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Bioaktive Sphingolipide spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation vieler entscheidender Prozesse in Endothelzellen. Speziell dem S1P wird eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Proliferation und Migration von Endothelzellen beigemessen. Diese Prozesse sind notwendige Teilschritte in der Angiogenese, welche eine wichtige biologische und medizinische Bedeutung hat. So ist die umorangiogenese eine Voraussetzung für die adäquate Versorgung des Tumors mit Sauerstoff und Nährstoffen und trägt des Weiteren zu dessen Aggressivität bei. Ein weiteres Merkmal vieler solider Tumoren ist das Vorkommen hypoxischer Bereiche und erhöhter NO-Spiegel, die zudem, je nach Konzentration, als proangiogene Faktoren wirken können. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung des Einflusses hypoxischer Bedingungen und des Signalmoleküls NO auf das Sphingolipidgleichgewicht in der humanen Endothelzelllinie EA.hy 926. Ein spezieller Fokus wurde dabei auf die Regulation der S1P synthetisierenden Sphingosinkinasen (SK) und der daraus resultierenden Beeinflussung angiogener Zellantworten gelegt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl Hypoxie als auch NO die Aktivität der SK-1, jedoch nicht der SK-2, langanhaltend erhöhten. Dieser Aktivitätsanstieg wurde durch eine Aktivierung des SK-1-Promotors mit einer nachfolgenden verstärkten mRNA- und Proteinexpression vermittelt. Dabei war unter Hypoxie der Transkriptionsfaktor HIF-1α der entscheidende SK-1 regulierende Faktor. Zusätzlich führte die durch Hypoxie ausgelöste Hochregulation der SK-1 zu einem Anstieg der zellulären S1P-Spiegel und zu einer Reduktion der Sphingosinkonzentration. Mechanistische Untersuchungen des Effekts von NO auf die SK-1 zeigten, dass dieser unabhängig von erhöhten cGMP-Konzentrationen aufgrund einer Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) durch NO war. Zum einen hatte die Verwendung des cGMP-Analogons 8-Bromo-cGMP und des Aktivators der sGC YC-1 keinen Einfluss auf die SK-1-Proteinexpression, und zum anderen hatte die Kostimulation mit dem sGC-Inhibitor ODQ keinen hemmenden Effekt auf die durch NO ausgelöste Hochregulation der SK-1. Demgegenüber ist die klassische MAPK-Kaskade essenziell für die Wirkung von NO auf die SK-1, da der MEK-Inhibitor U0126 die erhöhte Proteinexpression der SK-1 verhindern konnte. Die Aktivierung des vorgeschalteten kleinen GTP-bindenden Proteins p21ras ist ein möglicher Mechanismus, über den NO die Aktivierung der MAPKKaskade verursachen könnte (Lander et al, 1995). In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die funktionelle Konsequenz einer Regulation der SK-1 durch Hypoxie und NO in EA.hy 926 Zellen untersucht. Sowohl Hypoxie als auch NO wurden als pro-angiogene Faktoren beschrieben. Daher wurde anhand von Migrationsassays und in-vitro-Angiogeneseassays untersucht, ob die SK-1 bei diesen Zellantworten eine Rolle spielt. Die Depletion der SK-1 durch die Verwendung einer spezifischen siRNA oder mit Hilfe von lentiviralen shRNA-Konstrukten zeigte, dass die Hochregulation der SK-1 unter Hypoxie und NO essenziell für die erhöhte Migration der Endothelzellen ist. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass hypoxische Bedingungen und NO zu einer Hochregulation der SK-1 in EA.hy 926 Zellen führten und eine erhöhte Migrationsrate dieser Zellen zur Folge hatten. Somit ist die SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer pathologischen Angiogenese einhergehen, wie es im Tumorgeschehen der Fall ist.
Das Burkitt Lymphom ist ein aggressives B-Zelllymphom, das in tropischen Regionen Afrikas und in Neu Guinea endemisch auftritt und vor allem bei Kindern vorkommt. Die sporadische Form des Burkitt Lymphoms tritt weltweit in geringerer Häufigkeit auf und betrifft alle Altersschichten. In nahezu allen endemischen Fällen ist das Epstein-Barr Virus in den Tumorzellen nachweisbar, jedoch nur in ca. 20 % der sporadischen Fälle. Der Beitrag von EBV zur Entstehung EBV-positiver Burkitt Lymphome ist seit über 50 Jahren EBV-Forschung ungeklärt. Im Jahr 2004 wurden im Genom des Epstein-Barr Virus eine Reihe von microRNAs entdeckt, die potentiell für die Pathogenese des EBV-positiven Burkitt Lymphoms relevant sein könnten. Da die Expression der viralen microRNAs seither für das Burkitt Lymphom nur unvollständig beschrieben worden sind, wurden sie in dieser Arbeit systematisch analysiert und dadurch ein vollständiges Expressionsprofil erstellt. Es konnte dabei keine Unterscheidung zwischen endemischen und sporadischen Fällen erreicht werden, jedoch wurden hierbei erstmals Fälle identifiziert, die trotz nachgewiesener EBV-Assoziation keine viralen microRNAs enthielten. Neben den viralen microRNAs könnten im Burkitt Lymphom auch die zellulären microRNAs für die Tumorentstehung von Bedeutung sein. Deshalb wurde in dieser Arbeit auch die Expression der zellulären microRNAs aus Burkitt Lymphom-Biopsien charakterisiert. Durch hierarchisches „Clustering“ bildeten sich drei Gruppen, die hauptsächlich durch An- und Abwesenheit von zwei microRNAs (miR21 und miR92a) definiert wurden, denen onkogenes Potential zugeschrieben wird. Die Expressionsmuster der einzelnen Gruppen weisen auf zelluläre Mechanismen der Pathogenese des Burkitt Lymphoms hin.
Die genetische Charakteristik des Burkitt Lymphoms ist eine Chromosomentranslokation, welche das Protoonkogen c MYC unter die Kontrolle von regulatorischen Elementen der Immunglobulingene bringt. Durch die somit erhöhte Transkription von c-MYC entfaltet das Genprodukt sein onkogenes Potential. Mutationen im offenen Leserahmen können dieses Potential zusätzlich verstärken. Da c MYC ein pleiotroper Transkriptionsfaktor ist und somit auf eine ganze Reihe zellulärer Prozesse Einfluss hat, bewirkt die Translokation massive Veränderungen in der Zelle. Vorangegangene Untersuchungen der Arbeitsgruppe zeigten, dass die antivirale Interferonantwort durch hohe c MYC-Expression unterdrückt wird. Diese Beobachtung liefert eine mögliche Erklärung für die Immunevasion von Burkitt Lymphom-Zellen, trotz Anwesenheit des EBV-Genoms. In Zelllinien, die aus Burkitt Lymphom-Biopsien generiert wurden, konnte gezeigt werden, dass EBV eine Interferoninduktion auslöst, die durch c-MYC unterdrückt wird. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass Epstein-Barr-virale Nukleinsäureprodukte durch den zytosolischen Rezeptor RIG-I Interferon induzieren, dieser aber durch die hohe c-MYC-Expression transkriptionell gehemmt wird. Neben RIG-I wurden weitere Rezeptoren und Mediatoren der Interferoninduktionskaskade identifiziert, die ebenfalls transkriptionell von c-MYC unterdrückt werden. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass c-MYC durch Unterdrückung der angeborenen Immunität die Immunevasion von Burkitt Lymphom-Zellen ermöglicht.
Das sympathische Nervensystem entsteht aus Vorläuferzellen der Neuralleiste, die an die dorsalen Aorta gelangen und dort die primären sympathischen Ganglien bilden. Der Entwicklungsverlauf dieser Zellen hängt von den Signalen ab, welche sie während ihrer Wanderung empfangen. Die Differenzierung der Vorläuferzellen wird an der dorsalen Aorta angeregt. Als Signalmoleküle dienen die BMPs, die von der dorsalen Aorta gebildet und sezerniert werden. Die BMPs induzieren in den Vorläuferzellen die Expression der Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, die notwendig für den weiteren Differenzierungsprozess sind. Diese Transkriptionsfaktoren steuern direkt oder indirekt die Expression der terminalen Differenzierungsgene TH, DBH, SCG10 und NF160. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Zink-Finger-Transkriptionsfaktoren Gata2 und Gata3 ebenfalls eine essentielle Funktion in der Entwicklung sympathischer Neurone ausüben. Im Huhnembryo wird, im Gegensatz zur Situation in der Maus, in den sympathischen Vorläuferzellen nur Gata2 exprimiert. Gata2 wird nach den Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, jedoch vor den noradrenergen Markergenen TH und DBH exprimiert. Die Expression von Gata2 ist BMP-abhängig, wie durch BMPÜberexpression und BMP-Funktionsblockierung gezeigt wird. Die Überexpression von Mash1, Phox2b und Hand2 in Vorläuferzellen führt zur Expression von Gata2. In der Phox2b-Nullmutante sind Gata2 und Gata3 nicht exprimiert. Damit ist Gata2/3 unterhalb von Mash1, Phox2b und Hand2 in der BMP-induzieren Signalkaskade einzuordnen. Die Funktionsblockierung von Gata2 im Huhnembryo und die Eliminierung des Gata3-Gens in der Maus ergaben eine starke Reduktion in der Größe der sympathischen Ganglien. Zusätzlich war die Expression des noradrenergen Markergens TH stark reduziert. Die Überexpression von Gata2 in Neuralleistenvorläuferzellen führt vorwiegend zur Entstehung von Neuronen, die keine autonomen Eigenschaften aufweisen und TH-, Phox2b- und Mash1-negativ sind. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Gata2 im Huhn und Gata3 in der Maus Mitglieder des regulatorischen Netzwerks von Transkriptionsfaktoren sind, das essentiell für die Entwicklung sympathischer Neurone ist. Die Funktion der Gata-Faktoren in der noradrenergen Differenzierung autonomer sympathischer Neurone scheint jedoch von der Interaktion mit Koregulatoren abhängig zu sein, die in sympathischen Vorläuferzellen vorhanden sind. In Vorläuferzellen, welche diese Kofaktoren nicht erhalten, induziert Gata2 nahezu ausschließlich nicht-adrenerge Neurone. Gata2 könnte mit Phox2a/b und Hand2 interagieren, oder mit anderen unbekannten Faktoren die in den sympathischen Vorläuferzellen exprimiert sind. Die Entwicklung sympathischer und parasympathischer Neurone wird von BMPs sowie von den Transkriptionsfaktoren Mash1 und Phox2b gesteuert. Der Differenzierungsprozess in sympathischen und parasympathischen Ganglien führt zu unterschiedlichen Transmitterphänotypen. Sympathische Ganglien bestehen vorwiegend aus noradrenergen, parasympathische Ganglien dagegen aus cholinergen Neuronen. Hand2 wird in sympathischen Neuronen und nicht in parasympathischen Ziliarneuronen exprimiert und gilt als Transkriptionsfaktor der den noradrenergen Transmitterphänotyp spezifiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass auch die Transkriptionsfaktoren Gata2/3 nicht in parasympathischen Ziliarganglien exprimiert werden. Die Expressionsanalysen an mehreren parasympathischen Ganglien zeigte jedoch, dass die Expression von Gata2/3- nicht vollständig mit der noradrenergen Genexpression korreliert. Die Analyse der Gata2/3- Expression im Locus ceoruleus, dem wichtigsten noradrenergen Zentrum im Gehirn ergab, dass Gata2 und Gata3 im LC des Huhnembryos nicht exprimiert werden. Die Expression von Gata2/3 hängt somit nicht zwingend mit den noradrenergen Phänotyp zusammen. Die selektive Funktion von Gata2/3 in der Entwicklung peripherer noradrenerger Neurone zeigt zudem, dass der noradrenerge Phänotyp in den peripheren und zentralen Neuronen unterschiedlich reguliert wird.
Die noradrenergen Neurone der sympathischen Ganglien und die cholinergen Neurone der parasympathischen Ziliarganglien gehen aus den NLZ hervor. BMP-Signale induzieren die Differenzierung beider Neuronentypen, die mit der Expression von Ascl1 und Phox2a/b beginnt. Im Fall der sympathischen Ganglien werden dann Hand2 und GATA2/3 exprimiert, was wiederum zur Expression der noradrenergen Marker TH und DBH führt, die auch in differenzierten Neuronen weiterhin vorhanden sind. Im Gegensatz dazu werden während der Entwicklung der parasympathischen Ziliarneurone sowohl Hand2 als auch TH/DBH nur transient exprimiert, die differenzierten Neurone besitzen zum Großteil einen cholinergen Phänotyp (Goridis und Rohrer, 2002; Müller und Rohrer, 2002).
Thema dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der Hox-Gene bei der Differenzierung des PNS. 14 der analysierten Hox-Gene werden in den sympathischen Ganglien exprimiert, wobei wir uns bei der näheren Analyse auf das HoxB-Cluster beschränkt haben. HoxB5, HoxB6, HoxB7, HoxB8 und HoxB9 werden zwischen E4 und E7 in den sympathischen und sensorischen Ganglien exprimiert, wobei nur HoxB8 und HoxB9 eine deutliche Expression in den sympathischen Ganglien zeigen. Die HoxB-Gene könnten dem Expressionsmuster nach also eine Rolle bei der frühen Entwicklung und auch bei der Aufrechterhaltung des noradrenergen Phänotyps der sympathischen Ganglien spielen.
Die differenzielle Expression der HoxB-Gene in den sympathischen Neuronen und den Ziliarneuronen und ihre mögliche Beteiligung bei der Aufrechterhaltung des noradrenergen Charakters waren Ausgangspunkt für die ektopische Expression eines Vertreters des HoxB-Clusters, HoxB8, in den Ziliarganglien. In der Normalentwicklung wird die Expression von Hand2, TH und DBH nach E4 in den Ziliarneuronen stark reduziert (Abb. 22A). Wird HoxB8 in den Vorläuferzellen der Ziliarneurone in vivo überexprimiert, wird die Hand2-, TH- und DBH-Expression weit über E4 hinaus, bis mindestens E8 auf einem signifikant höheren Niveau gehalten (Abb. 22B). HoxB8 kann diesen Effekt allerdings nur ausüben, wenn es in den noch undifferenzierten Vorläuferzellen exprimiert wird. Die HoxB8-Überexpression in Primärkulturen von Ziliarneuronen an E5 oder E8 führt nur noch zu einem Anstieg der Hand2-Expression, hat aber keinen Einfluss mehr auf die noradrenerge Genexpression (Abb. 22B).
HoxB8 zeigt zusätzlich im Vergleich mit den anderen analysierten Hox-Genen einen spezifischen Effekt auf die Hand2-, TH- und DBH-Expression, denn sowohl das paraloge Hox-Gen HoxC8 als auch das anterior-exprimierte HoxB-Gen HoxB1 erreichen nur an E5 eine signifikante Expression der drei Gene. Weder HoxC8 noch HoxB1 können die Expression von Hand2 und TH/DBH über E5 hinaus aufrechterhalten (Abb. 22C), während HoxB8 deren Expression auch noch an E8 auf einem hohen Niveau halten kann.
Die HoxB8-vermittelte Aufrechterhaltung der TH- und DBH-Expression in den Ziliarneuronen konnte allerdings nicht in einen direkten Zusammenhang mit der erhöhten Hand2-Expression gebracht werden, da die Überexpression von Hand2 nicht zu einer Aufrechterhaltung von TH und DBH an E5 und E6 führt (Abb. 22C).
Die Effekte von HoxB8 auf die Entwicklung der Ziliarneurone, die durch HoxB8 z.T. noradrenerge, sympathische Eigenschaften annehmen, unterstützen die Vorstellung, dass HoxB8 bei der Differenzierung und Ausbildung des noradrenergen Phänotyps in sympathischen Ganglien eine Rolle spielt. Es konnte also erstmals einem Vertreter der Hox-Gen-Familie eine mögliche Funktion bei der Differenzierung autonomer Neurone zugeordnet werden.
Die Chemokinrezeptoren CXCR3 und CXCR4 sowie deren spezifische Liganden, CXCL9, -10 und -11 bzw. CXCL12, sind in bedeutender Weise an den pathologischen Prozessen der Th1-/Th17-vermittelten (Typ1- und Typ17-T-Helferzelle) Autoimmunerkrankungen beteiligt. Die dabei auftretenden chronischen Entzündungen sind gekennzeichnet durch eine massive Infiltration von Th1-Gedächtniszellen. Ergebnisse sowohl von tierexperimentellen Studien als auch von in vitro Experimenten weisen deutlich auf eine spezifische Wechselwirkung zwischen den proentzündlichen CXCR3- und dem homöostatischen CXCR4-Liganden hin. Weiterführenden Ergebnisse zu der molekularen Wechselwirkung von CXCR3 und -4 wurden jedoch bislang nicht veröffentlicht. Die Untersuchungen dieser Dissertation konzentrierten sich auf die Kooperation der beiden Chemokinrezeptoren in murinen Th1-Gedächtniszellen. Dabei sollte insbesondere der potentielle Einfluss dieser Interaktion auf die einzelnen Teilprozesse der Extravasation der T-Lymphozyten in vitro analysiert werden. Eingesetzt wurden hierfür statische Chemotaxis- und dynamische Flusskammerexperimente, die zum einen sensitiv genug und zum anderen für einen hohen Probendurchsatz geeignet sein mussten. Die verwendeten Techniken wurden dazu im Rahmen der Dissertation etabliert und validiert. Zunächst musste die Präzision des statischen Migrationssytems mit einer hohen Standardabweichung von durchschnittlich ± 40% deutlich verbessert werden. Ein Wechsel auf ein Kammersystem der Firma Corning verringerte die Abweichung auf ± 25%, und sogar auf ± 9,9% bei einer optimierten Auswertung mittels Durchflusszytometrie. Als weitere Methode wurde ein dynamisches Flusskammersystem mit automatischer Videoanalyse zur Bestimmung der Geschwindigkeit von Zellen etabliert. Zur Validierung der neu entwickelten Analysesoftware Imagoquant® wurden identische Filmaufnahmen von Flusskammerexperimenten hinsichtlich Zellrollen und Zellgeschwindigkeit ausgewertet und mit den Ergebnissen von zwei etablierten Methoden, der Handzählung und einem halbautomatischen Tracking-Programm, verglichen. In der gesamten Validierung stimmten die Berechnungen von Imagoquant® mit Ergebnissen der verschiedenen Auswertemethoden qualitativ überein, wobei die Filme um ein Vielfaches (16- bzw. 20-fach) schneller analysiert werden konnten als mit den bisher verwendeten Methoden. Somit konnte erfolgreich eine computergestützte Analysemethode validiert und etabliert werden, die schnell und benutzerunabhängig arbeitet und folglich objektive Daten im Hochdurchsatz generiert. Die Untersuchungen in den statischen und dynamischen Migrationssystemen ergaben, dass die Stimulation von Th1-Zellen mit CXCL9 zu einer heterologen Desensitivierung verschiedener CXCL12-vermittelter Effekte führt. In statischen Migrationsexperimenten wurde sowohl durch eine synchrone als auch eine sequentielle Stimulation mit CXCL9 eine CXCL12-vermittelte Chemotaxis signifikant vermindert. Der auftretende Effekt war dabei lang anhaltend und konnte noch bei einer Stimulationsdauer von 20 h beobachtet werden, ohne an Intensität zu verlieren. Weitere funktionelle Experimente erfolgten in dynamischen Flusskammerexperimenten, um die desensitivierende Wirkung von CXCL9 auf CXCL12-abhängige Interaktionen der Adhäsionskaskade von Th1-Zellen zu untersuchen. In mit E-Selektin und ICAM-1 Fc-Chimära) beschichteten Flusskammern führte immobilisiertes CXCL12 zu vermehrtem integrinabhängigen Rollen, welches durch eine Vorinkubation der Th1-Zellen mit CXCL9 reduziert wurde. In Flusskammern mit murinen Endothelzellen bewirkte immobilisiertes CXCL12 eine rasche integrinabhängige Adhäsion der Zellen und verkürzte dadurch deren Rollphase signifikant. Eine Vorbehandlung der Zellen mit CXCL9 verminderte dagegen die CXCL12-vermittelte Adhäsion und führte damit zu längeren Rollphasen. Deutliche Effekte zeigte CXCL12 bezüglich einer gesteigerten intravasalen und transendothelialen Migrationsrate von T-Lymphozyten, die durch eine Vorstimulation mit CXCL9 aufgehoben wurden. Um die beteiligten Mechanismen dieser Desensitivierung zu entschlüsseln, wurde die Oberflächenexpression von CXCR3 und CXCR4 in dem Th1-Zellklon durchflusszytometrisch analysiert. Dabei zeigte sich, dass eine Stimulation mit CXCL9 neben der ligandenspezifischen Internalisierung von CXCR3 auch eine Kreuzregulation der CXCR4-Oberflächenexpression bewirkte. Im Weiteren wurde die Phosphorylierung bekannter Signalmoleküle der CXCR4-Signalwege analysiert. Eine Vorbehandlung der Zellen mit CXCL9 desensitivierte die CXCL12-induzierte Phosphorylierung von Akt signifikant und führte zu einer zeitlichen Modulation des Signals. Ferner verzögerte eine Vorbehandlung der Th1-Zellen mit CXCL9 das CXCL12-induzierte Calciumsignal erheblich, während dabei eine 3,5-fach höhere maximale Ca2+-Konzentration gemessen wurde. Ein abgeleiteter Mechanismus der CXCL9-abhängigen Desensitivierung von CXCR4-Signalwegen beeinflusst insbesondere die Signaltransduktion über den T-Zellrezeptor und dadurch auch die Regulation von Rac1. Des Weiteren führt CXCL9 zur Gi- oder ZAP-70-vermittelten Aktivierung der PKC, welche darauffolgend den CXCR4-Rezeptor phosphoryliert und damit zu dessen Internalisierung führt. Die in vitro beobachtete Desensitivierung verschiedener CXCL12/CXCR4-vermittelter Effekte durch CXCL9 wirkt potentiell in der in vivo Situation von Autoimmunerkrankungen auf unterschiedliche Weise proinflammatorisch. Zum einen wird die Mobilisierung von Th1-Zellen aus CXCL12 exprimierenden peripheren Gewebe gefördert und gleichzeitig verhindert, dass Th1-Zellen in nicht entzündetes peripheres Gewebe rekrutiert werden. Zum anderen wird im Entzündungsgebiet die Affinität der Th1-Zellen zu den CXCL12-exprimierenden Endothelzellen verringert und die Migration in tieferliegende Gebiete der Entzündung begünstigt. Ferner vermindern CXCR3-Liganden auch antiinflammatorische Effekte des CXCL12s, wie z.B. die Polarisierung der Th1-Zellen in regulatorische T-Zellen.
Die vorliegende Dissertation hatte das Ziel molekulare Mechanismen der Präeklampsieerkrankung aufzuklären. Bei PE handelt es sich um eine schwangerschaftsassoziierte Krankheit, die in 3 bis 5 % aller Schwangerschaften auftritt und eine der Hauptursachen für maternale und fetale Mortalität und Morbidität ist. Zudem haben PE-Patientinnen und ihre Kinder im späteren Leben ein erhöhtes Risiko für die Ausbildung kardiovaskulärer und hypertensiver Erkrankungen. Trotz langer und intensiver Forschung konnte die komplexe Pathogenese von PE noch nicht aufgeklärt werden. Im Rahmen der Promotion sollten neue Gene in der präeklamptischen Plazenta identifiziert und ihre Funktionen im Pathogeneseprozess der Krankheit untersucht werden. Dabei war es wichtig die Zusammenhänge der gestörten Prozesse zu verstehen um Mutter und Kind vor schwerwiegenden und langfristigen Folgeerscheinungen von PE zu schützen.
Mit dem durchgeführten Gen-Array konnte gezeigt werden, dass bei PE die Expression einiger Gene der Angiogenese-, der Invasions- sowie der Migrationsregulation verändert waren. Zudem konnten anhand von Deregulationen bei der SURVIVIN und BCL6 Expression zwei weitere Gene identifiziert werden, deren Funktionen in der präeklamptischen Plazenta bislang unbekannt waren.
Bei PE kam es im Vergleich zur gesunden Kontrolle zu einer verringerten Genexpression von SURVIVIN. Eine Veränderung des Proteinlevels konnte jedoch nicht festgestellt werden. Die Analyse der Survivin Funktionen zeigte, dass die Zellen der präeklamptischen Plazenta, die konstantem zellulärem Stress ausgesetzt sind, versuchen durch Aktivierung aller Überlebensmechanismen, wie einer Stabilisierung des anti-apoptotischen Proteins Survivin, ihr Überleben zu sichern und somit die Funktionalität des ganzen Organs zu gewährleisten. Als multifunktionelles Protein ist Survivin bislang vor allem als Apoptose-Inhibitor sowie als Partner des CPC mit Funktionen bei der Zellteilung bekannt. Die Untersuchungen ergaben, dass Survivin auch in Trophoblastenzellen für den einwandfreien Ablauf der Mitose verantwortlich ist, da es bei einer Depletion zu einem G2/M Arrest der Zellen sowie einer erhöhten Rate an Centrosomen Abberationen und congression Fehlern kam. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass die Stabilisierung von Survivin bei Präeklampsie der Kompensation der gestörten Trophoblastenfunktionen dient indem die vermehrte Apoptose der Zellen verhindert und die Proliferation der Trophoblasten präzise gesteuert wird.
Im Rahmen der Dissertation wurden zudem die Funktionen von BCL6 bei Präeklampsie untersucht. BCL6 ist vorrangig durch seine Rolle bei der B-Zell Reifung und der T-Zell Regulation sowie als Onkogen bei B-Zell Lymphomen und auch bei Mammakarzinomen bekannt. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl die Gen-, wie auch Proteinexpression von BCL6 in der präeklamptischen Plazenta erhöht sind. Bei einer Depletion von BCL6 kam es zu verminderter Proliferation der Trophoblasten mit G2/M Arrest und vermehrter Apoptose sowie reduzierter Invasions- und Migrationsfähigkeit. Eine erhöhte BCL6 Expression führte zu einer verminderten Expression der Fusionsregulatoren Syncytin 2, β-hCG und GCM1, woraus eine gestörte, reduzierte Fusionsfähigkeit der Trophoblasten resultierte. Dies bedeutet, dass die Expression von BCL6 präzise reguliert werden muss um die Trophoblasten zu Beginn der Schwangerschaft vor Apoptose und Zellzyklusarrest zu schützen und somit die Invasion und Plazentation zu ermöglichen. Kommt es im weiteren Verlauf zu einer Deregulation mit erhöhter BCL6 Expression, so resultiert daraus eine verminderte Trophoblastenfusion und Präeklampsie.
Zusammenfassend belegt die Arbeit, dass mit Survivin und BCL6 zwei weitere Regulatoren der PE-Pathogenese identifiziert und charakterisiert wurden. Im Rahmen der Promotion konnten die Funktionen bei der Regulation von Zellzyklus, Apoptose sowie Trophoblastenfusion und –invasion dargestellt werden. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig um die Rolle von Survivin und BCL6 im ersten Schwangerschaftstrimester aufzuklären. Aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei PE stellen Survivin und BCL6 neue Möglichkeiten zur Entwicklung von Therapieansätzen sowie zur Identifizierung prognostischer Marker für die Präeklampsieerkrankung dar.
Survivin wird in einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert, während es in normalem Gewebe bis auf einige Ausnahmen kaum detektierbar ist. In den Krebszellen vermittelt Survivin eine erhöhte Resistenz gegenüber der Apoptose-Induktion, was eine Therapie jedoch meist bezweckt. Durch sein differenzielles Expressionsprofil wird Survivin mittlerweile als ein interessanter Angriffspunkt in der Entwicklung einer neuen, zielgerichteten Behandlung von Krebs betrachtet. Aus diesem Grund wurde zu Beginn der vorliegenden Arbeit die Eignung des anti-apoptotischen und Zellzyklus-regulierenden Proteins Survivin als Zielstruktur für eine Krebstherapie im Vergleich zu den veröffentlichten Publikationen verifiziert. Die Analyse der Survivin-Expression in unterschiedlichen Zelllinien ergab, dass sich in Tumorzellen eine charakteristische Überexpression des Survivin-Proteins zeigte im Vergleich zu gesunden, nicht-transformierten Zelllinien. Eine Inhibition der Survivin-Proteinexpression wurde mittels der Methode der RNA-Interferenz erzielt, bei der die Zielzellen mit shRNA-kodierenden Lentiviren infiziert wurden, welche eine gegen die Survivin-mRNA gerichtete Sequenz beinhalteten. Während Survivin-positive Tumorzelllinien und gesunde Endothelzellen eine starke Reduktion in der Lebend-Zellzahl in vitro aufwiesen, waren die Survivin-negativen Kontrollzelllinien von einem Verlust der Survivin-Expression nicht beeinträchtigt. Anschließend erfolgten eine Analyse der Survivin-Abhängigkeit etablierter Tumorzelllinien und die Untersuchung eines Survivin-Verlusts auf die murine Brustdrüsenentwicklung in vivo. Bei einer Inhibition der Survivin-Expression in Krebszellen in einem Transplanationsmodell konnte ein deutlich verzögertes Tumorwachstum beobachtet werden. Dagegen hatte Survivin in der Entwicklung der murinen Brustdrüse keinen Einfluss auf die Rekonstitution des Gewebes und die Proliferation bzw. Differenzierung der Brustepithelzellen. Um einen direkten protein-basierenden Inhibitor des Survivin-Proteins zu entwickeln und das Repertoire an allgemeinen Survivin-Interventionsstrategien zu erweitern, wurde im zweiten Teil der Arbeit mittels des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems ein neues Survivin-bindendes Protein isoliert. Nach dem Optimierungsprozess bestehend aus einer Fusion mit einem Trägerprotein zur erleichterten Proteinexpression, der Mutagenese eines Cysteins gegen Serin und der Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne konnte das Protein rekombinant in Bakterien hergestellt und durch Affinitätschromatographie in monomerer Form aufgereinigt werden. Anschließend wurde der Einfluss des artifiziellen, rekombinanten Survivin-inhibierenden Proteins (rSip) auf die Funktionen von Survivin bestimmt. rSip zeigte eine Stabilität von bis zu 14 Stunden im Zellkulturmedium und konnte durch seine C-terminale Proteintransduktionsdomäne in das Zytoplasma der Zielzellen aufgenommen werden. In einer Co-Immunpäzipitation konnte die Bindung von rSip an endogenes Survivin bestätigt werden. In Brustkrebszellen führte rSip in einer Konzentration von 1,5 µM zu einem schnellen Verlust des Survivin-Proteins, was möglicherweise auf eine proteosomale Degradation von Survivin zurückzuführen war. Die Analyse der Konsequenzen einer rSip-Behandlung auf die Funktionen von Survivin in der Apoptose-Inhibition und der Zellzyklus-Progression wurde im letzten Abschnitt der Arbeit durchgeführt. Eine viertägige Inkubation mit 1,5 µM rSip bewirkte eine deutliche Reduktion der Lebend-Zellzahl von bis zu 50% im Falle der Survivin-abhängigen Krebszelllinien. Bei den Survivin-negativen Zelllinien trat dagegen kein veränderter Phänotyp auf. Durch einen TUNEL-Test in Brustkrebszellen konnte gezeigt werden, dass die Ursache für die Abnahme der Zellzahl die Apoptose-Induktion durch rSip ist. In den Zellzyklus-Profilen von rSip-behandelten Krebszellen konnte ebenfalls ein starker Anstieg in der apoptotischen Zell-Population beobachtet werden. Abschließend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Arbeit neben der Methode der lentiviralen Applikation von Survivin-spezifischen shRNA-Sequenzen eine neue Möglichkeit der Interferenz mit der Survivin-Funktion in Krebszellen vorgestellt wurde. Die Entwicklung des Survivin-inhibierenden Proteins rSip steht zugegebenermaßen erst am Anfang. Die ersten hier präsentierten Ergebnisse zeigen jedoch klar ein Potential dieses vielversprechenden direkten Survivin-Inhibitors als ergänzende Wirkstoffklasse auf dem Gebiet der therapeutischen Proteine zu den bereits existierenden niedermolekularen Substanzen bzw. antisense-Oligonukleotiden, die auf Ebene der Transkription bzw. der Translation von Survivin wirken.
Die paravertebralen Grenzstränge entwickeln sich aus Neuralleistenzellen des Rumpf- und Lendenbereichs. Diese sammeln sich im Hühnerembryo an Embryonaltag 2,5-3 an der dorsalen Aorta und formen die primären sympathischen Ganglien. Die dorsale Aorta sezerniert Morphogene, welche einen Teil der Vorläuferzellen zur Differenzierung zu Neuroblasten anregt. Die sympathischen Neuroblasten sind, obgleich sie bereits neurale und noradrenerge Marker exprimieren, zur Zellteilung fähig. Sie unterscheiden sich darin von anderen Neuralleistenderivaten wie beispielsweise den Neuronen der parasympathischen Ziliarganglien und der sensorischen Hinterwurzelganglien. Schließlich wandern die primären sympathischen Ganglien weiter und bilden lateral zum Notochord die paravertebralen Grenzstränge (Rohrer, 2011).
Der Homöodomänen-Transkriptionsfaktor PROX1 wird im Laufe der Entwicklung höherer Vertebraten in vielen Geweben exprimiert. Welche Wirkung PROX1 dabei auf Überleben, Migration, Proliferation und Differenzierung hat, hängt davon ab, in welchem Zelltyp er aktiv ist (Dyer et al., 2003; Lavado et al., 2010). Im peripheren Nervensystem konnte PROX1 embryonal in den Hinterwurzelganglien und den sympathischen Ganglien nachgewiesen werden (Becker et al., 2009; Diplomarbeit Julia Holzmann, 2010). Zielsetzung dieser Dissertation war es, die Expression und die Funktion von PROX1 in sympathischen Ganglien von Hühnerembryonen zu analysieren.
Die Expressionsanalyse von PROX1 zeigte, dass der Anteil der PROX1-positiven Neurone an Embryonaltag 5 (E5) ein Maximum erreicht und danach im Laufe der Entwicklung stetig abnimmt. Dies gilt ebenso für die Population der proliferierenden Neuroblasten, welche ebenfalls im Laufe der Hühnerentwicklung erstmals detailliert untersucht wurde. Diese Korrelation führte zu der Vermutung, dass PROX1 hauptsächlich in proliferierenden Zellen exprimiert wird, welche anschließend experimentell bestätigt werden konnte. Die Population der PROX1-positiven und die der p27-negativen Neuroblasten haben in allen untersuchten Hamburger Hamilton-Stadien (HH-St 21-37) eine vergleichbare Größe. Dennoch ist PROX1 durchgehend in einem kleinen Teil der p27-positiven Neurone enthalten. Diese Population verändert sich im Laufe der Entwicklung kaum und das Fluoreszenzsignal eines oder beider Proteine ist bei doppelpositiven Zellen deutlich schwächer. Diese und andere Daten dieser Arbeit weisen darauf hin, dass es sich um Neuroblasten handelt, welche gerade aus dem Zellzyklus austreten. In postmitotischen Neuronen geht PROX1 verloren. Obwohl PROX1 in allen untersuchten HH-Stadien stark in der Population proliferierender Neurone exprimiert wird, zeichnet sich ab E7 eine kleinere Population von Neuroblasten in S-Phase ab, welche kein PROX1 enthalten.
Die Vorläuferzellen von Ziliarganglien werden, ähnlich wie die der sympathischen Ganglien, durch BMP-Proteine zur Differenzierung angeregt (Müller und Rohrer, 2002). Aufgrund der Ähnlichkeiten in der Entwicklung beider Neuralleistenderivate wurde die Expression von PROX1 in dieser Dissertation auch in Ziliarganglien untersucht: Der Transkriptionsfaktor wird dort nur an E4 und E5 vereinzelt in Neuronen exprimiert und nahezu gar nicht in Vorläuferzellen. In späteren HH-Stadien ist PROX1 in Ziliarganglien nicht mehr nachweisbar.
Ebenfalls konnte hier gezeigt werden, dass PROX1 in primären sympathischen Ganglien an E3 (HH-St 21) in Vorläuferzellen exprimiert wird, welche bereits begonnen haben, sich zu Neuroblasten zu differenzieren. Noch bevor die Differenzierung dieser Zellen jedoch abgeschlossen ist, wird PROX1 transient herunterreguliert. Die entstehenden Neuroblasten treten in dieser Phase kurzzeitig aus dem Zellzyklus aus. Da sich die Größe der p27-negativen und der PROX1-positiven Population auch an E3 stark ähnelt, kann man schließen, dass die Zellteilung in den Neuroblasten erst bei erneuter PROX1-Expression wieder aufgenommen wird. Ab E5 ist PROX1 fast ausschließlich in Neuroblasten nachweisbar.
Eine Funktionsanalyse von PROX1 unter Kulturbedingungen und im Hühnerembryo sollte durch Knockdown und Überexpression zeigen, welchen Einfluss der Transkriptionsfaktor auf die Proliferation der Neuroblasten nimmt. Die Manipulation der PROX1-Expression hatte in vitro einen proproliferativen Effekt. In vivo unterschieden sich Knockdown und Überexpression aber nicht von der Kontrolle.
Zusammenfassend wurde in dieser Doktorarbeit die Expression von PROX1 in sympathischen Ganglien von Hühnerembryonen im Detail analysiert. Der Transkriptionsfaktor ist sowohl in Vorläuferzellen als auch in Neuroblasten nur transient vorhanden. Zwar konnte eine klare Korrelation zwischen der Expression von PROX1 und der Proliferation der sympathischen Neuroblasten festgestellt werden, allerdings konnte eine Wirkung von PROX1 auf die Proliferation durch Funktionsanalysen nur teilweise bestätigt werden. Zusammen weisen die Daten darauf hin, dass PROX1 eine Rolle in der Feinregulation der Proliferation spielt.
1. Das Genom von A. woodii konnte sequenziert und annotiert werden. Der Organismus besitzt ein Chromosom von 4050521 Bp und keine Plasmide. Es sind 3495 ORFs kodiert. 2. Die Gene, die die Enzyme des Wood-Ljungdahl-Weges kodieren, konnten identifiziert werden. Sie sind hauptsächlich in drei Clustern organisiert, wobei für Cluster II gezeigt werden konnte, dass es ein Operon bildet und dort ungewöhnlicherweise ein RnfC-ähnliches Protein kodiert ist. 3. Gene für Proteine der Hexose-Verwertung konnten ebenfalls identifiziert werden. A. woodii besitzt sowohl PTS-Systeme als auch einen Na+/Zucker-Symporter zur Aufnahme von Hexosen. Die Enzyme der Glykolyse sind vollständig im Genom vorhanden und liegen im gesamten Genom verstreut vor. 4. Neben den Genen für die bereits charakterisierte Hydrogenase existieren im Genom weitere Gene, die potentielle Hydrogenasen oder Untereinheiten dieser kodieren. 5. Lange wurde für Methyltransferasen in A. woodii vermutet, dass es sich um energiekonservierende Enzyme handelt. Die Genomsequenz zeigte, dass das Genom Gene für 20 Methyltransferasen 1, 10 Methyltransferasen 2 und 22 Corrinoid-Proteine enthält. Die Methyltransferase und das Corrinoid-Protein des Wood-Ljungdahl-Weges konnten identifiziert werden. Allerdings konnte für keines der korrespondierenden Proteine eine Membranständigkeit vorhergesagt werden, was eine Beteiligung der Methyltransferasen an der Energiekonservierung ausschließt. Die Vielzahl der Methyltransferasen passt aber zu der Vielzahl von methylierten Verbindungen, die der Organismus verstoffwechseln kann. 6. Neben den gut charakterisierten etf-Genen aus dem car-Operon, das bei der Caffeat-Reduktion eine wichtige Rolle spielt, gibt es ein weiteres etf-Paar, welches mit den Genen für eine Laktat-Dehydrogenase und eine Laktat-Permease kolokalisiert ist. Welche Rolle die Proteine spielen bleibt noch aufzuklären. 7. Außer den Genen für die gut charakterisierte F1F0-ATP-Synthase finden sich Gene für eine V-Typ ATPase. Diese Gene bilden ein Operon. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Untereinheit VatA auch produziert wird. Die physiologische Rolle konnte allerdings noch nicht geklärt werden. 8. Basierend auf den genomischen Daten konnte ein Modell des Flagellums erstellt werden. Desweiteren wurde eine Vielzahl von Genen für chemotaktische Proteine identifiziert. Zur Verarbeitung von Umweltsignalen besitzt A. woodii Komponenten des Che-Systems, die zum einen aus E. coli und zum anderen aus B. subtilis bekannt sind. 9. In Proteomanalysen konnte festgestellt werden, dass die Enzyme des Wood- Ljungdahl-Weges beim Wachstum auf H2 + CO2 im Vergleich zum Wachstum auf Fruktose induziert werden, die Enzyme der Glykolyse werden dagegen reprimiert. Desweiteren ist die Hydrogenase (HydAB) auf H2 + CO2 induziert. Das am stärksten induzierte Protein ist eine Alanin-Dehydrogenase, deren Rolle im Stoffwechsel unbekannt ist. 10. Die Untersuchung des genomischen Kontextes der für die Na+-translozierende Ferredoxin:NAD+-Oxidoreduktase (Fno/Rnf) kodierenden Gene rnfCDGEAB ergab keine weiteren Gene, die mit Rnf in Verbindung stehen. Experimentelle Befunde zeigen, dass die Gene rnfCDGEAB ein Operon bilden. 11. Nach der Generierung von Antikörpern gegen die Untereinheiten des Rnf-Komplexes, die große lösliche Anteile besitzen, konnte nachgewiesen werden, dass RnfB, C und G in der Membran lokalisiert sind. Desweiteren wurde nachgewiesen, dass deren Produktion unabhängig von der An- oder Abwesenheit von Caffeat und den getesteten C-Quellen ist. 12. RnfG konnte in E. coli überproduziert und anschließend gereinigt werden, allerdings fehlte der vorhergesagte, kovalent gebundene Flavin-Cofaktor. 13. RnfC konnte ebenfalls in E. coli überproduziert und anschließend gereinigt werden. Nach Rekonstitution mit Eisen und Schwefel konnte ein Fe-Gehalt von 8 nmol/ nmol Protein und ein Schwefel-Gehalt von 5 nmol/nmol Protein bestimmt werden. Die im UV/Vis-Spektrum sichtbaren Maxima wiesen auf die Anwesenheit von FeS-Zentren hin. EPR-Analysen deuten darauf hin, dass die FeS-Zentren nur unvollständig assembliert sind. 14. Im Genom von A. woodii ist ein Cluster von Genen, das Proteine zur Umsetzung von 1,2-Propandiol kodiert, zu finden. Elektronenmikroskopisch konnte nachgewiesen werden, dass der Organismus in Gegenwart von 1,2-Propandiol Mikrokompartimente bildet. 15. In Zellsuspensionsversuchen konnte nachgewiesen werden, dass 1,2-Propandiol nicht zu Propionat und Acetat, sondern zu 1-Propanol und Propionat über das Intermediat Propionaldehyd umgesetzt wird. 16. Rohextrakte 1,2-Propandiol-gezogener Zellen katalysierten die Reduktion von NAD+ mit Propionaldehyd als Reduktant. Die Reaktion benötigte CoA, NAD+ (Km 0,35 mM) und Propionaldehyd (Km 1,3 mM). Das Temperaturoptimum betrug 30°C und das pH-Optimum lag zwischen pH 8 und 10. 17. Ein Antikörper gegen die Propionaldehyd-Dehydrogenase (PduP) aus S. enterica reagierte mit einem ca. 50 kDa-Protein 1,2-Propandiol-gezogener Zellen. Dies zeigt, dass PduP aus A. woodii und PduP aus S. enterica immunologisch verwandt sind. Western-Blot-Analysen zeigten, dass PduP nur in 1,2-Propandiol-, 2,3-Butandioloder Ethylenglykol-gezogenen Zellen nachweisbar war, aber nicht in Zellen die auf Fruktose, Ethanol oder H2 + CO2 gezogen waren. 18. Die Aktivität der Propionaldehyd-Dehydrogenase war in Zellen gezogen auf 1,2-Propandiol am höchsten. Nach Wachstum auf Fruktose oder H2 + CO2 war die Aktivität sehr niedrig. Genau gegensätzlich verhielten sich die Aktivitäten der Formiat-Dehydrogenase, einem Enzym des Wood-Ljungdahl-Weges, der ATPHydrolyse und des Rnf-Komplexes. 19. In Gegenwart von Caffeat und 1,2-Propandiol konnte A. woodii nicht wachsen. Das Wachstum auf 2,3-Butandiol oder Ethylenglykol in Gegenwart von Caffeat war möglich.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien assoziiert und gelten in den meisten Fällen als Erkrankungsursache. Das MLL-Gen auf der Chromosomenbande q23 des Chromosoms 11 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt, und die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusionsgene sind ausschließlich mit Hochrisikoleukämien assoziiert. Die häufigste Aberration ist eine reziproke Translokation zwischen den beiden Genen MLL und AF4 (4q21), die t(4;11)-Translokation, die in ca. 80% aller Akuten Lymphatischen Leukämien bei Kleinkindern, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie, auftritt. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapien resistent, so dass t(4;11) Leukämien mit einer ungewöhnlich schlechten Prognose verbunden sind. Welches der beiden Fusionsproteine, MLL-AF4 oder AF4-MLL, die bei der t(4;11)-Translokation entstehen für die Entstehung der Leukämie verantwortlich ist, wird noch kontrovers diskutiert. Bisherige Publikationen zeigen die Onkogenität beider Fusionsproteine, und ihr Potential, Leukämien im Mausmodell hervorzurufen. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe zeigen die onkogene Wirkung des AF4-MLL Fusionsproteins, dessen Expression zur Wachstumstransformation von murinen Zellen und einer Akuten Lymphatischen Leukämie in der Maus führt. Die onkogene Wirkung von AF4-MLL entsteht, sobald das Fusionsprotein nach seiner Prozessierung durch die Endopeptidase Taspase1 heterodimerisiert und dadurch vor SIAH-vermitteltem proteasomalen Abbau geschützt wird. So kann sich das heterodimerisierte Protein - anders als das AF4-Wildtyp Protein - in den Zellen anhäufen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Um die Heterodimerisierung des AF4-MLL Fusionsproteins kompetitiv zu inhibieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit kleine Fragmente aus der C-terminalen Interaktionsdomäne FYRC von MLL exprimiert. Dazu wurde die Interaktion kleiner Peptide aus der FYRC-Domäne mit dem N-terminalen Fragment des AF4-MLL Proteins mithilfe eines Biosensorsystems und Co-Immunopräzipitationen getestet. Anschließend wurden die kleinsten Peptide, die noch an das N-terminale Fragment binden können (B1 und B3), ausgewählt, und zusammen mit AF4-MLL co-exprimiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen von gereinigtem AF4-MLL·N konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Peptide dazu führt, dass das C-terminale Fragment nicht mehr an das N-terminale Fragment binden kann. Durch diese Inhibition der Heterodimerisierung kann der AF4-MLL Multiproteinkomplex nicht vollständig aufgebaut werden, da auch die C-terminalen Komplexpartner WDR5 und RBBP5 nur noch eingeschränkt binden können. Zusätzlich wurde die Stabilität der prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C im Falle einer Inhibition der Dimerisierung untersucht. Offensichtlich sind beide Fragmente nur stabil, wenn sie miteinander heterodimerisiert sind. Eine Blockierung der Interaktion durch kompetitive Peptide führt dazu, dass sowohl AF4-MLL·N als auch MLL·C proteasomal degradiert werden. Da auch das MLL-Wildtyp Protein über die Interaktionsdomänen FYRN und FYRC heterodimerisiert, wurde zusätzlich der Effekt der Expression der Peptide auf die Viabilität von MLL-exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die Peptide B1 und B3 in sechs unterschiedlichen Zelllinen, von denen zwei die t(4;11)-Translokation tragen, exprimiert. Anschließend wurde nach einer PI-Färbung der Anteil apoptotischer Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers ermittelt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass keines der beiden Peptide einen starken Einfluss auf Zelllinien hat, die das Wildtyp-MLL Gen besitzen. Die Apoptose der vier untersuchten Zelllinien war kaum erhöht, wenn diese Peptide exprimiert wurden. Interessanterweise scheint das Peptid B1 dagegen einen Apoptosefördernden Effekt auf diejenigen Zellen zu haben, die das AF4-MLL Protein exprimieren. Basierend auf den vorliegenden Daten kann die Aussage getroffen werden, dass es prinzipiell möglich ist, das AF4-MLL Fusionsprotein spezifisch anzugreifen. Eine Blockierung der Heterodimerisierung blockiert die Ausbildung des onkogenen AF4-MLL Multiproteinkomplexes. Dies führt zudem dazu, dass die beiden Taspase1-prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C proteasomal degradiert werden. Die Inhibition der Heterodimerisierung von AF4-MLL ist mit einer leicht erhöhten Apoptoserate in t(4;11)-positiven Zellen verbunden. Diese Beobachtung könnte in Zukunft von Bedeutung sein, wenn über neue Therapieansätze bei t(4;11) Leukämien nachgedacht werden sollte.