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Simone Hochmuth

• In einer Vielzahl maligner Zellen übt Par-4 eine proapoptotische Wirkung aus, indem es diese Zellen gegenüber Apoptose-induzierenden Substanzen wie Chemotherapeutika und Todesrezeptoragonisten durch die Herunterregulation der Expression von antiapoptotischem Bcl-2 sensibilisiert. Unter Berücksichtigung der Bedeutung von Bcl-2 in der Entwicklung einer Medikamentenresistenz bei der akuten myeloischen Leukämie wurde das Potential von Par-4, in den Zelllinien K562 und HEL Bcl-2 herunterzuregulieren und Apoptose zu induzieren, untersucht. Um die Hypothese zu unterstützen, dass Par-4 auch maligne myeloische Zelllinien gegenüber Apoptose-induzierenden Substanzen sensibilisiert, wurden K562- und HEL-Zellen stabil mit einem Par-4-Expressionsvektor und dem entsprechenden Par-4-negativen Kontrollvektor transfiziert. Die transfizierten Klone wurden mit konventionellen Chemotherapeutika (Bendamustin, Doxorubicin, Mitoxantron, Cladribin und AraC) und neuen Substanzen (STI571, LAQ824 und TSA) sowie mit Todesrezeptoragonisten (Fas-L und TRAIL) behandelt. In K562-Zellen führt die Überexpression von Par-4 zu einer Hochregulation der Konzentrationen von Bcl-2 und Daxx. Unter der Behandlung mit konventionellen Zytostatika und Todesrezeptoragonisten zeigten die Par-4-positiven Klone im Vergleich zu den Par-4-negativen Klonen keinen Anstieg der Apoptoserate. Der molekulare Mechanismus dieser Resistenz ist möglicherweise in dem Versagen von Par-4, Bcl-2 und Daxx herunterzuregulieren, begründet. Unter Inkubation mit STI571 und LAQ824 wurde der Apoptose-induzierende Effekt von Par-4 wiederhergestellt, ohne die Expression von Bcl-2 zu beeinflussen. Das Par-4-induzierte Ansprechen auf HDAC-Inhibitoren und STI571 ist assoziiert mit einer verstärkten Caspasenaktivierung, vermehrten Spaltung von cIAP-1 und -2 sowie einer verstärkten Herunterregulation von Daxx. Dies impliziert eine mögliche funktionelle Interaktion zwischen Par-4 und Daxx auf einem neuartigen Apoptoseweg, der durch STI571 und LAQ824 verstärkt wird, zumal dieser Effekt unter Behandlung mit Bendamustin nicht auftrat. In der erythroleukämischen Zelllinie HEL ist Par-4 nicht in der Lage, diese gegenüber konventionellen Chemotherapeutika und Todesrezeptoragonisten als auch STI571 und TSA zu sensibilisieren. Die Expression von Par-4 führte in HEL-Zellen zu einer Hochregulation von Bcl-2. Das Unvermögen von Par-4, Bcl-2 herunterzuregulieren, ist zumindest teilweise verantwortlich für die fehlende Sensibilisierung der Par-4-positiven HELKlone. Diese Hypothese wird durch die erhöhte Apoptoserate in den Par-4-negativen Klonen unter TSA unterstützt, was mit einer weiteren Herunterregulation von Bcl-2 assoziiert war. Darüber hinaus zeigten die Par-4-positiven im Vergleich zu den Par-4-negativen HEL-Zellen verminderte Konzentrationen des proapoptotischen Bax. Zusätzlich verstärkte Par-4 die Expression von Daxx und der Procaspasen-8, -9 und 10, wohingegen die Expression der Procaspasen-3 und -7 unverändert blieb. Par-4-positive Zellen waren nicht in der Lage, Daxx herunterzuregulieren, was mit einer verstärkten Sensibilisierung gegenüber Chemotherapeutika assoziiert war. Dies unterstützt die Schlussfolgerung, dass die Hochregulation von Daxx in Par-4-positiven HEL-Zellen dazu beiträgt, dass Par-4 keine Apoptose-sensibilisierende Funktion aufweist. Aufgrund der fehlenden Sensibilisierung gegenüber einer Vielzahl Apoptose-induzierender Substanzen kann angenommen werden, dass HEL-Zellen generell gegenüber dem Apoptose-induzierenden Effekt von Par-4 resistent sind. Die Rolle von Daxx - insbesondere seine Fähigkeit, Apoptose zu fördern oder zu hemmen - wird immer noch kontrovers diskutiert. Ein Interaktionspartner von Par-4 ist Daxx. Über Interaktionen von Par-4 und Daxx innerhalb des Zellkerns in PODs über die ZIP-Kinase wird ein neuer Apoptoseweg beschritten. Des Weiteren zeigen Par-4 und Daxx eine gleichgerichtete Herunterregulation unter Behandlung mit synergistischen Kombinationen von zytostatischen Substanzen. Um die funktionelle Bedeutung von Daxx in malignen Myelound Lymphozyten zu beleuchten, wurden HEL- und Jurkat-Zelllinien stabil mit einem Daxxexprimierenden Vektor und dem entsprechenden Kontrollvektor transfiziert. Durch Untersuchung einer ektopen Daxx-Expression auf molekularer Ebene in HEL-Zellen konnte gezeigt werden, dass Daxx zu einer Herunterregulation von p53 führt. Daxxüberexprimierende Myelozyten regulieren darüber hinaus Bax, ein proapoptotisches Bcl-2-Familienmitglied herunter, während die Expression von antiapoptotischem Bcl-2 unverändert bleibt. Des Weiteren vermindert Daxx die Expression der Initiatorcaspasen-8 und -10 und der Exekutionscaspase-7, wohingegen die Expression der Procaspasen-6, -7 und -9 unverändert bleibt. Die veränderten Proteinkonzentrationen der Caspasen in Daxx-überexprimierenden HEL-Klonen werden begleitet von einer verminderten Expression von cIAP-1, -2 und survivin. Trotz der gezeigten Auswirkungen einer Daxx-Expression auf wichtige Moleküle der Apoptosekaskade, hatte die Daxx-Expression in HEL-Zellen keine Auswirkungen auf die Proliferationsrate - eine Wirkung, die sehr wahrscheinlich mit der Unfähigkeit, die molekularen Veränderungen unter Serumentzug aufrechtzuerhalten, zusammenhängt. Unter einem proapoptotischen Stimulus ist Daxx nicht mehr in der Lage, die Expression von p53, Bax und der Procaspasen-8, -10 und -7 herunterzuregulieren. In der Daxx-transfizierten Zelllinie Jurkat erhöhte Daxx unter Inkubation mit Todesrezeptoragonisten wie Fas-L und TRAIL sowie unter Inkubation mit Doxorubicin die Apoptoserate. Die Veränderungen auf molekularer Ebene während des extrinsischen und intrinsischen Apoptosewegs zeigen, dass der Anstieg der Apoptoserate durch die Daxx-Überexpression über verschiedene Mechanismen hervorgerufen wird. Hauptunterschiede zwischen Fas-L-/TRAIL- induzierter und Doxorubicin-induzierter Apoptose bestehen im Expressionsmuster von XIAP, p53, Bid, ZIP-Kinase und Par-4. Die erhöhte Sensibilität war in beiden Apoptosewegen von der Aktivierung von Caspasen abhängig. Daxx verstärkt in Abhängigkeit vom apoptotischen Stimulus die Aktivierung von Caspasen auf unterschiedliche Art. In Daxx-positiven Klonen, die mit Fas-L oder TRAIL behandelt wurden, wurde die ZIP-Kinase hochreguliert, die Expression von Par-4 und Daxx verminderte sich proportional zur Apoptoserate, das heißt, je höher die Apoptoserate desto höher ist die Herunterregulation/Degradation von Par-4 und Daxx. Die Kombination von Doxorubicin mit einem Fas-blockierenden Antikörper führte in Daxx-positiven Jurkat-Klonen zu einer zweifachen Amplifizierung der Apoptoserate und der Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials.
• In a variety of malignant cells Prostate-apoptosis-response-gene (Par-4) exhibits a proapoptotic influence sensitizing these cells to apoptosis-inducing agents like chemotherapeutic agents and death receptor agonists by downregulating expression of antiapoptotic Bcl-2. Considering the crucial role of Bcl-2 in the development of chemoresistance of acute myeloid leukaemia (AML) cells the potential role of Par-4 to downregulate Bcl-2 and to induce apoptosis in the cell lines K562 and HEL were assessed. To test the hypothesis that Par-4 also sensitizes malignant myeloid cells towards apoptosis inducing agents K562 and HEL cells were stably transfected with a Par-4-expressing vector or the respective Par-4- negative control vector. The transfected clones were treated with various conventional chemotherapeutic agents (bendamustine, doxorubicin, mitoxantron, cladribine and Ara-C) and novel agents (STI571, LAQ824 and TSA), as well as with death receptor agonists (Fas-L and TRAIL). In K562 cells over-expression of Par-4 upregulates expression levels of Bcl-2 and Daxx. Upon treatment with conventional cytotoxic anti-cancer drugs and death receptor agonists Par-4-positive cells did not exhibit an increases rate of apoptosis as compared to Par-4-negative control cells. The molecular mechanisms of the resistance are possibly based on the failure of Par-4 to downregulate Bcl-2 and Daxx. However, upon incubation with STI571 and LAQ824 the apoptosis promoting effect of Par-4 was re-established without influencing the level of Bcl-2. The Par-4-induced response to HDAC-inhibitors and STI571 is associated with enforced caspase activation and enhanced cleavage of cIAP-1 and -2, as well as with a subsequently enhanced downregulation of Daxx. This implicates a possible functional interaction between Par-4 and Daxx in a novel apoptotic pathway forced by STI571 and LAQ824; above all this effect was not detected under treatment with Bendamustin. In the erytholeukemic cell line HEL Par-4 is not sufficient to sensitize to conventional chemotherapeutic drugs and death receptor agonists, as well as STI571 and TSA. Expression of Par-4 in HEL cells leads to an up-regulation of Bcl-2. The failure of Par-4 to downregulate Bcl-2 is at least partly responsible for the lacking sensibility of the Par-4 positive HEL clones. This hypothesis is supported by the increase of apoptosis upon treatment with TSA to a greater extent in Par-4 negative cells, which was associated with a further downregulation of Bcl-2. Moreover, Par-4-positive HEL cells exhibit a decreased level of the antiapoptotic protein Bax as compared to Par-4-negative cells. In addition, Par-4 increases the expression of Daxx as well as expression of the procaspases-8, -9 and -10, whereas the levels of the procaspases-3 and -7 remain unaltered. Par-4-positive HEL cells fail to downregulate Daxx whose downregulation is accompanied with augmented chemosensitivity. Thus supports the conclusion that the upregulation of Daxx in Par-4-positive cells contributes to the failure of Par-4 to promote apoptosis. Because of the lacking sensibility against a variety of apoptosis inducing substances it can be assumed, that HEL cells are generally resistant to the apoptosispromoting effect of Par-4. The role of Daxx, in particular its ability to promote or hinder proliferation, still remains controversial. A partner of interaction of Par-4 is Daxx. Through interactions between Par-4 and Daxx within the nucleus in PODS via ZIP-kinase a novel apoptotic pathway is followed. Furthermore in lymphatic cells Daxx as well as Par-4 exhibit a concomitant downregulation when treated with synergistic combinations of cytotoxic drugs. In order to elucidate the functional relevance of Daxx in malignant myelocytes and lymphocytes HEL and Jurkat cell lines were stably transfected with a Daxx-expressing vector or the respective Daxx-negative control vector. Assessing the molecular consequences of ectopic Daxx-expression in HEL cells, it was shown that Daxx downregulates p53. Moreover, Daxx overexpressing myelocytes downregulate the proapoptotic Bcl-2 family member Bax, while expression of antiapoptotic Bcl-2 is not influences. Furthermore, expression of Daxx diminishes expression levels of the initiatorcaspases-8 and -10 and the executionor-procaspase-7, whereas the procaspases-3, -6 and -9 remain unaltered. The altered protein levels of caspases in Daxx overexpressing HEL clones are accompanied by a decrease of expression of cIAP-1, -2 and survivin. Despite the described impact of Daxx expression on major molecules of the apoptotic cascade, expression of Daxx in HEL cells does not impact on the rate of proliferation, an effect most likely attributable to the inability to maintain the molecular alterations under the influence of serum withdrawal conditions. Upon a proapoptotic stimulus Daxx is unable to maintain its influence on expression levels of p53, Bax IAPs and the procaspases-8, -10 and -7. In the Daxx-transfected cell line Jurkat overexpression of Daxx increases the rate of apoptosis upon incubation with death receptor agonists such as Fas-L and TRAIL as well as upon incubation with the cytotoxic drug doxorubicin. Analysis of the molecular changes induced in the extrinsic and intrinsic apoptosis pathways reveals that augmentation of apoptosis by Daxx overexpression is conveyed by distinctly different mechanisms. Major differences between Fas/TRAIL-induced apoptosis and doxorubicin-induced apoptosis are observed in expression patterns of XIAP, p53, Bid, ZIP-Kinase and Par-4. The augmented sensibility towards apoptosis was clearly dependent on caspase activation in both pathways. Daxx increases activation of the caspases in distinct ways depending on the apoptotic stimulus. In Daxxpositive clones treated with Fas-L and TRAIL ZIP-Kinase was upregulated, expression of Par-4 and Daxx was diminished proportionately to the rate of apoptosis, i.e. the higher the rate of apoptosis the stronger significant is the downregulation/degradation of Par-4 and Daxx. The combination of Doxorubicin with a Fas-blocking antibody amplified rate of apoptosis and depolarisation of the mitochondrial membrane potential by at least twofold values in Daxx positive clones.