the body. When blood supply is insufficient, new vessels form to meet the metabolic tissue demands and to re-establish cellular homeostasis. Expansion of the vascular network through sprouting angiogenesis requires the specification of ECs into leading (sprouting) tip and following (non-sprouting) stalk cells. Attracted by guidance cues tip cells dynamically extend and retract filopodia to navigate the nascent vessel sprout, whereas trailing stalk cells proliferate to form the extending vascular tube. All of these processes are under the control of environmental signals (e.g. hypoxia, metabolism) and numerous cytokines and peptide growth factors. The Dll4/Notch pathway coordinates several critical steps of angiogenic blood vessel growth. Even subtle alterations in Notch activity can profoundly influence endothelial cell behavior and blood vessel formation, yet little is known about the intrinsic regulation and dynamics of Notch signaling in endothelial cells. In addition, it remains an open question, how different growth factor signals impinging on sprouting ECs are coordinated with local environmental cues originating from nutrient-deprived, hypoxic tissue to achieve a balanced endothelial cell response. Acetylation of lysines is a critical posttranslational modification of histones, which acts as an important regulatory mechanism to control chromatin structure and gene transcription. In addition to histones, several non-histone proteins are targeted for acetylation reversible acetylation is emerging as a fundamental regulatory mechanism to control protein function, interaction and stability. Previous studies from our group identified the NAD+-dependent deacetylase SIRT1 as a key regulator of blood vessel growth controlling endothelial angiogenic responses. These studies revealed that SIRT1 is highly expressed in the vascular endothelium during blood vessel development, where it controls the angiogenic activity of endothelial cells. Moreover, in this work SIRT1 has been shown to control the activity of key regulators of cardiovascular homeostasis such as eNOS, Foxo1 and p53. The present study describes that SIRT1 antagonizes Notch signaling by deacetylating the Notch intracellular domain (NICD). We showed that loss of SIRT1 enhances DLL4-induced endothelial Notch responses as assessed by different luciferase responsive elements as well as transcriptional analysis of Notch endogenous target genes activation. Conversely, SIRT1 gain of function by overexpression of pharmacological activation decreases induction of Notch targets in response to DLL4 stimulation. We also showed that the NICD can be directly acetylated by PC AF and p300 and that SIRT1 promotes deacetylation of NICD. We have identified 14 lysines that are targeted for acetylation and their mutation abolishes the effects of SIRT1 of Notch responses. Furthermore, over-expression or activation of SIRT1 significantly reduces the levels of NICD protein. Moreover, SIRT1-mediated NICD degradation can be reversed by blockade of the proteasome suggesting a mechanism resulting from ubiquitin-mediated proteolysis. Indeed, we have shown that SIRT1 knockdown or pharmacological inhibition decreased NICD ubiquitination. We propose a novel molecular mechanism of modulation of the amplitude and duration of Notch responses in which acetylation increases NICD stability and therefore permanence at the promoters, while SIRT1, by inducing NICD degradation through its deacetylation, shortens Notch responses. In order to evaluate the physiological relevance of our findings we used different models in which the Notch functions during blood vessel formation have been extensively characterized. First, retinal angiogenesis in mice lacking SIRT1 activity shows decreased branching and reduced endothelial proliferation, similar to what happens after Notch gain of function mutations. ECs from these mice exhibit increased expression of Notch target genes. Second, these results were reproducible during intersomitic vessel growth in sirt1-deficient zebrafish. In both models, the defects could be partially rescued by inhibition of Notch activation. Third, we used an in vitro model of vessel sprouting from differentiating embryonic bodies in response to VEGF in a collagen matrix. Our results showed that Sirt1-deficient cells shows impaired sprouting which correlated with increased NICD levels. In addition, when in competition with wild-type cells in this assay, Sirt1-deficient cells are more prone to occupy the stalk cell position. Taken together, our study identifies reversible acetylation of NICD as a novel molecular mechanism to adapt the dynamics of Notch signaling and suggest that SIRT1 acts as a rheostat to fine-tune endothelial Notch responses. The NAD+-dependent feature of SIRT1 activity possibly links endothelial Notch responses to environmental cues and metabolic changes during nutrient deprivation in ischemic environments or upon other cellular stresses.
Das Burkitt Lymphom ist ein aggressives B-Zelllymphom, das in tropischen Regionen Afrikas und in Neu Guinea endemisch auftritt und vor allem bei Kindern vorkommt. Die sporadische Form des Burkitt Lymphoms tritt weltweit in geringerer Häufigkeit auf und betrifft alle Altersschichten. In nahezu allen endemischen Fällen ist das Epstein-Barr Virus in den Tumorzellen nachweisbar, jedoch nur in ca. 20 % der sporadischen Fälle. Der Beitrag von EBV zur Entstehung EBV-positiver Burkitt Lymphome ist seit über 50 Jahren EBV-Forschung ungeklärt. Im Jahr 2004 wurden im Genom des Epstein-Barr Virus eine Reihe von microRNAs entdeckt, die potentiell für die Pathogenese des EBV-positiven Burkitt Lymphoms relevant sein könnten. Da die Expression der viralen microRNAs seither für das Burkitt Lymphom nur unvollständig beschrieben worden sind, wurden sie in dieser Arbeit systematisch analysiert und dadurch ein vollständiges Expressionsprofil erstellt. Es konnte dabei keine Unterscheidung zwischen endemischen und sporadischen Fällen erreicht werden, jedoch wurden hierbei erstmals Fälle identifiziert, die trotz nachgewiesener EBV-Assoziation keine viralen microRNAs enthielten. Neben den viralen microRNAs könnten im Burkitt Lymphom auch die zellulären microRNAs für die Tumorentstehung von Bedeutung sein. Deshalb wurde in dieser Arbeit auch die Expression der zellulären microRNAs aus Burkitt Lymphom-Biopsien charakterisiert. Durch hierarchisches „Clustering“ bildeten sich drei Gruppen, die hauptsächlich durch An- und Abwesenheit von zwei microRNAs (miR21 und miR92a) definiert wurden, denen onkogenes Potential zugeschrieben wird. Die Expressionsmuster der einzelnen Gruppen weisen auf zelluläre Mechanismen der Pathogenese des Burkitt Lymphoms hin.
Die genetische Charakteristik des Burkitt Lymphoms ist eine Chromosomentranslokation, welche das Protoonkogen c MYC unter die Kontrolle von regulatorischen Elementen der Immunglobulingene bringt. Durch die somit erhöhte Transkription von c-MYC entfaltet das Genprodukt sein onkogenes Potential. Mutationen im offenen Leserahmen können dieses Potential zusätzlich verstärken. Da c MYC ein pleiotroper Transkriptionsfaktor ist und somit auf eine ganze Reihe zellulärer Prozesse Einfluss hat, bewirkt die Translokation massive Veränderungen in der Zelle. Vorangegangene Untersuchungen der Arbeitsgruppe zeigten, dass die antivirale Interferonantwort durch hohe c MYC-Expression unterdrückt wird. Diese Beobachtung liefert eine mögliche Erklärung für die Immunevasion von Burkitt Lymphom-Zellen, trotz Anwesenheit des EBV-Genoms. In Zelllinien, die aus Burkitt Lymphom-Biopsien generiert wurden, konnte gezeigt werden, dass EBV eine Interferoninduktion auslöst, die durch c-MYC unterdrückt wird. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass Epstein-Barr-virale Nukleinsäureprodukte durch den zytosolischen Rezeptor RIG-I Interferon induzieren, dieser aber durch die hohe c-MYC-Expression transkriptionell gehemmt wird. Neben RIG-I wurden weitere Rezeptoren und Mediatoren der Interferoninduktionskaskade identifiziert, die ebenfalls transkriptionell von c-MYC unterdrückt werden. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass c-MYC durch Unterdrückung der angeborenen Immunität die Immunevasion von Burkitt Lymphom-Zellen ermöglicht.
The adaptive immune system protects against daily infections and malignant transformation. In this, the translocation of antigenic peptides by the transporter associated with antigen processing (TAP) into the ER lumen is an essential step in the antigen presentation by MHC I molecules. The heterodimeric ATP-binding cassette transporter (ABC) TAP consist of the two halftransporters TAP1 and TAP2. Each monomer contains an N-terminal transmembrane domain (TMD) and a conserved C-terminal nucleotide-binding domain (NBD). Together, the TMDs build the translocation core and the NBDs bind and hydrolyze ATP, energizing the peptide transport. TAP features an asymmetry in the two ATP-binding sites that are built of several conserved motifs. One motif is the D-loop with the consensus sequence SALD. The highly conserved aspartate of the D-loop of TAP1 reaches into the canonic ATP-binding site and contacts the Walker A motif and the H-loop of the opposite NBD, while the Asp of D-loop of TAP2 is part of the non-canonic ATP-binding site.
To examine this ABC transport complex in mechanistic detail, a purification and reconstitution procedure was established with the function of TAP being preserved. The heterodimeric TAP complex was purified via a His10-tag at TAP1 in a 1:1 ratio of the subunits. Nucleotide binding to the purified transporter was elucidated by tryptophan quenching assays and the affinity constants for MgADP and MgATP were determined to be 1.0 μM and 0.7 μM, respectevely. In addition, the TAP complex shows strict coupling between peptide binding and ATP hydrolysis, revealing no basal ATPase activity in the absence of peptides. Furthermore, TAP was reconstituted into proteoliposomes and the activity was tested by peptide transport and ATP hydrolysis. Interestingly, the kinetic parameters of the transporter in the reconstituted state are comparable to the data gained for TAP in microsomes.
To characterize the functional importance of the D-loop, D-loop mutants of either TAP1 or TAP2 were analyzed. Strikingly, TAP containing a mutated D-loop in TAP1 (D674A) shows an ATP-hydrolysis independent peptide translocation. Accordingly, the MHC I surface expression is similar to the wildtype situation. However, the same mutation in TAP2 (D638A) results in an ATPase dependent peptide transport similar to wildtype, whereas TAP containing mutations in both subunits leads to an inactive transporter. Although all D-loop mutants showed no altered peptide binding activity, the TAP1 mutant is inactive in peptide-stimulated ATPase activity. Strikingly, ATP or ADP binding is strictly required for the peptide translocation. Experiments carried out in proteoliposomes demonstrate that wildtype TAP can export peptides against their gradient when low peptide concentrations are offered. In contrast, the D674A mutant can facilitate peptide translocation along their concentration gradient in the two directions. At high peptide concentrations, TAP is trapped in a transport incompetent state induced by trans-inhibition. In conclusion, a TAP mutant that uncouples solute translocation from ATP hydrolysis was created. Since this passive substrate movement is strictly dependent on binding of ATP or ADP, an active transporter was turned into a “nucleotide-gated facilitator”.
In a cysteine cross-linking approach the conformational changes of TAP during peptide transport and the flexibility of the nucleotide binding domains were examined. Single cysteines were introduced in the D-loops of TAP1 and TAP2. Cross-linking by copper-phenantroline (CuPhe) was possible for all combinations. However, by adding ATP, ADP or peptide to the TAP complex no differences in the cross-linking efficiency were detected. By CuPhe cross-linking TAP was trapped in a conformation, in which the peptide binding site was not accessible. To complete a transport cycle, a flexibility of at least 17.8 Å of the NBDs is needed, since TAP cross-linked by CuPhe (2.0 Å) or bismaleimidoethane (BMOE, 8.0 Å) was transport inactive but when TAP was cross-linked by 1,11-bismaleimido-triethyleneglycol (BM[PEG]3, 17.8 Å) transport activity was preserved.
Funktionalisierung mikro- und nanostrukturierter Oberflächen zur spezifischen Proteinimmobilisierung
(2014)
Die vollständige Sequenzierung des humanen Genoms zu Beginn dieses Jahrtausends leitete einen Boom der Genomik ein, in deren Anfangszeiten man sich jedoch vor einer großen Herausforderung sah. Aufgrund der selbst bei einfachen Organismen großen Anzahl kodierender Gene und auch vor dem Hintergrund ständig wachsender Datenbanken mit immer neuen vollständig sequenzierten Arten, stellten sich genetische Analysen mit klassischen Methoden als zu zeit- und kostenaufwändig heraus. Die Entwicklung sog. DNA-Chips – feste Substrate, die mehre zehn- bis hunderttausend verschiedene Oligonukleotide tragen und die parallele Durchführung einer großen Anzahl von genetischen Analysen in sehr kurzer Zeit bei vergleichsweise geringen Kosten erlaubten – lösten dieses Problem. Analog hierzu werden Protein-Chips ähnlich gute Erfolgsaussichten in der Proteomik beschieden. Der Aufbau eines Protein-Chips ist dem eines DNA-Chips sehr ähnlich, allerdings sind die Anforderungen, die für eine funktionale Immobilisierung von Proteinen an eine Substratoberfläche gestellt werden, ungleich höher. Es muss gewährleistet sein, dass durch die Verankerung auf dem Substrat die native Struktur der Proteine nicht zerstört wird, dass die immobilisierten Proteine in einer Orientierung vorliegen, in der wichtige Merkmale, wie Bindungsmotive, aktive Zentren usw. weiterhin zugänglich sind und dass unspezifische Proteinadsorptionen auf ein Minimum reduziert werden. Ziel dieser Arbeit war es, ein Konzept für eine Protein-Chip-Plattform zu entwickeln, welches diese Voraussetzungen erfüllt.
Einleitend wird die Erarbeitung eines Assays zur Analyse einer Antikörper-Antigenwechselwirkung mittels Oberflächenplasmonresonanz-(SPR)-spektroskopie dargestellt. Da diese Technik ebenfalls eine native Immobilisierung von Proteinen auf einem festen Substrat erfordert, stellt sie eine Vorform der Protein-Chip-gestützten Analyse dar. Dem entsprechend werden an SPR-Oberflächen ähnliche Anforderungen gestellt wie an Protein-Chips. In der Etablierungsphase des SPR-Assays wurden zunächst grundlegende Parameter wie die Immobilisierungs- und Regenerationsbedingungen optimiert. Anschließend wurde überprüft, ob Antigen und Antikörper unter den gewählten Versuchsbedingungen noch miteinander interagieren konnten und die Wechselwirkung zwischen beiden Proteinen nicht beeinträchtig wurde. Hauptziel des SPR-Assays war die Überprüfung der Bindeaktivität verschiedener Chargen des Antikörpers im Vergleich zu einer Referenz-Charge unter Berücksichtigung eines möglichen Einflusses der Lagerzeit. Als Ergebnis konnte zwar eine geringe Abnahme der Bindungsaktivität beobachtet werden, welche eindeutig mit der Lagerzeit korrelierte, ein signifikanter Unterschied zwischen den zu vergleichenden Chargen war jedoch nicht erkennbar.
Der weitaus größere Teil der in dieser Dissertation beschriebenen Ergebnisse betrifft die Konzeption neuer Protein-Chip-Architekturen. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe um Armin Gölzhäuser von der Universität Bielefeld wurde eine Protein-Chip-Plattform erarbeitet, für deren Herstellung Nitrobiphenyl-(NBPT)-Monolagen auf Gold mit Hilfe chemischer Lithographie im Mikro bzw. Nanomaßstab strukturiert wurden. Die Strukturen wurden anschließend mit multivalenten NTA-Verbindungen funktionalisiert, sodass Proteine mit His-Tag spezifisch darauf verankert werden konnten. Die wichtigsten Vorteile dieses Systems sind eine hohe Bindungsstabilität der immobilisierten Proteine, eine aufgrund der weiten Verbreitung des His-NTA-Systems leichte Verfügbarkeit His-getaggter Proteine sowie die Erhaltung ihres nativen Zustandes bei gleichzeitig uniformer Orientierung auf der Substratoberfläche. Nachdem zunächst die grundsätzliche Machbarkeit der Strukturierung und Funktionalisierung gezeigt wurde, folgte eine eingehende Charakterisierung der einzelnen Fertigungsschritte per Rasterkraftmikroskopie (AFM) und SPR-Spektroskopie, um diese anschließend weiter zu optimieren. So konnte die Proteinresistenz in den Bereichen zwischen den Mikro- bzw. Nanostrukturen, in denen keine Proteine binden sollten, deutlich verbessert werden. Zusätzlich wurde die Effizienz der Oberflächenfunktionalisierung gesteigert, sodass eine höhere Immobilisierungsdichte möglich war. Die Funktionalität des verbesserten Protein-Chips wurde mittels AFM und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) überprüft. Es konnte eine hochspezifische und stabile, aber gleichzeitig reversible Bindung His-getaggter Proteine auf dem Protein-Chip gezeigt werden. Die bis dahin nass-chemisch durchgeführten Fertigungsschritte wurden in der Folge ins Hochvakuum übertragen, um die Herstellung dieser Protein-Chips mittels Gasphasenabscheidung zu ermöglichen. Als Ergebnis dieser Arbeiten konnten proteinresistente EG3-Monolagen allein durch Gasphasendeposition generiert werden. Bis auf die Funktionalisierung mit trisNTAs konnten im Rahmen dieser Arbeit sämtliche Fertigungsschritte in die Gasphase übertragen werden. Protein-Chips, die auf diese Art hergestellt worden waren, hatten in Hinsicht auf Bindungsspezifität und -stabilität ebenso gute Eigenschaften wie Protein-Chips aus der klassischen nass-chemischen Fertigung. Zusätzlich wurde parallel zu diesen Arbeiten ein neuer Ansatz zur Strukturierung und trisNTA-Funktionalisierung von EG3-SAMs erarbeitet.
Ein zweiter Protein-Chip-Prototyp sollte durch orthogonale Funktionalisierung von nano-strukturierten Glasoberflächen mit Polyenthylenglykol (PEG) und multivalenten Chelatoren hergestellt werden. CLSM-Untersuchten ergaben zunächst, dass dieser Ansatz der orthogonalen Funktionalisierung nicht gelang, da auf den Goldstrukturen nur wenig Protein zu binden schien, während in den vermeintlich proteinresistenten PEG-Bereichen eine vergleichsweise große Menge His-getaggter Proteine adsorbierte. Nach einer Reihe von Versuchen stand fest, dass sich die Verfahren zur Funktionalisierung mit PEG und bisNTA-Thiolen gegenseitig störten. Die PEGylierung verhinderte die anschließende Ausbildung einer dicht-gepackten bisNTA-SAM, was zwar durch vorheriges Aufbringen einer Schutz-SAM aus Undecylthiolen gemildert, aber nicht vollständig verhindert werden konnte. Die anschließende Funktionalisierung der Nanostrukturen mit bisNTA-Thiolen führte wiederum zur Dotierung der PEG-Schicht mit bisNTA-Thiolen, sodass diese Schicht ihre Proteinresistenz verlor. Da dieser ungewollte Prozess seine Ursache in der zweistufigen PEGylierungsreaktion hatte und dieser auch durch verschiedenste Block-Verfahren nicht vollständig verhindert werden konnte, wurde ein alternatives, einstufiges PEGylierungsverfahren getestet. Dieses hatte eine deutliche Verbesserung der Oberflächeneigenschaften zur Folge. Einerseits zeigten die Glasbereiche nun eine sehr gute Proteinresistenz, zum Anderen hatte das neue PEGylierungsverfahren keine negativen Auswirkungen auf die Ausbildung von bisNTA-SAMs. Mittels CLSM konnte auf Mikrostrukturen eine hochspezifische Proteinbindung beobachtet werden, während die PEGylierten Glasbereiche frei von Proteinen blieben. Interessanterweise konnte auf entsprechend funktionalisierten Nanostrukturen jedoch keine Proteinbindung nachgewiesen werden. Hierfür sind mehrere Ursachen denkbar, zu deren Klärung es weiterer Untersuchungen bedarf.