Analyse des molekularen Bindungsmechanismus zwischen BbCRASP-2 von Borrelia burgdorferi und den Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1
- Die Bindung von regulatorischen Proteinen an die Zelloberfläche ist eine wirkungsvolle Strategie, die sich humanpathogene Bakterien, insbesondere B. burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose, zu eigen gemacht haben, um der bakteriolytischen Wirkung von Komplement zu entgehen. Die Grundlage der Serumresistenz bei B. burgdorferi besteht vornehmlich in der Interaktion der Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 mit fünf verschiedenen Borrelienproteinen, die als Complement Regulator-Acquiring Surface Proteins bezeichnet werden. Bei der Genospezies B. burgdorferi s.s. nimmt das BbCRASP-2 Protein aufgrund seines spezifischen Bindungsverhaltens gegenüber Faktor H und FHL-1 eine Sonderstellung ein. In früheren Untersuchungen konnten vier potenzielle Bindungsregionen von Faktor H und FHL-1 im BbCRASP-2 Protein lokalisiert werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der detaillierten Charakterisierung der an der Bindung mit Faktor H und FHL-1 beteiligten Aminosäuren von BbCRASP-2 innerhalb der putativen Bindungsregionen 2, 3 und 4 sowie in einer Region, die eine coiled-coil Struktur aufweist. Dazu wurden selektiv Aminosäuren mittels gerichteter Mutagenese durch die neutrale Aminosäure Alanin ausgetauscht und das Bindungsverhalten der mutierten BbCRASP-2 Proteine untersucht. Mittels Ligandenaffinitätsblot-Analyse und ELISA konnten insgesamt 17 Aminosäuren – geladen, neutral polar, neutral unpolar - identifiziert werden, die nach Mutagenese eine erniedrigte Bindungskapazität oder keine Bindung gegenüber Faktor H und FHL-1 in mindestens einem der beiden Testmethoden aufwiesen. Von diesen Mutanten zeigen 6 Proteine (BbCRASP-2S72A, BbCRASP-2D84A, BbCRASP-2F91A, BbCRASP-2R139A, BbCRASP-2Y207A, BbCRASP-2Y211A) in beiden Testsystemen ein deutlich verändertes Bindungsverhalten. 12 weitere BbCRASP-2 Mutanten fielen im ELISA durch ihre reduzierte Bindungskapazität auf, verhielten sich jedoch im Ligandenaffinitätsblot im Vergleich zu BbCRASP-2 in ihrer Bindungseigenschaft unverändert. Die für die Faktor H/FHL-1 Bindung relevanten Aminosäuren verteilten sich in allen der drei untersuchten Bindungsregionen, wobei Austausche in der C-terminal gelegenen Region 4 den größten Effekt auf die Bindung zeigten. Dies deutet darauf hin, dass dem C-Terminus eine essentielle Rolle bei der Interaktion zugeordnet werden kann. In Bezug auf die Ladungseigenschaften der identifizierten Aminosäuren ergab sich ebenfalls ein sehr heterogenes Bild. Da sowohl geladene als auch polare und unpolare Aminosäuren an der Bindung von Faktor H und FHL-1 partizipieren, ist davon auszugehen, dass gleichermaßen elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen an der Bindung beteiligt sind. Zusätzlich konnte in der putativen coiled-coil Region eine Aminosäure (Phe91) identifiziert werden, die direkt oder indirekt an der Bindung von BbCRASP-2 und Faktor H/FHL-1 beteiligt ist. Für die Hypothese einer an der Interaktion beteiligten coiled-coil Struktur spricht, dass Aminosäuresubstitutionen an drei weiteren Positionen (Leu-94, Ile-98 und Tyr-101) eine reduzierte Bindung bewirkten. Die räumlich weit auseinander liegenden Positionen der als bindungsrelevant identifizierten Aminosäuren deuten darauf hin, dass sich der Bindungsmechanismus von BbCRASP-2 an Faktor H und FHL-1 komplexer darstellt, als zunächst vermutet. Es ist ferner zu erwarten, dass noch weitere Aminosäuren außerhalb der putativen Bindungsregionen die Interaktion von BbCRASP-2 mit den Regulatorproteine beeinflussen, da in dieser Studie gezeigt werden konnte, dass die Substitution von Phenylalanin an Position 91 einen deutlichen Einfluss auf die Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, obwohl sie außerhalb der ermittelten Bindungsregionen lokalisiert ist. Mit großer Wahrscheinlichkeit stellt die genaue Topologie des BbCRASP-2 Proteins ebenfalls einen entscheidenden Faktor für die Bindung dar. Deshalb sollte mit Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des BbCRASP-2 Moleküls eine genauere Beschreibung des molekularen Bindungsmechanismus möglich sein. Die vorliegenden Untersuchungen zum molekularen Mechanismus der Serumresistenz von B. burgdorferi tragen wesentlich zum Verständnis der komplexen Interaktion zwischen BbCRASP-2 mit Faktor H und FHL-1, den beiden Komplementregulatoren des alternativen Weges bei. Diese Erkenntnisse könnten langfristig gesehen für die Entwicklung eines Impfstoffs genutzt werden.
- Binding of regulatory proteins to bacterial surfaces is a sophisticated escape strategy used by diverse human pathogenic bacteria in order to avoid complement-mediated bacteriolysis, in particular Borrelia burgdorferi, the etiologic agent of Lyme disease. Serum resistance of B. burgdorferi is mainly based on the interaction of complement regulators factor H and FHL-1 with up to five distinct bacterial molecules, collectively termed as CRASPs (Complement Regulator-Acquiring Surface Proteins). Due to its specific factor H/FHL-1 binding properties, BbCRASP-2 is a unique protein among CRASPs of B. burgdorferi sensu stricto. In a previous study, four potential binding regions within the BbCRASP-2 molecule have been identified. The aim of the present study was to identify amino acid residues within these putative binding regions that are responsible for the binding of factor H and FHL-1. A separate region that potentially forms a coiled-coil structure was also characterized in this study. This was done by systematical substitution of single amino acid residues by a neutral alanine using site-directed mutagenesis. The respective BbCRASP-2 mutants were analyzed for their ability to bind factor H and/or FHL-1. Applying ligand affinity blotting and ELISA, up to 18 amino acid residues (charged, neutral polar and neutral non-polar) have been identified that showed a reduced binding capacity or no binding at all to factor H and FHL-1. Six of the BbCRASP-2 mutants, BbCRASP-2S72A, BbCRASP-2D84A, BbCRASP-2F91A, BbCRASP-2R139A, BbCRASP-2Y207A, and BbCRASP-2Y211A, displayed an altered binding property in both test systems. In addition, a reduced binding capacity could be demonstrated for 12 mutants using ELISA while binding was unchanged when the ligand affinity blot was employed on the same mutated proteins. The identified binding-relevant amino acid residues were distributed within the three putative binding regions whereby substitutions within the C-terminal binding region 4 showed the strongest effect on binding. Hence, the C-terminus of BbCRASP-2 appears to play an essential role in this interaction. A heterogeneous picture concerning the charge properties of the identified amino acid residues was observed. As charged, polar, and non-polar amino acid residues participate in binding of factor H and FHL-1 it has been suggested that both, electrostatic and hydrophobic forces are involved in this protein-protein interaction. Furthermore, an additional amino acid residue, Phe-91, within the putative coiled-coil region was identified to be either directly or indirectly involved in binding of factor H and FHL-1. Substitutions at three distinct positions (Leu-94, Ile-98, and Tyr-101) within the studied coiled-coil region also affected binding of both complement regulators, thus, it cannot be completely ruled out that this region might have an impact on the interaction. Resolving the crystal structure of the BbCRASP-2-Protein will be necessary to fully understand the way of interaction with complement regulators of the alternative pathway.
Author: | Johanna Schreiber |
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URN: | urn:nbn:de:hebis:30-115224 |
Referee: | Peter KraiczyGND, Frank Nürnberger |
Document Type: | Doctoral Thesis |
Language: | German |
Date of Publication (online): | 2011/09/13 |
Year of first Publication: | 2010 |
Publishing Institution: | Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg |
Granting Institution: | Johann Wolfgang Goethe-Universität |
Date of final exam: | 2011/08/11 |
Release Date: | 2011/09/13 |
Page Number: | 113 S. |
HeBIS-PPN: | 274639254 |
Institutes: | Medizin / Medizin |
Dewey Decimal Classification: | 6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit |
Sammlungen: | Universitätspublikationen |
Licence (German): | ![]() |