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Das Ziel der vorliegenden Studie war die vergleichende morphometrische Untersuchung der Molarenmorphologie rezenter Hominoidea. Im Mittelpunkt der Fragestellung stand die dreidimensionale Analyse des hominoiden Facettenmusters, neben dem quantitativen Vergleich der Relieftopographie und der konstruktiven Veränderung der Kauflächen mit zunehmender Abnutzung, im Hinblick auf die funktionellen Möglichkeiten zur effektiven Nahrungsaufschließung.
Die qualitative Analyse umfasst, neben der dentalmorphologischen Beschreibung, die digitale Fotodokumentation und die Klassifizierung der verschieden weit abgenutzten Molaren in vergleichende Abkauungsgrade.
Die quantitative Auswertung der virtuellen Zahnmodelle schließt die Vermessung der größten Länge, Breite und Höhe, die Berechnung des prozentualen Dentin- und Facettenflächenanteils, des Relief-Index sowie die Neigung und Orientierung der antagonistischen Facetten des Oberund Unterkiefers mit ein. Die Berechnung der korrespondierenden Facettenwinkel in einem einheitlichen Koordinatensystem erlaubt die Kalibrierung der okkludierenden Flächenareale und die Berechnung dreidimensionaler Richtungsvektoren, die die buccale und linguale Mandibelbewegung widerspiegeln. Je nach der Art der Verzahnung der in Okklusion tretenden Höckerflanken lassen sich aus dem räumlichen Zusammenspiel der Funktionselemente quetschende und scherende Komponenten differenzieren.
Die Ergebnisse, die am Rezentmaterial (244 Einzelzähne) gewonnen wurden, sind auf 16 ausgewählte Einzelzähne aus Sangiran und Punung (Java, Indonesien) der Sammlung VON KOENIGSWALD der Abteilung Paläoanthropologie und Quartärpaläontologie des Forschungsinstituts Senckenberg, übertragen worden.
Entsprechend der zu Anfang aufgeworfenen Fragestellung konnte ein für jede Gattung charakteristisches Reliefmuster der Okklusalfläche und dessen Veränderung im Laufe der Abkauung etabliert werden. Infolge des Abschleifens der konvexen Höckerspitzen kommt es zu einer unterschiedlich schnellen und intensiven Reliefverflachung. Die Reliefunterschiede zwischen den Gattungen bleiben im Laufe der Abnutzung erhalten. Gorilla besitzt das am stärksten ausgeprägte okklusale Relief und zeigt die intensivste Abnutzung der Kauflächen und grenzt sich von Pan und Hylobates und insbesondere von Pongo deutlich ab. Pongo besitzt das flachste okklusale Relief und zeigt eine geringere Abnutzung der Kauflächen.
Auf der Grundlage der rekonstruierten Facettenwinkel lässt sich das homologe Facettengrundmuster der Hominoidea weiter differenzieren. Alle Gattungen stimmen in der Position der Facettenareale weitgehend überein. Dieses homologe Facettenmuster resultiert aus der relativ zyklischen Kaubewegung. Die Relieftopographie und Profilierung der Kaufläche sind für die individuelle Bewegungsführung entscheident. Es konnte gezeigt werden, dass aus der unterschiedlichen Steilheit der Zahn-zu-Zahn-Kontakte, unter Berücksichtigung der auf der dreidimensionalen Orientierung der Facetten basierenden Bewegungsbahnen, verschiedene Funktionalitäten resultieren. Durch die Unterschiede in der räumlichen Facettenausdehnung prägt sich ein gattungsspezifisches Grundmusters aus, welches direkt mit der Funktion korreliert und die hohe Effizienz bei der unterschiedlichen Nahrungsaufbereitung bewirkt. Jene quantitativ erfassten Flächen und Bewegungen können funktionell interpretiert werden und stellen eine eindeutige Verbindung zu den in der Literatur aufgeführten Ernährungsweisen der Hominoidea her. Die Kauflächen der vier rezenten Gattungen können unter unterschiedlichen Nutzungsbedingungen im Hinblick auf eine spezifische Ernährungsweise verstanden werden.
Es wurde gezeigt, dass die dreidimensionale Ausrichtung homologer Facetten zu unterschiedlicher Funktionalität führen kann und demzufolge über die zweidimensionale Analyse hinausgeht.
Gorilla nutzt die Vielzahl steiler und kleiner Kontaktflächen zum Zerschneiden der überwiegenden faserigen Nahrungsbestandteile durch hohe Scherkräfte. Aufgrund der stark profilierten Kaufläche folgt die Bewegungsführung restriktiv dem Furchungsverlauf.
Pongo besitzt infolge der Konstruktion der Kaufläche große Kontaktareale, die in flachem Winkel aufeinandertreffen und so ein effizientes Quetschen oder Zermahlen der überwiegenden Früchtenahrung erlauben. Das flache Kauflächenprofil ermöglicht einen größeren Spielraum in der Bewegungsführung.
Pan und Hylobates besitzen ein Repertoire aus schneidenden und quetschenden Funktionselementen und somit einen geringeren Spezialisierungsgrad.
Die Beurteilung der Konstruktion und Funktion der pleistozänen Einzelmolaren im Vergleich mit den erarbeiteten Rezentmodellen ergibt eine Ähnlichkeit mit dem modernen Pongo. Die flache Relieftopographie, die geringe Steilheit der Winkel und die zusätzlichen Schmelzrunzelungen lassen auf ein Quetschen der Nahrung schließen. Eine phylogenetische Aussage zur Differenzierung zwischen Homo oder Pongo konnte aufgrund der kleinen und als exemplarisch anzusehenden Zahl fossilen Materials nicht eindeutig erfolgen.
Rafts: Rafts sind spezialisierte Domänen biologischer Membranen, die sich durch ihre spezifische Lipid- und Proteinzusammensetzung auszeichnen (zur Übersicht siehe Simons und Toomre, 2000). Die am besten beschriebenen Rafts sind die Caveolae, doch es gibt noch weitere weniger gut charakterisierte Rafttypen. Rafts werden verschiedene zelluläre Funktionen zugeschrieben wie z.B. gerichteter Transport von Membranproteinen, Endozytose und Signaltransduktion. Diese Funktionen erfüllen sie vornehmlich, indem sie verschiedene Proteine und Lipide bedingt durch ihre biophysikalischen Eigenschaften selektiv aufnehmen oder ausschließen. Viele Raftproteine sind über gesättigte Acylketten, wie Myristat oder Palmitat, oder einen GPIAnker mit der Membran assoziiert. Transmembranproteine, wie z.B. der EGFRezeptor, können jedoch auch in Rafts angereichert sein. Besonders an der Plasmamembran dienen Rafts als Signaltransduktionszentren, indem sie beteiligte Rezeptoren und Signalmoleküle konzentrieren.
Reggie-Proteine: Bei der Suche nach Proteinen, die bei der Regeneration von verletzten Sehnerven von Fischen hochreguliert werden, wurden Reggie-1 und Reggie-2 entdeckt (Schulte et al., 1997). Gleichzeitig wurden diese Proteine bei der Suche nach neuen Raftproteinen gefunden und als Flotillin-1 (=Reggie-2) und Flotillin-2 (=Reggie-1) bezeichnet (Bickel et al., 1997). Reggie-1 und -2 haben ein Molekulargewicht von 47 kDa und sind auf Aminosäuren-Basis zu 44% identisch. Homologe zu Reggie-1 wurden bislang in Mensch, Maus, Ratte und Fisch, wie auch in D. melanogaster gefunden. Die evolutionäre Konservierung der Reggies ist, mit beispielsweise 80% zwischen Ratte und Goldfisch, sehr hoch und weist auf eine wichtige Funktion hin, die Sequenzkonservierung verlangt. Reggie-1 wird ubiquitär exprimiert, wogegen Reggie-2 ein weniger verbreitetes Expressionsmuster aufweist. Reggie-1 ist vornehmlich an der Plasmamembran und an Endosomen lokalisiert. Die subzelluläre Lokalisation von Reggie-2 hängt vom Zelltyp ab...
Anthropogenic activities have a major impact on our planet and rapidly drive biodiversity loss in ecosystems at a global scale. Particularly over the last century, rising CO2 emissions significantly raised global temperatures and increased the intensity and frequency of droughts and heatwaves. Additionally, agricultural land use and fossil fuel combustion contribute to the continuous release of nitrogen (N) and phosphorus (P) into ecosystems worldwide through extensive fertilization and deposition from the atmosphere. It is important to understand how these rapid changes affect the evolution of plant populations and their adaptive potential. Adaptation by natural selection (i.e., adaptive evolution) within a few generations is an essential process as a response to rapid environmental changes. Rapid evolution of plant populations can be detected by using the so-called resurrection approach. Here, diaspores (i.e., seeds) from a population are collected before (ancestors) and after (descendants) a potential selection pressure (e.g., consecutive years of drought or changes in nutrient supply). Comparing phenotypes of ancestors and descendants in a common environment such as an outside garden, greenhouse, or climate chamber, may then reveal evolutionary changes. Ideally, plants are first grown in a common environment for an intermediate refresher generation to reduce parental and storage effects.
The aim of this thesis was to investigate the occurrence of adaptive evolution in natural plant populations in response to rapidly changing environments over the past three decades. I conducted three experiments using the resurrection approach to generate comprehensive data on the adaptive processes that acted on three plant populations from three different species over the last three decades. Furthermore, I filled knowledge gaps in plant evolutionary ecology and conceptually developed the resurrection approach further.
In Chapter I, I performed a novel approach by testing for adaptive evolution in natural plant populations using the resurrection approach in combination with in-situ transplantations. I cultivated seedlings from ancestors (23 – 26 years old) and contemporary descendants of three perennial species (Melica ciliata, Leontodon hispidus and Clinopodium vulgare) from calcareous grasslands in the greenhouse and In Chapter III, I assessed the reproducibility of phenotypic differences between genotypes among three different growth facilities (climate chamber, greenhouse, and outdoor garden). I also evaluated differences in phenotypic expression between plants grown after one vs. two intermediate generations (i.e., refresher generations). I performed this experiment within the framework of the resurrection approach and compared ancestors and descendants of the same population of Leontodon hispidus.
I observed very strong differences among plants growing in the different growth facilities. I found a significant interaction between the growth facility and the temporal origin (ancestors vs. descendants): descendants had significantly larger rosettes than ancestors only in the greenhouse and they flowered significantly later than ancestors exclusively in the climate chamber. I did not find significant differences between intermediate generations within the growth facilities. Overall, Chapter III shows that the use of a particular experimental system can dictate the presence and magnitude of phenotypic differences. This implies that absence of evidence is not evidence of absence when it comes to investigating genetically based trait differentiation among plant origins (in space or time). Experimental systems should be carefully designed to provide meaningful conditions, ideally mimicking the environmental conditions of the population’s origins. Finally, growing a second intermediate generation did not impact the genetic differences of ancestors and descendants within the environments, supporting the idea that only one intermediate generation may be sufficient to reduce detectable parental and storage effects.
The resurrection approach allows a better understanding of rapid plant adaptation, but some limitations deserve to be highlighted. I only studied one population per species, and Chapters II and III only focus on one population of L. hispidus, which is also hampering generalizations, as adaptive potential can vary greatly among populations of the same species. I only compared the ancestral genotypes to one descendant sample with a long time span in between (26 – 28 years), which makes it hard to pinpoint the selection agents that caused the genetic differentiation among the sampling years. Hence, closely monitoring biotic and abiotic factors of the studied populations between the ancestral and descendant sampling in future studies, would make identifying the responsible selection pressures more precise. I also recommend sampling multiple populations over consecutive years to improve the robustness of results and make generalizations more approachable.Furthermore, combining the resurrection approach with other methods such as in-situ transplantations will be valuable to offset the limitation that adaptations cannot be proven under artificial conditions (e.g., in the greenhouse).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden zum ersten Mal die Ökologie, Morphologie und Systematik von Pilzen untersucht, die assoziiert mit Haut- und Nagelläsionen von ambulanten Patienten sowie von Patienten dermatologischer Praxen in der Provinz Chiriquí im Westen Panamas nachgewiesen wurden. Die Pilze werden klassifiziert nach dem klinischen D-H-SSystem von Rieth und entsprechend ihrer Position im phylogenetischen System der Pilze. Die Morphologie der verschiedenen Arten wird dokumentiert auf der Grundlage von Kulturen und lichtmikroskopischer Untersuchungen durch Beschreibungen sowie Zeichnungen und Fotographien charakteristischer Strukturen. Die Pathogenität der einzelnen Pilzstämme wurde nicht nachgewiesen, sondern auf der Grundlage von Angaben aus der Literatur diskutiert. Außerdem lieferte die Literatur Daten zum Vorkommen der Pilze an Pflanzen und anderen Substraten in der Natur.
In Panama wurden zahlreiche klinische Proben untersucht, von denen ca. 100 Pilzstämme nach Deutschland geschickt wurden. Dort konnten 80 Stämme weiter kultiviert und detailliert untersucht werden. Mehr als 22 verschiedene Arten wurden beobachtet, die 17 verschiedenen Gattungen angehören. Sie entsprechen drei verschiedenen Arten von Dermatophyten, mindestens drei Arten von Hefen und 16 verschiedenen Schimmel- oder sonstigen Pilzarten.
Mit Ausnahme von Hormographiella verticillata wurden ausschließlich imperfekte Stadien beobachtet, und zwar überwiegend von verschiedenen Vertretern der Ascomycota: Dothideales: Scytalidium dimidiatum (6 Stämme), Eurotiales: Aspergillus spp. (4), Paecilomyces lilacinus (2), Penicillium sp. (2), Hypocreales: Fusarium lichenicola (3), F. solani (4), F. subglutinans (1), Microascales: Scopulariopsis brevicaulis (2), Onygenales: Trichophyton mentagrophytes (2), T. rubrum (9), T. tonsurans (7), Ophiostomatales: Sporothrix schenckii (1), Pleosporales: Curvularia geniculata (1), Polystigmatales: Colletotrichum gloeosporioides (1), Sordariales: Nigrospora sphaerica (1), Saccharomycetales: Candida spp. (12), Geotrichum candidum (8), incerte sedis: Pestalotiopsis cf. tecomicola (1), Tritirachium oryzae (1). Vertreter der Basidiomycota sind: Agaricales: Hormographiella verticillata bzw. Coprinellus domesticus (3), Polyporales: Unbekannter Basidiomycet (1), Trichosporonales: Trichosporon cutaneum (6).
Im Rahmen dieser Studie waren Schimmelpilze die am häufigsten bei Haut- und Nagelläsionen angetroffenen Pilze. Unter diesen waren Fusarium-Arten und Scytalidium dimidiatum besonders häufig vertreten. Candida-Arten wurden ebenfalls oft isoliert. Die wichtigste Art unter den Dermatophyten war Trichophyton rubrum. Die prozentualen Anteile der verschiedenen Gruppen entsprechen gut den von anderen Autoren aus anderen Regionen publizierten Ergebnissen. Dies erklärt sich aufgrund der ökologischen Tatsache, dass die Sporen der Schimmelpilze fast überall in der Natur vorhanden sind und diese Pilze viele verschiedene Substrate nutzen können. Candida-Arten gehören zur normalen Flora des Menschen, können aber bei immunodefizienten Patienten, Diabetikern u.a. schwere Haut- und Schleimhautinfektionen, sowie Organerkrankungen verursachen. Dermatophyten sind als Krankheitserreger oberflächlicher Hautmykosen bekannt.
Zum ersten Mal wird das Vorkommen von Hormographiella verticillata in Amerika nachgewiesen. Dieses imperfekte Stadium eines Basidiomyceten hat in Kultur Fruchtkörper gebildet, die als Coprinellus domesticus bestimmt wurden. Damit wurde zum ersten Mal die Anamorph-Teleomorph-Verbindung zwischen diesen beiden Arten festgestellt, die durch eine molekular-phylogenetische Analyse von LSU rDNA (große Untereinheit der ribosomalen DNA) unterstützt wird. Für diese Analyse wurden andere Stämme und Genbank-Daten zum Vergleich herangezogen.
In den Kulturen von H. verticillata entstehen vor der Entwicklung der Fruchtkörper asexuelle sterile Hyphen, die als Ozonium-Stadium bezeichnet werden können. Zum Vergleich wurden Herbarbelege von verschiedenen Arten dieser Gattung bearbeitet. Die Arten sind morphologisch nicht unterscheidbar, weshalb vorgeschlagen wird, nur den Gattungsnamen zur Bezeichnung des entsprechenden Entwicklungsstadiums zu benutzen.
Es war nicht möglich, aufgrund morphologischer Merkmale den Stamm des Unbekannten Basidiomyceten zu bestimmen. Erst eine molekular-phylogenetischer Analyse von LSU rDNA mit Vergleichssequenzen aus der Genbank zeigte, dass der Pilz nahe verwandt ist mit Vertretern der Polyporales.
Die bisher bekannten Cranialfragmente umfassen chronologisch den Zeithorizont der Eisenzeit (Hallstatt- und Latènezeit), die im nördlichen Mittelrheingebiet als stark regional geprägte Hunsrück – Eifel – Kultur bezeichnet wird. Absolutchronologisch datieren die perforierten Fragmente in die Zeit vom 8./ 7. Jh. v. Chr. bis in das 1 Jh. v. Chr.
Mit den Cranialfragmenten im Untersuchungsgebiet lässt sich ein eisenzeitlicher Schädelkult fassen, der bisher, durch die besondere Fundüberlieferung, nur auf die Region des nördlichen Mittelrheingebietes beschränkt scheint. Eine Häufung der Funde um das keltische Hengeheiligtum „Goloring“ im Landkreis Mayen – Koblenz als Zentrum der östlichen Hunsrück – Eifel – Kultur ist dabei klar erkennbar.
Sämtliche bisher bekannten Stücke stammen aus Siedlungsgruben eisenzeitlicher Gehöfte. Nach dem archäologischen Befund wurden die Stücke nach ihrer Verwendung im Sohlenbereich der Gruben deponiert.
Die bei den archäologischen Untersuchungen entdeckten Fragmente bestehen aus Einzelsegmenten oder größeren Teilen des menschlichen Schädels. Nach dem Befund wurden ausschließlich nur alte, schon skelettierte Schädel verwendet, die bereits längere Zeit im Sediment lagen und möglicherweise regulären Bestattungen entnommen wurden.
Sämtliche Stücke weisen als besondere Eigenart dieser Fundgruppe eine Lochung zur Aufhängung und Befestigung auf. Nach dem Befund konnte eine Aufhängung mit Riemen sowie eine Befestigung mit Eisendorn festgestellt werden. Weiterhin sind die Stücke sekundär modifiziert und manipuliert und lassen Schliff- und Schnittspuren, sowie Polituren erkennen. Die Schnittspuren wie auch die Lochungen wurden wahrscheinlich mit Steinwerkzeugen eingebracht. Die Schliffspuren finden sich besonders an den Rändern und Bruchkanten und lassen eine eindeutige sekundäre, postmortale Behandlung erkennen. Oft zeigen die Ränder zudem Schlagspuren einer groben Zurichtung.
Typologisch lässt sich eine Entwicklung fassen, die in der späten Urnenfelderzeit (Ha B) mit echten Trepanationsscheiben ihren Anfang hat. In der frühen Eisenzeit (Laufelder Gruppe im Mittelrheingebiet; Ha C) entstehen in Anlehnung an die Trepanationsscheiben gelochte und modifizierte Knochenscheiben bzw. Rondelle, die schon aus bereits skelettierten Schädeln entnommen wurden. In der älteren Hunsrück – Eifel – Kultur (Hallstattzeit; Ha D) wurden in der Regel größere Schädelteile und Segmente des Craniums perforiert und modifiziert. Während der darauf folgenden jüngeren Hunsrück – Eifel – Kultur (Latènezeit; Lt A/B) finden Schädelcalotten, halbe Schädel sowie größere Teile mit Os frontale oder Occipitale Verwendung. Aus der Mittellatènezeit (Lt C) liegt ein vollständiges Viscerocranium mit Lochung vor. In der späten Eisenzeit (Spätlatènezeit; Lt D) werden dann vollständige Schädel gelocht und modifiziert. Anhand der Typologie ist eine Entwicklung von medizinischen Schaustücken (Trepanationsscheiben) mit Amulettcharakter zu einem ausgeprägten Ahnen – bzw. Reliquienkult zu beobachten. Mit der frühen Hallstattzeit (Laufelder Gruppe; Ha C) wird ausschließlich schon skelettiertes Knochenmaterial verwendet.
Die anthropologische Untersuchung der auswertbaren Cranialfragmente ergab nach den Merkmalen am Schädel tendenziell mehr männliche Individuen. Das biologische Lebensalter lag nach den auswertbaren Charakteristika hauptsächlich in den Altersstufen adult bis matur und in Einzelfällen darüber. Es handelt sich um eine Altersgruppe, die in den regulären Nekropolen deutlich unterrepräsentiert ist, aber bei den Cranialfragmenten in den Siedlungen die Masse der Funde darstellt. Juvenile Individuen fehlen im Fundbestand bisher vollständig. Nach anthropologischen Kriterien handelt es sich bei fast allen Stücken um Langschädel mit dolichokranen Merkmalen.
Nach den Ergebnissen lässt sich der prähistorische Schädelkult an Mittelrhein und Mosel als ein ausgeprägter Ahnenkult charakterisieren. Die perforierten Cranialfragmente machen im Gegensatz zu anderen Regionen eine eigene Entwicklung bis zur Zeitenwende durch. Vereinzelte Parallelen zu den Funden im Mittelrheingebiet sind aus dem gesamten Verbreitungsgebiet der eisenzeitlich – keltischen Latènekultur bekannt. Zudem geben die antiken Autoren ebenfalls Hinweise auf eine solche Kultausprägung. Die Behandlung der Schädel in der Eisenzeit lässt auch rezente, ethnographische Parallelen zu den Inselkulturen Ozeaniens und Südostasiens erkennen.
Diadenosinpolyphosphate (ApnAs), wirken in einer Vielzahl unterschiedlicher Gewebe als extrazelluläre Signalmoleküle. Ihre asymmetrische Hydrolyse durch Enzyme auf der Zelloberfläche oder durch lösliche Enzyme im extrazellulären Milieu wurde in der Literatur bereits mehrfach beschrieben. Die molekulare Identität dieser Enzyme war jedoch nicht bekannt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Fähigkeit von NPP1, NPP2 und NPP3, den drei Mitgliedern der E-NPP-Familie, Diadenosinpolyphosphate zu hydrolysieren, untersucht. Dazu wurden humanes NPP1 und NPP3 aus der Ratte heterolog in CHO-Zellen exprimiert und die enzymatische Aktivität wurde anhand von Membranfraktionen analysiert. Für die Charakterisierung der katalytischen Eigenschaften von NPP2 wurde eine lösliche sekretierte Form des humanen NPP2 aus partiell aufgereinigtem Vaccinia-Viruslysat eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die heterolog exprimierten Enzyme NPP1, NPP2 und NPP3 die untersuchten Diadenosinpolyphosphate Diadenosin-5´,5´´´-P1,P3-triphosphat (Ap3A), Diadenosin-5´,5´´´-P1,P4-tetraphosphat (Ap4A) und Diadenosin-5´,5´´´-P1,P5-pentaphosphat (Ap5A), sowie das Diguanosinpolyphosphat Diguanosin-5´,5´´´-P1,P4-tetraphosphat (Gp4G) hydrolysieren.. Ein Vergleich der Hydrolyseraten zeigte, dass NPP1-2 Ap3A, Ap4A, Ap5A und Gp4G mit vergleichbarer Rate hydrolysieren. NPP3 zeigte ebenfalls keine Präferenz für eines der untersuchten Diadenosinpolyphosphate, hydrolysierte aber Gp4G im Vergleich zu Ap4A deutlich langsamer. Die Hydrolyse der Dinukleotide erfolgte asymmetrisch durch Spaltung der α,β-Pyrophosphatbindung. Als primäre Hydrolyseprodukte entstanden Nukleosid-5´-Monophosphat und der verbleibende Mononukleotidrest Npn-1. Für Ap3A als Substrat wurde für NPP1-3 ein alkalisches pH-Optimum mit maximaler Aktivität bei pH 8.5-9 (NPP1 und NPP3), bzw. pH 10 (NPP2) nachgewiesen. Die enzymatische Aktivität von NPP1-3 wurde durch EDTA inhibiert und die Km-Werte für Ap3A lagen mit 5,1 ± 3,6 µM (NPP1), 8,0 ± 0,5 µM (NPP2) und 49,5 ± 17,7 µM (NPP3) im niedrigen mikromolaren Bereich. Untersuchungen zur Hemmbarkeit der NPP-vermittelten Diadenosinpolyphosphathydrolyse (Ap4A) zeigten, dass die Enzyme NPP1, NPP2 und NPP3 nach Koapplikation verschiedener P2-Rezeptorantagonisten in unterschiedlichem Ausmaß inhibiert wurden. Cibacron Blue inhibierte kräftig alle drei Enzyme, während PPADS einen stärkeren inhibitorischen Einfluss auf die katalytsiche Aktivität von NPP1 und NPP3 als auf die katalytische Aktivität von NPP2 zeigte. Suramin inhibierte dagegen nur die NPP1 und NPP2 katalysierte Ap4AHydrolyse und hatte keinen Einfluss auf NPP3. Eine Inhibierung von NPP1-3 durch NaF wurde nicht beobachtet. Eine geringe inhibitorische Wirkung auf NPP1 wurde durch die extrazellulären Matrix-Komponenten Heparin und Heparansulfat, durch ATP und die Nukleotidanaloga, AMP-CP, AMP-CPP und ATP-γ-S beobachtet. NPP2 und NPP3 wurden durch AMP-CP nicht inhibiert. Den schwächsten inhibitorischen Einfluss zeigte ATP auf die durch NPP3-vermittelte Ap4AHydrolyse.
Die hier für NPP1-3 ermittelten katalytischen Eigenschaften zeigten Übereinstimmgen aber auch Unterschiede gegenüber früheren Daten, die für die Hydrolyse von Diadenosinpolyphosphaten auf der Oberfläche von Zellen ermittelt wurden. Insgesamt sprechen die Ergebnisse dafür, dass NPP1-3 die Hauptvertreter der Diadenosinpolyphosphat-hydrolysierenden Enzyme in Säugergewebe darstellen. Möglicherweise gibt es aber auch ApnA-hydrolysierende Enzyme, die nicht zu den bisher charakterisierten Mitgliedern der E-NPP-Familie zugehören.
In einem zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression von NPP1-3 im Gehirn der Ratte mittels Western-Blot-Analyse (Entwicklungsstadien P1, P21 und adult) untersucht. Aufgrund der geringen Spezifität der gegen NPP1 und NPP2 zur Verfügung stehenden Antikörper, konnten jedoch keine eindeutigen Aussagen zur Expression von NPP1 und NPP2 im Gehirn getroffen werden. NPP3 konnte im Rattengehirn nachgewiesen werden. Die Expression war entwicklungsabhängig und nahm mit zunehmendem Alter der Tiere deutlich ab. Die Entwicklung spezifischer Antikörper erscheint ein lohnender Ansatz, um die zelluläre Verteilung von NPP1-3 im Nervengewebe zu bestimmen.
The nucleus reuniens drives hippocampal goal‑directed trajectory sequences for route planning
(2023)
Goal-directed spatial navigation requires accurate estimates of one’s position and destination, as well as careful planning of a route between them to avoid known obstacles in the environment. Despite its general importance across species, the neural circuitry supporting the ability for route planning remains largely unclear. Previous studies described that place cells in the hippocampal CA1 encode the animal's next movement direction (Wood et al., 2000; Ito et al., 2015) and upcoming navigational routes (Pfeiffer & Foster, 2013). However, it has been shown that part of the CA1 activity representing the animal’s future behaviors is not necessarily generated in the hippocampus, but is derived from the medial prefrontal cortex (PFC) via the nucleus reuniens of the thalamus (RE) (Ito et al., 2015). Notably, the importance of the PFC in navigation has been demonstrated in several studies, including the recent finding of a goal map in the orbitofrontal cortex (Basu et al., 2021). Therefore, I hypothesized that information flow from the PFC to CA1 via the RE plays a key role in route planning.
To assess the animals' route planning ability, I designed a new navigation task in which a rat has to navigate to a fixed target location from various starting positions in an arena. Furthermore, by adding an L-shaped wall in the maze and removing all light sources in the experimental room, this task forced the animals to plan a wall-avoiding route without relying on direct sensory perceptions. I confirmed that rats could learn this task successfully, memorizing the wall location and taking a smooth wall-avoidance route. To test the role of the RE, I inactivated RE neurons by expressing the inhibitory opsin SwiChR++, which resulted in a significant deficit in the animal’s route planning ability, taking a longer non-smooth path to the destination. By contrast, this manipulation did not affect navigation performance when a straight goal-directed route was available, suggesting a specific role of the RE in route planning. I further found that DREADDs-mediated inactivation of neurons in the bilateral hippocampi resulted in a similar deficit in route planning ability, implying cooperation between the RE and the hippocampus.
I finally examined the activity of hippocampal CA1 neurons with and without RE inactivation. While neurons in the hippocampus exhibited brief trajectory sequences corresponding to the animal’s subsequent goal-directed journey, I found that this goal-directed bias of trajectory events was significantly reduced by RE inactivation, likely associated with route-planning deficits in these animals.
Altogether, this dissertation demonstrates the role of the RE from both behavioral and neural coding perspectives, identifying a pivotal circuit element supporting the animal’s route-planning ability.
Fungi belonging to the Rhytismatales (Ascomycota) are parasites or endophytes of plants, some are saprophytes. Their fruiting bodies are localized in different organs of the host plants belonging to many different families of gymnosperms and angiosperms. Many species of Rhytismatales are known on species of Pinaceae, Ericaceae, and Poaceae. These fungi usually have ascomata that are more or less embedded in host tissue and open by longitudinal or radial splits. They have a more or less carbonized covering stroma, thin-walled, iodine negative asci, and ascospores usually covered by gelatinous sheaths.
In the present study, two lists of species of Rhytismatales in China are presented. One is based on literature and includes 103 species in 15 genera. The second one contains the names of the species in the present study, 57 species in 20 genera based on 90 specimens I collected in the Yunnan and Anhui province in China during July to August in 2001. 31 species in the second list are new species or new records for China, so we presently know 134 species in 22 genera of Rhytismatales for China. 28 new species of Rhytismatales are proposed, 21 species from the Yunnan province and seven from the Anhui province. Among them, three new species are proposed in three new genera, Nematococcomyces, New Genus 1, and New Genus 2, respectively. The 28 new species are Cerion sp., Coccomyces spp. 1-2, Colpoma spp. 1-2, Hypoderma spp. 1-6, Lirula sp., Lophodermella sp., Lophodermium spp. 1-5, Nematococcomyces rhododendri C.-L. Hou, M. Piepenbr. & Oberw., Neococcomyces sp., New Genus 1 sp., New Genus 2 sp., Rhytisma spp. 1-2, Soleella sp., Terriera spp. 1-2, and Therrya sp. The genus Davisomycella is proposed as a synonym of Lophodermella based on observations of the morphology, ecology, and the infected organ. The four genera Cerion, Naemacyclus, Terriera, and Therrya, and three species, Hypoderma rubi, Lophodermium uncinatum, and Naemacyclus pinastri, are reported for the first time for China. All the new taxa, the newly recorded ones, as well as six species which had not been illustrated in detail before, are carefully described and illustrated by line drawings in the present study.
The results show that species of Rhytismatales are highly diverse especially in the natural vegetation in high mountainous areas in China. Most species of Rhytismatales are conspicuously host specific. The diversity of Rhytismatales is closely related to that of the preferred hosts, which are members of Pinaceae, Ericaceae, and Cupressaceae. Based on the detailed morphological observations, the significance of different morphological characteristics for a natural classification of Rhytismatales is discussed. Genera are traditionally defined by character states of a few characteristics, namely the opening patterns of ascomata, the depth of ascomata in the host tissue, and asci and ascospore shape. Data from collections in the field, detailed morphological investigation, and molecular data show, however, that the ecology, the infected organ, the host relationship, and many other characteristics have to be combined to circumscribe natural groups.
The discussion of the systematic significance of morphological characteristics is complemented by molecular data. In the present study, partial nuclear large subunit rDNA sequences of 52 specimens representing 38 species are used to analyse phylogenetic relationships for members of Rhytismatales.
Most species of Rhytismatales are placed in a monophyletic group corresponding to the Rhytismatales in the Maximum Parsimony analysis. The delimitation of the Rhytismatales from the Helotiales is, however, difficult. Cyclaneusma minus should be transferred from the Rhytismatales to the Helotiales, and Cudonia circinans and Spathularia flavida from the Helotiales to the Rhytismatales. These tranfers have previously been proposed based on SSU rDNA analysis by other authors. New Genus 1 sp. has morphological characteristics typical for species of Rhytismatales. In the LSU rDNA analysis, however, it is more closely related to Helotiales rather than toRhytismatales. Therefore New Genus 1 sp. is placed in the Helotiales.
Tryblidiopsis pinastri is morphologically intermediate between members of Rhytismataceae and Cudoniaceae. LSU rDNA sequences in the present study show that T. pinastri is more closely related to species of Cudoniaceae. Therefore, this species is removed from the Rhytismataceae to the Cudoniaceae. The delimitation of further families could not be resolved in the present analysis.
Though many new morphological, ecological, and molecular phylogenetic findings are contributed for the first time, the systematic conclusions at generic, family, and order level can only be fragmentary in the present study. With more collections and more molecular data of the worldwide 450 known and many more unknown species of Rhytismatales at hand, a natural system combining morphological and molecular analysis can be elaborated.
Einleitung
APP und die Alzheimersche Krankheit
Das Alzheimer Amyloid Precursor Protein (APP) ist ein Typ-1 Transmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 110-135 kDa [Selkoe et al. 1988, Weidemann et al. 1989]. Es wird in allen bisher untersuchten Geweben exprimiert und weist in mehrzelligen Organismen einen hohen Konservierungsgrad auf [Robakis et al. 1987, Rosen et al. 1989]. APP ist unter anderem Vorläufer des β-A4-Peptides (Aβ), das in extrazellulären Aggregaten (Plaques) im Zentralen Nervensystem von Alzheimer-Patienten akkumuliert [Masters et al. 1985]. Die sogenannte „Amyloid-Hypothese der Alzheimerschen Erkrankung“ besagt, dass das Aβ-Peptid eine pathologische Kaskade initiiert, die zur Bildung von amyloiden Plaques, neuronaler Funktionsstörung und letztendlich Demenz führt [Hardy 1997, Selkoe 1999].
Prozessierung des APP
Der Hauptanteil des zellulären APP wird über den (nicht pathogenen) α-Sekretase-Weg prozessiert, wobei das sekretorische APP (α-sAPP) freigesetzt wird, das beinahe der gesamten N-terminalen Ektodomäne des APP entspricht. Die α-Sekretase spaltet APP innerhalb der Aβ-Domäne und verhindert somit die Bildung des pathogenen Aβ-Peptides. Kandidaten für die Katalyse dieser Spaltung sind Proteasen der ADAM-Familie [Buxbaum et al. 1998, Hooper et al. 1997, Koike et al. 1999, Lammich et al. 1999, Loechel et al. 1998].
Das Aβ-Peptid entsteht bei der sukzessiven proteolytischen Spaltung des APP durch die sogenannten β- und γ-Sekretasen. Bei der β-Sekretase handelt es sich um die Aspartat-Protease BACE (β-site APP cleaving enzyme) [Hussain et al. 1999, Sinha et al. 1999, Vassar et al. 1999, Yan et al. 1999]. Die Identität der γ-Sekretase ist noch nicht endgültig geklärt, jedoch spielen Presenilin-1 und -2 sowie Nicastrin eine Rolle bei der γ-Spaltung des APP [de Strooper et al. 1998, 1999, Struhl et al. 2000, Wolfe et al. 1999].
Unter physiologischen Bedingungen wird ca. 30% des APP durch α-Sekretasen prozessiert, ein viel geringerer Anteil dagegen durch die β-Sekretasen. Mehr als die Hälfte des zellulären APP bleibt ungespalten [Koo 2002].
Biologische Funktionen des APP
Die Funktionen des APP lassen sich unterscheiden nach Funktionen der kurzen zytoplasmatischen Domäne und der ca. 100 kDa großen Ektodomäne (α-sAPP). Die zytoplasmatische Domäne des APP stellt eine Plattform für die Bindung verschiedener Interaktionspartner dar. In Kooperation mit den Bindungspartnern spielt APP eine Rolle in unterschiedlichsten zellulären Prozessen wie vesikulärem Transport, Zellmotilität oder Genaktivierung [Review siehe Annaert und de Strooper 2002]. Die meisten Interaktionspartner der zytoplasmatischen Domäne des APP binden an die YENPTY-Sequenz nahe des C-Terminus des APP, die auch als Signal für die Endozytose des APP dient [Perez et al. 1999].
Die sekretorische Ektodomäne des APP hat eine wachstumsfördernde und neuroprotektive Wirkung. Um diese Wirkung auszuüben, bindet α-sAPP an einen bisher unbekannten Rezeptor, der auf der Zelloberfläche diverser Zelltypen wie Neuronen, Fibroblasten, Thyreozyten und Keratinozyten exprimiert wird [Review siehe Schmitz et al. 2002].
Polarer Transport des APP
In polaren MDCK Zellen wird das APP-Holoprotein fast ausschließlich zur basolateralen Zelloberfläche transportiert [Haass et al. 1994]. Es wurde gezeigt, dass dieser polare Transport des APP durch Tyrosin 653 in der zytoplasmatischen Domäne des APP beeinflusst wird. Mutation dieses Tyrosins zu Alanin führte zu partieller Fehlsortierung von ca. 50% des APP zur apikalen Plasmamembran. Die Sekretion von α-sAPP dagegen fand in MDCK-Zellen unabhängig von Tyrosin 653 basolateral statt [Haass et al. 1995].
Intrazellulärer Proteintransport durch Adaptor-Protein-Komplexe
Am intrazellulären Proteintransport sind Adaptor-Protein-Komplexe (APs) beteiligt, die bestimmte Sortierungssignale in der zytoplasmatischen Domäne von Frachtproteinen erkennen. Bis heute sind vier dieser tetrameren AP-Komplexe (AP-1 bis AP-4) bekannt, die zum Teil verschiedene Isoformen einzelner Untereinheiten aufweisen, z.B. AP-1A und AP-1B [Review: Boehm und Bonifacino 2001]. Jeder AP-Komplex spielt eine Rolle in einem bestimmten Schritt des intrazellulären Proteintransportes. Für AP-1A wird eine Funktion im anterograden und retrograden Transport zwischen Endosomen und TGN beschrieben [Review: Hinners und Tooze 2003]. AP-2 vermittelt Endozytose verschiedener Transmembranproteine von der Plasmamembran [Review: Kirchhausen 2002]. AP-3 spielt eine Rolle im Proteintransport zu Lysosomen und Lysosom-ähnlichen Organellen wie Melanosomen [Robinson und Bonifacino 2001]. AP-4 sowie AP1-B sortieren Proteine zur basolateralen Plasmamembran polarer Epithelzellen [Fölsch et al. 1999, Simmen etal. 2002].
Die Sortierungsmotive, die von Adaptor-Komplexen in der zytoplasmatischen Domäne der Fracht-Proteine gebunden werden, enthalten in den meisten Fällen entweder ein Tyrosin oder zwei Leucine. Das gesamte Motiv besteht aus jeweils vier bis zehn Aminosäuren [Review siehe Bonifacino und Traub 2003].
Ziele der Arbeit
In der vorliegenden Arbeit wurde der polare Transport des APP in Epithelzellen untersucht. Ein Ziel war es, Faktoren zu finden, die den basolateralen Transport des APP in Abhängigkeit von Tyrosin 653 vermitteln. Des weiteren sollte der Transport von APP und sAPP in verschiedenen Epithelzelllinien analysiert werden. Um ein gutes Werkzeug zur Detektion von APP zu haben, wurden GFP-APP-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert.
Ergebnisse und Diskussion
GFP-APP-Fusionsproteine wurden hergestellt und in MDCK-, FRT- und LLC-PK1-Zellen stabil exprimiert. Die Charakterisierung der GFP-APP-Fusionsproteine durch Immunfluoreszenzanalysen zeigte, dass die chimeren Proteine im TGN sowie in peripheren Vesikeln lokalisiert sind und mit endogenem APP stark kolokalisieren. GFPAPP war somit gut geeignet, um den intrazellulären Transport des APP zu untersuchen.
Eine Analyse der zytoplasmatischen Domäne des APP im Bereich des Tyrosin 653 zeigte, dass dieses Tyrosin und die drei folgenden Aminosäuren (YTSI) ein Konsensus-Motiv für die Bindung von tetrameren Adaptor-Protein-Komplexen darstellen.
Zu Beginn dieser Arbeit waren AP-1 bis AP-3 bereits gut charakterisiert, wohingegen für AP-4 keine Funktion bekannt war. In Kollaboration mit Simmen et al. konnte gezeigt werden, dass AP-4 den basolateralen Transport einiger Proteine vermittelt [Simmen et al. 2002]. Immunfluoreszenzanalysen lokalisierten AP-4 im TGN und peripheren Vesikeln, die unterschiedlich von AP-1A/B markierten Strukturen waren. Da kaum Kolokalisation von AP-4 und AP-1A/B zu beobachten war, ist die Lokalisation von AP-4 und AP-1B, das auch eine Rolle im basolateralen Proteintransport spielt, in unterschiedlichen Subdomänen des TGN und unterschiedlichen vesikulären Strukturen anzunehmen.
Polarer Transport des APP durch Adaptor-Protein-Komplexe
Die mögliche Funktion von AP-1 und AP-4 im Transport von APP wurde zunächst mit Hilfe von in vitro-Bindungsstudien untersucht. Dazu wurde die zytoplasmatische Domäne des APP als GST-Fusionsprotein kloniert und exprimiert. Die Frachtproteinbindenden Untereinheiten von AP-1 und AP-4 wurden unter Verwendung von radioaktiv markiertem Methionin durch in vitro-Transkription und -Translation hergestellt. In Bindungsstudien interagierten AP-1A und AP-1B mit der zytoplasmatischen Domäne des APP, nicht aber AP-4. Diese Ergebnisse deuten an, dass AP-1A und AP-1B eine Rolle im intrazellulären Transport von APP spielen könnten. AP-4 dagegen scheint nicht an diesem Prozess beteiligt zu sein.
Durch Mutation des Tyrosin 653 in APP zu Alanin (Y653A) wurde die Interaktion zwischen AP-1B und APP stark verringert, was darauf hindeutet, dass dieses Tyrosin einen Teil des Bindungsmotivs für AP-1B darstellt. Übereinstimmend damit entspricht die genaue Aminosäureabfolge des Y653TSI-Motivs den Sotierungsmotiv-Präferenzen von AP-1B [Ohno et al. 1999]. Die Interaktion von AP-1A dagegen war mit WildtypAPP und der Tyrosin-Mutante vergleichbar und scheint somit auf einem anderen Interaktions-Motiv zu basieren. AP-1A und AP-1B erkennen somit unterschiedliche Sortierungsmotive in der zytoplasmatischen Domäne des APP und kooperieren möglicherweise im intrazellulären Transport des APP. Diese Ergebnisse sind der erste Bericht über eine Interaktion von Adaptor-Protein-Komplexen mit der zytoplasmatischen Domäne des APP.
Die Rolle von AP-1B im basolateralen Transport von APP wurde genauer untersucht mit Hilfe der LLC-PK1 Zelllinie, die kein AP-1B exprimiert [Ohno et al. 1999]. In LLCPK1-Zellen werden verschiedene Proteine unpolar zur apikalen und basolateralen Membran verteilt, die in MDCK-Zellen durch Interaktion mit AP-1B basolateral transportiert werden [Fölsch et al. 1999, Sugimoto et al. 2002]. Um den Transport von APP in polaren LLC-PK1-Zellen zu untersuchen, wurde Plasmamembran-ständiges GFP-APP durch zwei unabhängige Methoden nachgewiesen: die apikale oder basolaterale Oberfläche der Zellen wurde selektiv entweder biotinyliert oder mit GFPAntikörpern markiert. Beide Methoden zeigten, dass GFP-APP in LLC-PK1-Zellen sowohl an der apikalen als auch an der basolateralen Zelloberfläche lokalisiert ist. Somit wird auch APP in diesen Zellen im Vergleich zu MDCK-Zellen anders sortiert. Dieses Ergebnis festigt die Hypothese einer Funktion von AP-1B im Transport von APP, die aufgrund der Daten der in vitro-Bindungsstudien aufgestellt wurde.
Polare Sekretion des sAPP ist unabhängig vom Transport des Holoproteins
Neben dem Transport des APP-Holoproteins war auch die polare Sekretion des sAPP Thema dieser Arbeit. Es war gezeigt worden, dass basolaterale Sekretion des sAPP in MDCK-Zellen unabhängig vom Transport des APP-Holoproteins ist [Haass et al. 1995]. Dieses Ergebnis konnte in der vorliegenden Arbeit bestätigt und auf andere Zelllinien erweitert werden. Um die korrekte Sekretion von GFP-sAPP nachzuweisen, wurde die GFP-sAPP-Sekretion zunächst in polaren MDCK-Zellen untersucht, die stabil GFP-APP exprimierten. Da GFP am N-Terminus des APP angefügt ist, trägt auch das sezernierte APP die GFP-Markierung. GFP-sAPP konnte mittels Immunpräzipitation mit GFP-spezifischen Antikörpern lediglich im basolateralen Medium nachgewiesen werden. Somit sezernieren MDCK-Zellen GFP-sAPP in gleicher Polarität wie von Haass et al. für endogenes sAPP gezeigt wurde [Haass et al. 1995].
Experimente in GFP-APP exprimierenden LLC-PK1- und FRT-Zellen zeigten, dass auch hier die polare Sekretion des GFP-sAPP und der Transport des APPHoloproteins zwei unabhängige Prozesse sind. Polare LLC-PK1-Zellen transportierten GFP-APP zur apikalen und basolateralen Plasmamembran (siehe oben). GFP-sAPP-Sekretion aus polaren LLC-PK1-Zellen dagegen fand ausschließlich basolateral statt. In FRT-Zellen wurde GFP-sAPP im Gegensatz zu MDCK- und LLCPK1-Zellen apikal sezerniert. Kolokalisation des GFP-APP mit Transferrin-Rezeptor in FRT-Zellen deutete dagegen an, dass das Holoprotein wie in MDCK-Zellen basolateral transportiert wird. Dies ist auch zu erwarten, da FRT-Zellen AP-1B exprimieren und es auch in dieser Zelllinie basolateralen Transport vermittelt [A. Gonzalez, persönlich, ASCB 2003]. Nach diesen Ergebnissen zu urteilen, finden auch in FRT und LLC-PK1-Zellen APP-Transport und sAPP-Sekretion unabhängig voneinander statt.
Basolaterale sAPP-Sekretion ist unabhängig von der Ektodomäne
In MDCK-Zellen wurde zusätzlich die Sekretion eines GFP-APP untersucht, in dem der Großteil der Ektodomäne deletiert und durch GFP ersetzt wurde, die SekretaseSchnittstellen jedoch noch vorhanden waren. Durch Immunfluoreszenzanalyse wurde zunächst nachgewiesen, dass die subzelluläre Lokalisation dieser Deletionsmutante der des endogenen APP entspricht. Die Sekretion dieses stark verkürzten sAPP erfolgte wie die des Wildtyps basolateral. Dieses Ergebnis deutet an, dass die Determinante für die basolaterale Sekretion des sAPP nicht innerhalb der Ektodomäne liegt, wie in einigen älteren Publikationen angenommen wird [Haass et al. 1995, de Strooper et al. 1995]. Neuere Ergebnisse dagegen führen die polare Sekretion des sAPP auf die basolaterale Lokalisation der α-Sekretase zurück [Capell et al. 2002], was die basolaterale Sekretion der Deletionsmutante erklären könnte.
sAPP-Bindung an polaren Zellen
Durch Interaktion mit einem bisher unbekannten Rezeptorprotein erfüllt sAPP für verschiedene Zelltypen die Funktion eines Wachstumsfaktors [Saitoh et al., 1989, Pietrzik et al., 1998, Hoffmann et al., 2000]. Da viele Wachstumsfaktor-Rezeptoren selektiv entweder an der apikalen oder basolateralen Plasmamembran von Epithelzellen lokalisiert sind, wurden Bindungsstudien mit rekombinant exprimiertem sAPP (sAPPrec) an polaren FRT und MDCK-Zellen durchgeführt. Analyse der Bindung mit einem sAPPrec-spezifischen Antikörper zeigte, dass sAPP ausschließlich an der apikalen Plasmamembran beider Zelllinien bindet. Da die Sekretion des sAPP in FRT-Zellen ebenso apikal erfolgt, ist in dieser Zelllinie eine autokrine Regulation durch sAPP vorstellbar, was auch durch vorherige Ergebnisse angedeutet wurde [Pietrzik et al. 1998]. Für MDCK-Zellen, die sAPP basolateral sezernieren und apikal binden, muss ein anderer Regulationsmechanismus vorliegen. Es könnte sich um parakrine Regulation handeln, was jedoch noch bestätigt werden muss.
Fazit: In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass tetramere Adaptor-ProteinKomplexe eine Rolle im intrazellulären Transport von APP spielen. In diesem Zusammenhang wurde die Funktion des AP-4-Komplexes in einer Kollaboration analysiert. Es wurde gezeigt, dass AP-1A und AP-1B eine Rolle im Transport von APP spielen. Eine Funktion von AP-4 im Transport von APP ist nach den vorliegenden Ergebnissen unwahrscheinlich. Untersuchungen zur APP-Sortierung in verschiedenen Epithelzelllinien zeigten, dass die Hypothese der Unabhängigkeit von APP-Transport und sAPP-Sekretion als genereller Mechanismus angesehen werden kann. Durch Analyse der sAPP-Bindung an polaren FRT- und MDCK-Zellen wurde erstmals die polare Lokalisation des putativen sAPP-Rezeptors untersucht, was einen ersten Einblick in den Mechanismus der sAPP-vermittelten Regulation in polaren Zellen ermöglichte.
Cytochrome P450 (CYP) enzymes oxidize, peroxidize and/or reduce cholesterol, vitamins, steroids, xenobiotics and numerous pharmacological substances in an oxygen- and NADPHdependent manner. Since many CYP isozymes are also capable of metabolizing arachidonic acid to biologically active products, CYP enzymes are often described as the third pathway of arachidonic acid metabolism i.e., in addition to cyclooxygenases and lipoxygenases. CYP enzymes are predominantly expressed in the liver while others, such as members of the CYP 2J, CYP 2C and CYP 4A subfamilies, can be detected in extrahepatic tissues, particularly in the cardiovascular system. Recent data suggest that a CYP 2C enzyme(s) expressed in coronary artery endothelial cells generate epoxyeicosatrienoic acids (5,6-; 8,9-; 11,12- and 14,15-EET) which contribute to the acute control of vascular tone and the longterm regulation of vascular homeostasis.
The expression of CYP 2C in coronary artery endothelial cells is regulated by a number of stimuli, such as cyclic stretch and fluid shear stress as well as by the corticosteroid cortisol and a number of CYP substrates (nifedipine, cerivastatin and -naphthoflavone). However, the signalling pathways and the transcription factors involved in regulating the expression of the gene are unknown.
Since most of the CYP 2C enzymes are transcriptionally regulated, we were interested in identifying the CYP 2C isoform(s) expressed in porcine coronary artery endothelial cells (PCAEC) as well as determining its/their promoter sequence(s). The overall goal was to study the involvement of different transcription factor binding elements in the regulation of the CYP 2C gene(s). Porcine coronary arteries were used given the possibility of analysing the results obtained at the cellular level with alterations in vascular function. Comparison of the porcine CYP 2C and the human CYP 2C8 and 2C9 promoters was also a major goal of this study.
To identify the relevant porcine CYP 2C isoform nested RT-PCR was performed using total RNA from porcine coronary artery endothelial cells. Comparison of the sequence of the product of this reaction with the NCBI database suggested that the CYP 2C expressed in PCAEC was approximately 85% homologous with the human CYP 2C9 enzyme. To obtain the full length CYP 2C isoform 5´ rapid amplification of cDNA end (5´ RACE) was performed using a downstream reverse gene specific primer which is conserved in all of the porcine CYP 2C isoforms. The intention behind using such a primer was to amplify all the possible CYP cDNAs expressed in PCAEC. With the 5´ RACE technology it was possible not only to identify the exact isoform (CYP 2C34) expressed in PCAEC, but it was also possible to amplify 550 bp of the 5´ upstream region. This result was authenticated by comparing the protein/nucleotide sequence with other human CYP 2C genes such as CYP 2C8 and CYP 2C9 as well as different porcine CYP 2C genes (CYP 2C34, CYP 2C49). Multiple protein/nucleotide sequence alignment revealed approximately 85-90% sequence identity. An exon1-2 specific radio-labelled probe of the CYP 2C34 gene was then used to screen a porcine genomic library for positive genomic clones containing the promoter region of the CYP 2C34 gene.
For the isolation of 5´ flanking region of CYP 2C34 gene a PCR-based directional genome walking strategy was used in which the positive porcine genomic BAC clones were taken as a DNA template. Four arbitrarily designed universal walking primers and a gene-specific primer derived from the CYP 2C34 gene sequence were employed and led to the identification and isolation of 1.4 kb of the 5´ flanking region.
The 1.4 kb 5´ flanking region of CYP 2C34 gene contains multiple transcription factor binding sites including glucocorticoid-responsive element (GRE), hypoxia-responsive element (HRE), CAAT-enhancer binding protein (C/EBP), stress responsive element (STRE) consensus sequences. CYP 2C34 promoter constructs were generated and reporter gene activity (luciferase) activity was compared with that of a promoterless vector (pGL3-Basic) at first in HEK cells and then in PCAEC. After using cortisol as a positive control to demonstrate that the promoter constructs generated were functional we determined the effects of physiologically relevant stimuli i.e., hypoxia and cyclic stretch. Additional experiments with zinc sulphate were performed in a preliminary analysis of the role of Zn2+ inducible transcription factors and might be cooperative heterodimerization formation with these transcription factor with C/EBP in the regulation of CYP 2C34 expression. With all these stimuli, reporter gene activity of CYP 2C34 promoter was significantly (3-8 fold) increased over values obtained in unstimulated cells.
Analysis of the regions that are essential for the induction of promoter activity in response to the different stimuli of interest have to be performed in combination with gel shift assays, siRNA experiments as well as site-directed mutagenesis experiments. Comparison of the regulation of the CYP 2C34 gene and correlation with changes in vascular function (in isolated porcine coronary arteries) should deliver information relevant to the regulation of the CYP 2C enzyme expressed in human coronary artery endothelial cells. The recent demonstration of a clinically relevant role for CYP 2C9 in coronary heart disease underlines the importance of such a study.