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Victoria Andrea Maria Recknagel

• Die E3-Ubiquitinligase TRIM25 ist in verschiedenen humanen Tumoren verstärkt exprimiert, was häufig mit einer schlechten Prognose der betroffenen Patienten sowie dem Auftreten von Therapieresistenzen korreliert. Unsere Arbeitsgruppe konnte TRIM25 zuvor als Caspase-2 und -7 mRNA-bindendes Protein und negativen Regulator beider Caspasen in humanen Kolonkarzinomzellen identifizieren. Ein transienter TRIM25 Knockdown führt in Abhängigkeit der erhöhten Expression der jeweiligen Caspasen zur Sensitivierung der Kolonkarzinomzellen gegenüber Chemotherapeutika-induzierter Apoptose. Ein Ziel dieser Arbeit war, die Übertragbarkeit dieser Erkenntnisse auf einen loss-of-function-Ansatz mit stabilen TRIM25 Knockdown Zellen zu überprüfen. Die stabilen Knockdown Zellen sollten der späteren Etablierung eines Xenograftmodells dienen. Da zahlreiche TRIM Proteine bekannterweise eine vielseitige Rolle bei der Regulation sowohl onkogener als auch tumorsuppressiver Prozesse einnehmen, wurde als weitere maßgebliche Fragestellung dieser Arbeit der Einfluss von TRIM25 auf wichtige tumorigene Eigenschaften wie Proliferation, Migration, Zellzyklus und Inflammation untersucht. TRIM25-abhängige Effekte auf das Migrationsver halten von RKO-Zellen wurden im in vitro-Wundheilungsassay mit stabilen TRIM25 Knock down Zellen analysiert. Aufgrund hoher interexperimenteller Unterschiede im Migrations verhalten derselben Zellklone konnte hinsichtlich einer TRIM25-abhängigen Regulation der Migration jedoch keine eindeutige Aussage getroffen werden. Dagegen belegten die gezeigten Proliferationsassays eine signifikant vermehrte Proliferation von RKO-Zellen nach stabilem TRIM25 Knockdown. Dies legt eine tumorsuppressive Rolle von TRIM25 nahe. Durch flusszytometrische Analysen stabiler TRIM25 Knockdown und Kontrollzellen zeigten hinge gen keinen konsistenten Einfluss von TRIM25 auf den Zellzyklus von RKO-Zellen. Eine Sensitivierung von Kolonkarzinomzellen gegenüber Chemotherapeutika-induzierter Apoptose konnte auch in stabilen TRIM25 Knockdown Zellen nachgewiesen werden, während die für transiente Ansätze bekannte, TRIM25 Knockdown-abhängige Hochregulation von Caspase 2 und -7 dagegen deutlich geringer ausgeprägt war. Dies lässt vermuten, dass die Tumorzellen einer Hochregulation Zelltod-induzierender Proteine bei einem konstitutiven TRIM25Knockdown gegenregulieren. Aufgrund der aber nach wie vor nachweisbaren Sensitivierung der TRIM25 Knockdown Zellen gegenüber Apoptose, können zusätzliche, bisher noch nicht bekannte Mechanismen postuliert werden, welche zur Sensitivierung dieser Zellen gegenüber Apoptose beitragen. Die daraus abgeleitete, TRIM25-abhängige Apoptosehemmung spricht für einen „Überlebensmechanismus“, welcher maßgeblich zur Chemotherapieresis tenz von Kolonkarzinomzellen beitragen kann. Hinsichtlich eines Einflusses von TRIM25 auf entzündliche Prozesse wurden RKO-Zellen mit klassischen Aktivatoren des NLRP3-Inflammasoms stimuliert und ausgewählte Marker mittels Western Blot-Analysen nachgewiesen. TRIM25 Knockdown-abhängig war eine verminderte Spaltung der Apoptosemarker Caspase-3, -7 und PARP-1 nachweisbar. Caspase-7 und PARP-1 spielen bekanntermaßen auch im Rahmen Inflammasom-induzierter Signalprozesse eine wichtige Rolle, während die Spaltung von Caspase-3 durch das NLRP3-Inflammasom induziert werden kann und v.a. für apoptotische oder pyroptotische Prozesse verantwortlich gemacht wird. Daher kann postuliert werden, dass der stabile TRIM25 Knockdown zur Hemmung von Inflammasom-induzierten Signalprozessen führt und darüber Kolonkarzinomzellen vor Apoptose/Pyroptose geschützt werden. Umgekehrt deutet dies auf eine Aktivierung von Inflammasom-vermittelten Signalprozessen durch TRIM25 hin. Aufgrund der hohen Inzidenz und Mortalität, der schlechten Prognose und der Entwicklung von Therapieresistenzen besteht ein dringender Bedarf in der Entwicklung neuer, verbesserter Therapien des kolorektalen Karzinoms sowie der Resensibilisierung der Krebszellen gegenüber gängigen, bereits bestehenden Therapieoptionen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein onkogener Einfluss von TRIM25 auf Kolonkarzinomzellen durch Hemmung Chemotherapeutika-induzierter Apoptose nachgewiesen werden, während eine mögliche tumorigene Rolle von TRIM25 durch zusätzliche Aktivierung Inflammasom-induzierter Signalprozesse weiterer Untersuchungen bedarf. Zusammenfassend kann TRIM25 als vielversprechender therapeutischer Angriffspunkt für die Entwicklung von sowohl neuen antientzündlichen als auch tumorsuppressiven Therapien betrachtet werden.
• The E3 ubiquitin ligase TRIM25 is overexpressed in various human tumors and often correlates with poor prognosis and the occurrence of therapy resistance in patients. Our group has previously identified TRIM25 as a caspase-2 and -7 mRNA-binding protein and novel suppressor of both caspases in human colon carcinoma cells. Transient TRIM25 silencing leads to increased sensitivity of colon carcinoma cells towards drug-induced apoptosis depending on the increased expression of the respective caspases in response to TRIM25 silencing. The goal of this study was to compare results from the transient TRIM25 knockdown approach with those obtained with stable TRIM25 knockdown cells. These cells were also planned for the later establishment of a xenograft model of colon cancer. Since TRIM proteins are known to play multifaceted roles in the regulation of both oncogenic and tumor-suppressive processes, a further aim of this study was to investigate the impact of TRIM25 on important tumorigenic features such as proliferation, migration, cell cycle and inflammation. TRIM25-dependent effects on the migration of RKO cells were analyzed by wound healing assays in stable TRIM25 knockdown cells. However, due to inter-experimental differences in the migration of cell clones, no conclusion could be made regarding a TRIM25-dependent regulation of migration. Besides a comparison of cell cycle of stable TRIM25 knockdown with control cells by flow cytometry did not reveal any consistent impact of TRIM25. In contrast, proliferation assays demonstrated a significant increase in cell proliferation in stable TRIM25 knockdown cells suggesting a tumor suppressive role of TRIM25. A sensitization of colon carcinoma cells towards drug-induced apoptosis was confirmed in stable TRIM25 knockdown cells, while the stable TRIM25 knockdown-dependent upregulation of caspases was weaker than after transient knockdown. This suggests that the tumor cells counter-regulate the upregulation of cell death-inducing proteins during a long-term TRIM25 knockdown. However, since cells were still sensitized to drug-induced apoptosis, additional, as yet unknown mechanisms contributing to the TRIM25 knockdown-dependent sensitization of colon carcinoma cells can be postulated. The concluded TRIM25-dependent inhibition of apoptosis supports the assumption of a "survival mechanism" which is underlying chemotherapeutic drug resistance of colon carcinoma cells. Regarding the possible influence of TRIM25 on inflammatory processes, RKO cells were stimulated with classical activators of the NLRP3 inflammasome and selected markers were detected by Western blot analysis. The results showed reduced cleavage of caspase-3, -7 and PARP-1 in stable TRIM25 knockdown cells. While cleavage of Caspase-7 and PARP-1 indicate an activation in inflammasome-induced signaling processes, the cleavage of caspase-3 by the NLRP3 inflammasome is more likely to reflect either apoptotic or pyroptotic processes. Together these data indicate that the long-term TRIM25 knockdown impairs inflammasome-induced signaling processes and thereby may protect colon carcinoma cells from apoptosis/pyroptosis. Conversely, this suggests an activation of inflammasome-mediated signaling processes by TRIM25. Due to the high incidence and mortality, the poor prognosis and the development of therapy resistance, there is an urgent need for the development of new, improved therapies for colorectal carcinoma and the resensitization of cancer cells to current therapies. The results of this study demonstrate an oncogenic impact of TRIM25 on colon carcinoma cells by inhibiting drug-induced apoptosis, while a possible tumorigenic role of TRIM25 through additional activation of inflammasome-induced signaling processes needs further investigation. In summary, TRIM25 could reflect a promising therapeutic target for the development of new anti-inflammatory and tumor-suppressive therapies.