Open Access

Julia Schulte

• Das bakterielle Transfusionsrisiko stellt eine große Herausforderung in der Transfusionsmedizin dar, bei dem aufgrund der Lagerungstemperatur vor allem die Thrombozytenkonzentrate, aber auch Erythrozytenkonzentrate betroffen sind. In Deutschland wurde als Maßnahme zur Reduzierung des Risikos die Haltbarkeit der Thrombozytenkonzentrate von 5 Tagen auf 4 Tage verkürzt. Neben bakteriellen Kulturmethoden sind in den letzten Jahren auch Schnellnachweismethoden entwickelt worden. Die Einführung von Realtime-PCR Methoden hat besonders bei viralen transfusionsmedizinisch relevanten Pathogenen zu einer signifikanten Reduktion des Restinfektionsrisikos geführt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Optimierung einer generischen Bakterien PCR aus Thrombozytenkonzentraten und aus Vollblut sowie eine Anwendungsstudie des entwickelten Nachweisverfahrens aus Vollblutproben. Im ersten Teil, in dem die Entwicklung und Optimierung der Bakterien-PCR im Vordergrund stand, wurden sieben unterschiedliche Extraktionsverfahren synoptisch miteinander verglichen. Eine Hauptherausforderung bestand darin, dass einzelne PCR-Reagenzien und auch Verbrauchsartikel mit bakteriellen ribosomalen Nukleinsäuren kontaminiert waren und somit reaktive Signale sowohl in Negativkontrollen als auch in Wasserkontrollen detektiert wurden. Letztendlich erwies sich eine Extraktion aus Vollblutproben in Kombination mit einer SYBR Green 16S-PCR als zuverlässig, um Bakterien in Vollblut nachzuweisen. Die entwickelte PCR wurde anschließend in drei Phasen überprüft. Bei einer Untersuchung in unterschiedlichen Poolgrößen ergibt sich die höchste Sensitivität in einer Einzelprobenanalyse, eine Poolgröße von maximal 5 Proben pro Pool ergab akzeptable Nachweisgrenzen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass es gerade bei Raumtemperatur (21° C) zunächst zu einer Reduktion der Bakterienkonzentration durch leukozytäre Phagozytose kommt, bevor anschließend ein sigmoidales Wachstum einsetzt. Die vorliegende Arbeit stellt somit eine mögliche Alternative zu vorhandenen Kulturmethoden dar und hat den Vorteil, dass die Ergebnisse eine Relevanz für alle Blutkomponenten haben. Dies bietet somit die Option, die Sicherheit der Blutprodukte weiter zu erhöhen.
• The residual bacterial transfusion risk is a major challenge in transfusion medicine, which is very important for platelet concentrates due to the storage temperature but affected also packed red blood cells. In Germany, as a measure to reduce the transfusion transmitted bacterial risk the shelf-life was reduced from five days to four days in 2009. In addition to bacterial culture methods rapid bacterial detection methods (e. g. NAT, FACS etc.) were developed in recent years. The introduction of real-time NAT methods has reduced significantly the transfusion transmitted risk for relevant viral infections (e. g. HBV, HCV and HIV-1). This manuscript describes the development and optimization of a generic PCR for bacterial detection in platelet concentrates and whole blood, and a case study of the developed detection method in whole blood samples. The first part, focused on the development and optimization of a generic bacterial PCR. Therefore seven different extraction methods were compared with each other. The decontamination of PCR reagents and consumables with bacterial ribosomal nucleic acids was a major challenge to reduce the fluorescence signal in negative controls and water control samples. Finally, an extraction from whole blood samples in combination with SYBR Green PCR 16S was feasible for bacterial detection in whole blood. The developed PCR was subsequently checked in three phases. The highest sensitivity was detected by individual donation NAT (ID-NAT) screening, although screening in mini-pools up to five samples per pools yielded acceptable detection limits. Moreover, it was shown that storage of spiked whole blood concentrates at room temperature (21° C) d emonstrated first a reduction of the bacterial concentration due to leukocyte phagocytosis before a sigmoid growth kinetic was detected. This work thus represents a potential alternative to existing culture methods and has the advantage that screening results have a relevance for all three blood components. Therefore the results represent an additional step to improve blood safety.