Optimierung eines Vollblutassays zur durchflusszytometrischen Bestimmung antigenspezifischer T-Lymphozyten der Herpesvirengruppe und seine Anwendbarkeit bei immunsupprimierten Patienten nach Stammzelltransplantation
- Der durchflusszytometrische Nachweis antigenspezifischer T-Lymphozyten über die
Zytokinproduktion nach Kurzeitstimulation ermöglicht Aussagen über die zelluläre
Immunität, was in bestimmten Patientenkollektiven wie z. B. stammzelltransplantierten
Patienten von großem Wert sein kann. Infektionen mit Herpesviren wie z.B. dem
humanen Zytomegalievirus (CMV) oder den Herpes-Simplex-Viren (HSV) können in
diesem Kollektiv zu schweren, zum Teil auch letal verlaufenden Erkrankungen führen.
Zwar wurde diese Methode inzwischen durch die Entwicklung kommerzieller Testkits
zum Nachweis dieser Lymphozyten direkt aus Vollblut vereinfacht. Dennoch ist die
Durchführung dieses Tests nur wenig standardisiert und sehr aufwendig. In dieser
Arbeit wurde die Methode der Bestimmung antigenspezifischer T-Lymphozyten aus
Vollblut daher im Bezug auf die Durchführbarkeit optimiert sowie die Anwendbarkeit
dieser Methode bei Patienten mit bestehender Lymphopenie evaluiert.
Im Einzelnen wurde zunächst die Messung antigenspezifischer CD4+ T-Lymphozyten
anhand des Superantigens Staphylokokkenenterotoxin-B (SEB) sowie der Herpesviren
CMV und HSV-1 eingeführt. Hierzu wurde die Spezifität der Lymphozytenreaktionen
im Hinblick auf den Immunstatus von Probanden getestet und die Reproduzierbarkeit
der Messergebnisse ermittelt. Zur Vereinfachung der Stimulation wurde der
Thermoblock eingeführt, der die Inkubation der Proben automatisch nach einer
vorgegebenen Zeitspanne beendet. Vergleichende Ansätze nach der herkömmlichen
Methode mit einer Inkubation im Brutschrank ergaben keine Differenzen zwischen den
Inkubationsmethoden hinsichtlich der Resultate. Weiterhin wurde versucht, die Proben
zu konservieren, um so das Zeitfenster zwischen Blutentnahme und Verarbeitung der
Blutprobe zu vergrößern. Hierfür wurden die Proben mit dem Reagenz CytoChex®
behandelt, einem Zellstabilisator, der der Konservierung von Leukozyten dient. Trotz
mehrfacher Abwandlung des Protokolls gelang es nicht, die Blutproben für die
antigenspezifische Stimulation zu konservieren.
Ein zentraler Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Fragestellung nach der
Anwendbarkeit dieses Testes zum Nachweis CMV-spezifischer T-Lymphozyten im
Rahmen einer Lymphopenie. Dies wurde bei einem Kollektiv stammzelltransplantierter
Patienten untersucht. Es zeigte sich, dass in diesem Kollektiv der Test durchführbar ist,
wenn mindestens 1.000 CD8+ T-Lymphozyten bzw. 3.000 CD4+ T-Lymphozyten durchflusszytometrisch nachgewiesen werden konnten. Anhand dieses Kollektivs wurde
zuletzt die Effizienz dieser Methode durch Weglassen der Kontrollantigenmessungen in
bestimmten Fällen und Einführung eines Auswertungstemplates zur indirekten
Ermittlung CD4+ T-Lymphozyten aus der CD8+ T-Lymphozytenmessung gesteigert.
Zusammenfassend bringen die in dieser Arbeit vorgestellten Modifikationen der
Standardmethode eine deutliche Vereinfachung mit sich. Weiterhin wird es möglich,
auch im Rahmen einer Lymphopenie antigenspezifische T-Lymphozyten nachzuweisen.
Dies ermöglicht zumindest weitere Untersuchungen im Hinblick auf die Fragestellung
nach einer ausreichenden Immunantwort gegen CMV bei immunsupprimierten
Patienten. So können in Zukunft auch bei Patienten mit hohem Risiko für eine CMVReaktivierung
und Erkrankung Aussagen über die Immunsituation gemacht werden um
möglicherweise eine Verbesserung der diagnostischen und damit auch therapeutischen
Situation dieser Patienten zu erzielen.
- The detection and quantification of antigen specific T lymphocytes by measurement of
intracellular cytokine production after short time stimulation provides information about
cellular immunity. Such information can be useful in the assessment of the immune
status of specific patient groups, for example after stem cell transplantation. In these
patients infections with herpes viruses such as human cytomegalovirus (CMV) or
herpes simplex virus (HSV) may cause severe disease and death. Though commercial
test kits helped to simplify the detection of antigen specific T lymphocytes, they are still
little standardized and elaborated. Furthermore the determination of CMV-specific
lymphocytes may be limited by lymphopenia occurring after transplantation. We
evaluated a commercial test kit for the reliable determination of CMV specific
development in lymphopenic patients after stem cell transplantation. Using a whole
blood protocol for the flow cytometric detection of antigen-specific CD4+ T-helper and
CD8+ cytotoxic T lymphocytes this test kit measures intracellular cytokine production
after stimulation with HCMV antigen. In addition we optimized the test with regards to
cost and time efficiency.
First the detection of specific lymphocytes was introduced utilizing staphylococcal
enterotoxine B (SEB) and the herpes viruses HSV-1 and CMV. The specifity of the
immune response was tested and the reproducibility evaluated. A thermomixer was
introduced to simplify the process of stimulation. Compared to incubation in the
incubator, there was no difference in the results. Further preservation of blood samples
was attempted to extend the time frame between withdrawal and processing of blood
tests. Therefore samples were treated with the reagent CytoChex®, a cell stabilizing
solution. Tough many variations of the protocol were tested, there was no success in the
conservation of blood samples for later antigen stimulation.
The measurement of HCMV-specific T lymphocytes was feasible when at least 3,000
CD4+ or 1,000 CD8+ T cells could be counted by flow cytometry. Detection of
HCMV-specific T lymphocytes was possible, on average, 67 (SD±61) days after
transplantation for CD4+ cells and 27 (SD±13) days for CD8+ cells, thus being still
within the critical time for HCMV reactivation.
In conclusion, the use of modern test kits permits the measurement of HCMV-specific T
lymphocytes in stem cell transplant recipients and may be included in the HCMV monitoring system after SCT. The modifications presented in this work simplify the
processing of the samples significantly. This enables further investigations regarding the
quality of an immune response against specific pathogens such as CMV, to assess the
immune situation of patients with high risk for a reactivation and disease. This may help
to improve the diagnostic and therapeutic situation of these patients.