Open Access

Samuel Arthur Theuerkauf

• In den letzten Jahren haben verschiedene pandemische Viren zu beträchtlichen Krankheits- und Todesfällen geführt. Um dieser ständigen Bedrohung entgegenzuwirken, ist es wichtig diagnostische Testsysteme und Therapien anzupassen oder neu zu etablieren. Diese Arbeit konzentriert sich auf die pandemischen Viren SARS-CoV-2 und HIV. Der Zelleintritt von SARS-CoV-2 wird durch das Spike-Protein (S) ausgelöst, welches die Fusion der Virushülle mit der zellulären Membran bewirkt. Erste Studien haben gezeigt, dass das S-Protein eine hohe Fusionsaktivität aufweist. Aus diesem Grund sollten in dieser Arbeit neue Fusionstests etabliert werden, um potenzielle Inhibitoren der Zellfusion zu evaluieren. Im ersten Teil dieser Thesis wird die Etablierung von quantitativen Tests zur Evaluierung der Zell-Zell und Partikel-Zell Fusionsaktivität, welche durch S bewirkt wird, demonstriert. Trotz jahrelanger Forschung können HIV-Patienten nicht geheilt werden und Virusinfektionen treten weiterhin weltweit auf. Das größte Problem bei der Entwicklung eines Heilmittels ist die frühe Bildung von Reservoirzellen während einer Infektion. Um diese Reservoirzellen zu identifizieren, wurde der Oberflächenmarker CD32a vorgeschlagen. Die Nutzung von Cas9-Nukleasen zur Inaktivierung von HIV ist in vitro erfolgreich, aber der effiziente Transfer in Reservoirzellen bleibt weiterhin herausfordernd. Im zweiten Teil dieser Thesis werden Rezeptor-gerichtete Adeno-assoziierte Vektoren (AAVs) für die HIV-Gentherapie präsentiert, die CD4 und CD32a für den Zelleintritt nutzen. Zur Charakterisierung der Fusionsaktivität von SARS-CoV-2 wurden drei quantitative Fusionstests etabliert, welche Partikel- und Zell-Zell Fusionen berücksichtigen. Für den Partikel-Zell Fusionstest wurden lentivirale Vektoren (LV) verwendet, welche das S-Protein auf ihrer Oberfläche präsentierten. Die Transduktionseffizienz von S-LV erreichte auf Zellen, die den SARS-CoV-2 Rezeptor ACE2 exprimieren, ein Signal-zu-Hintergrund Verhältnis von über 2000. Durch die Präsentation von S auf leeren LV-Partikeln konnte die Fusion von benachbarten Zellen detektiert und quantifiziert werden („fusion-from-without“ (FFWO)). Für die Quantifizierung wurde ein Reporter-Komplementationstest etabliert. Hierbei wurden die Alpha- und Omega-Fragmente der β-Galaktosidase getrennt in zwei Zielzellpopulationen exprimiert, die beide ACE2 exprimierten. Durch die Zugabe von S-Partikeln kam es zur Fusion der Zielzellen und zur Komplementation der Alpha- und Omega-Fragmente. Die resultierende β-Galaktosidase-Aktivität konnte anschließend quantifiziert werden. Unter optimalen Versuchsbedingungen erreichte dieser Assay ein Signal-zu-Hintergrund Verhältnis von 2,7 Größenordnungen. Anschließend wurde der Komplementationstest für die Messung der Zell-Zell Fusion verwendet. In diesem Test exprimierten Effektorzellen S und das Alpha-Fragment, Zielzellen ACE2 und das Omega-Fragment. Obwohl die S-Expression auf den Effektorzellen sehr gering war, konnte dennoch eine signifikante Fusion nachgewiesen werden. Auch hier konnte unter optimalen Versuchsbedingungen ein hohes Signal-zu-Hintergrund Verhältnis von 2,9 Größenordnungen festgestellt werden. Nach der Etablierung der Testsysteme wurden S-spezifische Inhibitoren verwendet. Im Gegensatz zu Partikel-Zell-Fusionen wurde die Fusionsaktivität von S auf Zellen nur mäßig inhibiert. Dies deutet daraufhin, dass das Eindringen von Partikeln in Zellen wirksamer verhindert werden kann als die Ausbreitung durch Zell-Zell Fusionen. Um AAVs spezifisch an HIV-Reservoirzellen zu binden, wurden CD4- und CD32a-spezifische DARPins („designed ankyrin repeat proteins“) in Rezeptor-verblindete AAVs eingebaut. Ebenso wurden beide DARPins gleichzeitig auf dem Kapsid präsentiert, um eine höhere Spezifität für doppelt-positive Zellen zu erreichen. Wenn diese Partikel einer Zellmischung aus CD4-, CD32a- und CD4/CD32a-exprimierenden Zellen zugesetzt wurden, transduzierten die bispezifischen Vektoren vorzugsweise doppelt-positive Zellen. Diese Präferenz war am höchsten in Zellkulturen, die stark unterrepräsentierte CD4/CD32a-exprimierende Zellen enthielten. Unter diesen Voraussetzungen erreichten bispezifische Vektoren eine bis zu 66-fach höhere Transduktionseffizienz auf CD4/CD32a-positive Zellen im Vergleich zu CD32a-exprimierenden Zellen. Darüber hinaus zeigten bispezifische AAV eine präferentielle Bindung und Transduktion von isolierten Primärzellen und Zellen in Vollblut. Selbst nach systemischer Injektion in humanisierte Mäuse wurden doppelt-positive Zellen effizienter von bispezifischen als von monospezifischen AAVs transduziert. Schließlich zeigten die generierten Vektoren, welche die Cas9 Nuklease transferierten, eine effiziente Inhibition der HIV-Replikation.