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Isabel Nadine Ott

• Die Gattung Mycobacterium umfasst mehr als einhundert verschiedene Spezies und wird in zwei große Gruppen unterteilt; die Gruppe der typischen Mykobakterien (obligat pathogen) und die Gruppe der atypischen Mykobakterien (fakultativ pathogen, ubiquitär vorkommend). Die Klinik der Mykobakteriosen ist mannigfaltig. Je nach Erreger und Immunstatus des Erkrankten können diese Infektionen, v.a. bei immunkompromittierten Patienten, letal verlaufen. Die frühzeitige Diagnostik und spezifische Therapie kann somit maßgeblich zur Senkung der Letalität der Mykobakteriosen beitragen. Die derzeit zur Verfügung stehenden diagnostischen Methoden sind nicht immer ausreichend um in jedem Einzelfall den Erreger genau zu klassifizieren. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Erarbeitung einer sensitiven und schnellen Methode, zur Identifizierung der typischen und atypischen Mykobakterien. Die Testungen erfolgten zunächst mittels kulturell gewonnenen Mykobakterien-Suspensionen. Anschließend wurde der Methode anhand von, in Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten, Gewebeproben evaluiert. Methode Im Rahmen der Extraktion wurde ein kommerzieller Kit (Roche High Pure PCR Template Preparation Kit®) durch mehrere Schritte ergänzt. Der Gewebe-Verdau mit Proteinase K wurde durch einen Inkubationsschritt über Nacht bei 72°C erweitert. Zudem wurde die Aufspaltung der Hülle der Mykobakterien durch wiederholende Temperaturwechsel von 300°C (+100°C in kochendem Wasser; -196°C in Flüssigstickstoff) unterstützt. Als Zielsequenz der Nested-PCR wurde die 16S rRNA verwendet. Das äußere Primerpaar, mit dem Primer 285 (5´ GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG 3´) und dem Primer 264 (5´TGC ACA CAG GCC ACA AGG GA 3´), amplifiziert ein 1037 Basenpaar langes Fragment. Bei dem inneren Amplifikat der Nested-PCR kommen die Primer 245 (5´ TAA TAC ATG CAA GTC GAA CG 3´) und Primer 259 (5´ TTT CAC GAA CAA CGC GAC AA 3´) zum Einsatz, welche ein Fragment mit der Länge von 560 Basenpaaren amplifizieren. Zur Verringerung der Kontaminationsgefahr wurde die Nested-PCR durch ein UTP-Verfahren ergänzt. Im Rahmen dessen wurden der Primer 285 um 2 Nukleotide am 3´Ende (5´ GAG AGT TTG ATC CTG GCT C 3‘) und der Primer 264 ebenfalls um 2 Nukleotide am 3´Ende (5´TGC ACA CAG GCC ACA AGG 3´) verkürzt. Ergebnisse Mit Hilfe der standardisierten Mykobakterien-Suspensionen konnte eine Sensitivitäts-Steigerung, alleinig durch die erneuerte DNA-Extraktion, um den Faktor 10 gezeigt werden. Die Etablierung der Nested-PCR, im Vergleich zu einer herkömmlichen PCR, brachte nochmalig eine Sensitivitäts-Steigerung um den Faktor 100. Insgesamt wurden 118 Organbiopsien untersucht. Davon war bei 46 Proben klinisch eine Tuberkulose und bei 42 Proben eine atypischen Mykobakteriose nachgewiesen. Die verbleibenden 30 Proben gehörten dem Vergleichskollektiv (Negativkontrollen) an. Von insgesamt 23 kulturell und/oder mikroskopisch positiven Proben konnte bei 7 Proben (30,4%) M. tuberculosis mittels Nested-PCR nachgewiesen werden. Für die atypischen Mykobakteriosen lag die Zahl bei 6 von 23 Proben (26,1%). Damit ist die Nested-PCR für atypische Mykobakterien nicht signifikant schlechter als für M. tuberculosis. Die Spezifität der Nested-PCR mit anschließender Sequenzierung, sowohl für die Tuberkulose, als auch für die atypischen Mykobakteriosen, beträgt 100%. Der positive Vorhersagewert für die Diagnosesicherung einer Tuberkulose, als auch einer atypischen Mykobakteriose, mittels Nested-PCR ist P = 1. Diskussion Diese Nested-PCR ermöglicht mittels nur einer Methode den Nachweis von typischen und atypischen Mykobakterien. Das Verfahren wurde erfolgreich getestet und evaluiert. Mit Hilfe dieses Verfahrens kann innerhalb von 48 Stunden (und an schließender Sequenzierung) der gezielte und spezifische Erregernachweis aus Organbiopsien erfolgen. Zudem bietet es die Möglichkeit einer routinemäßigen Anwendung. Diese Methode kann demnach in Einzelfällen zu einer eindeutigen und schnellen Diagnosesicherung und zur frühzeitigen und gezielten antimykobakteriellen Therapie beitragen. Darüber hinaus beinhaltet sie die Möglichkeit zur Durchführung von retrospektiven Studien, da der Nachweis der Mykobakterien aus Formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben erfolgte.
• The genus Mycobacterium includes more than one hundred species. It can be subdivided into two main groups, typical (obligate pathogen) and atypical (facultative pathogen, ubiquitous) mycobacteria. The clinical symptoms resulting from mycobacteriosis can be very diverse. These infections may be fatal depending on the agent and the state of the patient’s immune system. The risk of fatality can be reduced dramatically if the mycobacteriosis is diagnosed at an early stage, allowing customised treatment. The diagnostic methods that are currently available do not always suffice distinct agent classification. This dissertation aims to develop an efficient and sensitive method for identifying typical and atypical mycobacteria. The tests were initially carried out using mycobacterial suspensions which were obtained from cultures. Subsequently, formalin-fixed, paraffin-imbedded tissue samples were deployed to evaluate the method. Method A commercial Kit (Roche High Pure PCR Template Preparation Kit®) supplemented by several extra steps was used for the extraction. This included, among other steps, extending the incubation period of tissue fermentation with proteinase K over night at 72°C. To aid splitting the mycobacterial shell the temperature was repeatedly varied between +100°C (boiling water) and -196°C (liquid nitrogen). The target for the nested-PCR was the 16S rRNA. The outer pair of primers consisted of primer 285 (5´ GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG 3´) and primer 264 (5´ TGC ACA CAG GCC ACA AGG GA 3´). These primers amplify a fragment of 1037 base pairs in length. For the inner amplification the primers 245 (5´ TAA TAC ATG CAA GTC GAA CG 3´) and 259 (5´ TTT CAC GAA CAA CGC GAC AA 3´) came into use. The resulting fragment here is 560 base pairs long. In order to lessen the risk of contamination, the nested-PCR was supplemented by a UTPprocedure. To do so, it was necessary to truncate primers 285 and 264. They were both shortened at the 3’ end (primer 285: 5´ GAG AGT TTG ATC CTG GCT C 3‘, primer 264: 5´ TGC ACA CAG GCC ACA AGG 3´). Results By utilising standardised mycobacterial suspensions, it could be demonstrated that the sensitivity increased tenfold with the enhanced extraction alone. This effect could be further magnified by deploying a nested-PCR. In this case the sensitivity could be increased up to 100 times to that of a regular PCR. In all 118 biopsies were examined. Of these, 46 samples had apparent tuberculosis and 42 samples had atypical mycobacteriosis. The remaining 30 samples made up the control group. M. tuberculosis could be proven in seven of the 23 (30.4%) cultural and/or microscopic positive samples using a nested-PCR. This number was six out of 23 samples (26.1%) for the atypical mycobacteriosis. Therefore the nested-PCR for M. tuberculosis was not significantly better than it was for atypical mycobacteria. The specificity of the nested-PCR was 100% for both groups. The positive predicted value was P = 1 for an assured diagnosis of tuberculosis and atypical mycobacteriosis. Discussion This nested-PCR method enabled detection of typical and atypical mycobacteria in one process, which proved successful and achieved a positive evaluation. It makes it possible to localise and identify the agents within 48 hours (excluding sequencing). In addition, it lends itself to everyday clinical use. The procedure ensures a faster and more precise diagnosis so that a customised mycobacterial treatment can be initiated as soon as possible. Due to the tissue samples being formalin-fixed and paraffin-imbedded, this nested-PCR method offers the opportunity of carrying out retrospective studies.