Open Access

Sanjay Menon

• Ziel der vorliegenden Arbeit war es ein in vitro Modell mit verschiedenen Zellkulturen zunächst zu erschaffen, anhand dessen man pathologische Erkenntnisse für die anschließende Untersuchung von Blutkomponenten von herzchirurgischen Patienten, die mit Hilfe der Herz-Lungen-Maschine [HLM] operiert wurden, gewinnen wollte. Die dabei anschließend untersuchten Blutkomponenten der Patienten waren neutrophile Granulozyten [PMN], die für endotheliale Dysfunktionen und damit Störungen der interzellulären Kontakte an der Blut-Hirn-Schranke [BHS] verantwortlich gemacht werden. Für die Untersuchungen wurden ausschließlich Western Blots verwendet mit deren Hilfe man die Änderungen der Expression der einzelnen Zell-Zell-Proteine nachgewiesen hat. Als Modelle für die interzellulären Kontakte dienten Zellkulturmodelle, an denen die jeweils dominierenden Kontakttypen untersucht wurden. Am Modell der „Adherens Junction“ [AJ] mit humanen umbilikalvenösen Zellen [HUVEC] stellte sich heraus, dass eine Stimulation dieser Zellen mit TNF-α und eine anschließende Kokultivierung mit agonistischen CD29 AK stimulierten polymorphkernigen Granulozyten [PMN] zu einer Veränderung, im Sinne einer reduzierten Expression, von AJ und „Tight Junction“ [TJ] Molekülen führte. Dabei ist bekannt, dass β1 –Integrin [CD29] abhängige Mechanismen bei von herzchirurgischen Patienten stammenden PMN im Rahmen von Transmigrationsvorgängen eine Rolle spielen und durch einen CD29-inhibierenden Antikörper blockierbar sind. Eine Kombination von TNF-α und agonistischen CD29 Antikörper zusammen beeinflußt die Barrierefunktion mehr als die Einzelsubstanzen. Außerdem wurde der Natrium-Protonen-Austauscher Hemmer Cariporid [HOE642] mit seinen aus in vivo bekannten Zell-Zell-Kontakt-stabilisierenden Effekt untersucht. Hierbei wurden CACO-2 Zellen benutzt, die besonders stark TJ exprimieren. Es zeigte sich, dass dieser Stoff im Stande ist, die TJ bei paralleler Anwendung von PMA, einem Endothelschranken Modulierer, zu stabilisieren. In einer unabhängigen Studie sah man ebenfalls, dass die S100-B Werte im Blut durch diese Substanz gesenkt wird. Eine andere Zelllinie wurde allerdings nicht untersucht. Versuche mit Stimuli zeigten, dass PMA vorstimulierte MVEZ in Kokultur mit unbehandelten PMN von gesunden Probanden fähig sind, AJ Proteine in ihrer Verteilung zu modulieren. Das gleiche Ergebnis konnte auch bei mit niedriger Konzentration (1U /ml) TNF-α stimulierte MVEZ mit unbehandelten PMN von gesunden Probanden für AJ und TJ Proteine gezeigt werden. Bei Stimulation der MVEZ mit TNF-α und Stimulation der PMN mit PMA kam es zu Änderungen an beiden Zell-Zell-Kontakt Typen, wobei eine zeitkinetische Komponente relevant zu sein scheint. Bei Doppelstimulation der Endothelzellen und der Leukozyten mit PMA kam es ohne Signifikanz der Dauer zu einer Minderproduktion der AJ Moleküle β-Catenin und VE-Cadherin. Zudem ist auch interessant festzustellen, dass mikrovaskuläre Endothelzellen, die mit einer Konzentration TNF-α ab 50U /ml aktiviert werden, ohne weiteren Granulozyteneinfluss bereits modulierende Effekte auf die interzellulären Kontakte erfahren. Versuche mit Patienten PMN, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Operation abgenommen und mit MVEZ vom Schwein kokultiviert wurden, wiesen Hinweise auf eine funktionelle Beeinträchtigung der Zell-Zell-Kontakte auf.
• The intention of this dissertation was to establish an in vitro model with different cell cultures that ought to assist to subsequently gain insight into the pathological processes, which occur in patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass (CPB). The relevant blood components of these patients for this thesis that were examined in ensuing steps, were polymorphnuclear granulocytes (PMN), which are responsible for the endothelial dysfunctions and thus disorders of the intercellular bonds of the blood-brain-barrier (BBB). The experiments were exclusively based on Western Blotting, which helped to determine the change of protein amount of the cell-cell contacts. Cell cultures with corresponding dominating contact types were used as reference models for the intercellular bonds. With the primarily “adherens junction” (AJ) expressing model of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) it could be shown that a stimulation of these cells with the cytokine TNF- α and a following co-culture with CD29 (an integrine on leukocytes) stimulated PMN leads to a reduced production of AJ and “tight junction” (TJ) molecules. It is well known that β1- Integrine (CD29) dependent mechanisms from PMN of cardiac surgery patients play a role in transmigration actions and that they can be blocked with the aid of an CD29 inhibiting antibody. It could be shown that a combination of both, TNF- α and CD29 stimulating antibodies, influence the properties of the cellular barrier more than the single substances themselves. Besides we examined the sodium-proton-exchange-inhibitor [cariporide, HOE642], which is known in vivo to have a stabilizing effect on the cell-cell contacts. CACO-2 cells were utilized herefore, which primarily express TJ. The experiments showed that this substance was able to stabilize the TJ when given to the endothelial cells parallel to PMA, a known modulator of the cell barrier. However, another cell line was not examined. In an independent study cariporide was proven to also decrease the S 100-B parameters in blood. Studies with stimulating substances showed that PMA stimulated microvascular endothelial cells (MVEC) cocultured with nonstimulated PMN of healthy subjects are able to modulate AJ proteins in their cell distribution. The same result could be gained for AJ and TJ with TNF- α (in a low concentration: 1U/ ml) stimulated MVEC with unstimulated PMN of healthy subjects. When both the cells were stimulated parallel, i.e. MVEC with TNF- α and PMN with PMA, changes in both the cell-cell contact types was seen. However, a time dependent component seems to be relevant for this. When stimulating both, endothelial cells and leucocytes with PMA, there was a time independent reduced production of the AJ molecules β- catenin and VE-cadherin. Further, it is interesting to note that MVEC, which are stimulated with a TNF- α concentration from 50 U/ ml onwards, without additional impact of granulocytes, show modifying effects on the intercellular contacts. Finally, experiments with PMN of patients of different time points, who were undergoing cardiac surgery, and subsequent coculture with porcine MVEC showed a functional impairment of the cell-cell contacts.