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Get3 in Arabidopsis
(2021)
Der guided entry of tail-anchored proteins (GET) Biogenese-Weg vermittelt den Transport und die Insertion von tail-anchor (TA) Proteinen in die Doppellipidschicht des Endoplasmatischen Retikulums (ER). TA Proteine sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Transmembran Domäne (TMD) in den letzten 50 Aminosäuren ihrer Sequenz beherbergen. Diese TMD enthält die notwendigen Informationen, mit denen die Proteine an ihren jeweiligen subzellulären Zielort transportiert werden können. TA Proteine erfüllen eine Vielzahl von essentiellen biologischen Prozessen, sie fungieren zum Beispiel als Rezeptoren, sind maßgeblich an der Fusion von Vesikeln beteiligt sowie an der Initiation von Apoptose. Durch ihren modularen Aufbau können TA Proteine nicht mit dem Signalerkennungspartikel interagieren und müssen deshalb posttranslational zum ER geleitet werden. Im Modellorganismus Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) ist der GET Biogenese-Weg am besten beschrieben und läuft wie folgt ab: Nach der Termination der Translation bindet das Protein SgtA das TA Protein und händigt es über den Adapter-Komplex, bestehend aus Get4 und Get5, an die zytosolische ATPase Get3 aus. Get3 ist der zentrale Zielsteuerungsfaktor des GET Biogenese-Weges. Sobald sich ein Komplex aus Zeilsteuerungsfaktor und TA Protein gebildet hat, wird dieses zur Membran des ERs überführt. Dort wird das TA Protein an den Rezeptorkomplex bestehend aus Get1 und Get2 übergeben, welcher anschließend die Insertion des TA Proteins in die Doppellipidschicht des ERs initiiert.
Get3 hat im zellulären Kontext noch eine weitere Funktion. Unter oxidativem Stress oder Energie depletierenden Bedingungen wird Get3 zu spezifischen Foci rekrutiert, an denen sich noch weitere durch Stress -induzierbare Proteine, wie z.B. die der Familie der Hitze Stress Proteine (HSPs) versammeln. Analysen haben gezeigt, dass Get3 unter den oben genannten Bedingungen, Konformationsänderungen durchläuft und dann als ATP unabhängige Holdase fungiert. Diese kann die exponierten, hydrophoben Anteile von Proteinen binden, um dadurch die Proteostasis aufrechtzuhalten.
Durch die Bedeutsamkeit der TA Proteinen ist die zentrale ATPase Get3 in allen Domänen des Lebens hochgradig konserviert. Phylogenetische Analysen ergaben, dass sich Get3 im Allgemeinen in eine „A“ Gruppe sowie eine „BC“ Gruppe aufspaltet. Im Modellorganismus Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) wurden drei Orthologe zu Get3 identifiziert. Eins davon gehört zu der „A“ Gruppe und befindet sich im Zytoplasma. Die anderen zwei Orthologe befinden sich in den Organellen endo-symbiotischen Ursprungs und gehören der „BC“ Gruppe an. Untersuchungen an verschiedenen Deletionsmutanten in A. thaliana haben gezeigt, dass die Mutationen einzelner GET Komponenten zu einer signifikanten Verkürzung der Haarwurzeln führen, obwohl der restliche Habitus der Pflanze unverändert bleibt. Diesbezüglich wurde SYP123 als einziges TA Proteine identifiziert, dessen Abundanz durch die Deletion von GET Komponenten beeinflusst werden kann. Von den anderen beiden Orthologen organellären Ursprungs ist, abgesehen von ihrer Lokalisation nichts weiter bekannt
Vier Orthologe Gruppen in Pflanzen
Da bislang nicht mehr als zehn Pflanzenarten für phylogenetische Analysen herangezogen wurden, wurden in dieser Arbeit die taxonomischen Beziehungen von Get3 zu einander in 50 Spezies der Viridiplantae auf Basis der Orthologie sowie Homologie untersucht. Dies führte zur Identifizierung einer zytolischen (AtGet3a), einer plastidären (AtGet3b), einer mitochondriellen (AtGet3c) sowie einer Monokotyledone spezifischen Gruppe (SBGet3). Die Lokalisation der ersten drei Gruppen wurde in selektierten Pflanzen, sowohl homolog als auch heterolog, der unterschiedlichen Spezies mittels saGFP untersucht, und es konnte gezeigt werden, dass mehrere Get3 Orthologe mit unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen eine unter Pflanze häufig auftretende Eigenschaft ist. Das Weitern konnte gezeigt werden, dass manche Komponenten des Präzielsteuerungskomplexes (SgtA und Get4) sowie des Rezeptorkomplexes (Get1) in fast allen der 50 untersuchten Pflanzenarten vorhanden sind. Dies weist auf eine Konservierung des gesamten GET Biogenese-Weges in Pflanzen hin.
Get3a in Arabidopsis thaliana
Da die molekulare Zusammensetzung des Präzielsteuerungskomplexes für AtGet3a in A. thaliana nicht bekannt ist, habe ich Co-Immunpräzipitationen mit Zellextrakten aus weißer Zellkultur und einen von mir selbst aufgereinigten Antikörper gegen AtGet3a durchgeführt. Nach anschließender Gelelektrophorese und einer Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue ließ sich ein reproduzierbares Muster aus Proteinbanden erkennen, welche ausgeschnitten und mittels LC-MS/MS analysiert wurden. Dadurch wurde ein putativer Kandidat für Get5 identifiziert sowie eine Assoziation mit Chaperonen und proteasomalen Untereinheiten.
Um die Zielsteuerungseffizienz und Topologie von ER-Membranproteinen zu analysieren habe ich (i) die rekombinante Synthese eines Modell-TA Proteins mit glykosylierbarem opsin bovine glycosylation Tag (OPG) etabliert sowie (ii) eine Methode etabliert um in isolierten Protoplasten die Richtigkeit der Insertion zu überprüfen. Mit Hilfe dieser Methoden können nun verschiedene Mutanten auf ihre Insertions-Wirksamkeit untersucht werden. Desweitern können durch Mutationsanalysen die notwendigen physikochemischen Eigenschaften für die Erkennung des Substrates ermittelt werden.
Eine weit verbreitete Methode im GET Feld ist die tail-anchor translocation (TAT). Bei dieser Methode werden isolierte mikrosomale Fraktionen des rauen ERs mit rekombinanten Komplexen bestehend aus Zielsteuerungsfaktor und TA Protein inkubiert. Durch einen rekombinanten OPG, der im Lumen des ERs post-translational modifiziert werden kann, ist die Beobachtung einer zeitabhängigen Kinetik der Glykosylierung möglich. Dieses System wurde bislang nur für Komponenten aus Säugern oder Hefen benutzt, aber noch nie mit einem System auf pflanzlicher Basis. Um dies zu verwirklichen, habe ich die rekombinante Proteinexpression soweit optimiert, dass der Großteil des synthetisierten Proteins sich im löslichen Anteil des Lysats statt in den Inclusion Bodies befand. Mittels dieser Optimierung konnte ich die Ko-Expression von Zielsteuerungsfaktor mit TA Protein als löslichen Komplex etablieren. Ergänzend zu den löslichen Komplexen habe ich eine geeignete Methode etabliert um mittels Saccharosegradienten mikrosomale Fraktionen aufzutrennen in denen AtGet3a angereichert ist. Leider müssen noch die Parameter der Reaktion optimiert werden, aber die Akquirierung alle nötigen Bestandteile ist etabliert.
This thesis investigates the structure of research articles in the field of Computational Linguistics with the goal of establishing that a set of distinctive linguistic features is associated with each section type. The empirical results of the study are derived from the quantitative and qualitative evaluation of research articles from the ACL Anthology Corpus. More than 20,000 articles were analyzed for the purpose of retrieving the target section types and extracting the predefined set of linguistic features from them. Approximately 1,100 articles were found to contain all of the following five section types: abstract, introduction, related work, discussion, and conclusion. These were chosen for the purpose of comparing the frequency of occurrence of the linguistic features across the section types. Making use of frameworks for Natural Language Processing, the Stanford CoreNLP Module, and the Python library SpaCy, as well as scripts created by the author, the frequency scores of the features were retrieved and analyzed with state-of-the-art statistical techniques.
The results show that each section type possesses an individual profile of linguistic features which are associated with it more or less strongly. These section-feature associations are shown to be derivable from the hypothesized purpose of each section type.
Overall, the findings reported in this thesis provide insights into the writing strategies that authors employ so that the overall goal of the research paper is achieved.
The results of the thesis can find implementation in new state-of-the-art applications that assist academic writing and its evaluation in a way that provides the user with a more sophisticated, empirically based feedback on the relationship between linguistic mechanisms and text type. In addition, the potential of the identification of text-type specific linguistic characteristics (a text-feature mapping) can contribute to the development of more robust language-based models for disinformation detection.
Using walls to navigate the room: egocentric representations of borders for spatial navigation
(2021)
Spatial navigation forms one of the core components of an animal’s behavioural repertoire. Good navigational skills boost survival by allowing one to avoid predators, to search successfully for food in an unpredictable world, and to be able to find a mating partner. As a consequence, the brain has dedicated many of its resources to the processing of spatial information. Decades of seminal work has revealed how the brain is able to form detailed representations of one’s current position, and use an internal cognitive map of the environment to traverse the local space. However, what is much less understood is how neural computations of position depend on distance information of salient external locations such as landmarks, and how these distal places are encoded in the brain.
The work in this thesis explores the role of one brain region in particular, the retrosplenial cortex (RSC), as a key area to implement distance computations in relation to distal landmarks. Previous research has shown that damage to the RSC results in losses of spatial memory and navigation ability, but its exact role in spatial cognition remains unclear. Initial electrophysiological recordings of single cells in the RSC during free exploration behaviour of the animal resulted in the discovery of a new population of neurons that robustly encode distance information towards nearby walls throughout the environment. Activity of these border cells was characterized by high firing rates near all boundaries of the arena that were available to the animal, and sensory manipulation experiments revealed that this activity persisted in the absence of direct visual or somatosensory detection of the wall.
It quickly became apparent that border cell activity was not only modulated by the distance to walls, but was contingent on the direction the animal was facing relative to the boundary. Approximately 40% of neurons displayed significant selectivity to the direction of walls, mostly in the hemifield contra-lateral to the recorded hemisphere, such that a neuron in left RSC is active whenever a wall occupies proximal space on the right side of the animal. Using a cue-rotation paradigm, experiments initially showed that this egocentric direction information was invariant to the physical rotation of the arena. Yet this rotation elicited a corresponding shift in the preferred direction of local head-direction cells, as well as a rotation in the firing fields of spatially-tuned cells in RSC. As a consequence, position and direction encoding in RSC must be bound together, rotating in unison during the environmental manipulations, as information about allocentric boundary locations is integrated with head-direction signals to form egocentric border representations.
It is known that the RSC forms many anatomical connections with other parts of the brain that encode spatial information, like the hippocampus and para-hippocampal areas. The next step was to establish the circuit mechanisms in place for RSC neurons to generate their activity in respect to the distance and direction of walls. A series of inactivation experiments revealed how RSC activity is inter-dependent with one of its communication partners, the medial entorhinal cortex (MEC). Together they form a wider functional network that encodes precise spatial information of borders, with information flowing from the MEC to RSC but not vice versa. While the conjunction between distance and heading direction relative to the outer walls was the main driver of neural activity in RSC, border cells displayed further behavioural correlates related to movement trajectories. Spiking activity in either hemisphere tended to precede turning behaviour on a short time-scale in a way that border cells in the right RSC anticipated right-way turns ~300 ms into the future.
The interpretation of these results is that the RSC’s primary role in spatial cognition is not necessarily on the early sensory processing stage as suggested by previous studies. Instead, it is involved in computations related to the generation of motion plans, using spatial information that is processed in other brain areas to plan and execute future actions. One potential function of the RSC’s role in this process could be to act correctly in relation to the nearby perimeter, such that border cells in one hemisphere are involved in the encoding of walls in the contralateral hemifield, after which the animal makes an ipsilateral turn to avoid collision. Together this supports the idea that the MEC→RSC pathway links the encoding of space and position in the hippocampal system with the brain’s motor action systems, allowing animals to use walls as prominent landmarks to navigate the room.
The main aim of this thesis work was to elucidate the catalytic mechanism of several enzyme complexes on the basis of their three-dimensional structure. All investigated enzyme complexes occur in the anaerobic energy metabolism and have an essential function by the challenging degradation of aromatic compounds and the flavin-based electron bifurcation (FBEB)/confurcation, an energy-coupling mechanism. More specifically, I studied the phthaloyl-CoA decarboxylase of Thauera chlorobenzoica (Pcd) involved in phthalate ester decomposition, the FBEB protein complexes lactate dehydrogenase/electron-transfer flavoprotein (Ldh/EtfAB) of Acetobacterium woodii, the heterodisulfide-related subunit HdrA of the sulfur- oxidizing bacteria Hyphomicrobium denitrificans (sHdrA). In addition, I contributed to the structure determination of the caffeyl-CoA reductase- EtfAB complex of A. woodii and the naphthoyl-CoA reductase of the sulfate-respiring enrichment culture N47 (mentioned in the Appendix E and F).
Die Fähigkeit der spezifischen und kontextabhängigen zellulären Adaption auf intrinsische und/oder extrinsische Signale ist das Fundament zellulärer Homöostase. Verschiedene Signale werden von Membranrezeptoren oder intrazellulären Rezeptoren erkannt und ermöglichen die molekulare Anpassung zellulärer Prozesse. Komplexe, ineinandergreifende Proteinnetzwerke sind dabei elementar in der Regulation der Zelle. Proteine und deren Funktionen werden dabei nach Bedarf reguliert und unterliegen einem ständigen proteolytischen Umsatz.
Die stimulusabhängige Gentranskription und/oder Proteintranslation nimmt hier eine zentrale Stellung ein, da die zugrundeliegende Maschinerie die Komposition und Funktion der Proteinnetzwerke entsprechend anpassen kann. Zusätzlich zur Regulation der Proteinabundanz werden Proteine posttranslational modifiziert, um deren Eigenschaften rasch zu ändern. Zu posttranslationalen Modifikationen zählen die Ubiquitinierung und/oder Phosphorylierung, welche die Proteinfunktionen hochdynamisch regulieren. Deregulierte Proteinnetzwerke werden oft mit Neurodegeneration und Autoimmun- oder Krebserkrankungen assoziiert. Auch Infektionen mit humanpathogenen Bakterien greifen stark in den Regulierungsprozess von Proteinnetzwerken und deren Funktionen ein. Die zelluläre Homöostase wird dadurch herausgefordert.
Bakterien der Gattung Salmonella sind zoonotische, gramnegative, fakultativ intrazelluläre Pathogene, welche weltweit millionenfach Salmonellen-erkrankungen hervorrufen. Von besonderer Bedeutung ist dabei Salmonella enterica serovar Typhimurium (hiernach Salmonella), welches im Menschen, meist durch mangelnde Hygienemaßnahmen, Gastroenteritis auslöst.
Immunität in Epithelzellen wird über das angeborene Immunsystem vermittelt und dient der Pathogenerkennung und -bekämpfung. Die Toll-like Rezeptoren (TLR) gehören zu den Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors), welche spezifische mikrobielle Strukturen detektieren und eine kontextabhängige zelluläre Antwort generieren. Danger-Rezeptoren erkennen hingegen nicht direkt das Pathogen, sondern zelluläre Perturbationen, welche durch Zellschäden oder bakterielle Invasionen verursacht werden. Die intrinsische Fähigkeit der Wirtszelle, sich gegen Infektionen/Gefahren zu wehren wird dabei als zellautonome Immunität bezeichnet. Dabei nehmen induzierte proinflammatorische Signalwege und zelluläre Stressantworten eine wichtige Stellung ein. Die zelluläre Stressantwort aktiviert unter anderem die selektive Autophagie. Diese kann spezifisch aberrante Organelle, Proteine und invasive Pathogene abbauen. Ein weiterer Stresssignalweg ist die integrated stress response (ISR), welche eine selektive Proteintranslation erlaubt und damit die Auflösung des proteintoxischen Stresses ermöglicht.
Zur Penetration von Epithelzellen benötigt Salmonella ein komplexes System an Virulenzfaktoren, welches die bakterielle Internalisierung und Proliferation in der Wirtszelle ermöglicht. Salmonella nutzt dazu ein Typ-III-Sekretionssystem. Das System sekretiert bakterielle Virulenzfaktoren in die Zelle, sodass eine hochspezifische Modulierung des Wirtes erzwungen wird.
Die Virulenzfaktoren SopE und SopE2 spielen dabei eine Schlüsselrolle, da sie die Pathogenität von Salmonella maßgeblich vermitteln. Durch molekulare Mimikry von Wirts GTP (Guanosintriphosphat) -Austauschfaktoren aktivieren SopE und SopE2 die Rho GTPasen CDC42 und Rac1. GTP-geladenes CDC42 und Rac1 wiederum aktivieren das Aktinzytoskelett und stimulieren die Polymerisierung von Aktinfilamenten über den Arp2/3-Komplex an der Invasionsstelle. Das Pathogen wird dadurch in ein membranumhülltes Vesikel, die sogenannte Salmonella-containing Vakuole (SCV), aufgenommen. Die SCV stellt eine protektive, replikative, intrazelluläre Nische des Pathogens dar und wird permanent durch verschiedene Virulenzfaktoren moduliert.
Im Allgemeinen führt die Aktivierung von Mustererkennungsrezeptoren und Danger-Rezeptoren also zu einer zellulären Stressantwort und Entzündungsreaktion, wodurch es zur Bekämpfung der Infektion kommt. Inflammatorische Signalwege werden meist über den zentralen Transkriptionsfaktor NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells) vermittelt. NF-κB bewirkt die Induktion von proinflammatorischen Effektoren und Stressgenen. Zellautonome Immunität wird zusätzlich durch antibakterielle Autophagie ermöglicht, wobei Salmonella selektiv über das lysosomale System abgebaut werden. Das bakterielle Typ-III-Sekretionssystem verursacht an einigen wenigen SCVs Membranschäden, sodass Salmonella das Wirtszytosol penetrieren. Zytosolische Bakterien werden dabei spezifisch ubiquitiniert. Dies erlaubt die Erkennung durch die Autophagie-Maschinerie.
In der vorliegenden Arbeit wurde die zellautonome Immunität von Epithelzellen während einer akuten Salmonella Infektion durch quantitative Proteomik untersucht...
Background: During ECMO therapy ischemia of the limbs or internal organs are potential lethal complications. This study analyzed incidence and type of ischemic complications during ECMO therapy, divided in limb, mesenteric, cardiac and neurological ischemia.
Methods: In this single-center retrospective observational study data from 348 patients treated with veno-venous, veno-arterial or veno-venous-arterial ECMO at the Asklepios Klinik Langen between April 1st 2011 and March 31st 2020 was screened. 321 patients with diagnosis of acute respiratory distress syndrome, cardiogenic or septic shock were included.
Primary outcome variable was type of ischemic complication. Further variables were serum lactate levels 24h before and immediately after diagnosis of the ischemic complication, duration of ICU and hospital stay, ECMO therapy and duration of invasive ventilation and arterial blood gas analysis on day of admission to the ICU. Age, sex, ECMO mode, diagnosis, SAPS II, SOFA score, hospital mortality, the use of renal replacement therapy and tracheotomy, the occurrence of infections during the ICU stay and the need of CPR before ECMO implantation were recorded as well.
Results: 62/321 patients (19.3%) were diagnosed with an ischemic complication. Most common areas were limbs (n=32) and mesenteric ischemia (n=21). Patients who were diagnosed with a septic shock had the highest rate of ischemic complications (36.2%). In VV mode there was a difference in survival between patients with and without ischemic complication (p=0.025). Using multivariate logistic regression, age ≥50 years (p=0.029; OR=2.793; CI 1.109 – 7.033), use of hemodialysis (p=0.003; OR=3.283; CI=1.513 – 7.124) and initial diagnosis of a septic shock (p=0.049; OR=2.144; CI=1.003 – 4.583) could be identified as predictors for ischemic complications.
Conclusions: Ischemic complications are frequent during ECMO therapy. An age of at least 50 years, the use of hemodialysis and diagnosis of a septic shock were predictors of ischemic complications. No correlation between ECMO mode and ischemic complications was found. An influence of ischemic complications on survival could be found only in patients treated with VV mode.
This dissertation analyses the degrees and trajectories of financialisation in the region of South-Eastern Europe. It modifies and applies an eclectic comparative framework for comparing the degrees of financialisation across time and space on different levels. The thesis finds that from the turn of the century until the Great Financial Crisis of 2008, most South-Eastern European countries have increased their degree of financialisation on the different levels, especially on the levels of household, international financialisation and partly the financial sector. Financialisation of non-financial companies is barely existing. After the financial crisis, financialisation is revealed to stagnate in the region. In a second step, the dissertation conducts three case studies on extreme cases: financial sector financialisation in Bulgaria, international financialisation in Serbia and non-financial company and household financialisation in Croatia. Their trajectories are exposed to be mainly driven by deregulation, changed practices by foreign banks, the privatisation of public goods and the liberation of capital controls. The dissertation serves to geographically enlarge the research of financialisation to a peripheral region of the Global North and to add to the discussion on comparative financialisation approaches.
Die vorliegende Arbeit präsentiert Forschungsarbeiten basierend auf nanoskopischen Oberflächenmessungen an plasmonischen Metaoberflächen und zweidimensionalen Materialien, insbesondere dem halbleitenden Übergangsmetal-Dichalcogenid (TMDC) WS_2. Die Thesis ist in sieben Kapitel untergegliedert. Die Einleitung vermittelt einen Überblick über die treibenden Kräfte hinter der Forschung im Bereich der Nanophotonik an zweidimensionalen Materialsystemen. Die Untersuchung der Licht-Materie-Wechselwirkung an dünnen Materialgrenzflächen zieht sich als roter Faden durch die gesamte Arbeit.
Das zweite Kapitel beschreibt den experimentellen Aufbau, der für die Durchführung der nanoskopischen Messungen in dieser Arbeit implementiert wurde. Es werden theoretische Grundlagen, das Messprinzip und die Implementierung des optischen Rasternahfeldmikroskops (s-SNOM) skizziert. Außerdem wird ein Strom-Spannungs-Rasterkraftmikroskop (c-AFM) im Kontaktmodus genutzt, um elektrische Ströme auf mikroskopischen zweidimensionalen TMDC-Terrassen zu messen. In den darauffolgenden vier Kapiteln werden die Beiträge dieser Arbeit zur Untersuchung der Licht-Materie-Wechselwirkung auf der Nanoskala aus verschiedenen Perspektiven vorgestellt. Jedes Kapitel enthält eine kurze Einleitung, einen Theorieteil, Messdaten oder Simulationsergebnisse sowie eine Analyse; vervollständigt durch einen Schlussteil.
Die zentrale Arbeit an einer metallischen Metaoberfläche aus elliptischen Goldscheiben wird in Kapitel 3 vorgestellt. Der zugehörige Theorieteil führt in das Konzept von Oberflächen-Plasmon-Polaritonen (SPP) ein, das für den Forschungsbereich der Plasmonik im Allgemeinen wesentlich ist. Verschiedene Methoden zur Berechnung der Dispersionsrelation dieser Oberflächenmoden an ein- und mehrschichtigen Grenzflächen werden auf die untersuchte Metaoberflächenprobe angewendet. Das Modell sagt drei verschiedene Moden voraus, die sich an der Grenzfläche ausbreiten. Eine teil-gebundene ins Substrat abstrahlende Oberflächenmode sowie zwei vergrabene stark gebundene anisotrope Moden. Eine auf der Probe platzierte Nanokugel aus Silizium wird als radiale Anregungsquelle verwendet.
Der Vergleich mit s-SNOM-Nahfeldbildern zeigt, dass nur die schwach gebundene geführte Modenresonanz ausreichend angeregt wurde, um durch s-SNOM-Bildgebung nachgewiesen werden zu können. Die schwache Oberflächenbindung erklärt die scheinbar isotrope Ausbreitung auf der anisotropen Oberfläche. Die Beobachtung der verbleibenden stark eingegrenzten anisotropen vergrabenen Moden würde eine verbesserte tiefenempfindliche Auflösung des Systems erfordern, die im Prinzip für Schichtdicken von 20 nm möglich sein sollte. Darüber hinaus wirft die Beobachtung die Frage auf, ob die durch Impuls- und Modenvolumenanpassung der Nanokugel gegebene Anregungseffizienz einen ausreichenden Anregungsquerschnitt erzeugt, um nachweisbare vergrabene SPP-Moden zu erzeugen.
In Kapitel 4 wird die Idee der Visualisierung vergrabener elektrischer Felder mit s-SNOM fortgesetzt. Hier wird es auf die Untersuchung von WS_2 angewendet, einem zweidimensionalen TMDC-Material, welches Photolumineszenz zeigt. Durch die Strukturierung des Galliumphosphid-Substrats unter der hängenden Monolage, die von einer dünnen Schicht aus hBN getragen wird, wird die Photolumineszenzausbeute um den Faktor 10 erhöht. Dies wird durch den Entwurf einer lateralen DBR-Mikrokavität mit zusätzlich optimierter vertikaler Tiefe erreicht, die in das Substrat geätzt wurde.
Die hochauflösende Abbildung der elektrischen Feldverteilung im Resonator wird durch den Einsatz von s-SNOM ermöglicht, um die Verbesserung der Einkopplung durch diese beiden Ansätze zu bewerten. Es konnte festgestellt werden, dass die laterale Struktur überwiegend zur verstärkten Photolumineszenzausbeute beiträgt, während für die Einkopplung keine offensichtliche Verstärkung auf die vertikale Strukturoptimierung zurückgeführt werden konnte.
Das zweidimensionale Material WS_2 wird in Kapitel 5 erneut mit Hilfe von c-AFM untersucht. Unterschiedlich dicke Multilagen auf Graphen und Gold dienen als Tunnelbarrieren für vertikale Ströme zwischen Substrat und leitender c-AFM-Messpitze. Die Daten können mit einem Fowler-Nordheim-Modell mit Parametern für die Tunnelbreite und Schottky-Barrierenhöhen der beiden Grenzflächen erklärt werden. Die Messungen zeigen jedoch eine schwache Reproduzierbarkeit, was eine detailliertere Zusammenfassung der relevanten Fehlerquellen erfordert. In der Schlussfolgerung des Kapitels werden mehrere Schlüsselaspekte vorgeschlagen, die bei künftigen Messungen berücksichtigt werden sollten. Entscheidend ist, dass c-AFM sehr empfindlich auf die Adsorption von Wasserfilmen an der Probenoberfläche reagiert, worunter WS_2-Oberflächen unter Umgebungsbedingungen leiden...
Intrinsische und extrinsische Faktoren wie die Darreichungsform, Komedikation und genetische Polymorphismen können einen signifikanten Einfluss auf die Exposition des Wirkstoffes haben und in der Folge zu Veränderungen in der Wirksamkeit oder Sicherheit eines Wirkstoffes führen. Die Fähigkeit die Auswirkungen solcher Faktoren auf die Exposition und die pharmakologische Aktivität eines Wirkstoffes zu quantifizieren und zu extrapolieren, repräsentiert einen Meilenstein bei der Bestimmung der erforderlichen Dosisanpassungen und der Umsetzung von Risikomanagementstrategien in der klinischen Pharmakologie. Unter dem Blickwinkel der modellbasierten Arzneimittelforschung und -entwicklung (engl. model-informed drug discovery and development (MID3)) können dynamisch mechanistische Modelle, wie z. B. whole-body PBPK/PD-Modelle, für die Vorhersage des Effekts sowie der Wechselwirkung mehrerer Faktoren auf PK und PD nützlich sein und könnten daher als Orientierung für die Wahl der Formulierung und für klinische Dosierungsempfehlungen dienen.
Obwohl PBPK-Modelle in der Pharmabranche inzwischen routinemäßig zur internen Entscheidungsfindung und zur Unterstützung der regulatorischen Bewertung eingesetzt werden, bleibt das Vertrauen Waiver von speziellen klinischen pharmakologischen Studien für biopharmazeutische Anwendungen durch PBPK- Modellanalysen zu stützen eher gering. Andererseits hat sich die virtuelle Bioäquivalenz im Zusammenhang mit der Simulation klinischer Studien als ein vielversprechendes, aber noch unterentwickeltes Feld erwiesen, mit dessen Hilfe der Anwendungsbereich der PBPK-Modellierung in der Biopharmazeutik erweitert werden kann. So werden beispielsweise BCS-basierte Biowaiver für Wirkstoffe der BCS-Klassen II und IV derzeit von den Gesundheitsbehörden nicht akzeptiert. In einigen Fällen hat die PBPK-Modellierung durch Verknüpfung der In-vitro-Freisetzung mit der In-vivo-Performance der Formulierung jedoch gezeigt, dass ein solcher Ansatz unter Umständen wissenschaftlich gerechtfertigt sein könnte. Auf ähnliche Weise können PBPK-Modellierung und VBE verwendet werden, um klinisch relevante Spezifikationen für die Wirkstofffreisetzung festzulegen und den "safe space" der Freisetzung zu definieren (oder zu erweitern). Doch selbst bei Wirkstoffen, die Unterschiede im Umfang und in der Rate der Absorption außerhalb der Bioäquivalenzgrenzen aufweisen, was bedeutet, dass sie nicht als bioäquivalent und damit austauschbar angesehen werden können, kann die therapeutische Äquivalenz beibehalten werden, sofern dies durch eine Expositions-Wirkungs-Analyse und/oder eine Expositions-Sicherheits-Analyse unter Verwendung empirischer, halb- oder vollmechanistischer PK/PD-Modelle angemessen begründet wird.
Wie bereits erwähnt bieten PK/PD- und insbesondere PBPK/PD-Modelle einen mechanistischen Ansatz, der die Gewebekonzentrationen am Wirkort des Wirkstoffes mit der pharmakologischen Wirkung verknüpft. Im Rahmen dieser Arbeit wird zunächst ein Überblick über bestehende PK/PD-Modelle und deren mathematischen Umsetzung vorgestellt. Darüber hinaus sind wirkstoffspezifische Fallbeispiele mit einer offensichtlichen Entkopplung von PK und PD von besonderem Interesse, bei denen Expositionsschwankungen weniger kritisch, wenn nicht gar irrelevant für die pharmakologische Reaktion sind (Publikation 1).
In diesem Zusammenhang bietet PBPK Modellierung und Simulation die Möglichkeit die oben genannten wissenschaftlichen Überlegungen zu untersuchen, ungetestete Szenarios zu erforschen und schließlich evidenzbasiert und arzneimittelspezifische Empfehlungen für Bioäquivalenzprüfungen zu erteilen. Daher bestand das Hauptziel darin PBPK/PD-Modelle zu entwicklen, zu validieren und anzuwenden sowie virtuelle Trials zu simulieren, um den relativen Effekt der In-vitro/ In-vivo-Freisetzung, PK-Charakteristiken (z.b. die Halbwertszeit) und die intraindividuelle Variabilität bei der In-vivo-Arnzeimittelwirkung von BCS Klasse II schwach sauren Verbindungen zu beurteilen und einen PBPK-IVIVE integrierten Arbeitsablauf vorzuschlagen, um virtuelle Bioäquivalenzstudien durchzuführen.
Es wurden drei BCS Klasse II schwach saure Wirkstoffe (Naproxen, Flurbiprofen, Ibuprofen) mit ähnlicher Disposition und ähnlichen metabolischen Eigenschaften zur Untersuchung ausgewählt. Allgemein sind alle drei Wirkstoffe stark an Plasmaproteine gebunden und haben daher ein niedriges Verteilungsvolumen, niedrigen First-Pass-Effekt, niedrige systemische Clearance und eine nahezu vollständige Bioverfügbarkeit (F>0.9). Allerdings unterscheiden sie sich signifikant in ihrer Halbwertszeit: Für Naproxen beträgt t1/2≃20-24 h, für Flurbiprofen t1/2≃7 h und für Ibuprofen t1/2≃2 h, was moderate bis lange, moderate und kurze Halbwertszeiten widerspiegelt.
Für alle drei Wirkstoffe wurde ein systematischer Arbeitsablauf erstellt einschließlich: i) Charakterisierung von in vitro biopharmazeutischen Eigenschaften (z.b. Löslichkeit, Freisetzung) gefolgt von modellbasierten Analysen von In-vitro-Ergebnissen, ii) Entwicklung und umfassende Validierung von PBPK/PD-Modellen und iii) Simulierung und Risikoeinschätzung von Bioäquivalenzstudien. Die Fallstudien von Naproxen (Publikation 2) und Ibuprofen (Publikation 3) konzentrieren sich auf bewährte Verfahren der IVIVE für biopharmazeutische Parameter, Risikoabschätzung und Simulation von Bioäquivalenzstudien mit PBPK-Modellen, welche die inter-occasion Variabilität miteinbeziehen. Das Beispiel von Flurbiprofen (Publikation 4) hebt die Wichtigkeit des Verständnisses des relativen Einflusses von intrinsischen (z.b. genetische Polymorphismen) und extrinsischen (z.b. Komedikationen) Faktoren auf die PK und PD des Wirkstoffes hervor, wenn Empfehlungen für die Bioäquivalenz und die therapeutische Gleichwertigkeit gemacht werden. Alle drei Fallbeispiele liefern mechanistische Erkenntnisse über die Freisetzungssgrenzen, die für die In-vivo-Arneimittelwirksamkeit kritisch ist, unter Berücksichtigung der PK-Eigenschaften des Wirkstoffes und der physiologischen Variabilität mit dem Ziel den Status quo des aktuellen BCS-basierten Biowaiveransatzes in Frage zu stellen und integrierte In-vitro-, In-vivo- und In-silico-Paradigma der Risikobewertung für Waiver von In-vivo-Bioäquivalenzstudien einzuführen.
In dem letzten Teil der Arbeit werden Herausforderungen, Kenntnislücken und Möglichkeiten von PBPK/PD-Modellierung zur Unterstützung von Waivern von in vivo klinischen Studien im Bereich von oralen Biopharmazeutika diskutiert (Publikation 5).
Im Großen und Ganzen schlägt diese Dissertation biorelevante In-vitro-Methoden für die Vorhersage von In-vivo-Formulierungsperformance und neue PBPK/PD-Methoden vor, um Daten von in vitro biopharmazeutischen Experimenten zu den In-vivo-Bedingungen zu extrapolieren. Außerdem ist dies das erste Mal nach unserem Kenntnisstand, dass PBPK/PD-Ansätze zur Durchführung virtueller Bioäquivalenzstudien vorgeschlagen werden, die auch die inter-occasion Variabilität der Pharmakokinetik berücksichtigen. Desweiteren hebt diese Arbeit die Bedeutung von pharmakokinetischen Eigenschaften auf Bioäquivalenz-Ergebnissen hervor und stellt ein neues Konzept zur Risikoeinschätzung von Bioäquivalenz vor, in welchem die Bewertung des Bedarfs eines Waivers von einer In-vivo-Bioäquivalenzstudie sowohl auf biopharmazeutischen als auch pharmakokinetischen Wirkstoffeigenschaften basiert und quantitativ mit PBPK/PD-Modellierung bewertet wird.
The Southern Ocean (SO) is one of the most pristine regions of our Planet, characterised by high levels of biodiversity (5% of the global diversity) (David and Saucède 2015) and hosting a unique fauna (up to 90% of SO species are endemic) (De Broyer and Danis 2011; Chown et al. 2015). Yet, the knowledge on SO biodiversity is still far from being completed. In addition, the knowledge on the impact that changing environments have on SO species-richness is very little and for some groups, it is still totally unknown. For instance, most of studies generally focus on one single species such as Antarctic krill (Kawaguchi et al. 2011), Clio pyramidata Linnaeus, 1767 (Orr et al. 2005), Globigerina bulloides d'Orbigny, 1826 (Moy et al. 2009), or only on a high taxonomic level (e.g. phylum, class): Echinodermata, Crustacea, Mollusca, Porifera, Bryozoa, Brachiopoda, Hydrozoa, Ascidiacea, Holoturoidea
(Barnes 1999; Rowden et al. 2015; Post et al. 2017; Gutt et al. 2019; Vause et al. 2019; Pineda-Metz et al. 2020). Ultimately, the influence of sea-ice coverage on benthic species diversity was totally unknown prior to this study. In light of this, the objectives of the thesis are:
1. To expand the knowledge on shelf and deep-sea peracarid assemblage structure and abundance on a small regional (Weddell Sea) and on a large regional (Atlantic sector of the SO and South Atlantic Ocean) geographic scale.
2. To assess the environmental variables driving peracarid assemblage structure and abundance from the above mentioned areas.
3. To investigate SO benthic isopod species diversity from the Atlantic sector of the SO and assess the influence of environmental variables on their species-richness and composition.
4. To describe new possible peracarid species by means of integrative taxonomy, using morphological descriptions and whole genome sequencing analyses to support the species identification.
Objective outcomes: The present thesis provides new information on the abundance and assemblage structure based on 64766 peracarid crustaceans from different 28 locations within the Atlantic sector of the SO continental shelf and deep sea (Chapters I-II). These locations are characterised by different environmental conditions, for instance different sea-ice concentrations. Results from Chapters I-II confirmed the dominance of peracarid assemblages in the benthos, with amphipods being the most abundant group, followed by isopods. Sea ice was identified as the main driver shaping benthic peracarid assemblage structure (Chapter I). On a larger geographic scale and wider bathymetric range (e.g. including sampling locations from previous studies performed in the South Atlantic Ocean
and at a depth range from 160 to ~6000 m), depth was the main physical variable driving peracarid assemblage structure (Chapter III). In addition, 16157 isopod specimens from the Atlantic sector of the SO were identified to species level at a smaller scale (Chapter IV). In this case, sea ice was identified as the main physical driver affecting isopod diversity and composition among sampling locations (Chapter IV). Reduced concentration of sea ice
causes a decrease in isopod biodiversity, thus climate change was identified as a huge threat for this taxon and for SO benthos in general. During the identification process, two new isopod species were discovered (Chapter V). The two new species (Notopais sp.1 n. sp. and Notopais sp.2 n. sp.) were accurately described and identified by means of integrative taxonomy. This provided the first whole genome sequencing of benthic isopods from the SO and the first complete mitochondrial genome of the genus Notopais (Chapter V). Thanks to the collaboration with the University of Genoa (Dipartimento di Scienze della Terra dell'Ambiente e della Vita, DISTAV, Italy) and the National Antarctic Museum (MNA) in Genoa, two new SO species of the suborder Valvifera G. O. Sars, 1883 were described by means of classical taxonomy. In this case, a molecular approach could not be used because both new species were represented by a single specimen, therefore it was important to preserve the integrity of the holotypes (Chapters VI-VII).