Open Access

Birgit Kabartaş

• Der durchflusszytometrische Nachweis antigenspezifischer T-Lymphozyten über die Zytokinproduktion nach Kurzeitstimulation ermöglicht Aussagen über die zelluläre Immunität, was in bestimmten Patientenkollektiven wie z. B. stammzelltransplantierten Patienten von großem Wert sein kann. Infektionen mit Herpesviren wie z.B. dem humanen Zytomegalievirus (CMV) oder den Herpes-Simplex-Viren (HSV) können in diesem Kollektiv zu schweren, zum Teil auch letal verlaufenden Erkrankungen führen. Zwar wurde diese Methode inzwischen durch die Entwicklung kommerzieller Testkits zum Nachweis dieser Lymphozyten direkt aus Vollblut vereinfacht. Dennoch ist die Durchführung dieses Tests nur wenig standardisiert und sehr aufwendig. In dieser Arbeit wurde die Methode der Bestimmung antigenspezifischer T-Lymphozyten aus Vollblut daher im Bezug auf die Durchführbarkeit optimiert sowie die Anwendbarkeit dieser Methode bei Patienten mit bestehender Lymphopenie evaluiert. Im Einzelnen wurde zunächst die Messung antigenspezifischer CD4+ T-Lymphozyten anhand des Superantigens Staphylokokkenenterotoxin-B (SEB) sowie der Herpesviren CMV und HSV-1 eingeführt. Hierzu wurde die Spezifität der Lymphozytenreaktionen im Hinblick auf den Immunstatus von Probanden getestet und die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse ermittelt. Zur Vereinfachung der Stimulation wurde der Thermoblock eingeführt, der die Inkubation der Proben automatisch nach einer vorgegebenen Zeitspanne beendet. Vergleichende Ansätze nach der herkömmlichen Methode mit einer Inkubation im Brutschrank ergaben keine Differenzen zwischen den Inkubationsmethoden hinsichtlich der Resultate. Weiterhin wurde versucht, die Proben zu konservieren, um so das Zeitfenster zwischen Blutentnahme und Verarbeitung der Blutprobe zu vergrößern. Hierfür wurden die Proben mit dem Reagenz CytoChex® behandelt, einem Zellstabilisator, der der Konservierung von Leukozyten dient. Trotz mehrfacher Abwandlung des Protokolls gelang es nicht, die Blutproben für die antigenspezifische Stimulation zu konservieren. Ein zentraler Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Fragestellung nach der Anwendbarkeit dieses Testes zum Nachweis CMV-spezifischer T-Lymphozyten im Rahmen einer Lymphopenie. Dies wurde bei einem Kollektiv stammzelltransplantierter Patienten untersucht. Es zeigte sich, dass in diesem Kollektiv der Test durchführbar ist, wenn mindestens 1.000 CD8+ T-Lymphozyten bzw. 3.000 CD4+ T-Lymphozyten durchflusszytometrisch nachgewiesen werden konnten. Anhand dieses Kollektivs wurde zuletzt die Effizienz dieser Methode durch Weglassen der Kontrollantigenmessungen in bestimmten Fällen und Einführung eines Auswertungstemplates zur indirekten Ermittlung CD4+ T-Lymphozyten aus der CD8+ T-Lymphozytenmessung gesteigert. Zusammenfassend bringen die in dieser Arbeit vorgestellten Modifikationen der Standardmethode eine deutliche Vereinfachung mit sich. Weiterhin wird es möglich, auch im Rahmen einer Lymphopenie antigenspezifische T-Lymphozyten nachzuweisen. Dies ermöglicht zumindest weitere Untersuchungen im Hinblick auf die Fragestellung nach einer ausreichenden Immunantwort gegen CMV bei immunsupprimierten Patienten. So können in Zukunft auch bei Patienten mit hohem Risiko für eine CMVReaktivierung und Erkrankung Aussagen über die Immunsituation gemacht werden um möglicherweise eine Verbesserung der diagnostischen und damit auch therapeutischen Situation dieser Patienten zu erzielen.
• The detection and quantification of antigen specific T lymphocytes by measurement of intracellular cytokine production after short time stimulation provides information about cellular immunity. Such information can be useful in the assessment of the immune status of specific patient groups, for example after stem cell transplantation. In these patients infections with herpes viruses such as human cytomegalovirus (CMV) or herpes simplex virus (HSV) may cause severe disease and death. Though commercial test kits helped to simplify the detection of antigen specific T lymphocytes, they are still little standardized and elaborated. Furthermore the determination of CMV-specific lymphocytes may be limited by lymphopenia occurring after transplantation. We evaluated a commercial test kit for the reliable determination of CMV specific development in lymphopenic patients after stem cell transplantation. Using a whole blood protocol for the flow cytometric detection of antigen-specific CD4+ T-helper and CD8+ cytotoxic T lymphocytes this test kit measures intracellular cytokine production after stimulation with HCMV antigen. In addition we optimized the test with regards to cost and time efficiency. First the detection of specific lymphocytes was introduced utilizing staphylococcal enterotoxine B (SEB) and the herpes viruses HSV-1 and CMV. The specifity of the immune response was tested and the reproducibility evaluated. A thermomixer was introduced to simplify the process of stimulation. Compared to incubation in the incubator, there was no difference in the results. Further preservation of blood samples was attempted to extend the time frame between withdrawal and processing of blood tests. Therefore samples were treated with the reagent CytoChex®, a cell stabilizing solution. Tough many variations of the protocol were tested, there was no success in the conservation of blood samples for later antigen stimulation. The measurement of HCMV-specific T lymphocytes was feasible when at least 3,000 CD4+ or 1,000 CD8+ T cells could be counted by flow cytometry. Detection of HCMV-specific T lymphocytes was possible, on average, 67 (SD±61) days after transplantation for CD4+ cells and 27 (SD±13) days for CD8+ cells, thus being still within the critical time for HCMV reactivation. In conclusion, the use of modern test kits permits the measurement of HCMV-specific T lymphocytes in stem cell transplant recipients and may be included in the HCMV monitoring system after SCT. The modifications presented in this work simplify the processing of the samples significantly. This enables further investigations regarding the quality of an immune response against specific pathogens such as CMV, to assess the immune situation of patients with high risk for a reactivation and disease. This may help to improve the diagnostic and therapeutic situation of these patients.