Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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The canonical Wnt pathway, also known as Wnt/β-‐catenin pathway, comprises a network of proteins which control diverse developmental and adult processes in all metazoan organisms. The binding of canonical Wnt ligands to a cell surface receptor complex, consisting of frizzled family members and low density lipoprotein receptor-‐ related protein 5 or 6 co‐receptors, triggers a signaling cascade which results in a β-catenin-‐mediated transcriptional activation of different target genes, implicated in cellular proliferation, apoptosis, migration and differentiation. A couple of years ago, several groups including us, iden2fied transient activation of the canonical Wnt-pathway in endothelial cells (ECs) of the developing central nervous system (CNS). In this context, Wnt/β-‐catenin signaling could be demonstrated to be crucial for brain angio genesis as well as for the establishment of the blood-brain barrier (BBB) phenotype in the newly formed vessels.
Gliomas, in particular the glioblastoma (GBM), belong to the group of highly vascularized solid tumors which gain their vascularization due to an angiogenic switch occurring during tumor progression. Interestingly, nuclear localized β-‐catenin could be exclusively detected in the activated endothelium of induced rat gliomas and of human GBM, suggesting a so far unknown and not further characterized involvement of the canonical Wnt pathway in pathological angiogenesis. In order to systematically decipher the precise role of endothelial Wnt/β-‐catenin signaling in tumor angiogenesis, I established
murine GL261 glioma cell lines overexpressing either Wnt1 or Dickkopf (Dkk) 1 in a doxycycline-‐dependent manner, an activator and potent inhibitor of Wnt/β-‐catenin signaling, respectively. In subcutaneous and intracranial transplantations, tumor-derived Wnt1 reduced, while Dkk1 increased GL261 tumor growth without affecting in vitro proliferation, cell cycle or cell death of the established cell lines. Nowadays, it is well accepted that solid tumors are dependent on vascular support allowing them to grow beyond a certain size. In my work I could show that tumor-‐derived Wnt1 targets the tumor vasculature by increasing endothelial Wnt/β-‐catenin signaling, which reduced tumor vessel density and resulted in a more quiescent tumor vasculature. Furthermore, Wnt1-‐expression mediated tight association of smooth muscle cells (SMCs) and pericytes to the tumor endothelium, a phenotype which is unusual for tumor vessels and a described hallmark of tumor vessel normalization. In contrast, inhibition of endothelial Wnt/β-‐catenin signaling by Dkk1 mediated an opposing effect, characterized by endothelial hyper-proliferation and a tumor vasculature with a rough basal lamina distribution and loosely anached mural cells, indicative of a strong angiogenic activity. The described vascular effects in Wnt1-expressing GL261 tumors could be verified by subcutaneous transplantations of a rat glioma cell line constitutively expressing Wnt1. Furthermore, an applied in vivo MatrigelTM plug assay uncovered the reduction in vessel density upon Wnt1 simulation to be tumor cell independent, suggesting an EC-‐autonomous effect. This hypothesis was confirmed by subcutaneous transplantations of parental GL261 cells into mice with genetically generated endothelial β-‐catenin gain-of-function (GOF). The derived GOF tumor from this experiment comprised a quiescent and normalized tumor vasculature and phenocopied the vascular effects observed in Wnt1-expressing tumors.
Our previous work provided evidence that Wnt/β-‐catenin signaling contributes to the BBB phenotype of the developing CNS through the transcriptional regulation of the tight junction protein claudin-‐3. Furthermore, the coverage of pericytes to brain vessels has been described to correlate with BBB integrity. In agreement with these publications, vessels of intracranial Wnt1-‐expressing GL261 tumors retained or regained barrier properties, indicated by a reduced leakage of the tracer Evans blue and endogenous mouse immunoglobulin G and increased junctional localiza2on of the tight junction proteins claudin-‐3, -‐5 and zonula occludens-‐1.
Overall, we detected sustained endothelial Wnt/β-‐catenin signaling to induce a quiescent and normalized tumor vascularization. Interestingly, the Notch signaling pathway has been shown to inhibit the angiogenic tip cell and to promote the quiescent stalk cell phenotype via its ligand Delta-like ligand 4 (Dll4) and the receptors Notch1 and 4. Mechanistically, my work demonstrated for the first time that overactivation of endothelial Wnt/β-‐catenin signaling reactivated expression of Dll4 in the tumor endothelium, which could be shown in vitro to increase Notch signaling and to favor a stalk cell-like gene signature. Furthermore, we uncovered the platelet-derived growth factor subunit B (pdgm) as a novel transcriptional target of Wnt/β-catenin signaling in ECs. Hence endothelial-‐derived PDGF-‐B is known to promote the recruitment of mural cells, the upregulation of this factor might explain the increased SMC/pericyte coverage observed in the tumor vasculature upon sustained endothelial Wnt/β-‐catenin signaling which additionally might promote a cycle of vascular normalization.
Taken together, my work reveals several vascular effects, being mediated by reinforced endothelial Wnt/β-‐catenin signaling during tumor angiogenesis. While a moderate level of canonical Wnt signaling, observed in vessels of human astrocytomas and murine control tumors, is considered to be associated with tumor angiogenesis, dominant activation of this pathway in ECs is shown to limit angiogenesis and to promote a quiescent and normalized tumor vasculature with increased barrier properties. Furthermore, my work discovers pdgm as a novel target of canonical Wnt signaling in ECs.
The work presented in this dissertation therefore not only uncovers the role of endothelial Wnt/β-‐catenin signaling in tumor angiogenesis but additionally reveals this pathway to be a novel modulator in pathological vessel development which might proof to be a valuable therapeutic target for anti-angiogenic and edema glioma therapy.
Hepatitis C virus (HCV) assembly and production is closely linked to lipid metabolism. Indeed, lipid droplets (LD) have been shown to serve as a platform for HCV assembly. To investigate the effect of HCV on the host cell proteome, 2D-gelelectrophoresis with subsequent MALDI-TOF mass spectrometry of HCV replicating and the corresponding control cells were done. Based on this analysis, it was found out that HCV-replicating Huh7.5 cells revealed lower amounts of TIP47 (tail interacting protein of 47kD) compared to HCV-negative cells. TIP47, a cytoplasmic sorting factor, has been shown to be associated with lipid droplets. As it is known that HCV-replication and assembly takes place at the so called ”membranous web” that is composed of LDs and rearranged ER-derived membranes, it was tempting to investigate the role of TIP47 in HCV life-cycle. Western blot analysis did reveal that overexpression of TIP47 in HCV replicating Huh7.5 cells leads to decreased amounts of the HCV core protein while the levels of non-structural protein (NS)5A and intracellular HCVgenomes are increased. Moreover, in TIP47 overproducing cells higher amounts of infectious HCV particles are secreted. Vice versa, inhibition of TIP47 expression by siRNA results in a decreased level of intracellular NS5A, increased amounts of intracellular core and less infectious viral particles in the supernatant. In addition, complete silencing of TIP47 by lentiviral transduction abolishes HCV replication that can be restored by transfection of these cells with a TIP47 expression construct. It has been shown recently that apoE binds to NS5A and that this interaction plays an important role for the HCV life cycle (Benga et al., 2010). The C-terminal part of TIP47 harbours a 4 helix bundle motif and displays high homology to the N-terminus of apoE. Therefore, we investigated the interaction of NS5A and TIP47. Confocal double immunofluorescence microscopy revealed that a fraction of NS5A colocalizes with TIP47. Coimmunoprecipitation experiments and a yeast-two-hybrid screening confirmed the interaction between NS5A and TIP47 and deletion of the N-terminal-TIP47-PAT domain abolishes this interaction. From this we conclude that the TIP47-NS5A interaction is required for virus morphogenesis. Moreover, TIP47 can bind to Rab9 and this is relevant for targeting the viral particle out of the cell. In accordance to this, TIP47 was identified to be associated to the viral particle. Mutants of TIP47 that fail to bind Rab9 reveal lower amounts and a changed distribution of the HCV core protein. Furthermore, we could see that the core staining colocalizes with subcellular structures that were identified as autophagosomes using a p62-specific antibody which is a specific autophagosome-marker. Based on this, we hypothized that destruction of the Rab9 binding domain misdirects the viral particle towards the lysosomal compartment.
For the first time it could be shown that TIP47 interacts with NS5A and is associated to the viral particle, therefore plays a crucial role for the virus morphogenesis and secretion of the viral article.
Taken together, these results indicate that TIP47 is an essential cellular factor for the life cycle of HCV Abstract and might be used as target for antiviral treatment, e.g. by targeting the NS5A-TIP47 interaction, based on small molecules that mimic the NS5A-specific sequence that binds to TIP47 which might result in a competition of the TIP47/NS5A interaction.
Typ I Interferone sind bekannt für die durch sie vermittelten immunaktivierenden bzw. antiviralen Effekte. Nach ihrer Induktion, im Rahmen der angeborenen Immunantwort, vermitteln Interferone nicht nur einen systemischen anti-viralen Status, sondern können auch wichtige Effektormechanismen der adaptiven Immunität dahingehend beeinflussen, dass sie diese verstärken bzw. ermöglichen. Im Allgemeinen kann diese Eigenschaft als pro-inflammatorische Aktivität der Interferone bezeichnet werden. Allerdings gehört es ebenfalls zu den Eigenschaften der Interferone eine Verminderung der adaptiven Immunität bewirken zu können, was als anti-inflammatorische Aktivität verstanden werden kann. Insgesamt kann man die durch Interferone induzierten Effekte also als ambivalent bezeichnen.
Die Leber als Immunorgan besitzt, ähnlich wie die Interferone, eine zentrale Rolle in der Immunität und sollte in ihrer Funktion als Vermittler zwischen Immunaktivierung und Immuntoleranz nicht unterschätzt werden. Die Aufgaben der Leber können ebenfalls als ambivalent bezeichnet werden, da sie zum einen eine unnötige Aktivierung des Immunsystems verhindern muss um eine Schädigung der Leberzellen zu vermeiden (Immuntoleranz). Zum anderen muss auch in der Leber eine Immunaktivierung stattfinden können, um den Schutz vor Pathogenen zu gewährleisten.
In einem Leberschadenmodell, das künstliche Doppelstrang-RNA (poly(I:C)) zur Induktion von Typ I Interferonen verwendet, sollen im Rahmen der vorliegenden Arbeit Immunmodulationen, insbesondere in der Leber, untersucht werden. Hierbei liegt das Hauptaugenmerk auf den Interferon-vermittelten Effekten, die eine Schädigung der Leber verhindern.
Werden Interferonrezeptor-defiziente Tiere (IFNAR-/-) intraperitoneal mit poly(I:C) behandelt kann eine ausgeprägte Schädigung der Leber sowie Hepatitis in diesen Tieren beobachtet werden. Wildtyp (WT) Mäuse zeigen hingegen keinerlei Schädigungen der Leber, was für einen protektiven bzw. anti-inflammatorischen Effekt spricht, der über den IFNAR und damit über Typ I Interferone vermittelt wird. Unter Verwendung von Mäusen, die eine selektive Deletion des IFNAR auf bestimmten Immunzellen tragen (alle anderen Zellen der Maus exprimieren jedoch weiterhin den IFNAR), konnte der Immunzelltyp ermittelt werden, der beim IFNAR-vermittelten Schutz der Leber eine Schlüsselrolle übernimmt. Aus diesen Experimenten wird deutlich, dass es myeloide Zellen sind, die über den IFNAR durch Typ I Interferone stimuliert werden müssen, um im poly(I:C)-induzierten Leberschadenmodell einen Schutz der Leber zu bewirken. Ergänzend dazu konnte gezeigt werden, dass CD11b- und F4/80-doppelt positive Makrophagen nach poly(I:C)-Behandlung in die Leber von WT Mäusen infiltrieren. Zudem wurde in Experimenten mit Interferon-Reporter Mäusen deutlich, dass diese infiltrierenden Makrophagen über den IFNAR durch Typ I Interferone stimuliert sind. Nach poly(I:C)-Behandlung konnte gezeigt werden, dass Leber-infiltrierende Zellen in WT Mäusen anti-inflammatorischen Interleukin-1 Rezeptor Antagonisten (IL-1RA) sekretieren. In Abwesenheit eines funktionalen Interferonsystems hingegen (in IFNAR-/- Mäusen) konnte eine gestörte IL-1beta- und IL-1RA-Balance festgestellt werden. Für diese Zytokine, die sich gegenseitig regulieren, indem der anti-inflammatorische IL-1RA mit dem pro-inflammatorischen IL-1beta um die Bindung an den IL-1 Rezeptor konkurriert, konnte gezeigt werden, dass ihre Expression in der Leber Interferon-abhängig reguliert wird. In IFNAR-/- Mäusen und in Mäusen, deren IFNAR selektiv auf myeloiden Zellen deletiert war, konnte keine IL-1RA-Expression durch infiltrierende Zellen detektiert werden. Da in diesen Tieren nach poly(I:C)-Behandlung massive Leberschäden beobachtet wurden, kann vermutet werden, dass das Vorhandensein des anti-inflammatorischen IL-1RA unerlässlich für den Schutz der Leber ist.
Abschließend kann zusammengefasst werden, dass die Interferon-vermittelten Effekte, die eine Schädigung der Leber verhindern, zum einen auf der Stimulation und Rekrutierung von Makrophagen beruhen. Zum anderen beruhen diese Effekte auf der Induktion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-1RA, und der dadurch blockierten Wirkung des pro-inflammatorischen IL-1beta.
Durch diese Ergebnisse werden neue Einblicke in die Interferon-vermittelte Hemmung von Virus- und Autoimmun-induzierten Erkrankungen der Leber ermöglicht. Genutzt werden könnten diese für die Optimierung IFN-basierter Therapien. Beispielsweise kann durch die gezielte Induktion anti-inflammatorischer Zytokine über IFNAR-induzierte Signalwege oder die direkte Gabe anti-inflammatorischer Zytokine (z.B. IL-1RA) eine Therapie entwickelt werden, die neben den vorteilhaften Eigenschaften der Zytokine eine verbesserte Aktivierung von Immunzellen ermöglicht.
Sowohl die Gifte der Kegel- (Conidae) als auch die der Schraubenschnecken (Terebridae) enthalten eine Vielzahl pharmakologisch aktiver Peptide. Vor allem die Conopeptide bzw. Conotoxine aus den Giften der Kegelschnecken werden aufgrund ihrer Selektivität für Ionenkanäle und Rezeptoren seit langem als Werkzeuge in der neuropharmakologischen Forschung eingesetzt. Hier rücken gerade neuronale nikotinische Acetylcholinrezeptoren immer mehr in den Fokus der medizinischen Forschung, da sie vermutlich an der Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, Demenz, Schizophrenie und Epilepsie beteiligt sind. Ziel dieser Dissertation war es daher, neue Inhibitoren in den Giften Kegelschnecken (Conidae) und der Schraubenschnecken (Terebridae) für nikotinische Acetylcholinrezeptoren, vor allem der neuronalen Subtypen, zu identifizieren. Es erfolgte die:
1. Identifizierung neuer αD-Conotoxine
Aus den Giften von Conus capitaneus und C. mustelinus konnten zwei native αDConotoxine (αD-CAP und αD-MUS) isoliert und charakterisiert werden. Beide Toxine sind Homodimere mit Molekulargewichten von 11 kDa und inhibieren nikotinische ACh-Rezeptoren. Sie blockieren die Subtypen α7>α3β2>α4β2, wobei sich αD-MUS als potenter als αD-CAP erweist (IC50-Werte von αD-MUS: α7 0,12 nM, α3β2 1,08 nM, α4β2 4,5 nM; IC50-Werte von αD-CAP α7 0,25 nM, α3β2 2,8 nM, α4β2 28,6 nM). Hingegen haben die αD-Conotoxine auf die Rezeptorsubtypen α3β4, α4β4 und α1β1γδ keinen hemmenden Einfluss. Zusätzlich konnten drei weitere αD-Conotoxine mit Hilfe der cDNA von C. vexillum und C. betulinus identifiziert werden. Eine Besonderheit hierbei war, dass innerhalb der Familie der αD-Conotoxine zwei unterschiedliche Signalsequenzen vorkommen und somit diese Sequenzen nicht stark konserviert sind.
2. Charakterisierung des α-Conotoxins SI aus dem Gift von C. striatus
Im Gift der Kegelschnecke Conus striatus wurde ein Peptid mit inhibierender Wirkung an α7-Rezeptoren nachgewiesen. Molekulare Masse (1.352,5 Da) und Aminosäuresequenz entsprachen dem α-Conotoxin SI, das als Antagonist muskulärer nACh-Rezeptoren bekannt ist. Da die Ergebnisse mehrere Jahre zurück lagen und bisher keine Analysen im Oozytenexpressions-System durchgeführt wurden, wurdeeine mögliche Aktivität sowohl an neuronalen als auch an muskulären nACh-Rezeptoren vermutet. Voltage Clamp-Messungen bestätigten die spezifische Wirkung am Muskeltyp, wodurch die Aktivität am α7-Rezeptorsubtyp einem anderen Conopeptid, zugewiesen werden muss, das als Beiprodukt isoliert wurde.
3. Identifizierung neuer Conotoxine der A-Superfamilie Mit molekularbiologischen Methoden unter Nutzung von cDNA-Bibliotheken gelang es, 27 Conotoxine (17 neue und 10 bekannte) aus der A-Superfamilie zu identifizieren: drei α- und zwei κA-Conotoxine aus Conus striatus, zwei α-Conotoxine aus C. betulinus, zwei α- und zwei κA-Conotoxine aus C. carinatus, drei α-Conotoxine aus C. catus, drei α- und zwei κA-Conotoxine aus C. circumcisus, ein α-Conotoxin aus. C. geographus, zwei aus C. imperialis, jeweils eines aus C. lividus, C. quercinus, C. sponsalis sowie zwei aus C. terebra Die Vielzahl der identifizierten α-Conotoxine belegt die hohe Diversität dieser Toxine in den Giften der Kegelschecken. Anhand von Vergleichen mit bereits bekannten Toxinen werden die möglichen Wirkungsweisen einiger neuer α-Conotoxine diskutiert. Für einen Teil der α-Conotoxine wurden 3D-Strukturmodelle erstellt, die Einblicke in die Bindung der Toxine an den Rezeptor geben können.
4. Untersuchung der Gifte der Terebridae
Die inhibierende Aktivität einiger Gifte (Terebra consobrina, T. argus, Myurella affinis, Acus felina, A. chlorata, A. maculata und Hastulopsis pertusa) an nACh-Rezeptoren (α7, α3β2, α4β2, α3β4, α4β4 und α1β1γδ) wurde erstmals nachgewiesen. An Kalium- und Natriumkanälen zeigten die Giftextrakte keine Wirkung. Die Giftextrakte von Myurella affinis und Acus maculata waren am potentesten und blockierten alle untersuchten nACh-Rezeptoren. Dies ist besonders ungewöhnlich, da diese Terebriden-Arten nach der Literatur (Puillandre & Holford, 2010) keinen Giftapparat besitzen sollen. Eine weitere Auffälligkeit aller Terebriden-Giftextrakte war neben der Selektivität für a7-Rezeptorsubtypen, eine hohe Aktivität gegenüber α4-enthaltenden Rezeptoren. In den Giften und mit Hilfe von cDNA-Bibliotheken von Kegelschnecken konnte eine Vielzahl neuer Inhibitoren für neuronale nikotinische Acetylcholinrezeptoren identifiziert werden. Sie zeigen ein breites Wirkungsspektrum, das die unterschiedlichsten nAChRSubtypen einschließt, was ihre Verwendung als pharmaklogische Werkzeuge begrenzt. Hingegen zeigen die Gifte der Schraubenschnecken ein Selektivitätsspektrum, das die Analyse ihrer Peptide als vielversprechend erscheinen lässt.