Open Access

Cynthia Gershome

• The angiotensin converting enzyme (ACE) is an important component of the renin-angiotensin system (RAS) and is crucially involved in the homeostasis of fluid and electrolyte balance and thus in the regulation of blood pressure. The zinc metallopeptidase is involved in the generation of angiotensin II, a potent vasoconstrictor and in the degradation of bradykinin, a potent vasodilator. It is worth noting that ACE more readily hydrolyzes bradykinin than it does angiotensin I thus culminating in the net physiological effect of the production of a vasoconstrictor and the decrease in the availability of a vasodilator. ACE inhibitors have become one of the most successful therapeutic approaches as a first line of therapy in hypertension, and are also widely used in treating heart failure, myocardial infarction, stroke, coronary artery disease and impaired left ventricular function. However, one unexpected clinically relevant finding related to ACE inhibitors is their ability to delay the onset of type II diabetes that was revealed by various large clinical trials. However, the mechanisms underlying these beneficial effects of ACE inhibitor therapy are currently unclear and cannot be explained by the prevention of angiotensin II formation or the attenuated degradation of bradykinin. Thus the potential beneficial effects attributed to ACE inhibitors may occur independent of reductions in blood pressure paving way for new and/or unknown mechanism. Our group has recently redefined ACE as a signal transduction molecule which upon binding to ACE inhibitor turns on a signalling cascade leading to phosphorylation of Ser1270 by CK2, activation of JNK and changes in gene expression in endothelial cells. However the mechanism by which ACE inhibitor initiates the signalling cascade was not clear. It was hypothesized that ACE, which is anchored to the membrane with a single transmembrane domain should dimerize prior to initiating further downstream signalling events in endothelial cells. Therefore, we sought to explore whether or not ACE forms dimers in endothelial cells and whether ACE dimerization is essential for the initiation of ACE signalling in endothelial cells. Using native gel electrophoresis, we found that ACE forms dimers in endothelial cells and that there is an increase in the dimer formation upon treatment of endothelial cells with ACE inhibitors. ACE homodimerization was also demonstrated using the split-ubiquitin system and chemical cross-linking experiments. ACE dimers are also formed in endothelial cells overexpressing the non-phosphorylatable ACE, wherein ACE signalling was abolished indicating that dimerization process is not influenced by the phosphorylation of the serine residue residing in the cytoplasmic tail. Monosaccharides like glucose, galactose and mannitol did not have any influence on ACE-inhibitor induced dimerization. Making use of different monoclonal antibodies directed to the epitopes of N-domain which harbours carbohydrate recognizing domain, also did not affect dimerization. However, inactivation of the C-domain active site by introducing mutation of the key histidine residues in HEMGH consensus sequences, which complexes the zinc ions, abolished enzyme dimerization both in the basal state and in response to ramiprilat. Mutation of the C-domain also resulted in the loss of ACE inhibitor-induced ACE signalling, that is we failed to observe ramiprilat-induced increase in the phosphorylation of the Ser1270 and the subsequent JNK activation. ACE-inhibitor induced dimerization precedes the phosphorylation of Ser1270 and activation of JNK. Thus the ACE-inhibitor induced dimerization via the C-domain of ACE represents the initial step in the ACE signalling pathway which involves the activation of JNK/c-Jun pathway and leading to the changes in the gene expression in endothelial cells. Our group previously identified ACE itself as well as cyclooxygenase-2 (COX-2) as two “ACE signalling-regulated” genes. To screen for additional genes regulated in a similar manner we used DNA microarray technology, to assess ramiprilat-induced changes in the endothelial cell gene expression. 21 genes were identified to be differentially regulated of which, 7 were upregulated and 14 were downregulated by ramiprilat. However, when screened at the protein level, we found no significant differences between the untreated control cells and those treated with ramiprilat. As several other cells and tissues possess a fully functional RAS we screened plasma samples from healthy volunteers as well as from patients with coronary artery disease for the proteins identified in the microarray. We observed that the cellular retinal binding protein-1 (CRBP-1) was detectable at low levels in plasma from patients and that ramipril markedly increased serum levels of this protein. Endothelial cells overexpressing CRBP-1 demonstrated increased RXRE and PPRE activity when stimulated with 9-cis retinoic acid and rosiglitazone respectively suggesting that CRBP-1 might affect gene expression via heterodimerization of PPAR elements with RXR elements by virtue of its function as a transport protein of retinoic acid. Studies aimed at determining the consequences of elevated CRBP-1 expression on endothelial cell homeostasis are ongoing. Although the RAS has been described in many other tissues apart from endothelial cells, ACE signalling has not yet been addressed in tissues such as monocytes/macrophages, which have an increased ACE expression in an atherosclerotic setting. We observed that upon stimulation of cultured ACE expressing monocytes with ramiprilat, JNK is activated suggesting the occurrence of ACE signalling in human monocytes. It is worth noting that ACE inhibitors delay the onset of type II diabetes in spite of moderate decrease in blood pressure. To further elucidate the mechanism underlying this effect, we found that ACE inhibitors increase the PPARgamma levels in the nuclear extracts of ACE expressing monocytes which were also reproduced in human endothelial cells overexpressing human somatic ACE. However, ramiprilat did not have any direct effect on the activity of a luciferase-coupled promoter containing several copies of the PPRE in human endothelial cells. These results contrasted with the actions of the PPARgamma agonist suggesting that ramiprilat enhances PPARgamma levels through an indirect mechanism. We next hypothesized that ramiprilat might increase the levels of 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 (15dPGJ2) which is a natural ligand for PPARgamma via COX enzymes in monocytes. We observed that ramiprilat was able to decrease the diminution of COX-2 levels upto 48 hours of treatment but the levels of 15dPGJ2 were too low to be detected by ELISA. However ramiprilat enhanced the plasma levels of adiponectin, a downstream target of PPARgamma, which is a anti-atherogenic and anti-inflammatory adipokine, in patients with coronary artery disease. Though adiponectin is a PPARgamma-regulated gene, the observed increase in adiponectin might be attributed to the increase in RXR rather than via PPARgamma. Taken together, the results of this investigation have revealed that ACE inhibitors initiate ACE signalling by eliciting the dimerization of the enzyme, more specifically via its C-domain active centers. The ACE signalling cascade when activated leads to the enhanced expression of ACE, COX-2 and CRBP-1 which in turn favours the heterodimerization of PPARgamma with RXR and thus results in the increased expression of “PPARgamma regulated” genes such as adiponectin. The latter results provide a molecular basis for the observation that ACE inhibitors can delay the onset of type 2 diabetes in as much as it was possible to link ramipril with CRBP-1, RXR activity and the expression of adiponectin, an adipokine associated with improved insulin sensitivity. Further work is however required to elucidate the consequences of ACE inhibitors in monocytes and adipocytes as well as in intact animals.
• Das Angiotensin-konvertierende Enzym (ACE) ist eine zentrale Komponente des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) und ist insbesondere für die Regulation des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes sowie für die Kontrolle des Blutdrucks von großer Bedeutung. Das Enzym wandelt zum einen Angiotensin I in das stark vasokonstrikitorisch wirkende Hormon Angiotensin II um und hydrolysiert zum anderen das vasodilatorisch wirkende Hormon Bradykinin in inaktive Fragmente. Die Hemmung des RAS durch ACE-Inhibitoren ist zu einer wichtigen, erfolgreichen therapeutischen Maßnahme geworden, nicht nur zur Behandlung des Bluthochdrucks, sondern auch bei Myokardinfarkten, Diabetes mellitus Typ II, Schlaganfällen, koronarer Herzkrankheit (KHK) sowie bei Links-Herz-Insuffizienz. Interessanterweise lässt sich eine Reihe der positiven Effekte der ACE-Inhibitoren nicht allein durch Senkung des Angiotensin II-Spiegels bzw. Anstieg der Bradykinin-Konzentration erklären. Vielmehr scheint es noch andere Wege zu geben, mittels derer ACE-Inhibitoren ihre positiven Wirkungen entfalten. Im Hinblick darauf ist von besonderem Interesse, dass das Enzym ACE erst kürzlich als Signaltransduktionsmolekül identifiziert werden konnte. Die Bindung von ACE-Inhibitoren an ACE löst in Endothelzellen eine Signaltransduktionskaskade aus, bei der zunächst die ubiquitäte Proteinkinase CK2 ACE an einem intrazellulären Serin-Rest (Ser1270) phosphoryliert. Infolge dieser Phosphorylierung wird der c-Jun/JNK-Signalweg und der Transkriptionsfaktor AP-1 aktiviert, was zur Steigerung der Expression von ACE und Cyclooxygenase-2 (COX-2) führt. In Endothelzellen, die eine nicht-phosphorylierbare Mutante von ACE (S1270A) überexprimieren, findet das ACE-Signalling nicht statt. Da mittels der Technik inverser Micellen gezeigt werden konnte, dass ACE als Dimer vorliegen kann, sollte die physiologische Relevanz dieser Dimerisierung und deren Einfluß auf das ACE-Signalling in Endothelzellen untersucht werden. Mit Hilfe nativer Gelelektrophorese, sowie Experimenten mit dem Split-ubiquitin System oder chemischem „Cross-linking“ konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass ACE in Endothelzellen als Dimer vorliegt und die Dimerisierung durch Gabe von ACE-Inhibitoren gesteigert wird. Da die nicht-phosphorylierbare, inaktive ACE-Mutante auch dimerisieren kann, konnte ein Einfluss der ACE-Phosphorylierung auf die Dimerisierung ausgeschlossen werden. Obwohl eine Dimerisierung des Enzyms über eine N-terminale Zucker-Seitenkette postuliert worden war, konnte im Rahmen dieser Arbeit die ACE-Inhibitor-induzierte Dimerisierung weder durch die Gabe von Monosacchariden wie Glukose, Galactose und Mannitol unterdrückt werden, noch durch die Inkubation der Endothelzellen mit verschiedenen N-terminalen, monoklonalen ACE-Antikörpern. Die basale und ACE-Inhibitor-induzierte Dimerisierung von ACE konnte jedoch durch die Inaktivierung des C-terminalen, aktiven Zentrums von ACE durch Mutation der Histidinreste in der HEMGH-Konsensussequenz verhindert werden. Dies führte zur völligen Aufhebung des ACE-Signaltransduktion weges, d.h. weder die Ramiprilat-vermittelte Phosphorylierung an Ser1270 noch die JNK-Aktivierung erfolgte. Somit konnte die durch ACE-Inhibitoren induzierte Dimerisierung über die carboxyterminale Domäne des Enzyms als Initiationspunkt der ACE-Signaltransduktion bestätigt werden. Mittels DNA-Microarray Technologie wurde ferner der Einfluss der ACE-Dimerisierung und der dadurch initiierten Signaltransduktion auf die Expression weiterer Gene untersucht, wobei 21 durch Ramiprilat regulierte Gene identifiziert wurden. Sieben Gene wurden in ihrer Expression gesteigert, 14 abgeschwächt. Zahlreiche weitere Experimente zeigten jedoch, dass Ramiprilat keinen Einfluss auf die Menge der durch diese Gene kodierten Proteine in Endothelzellen hatte. Da eine Reihe anderer Zellen und Gewebe ein funktionelles RAS exprimieren, untersuchten wir auch das Blutplasma von gesunden Probanden und Patienten mit KHK. Interessanterweise fand sich im Plasma von Patienten unter Ramipril-Therapie eine erhöhte Konzentration des „Cellular retinol binding protein-1“ (CRBP-1), welches auch mittels Microarray als durch Ramiprilat-hochreguliertes Gen ermittelt worden war. In Endothelzellen führte eine Überexpression von CRBP-1 zu einem Anstieg der Promotoraktivität von RXRE und PPRE nach Stimulation durch 9-cis Retinolsäure und Rosiglitazon, was möglicherweise auf das erhöhte, zelluläre Angebot von Retinol-Produkten und einer daraus resultierenden vermehrten Dimerisierung von PPAR und RXR zurückzuführen ist. Obwohl das RAS nicht nur in Endothelzellen, sondern auch in anderen Geweben eine Rolle spielt, konnte das ACE-Signalling bislang noch nicht in anderen Geweben nachgewiesen werden. Insbesondere die Untersuchung des ACE-Signallings in Monozyten bzw. Makrophagen könnte von besonderem medizinischem Interesse sein, da in diesen Zelltypen die ACE-Expression im Rahmen der Entwicklung einer Atherosklerose deutlich ansteigt. Es scheint jedoch ein ACE-Signalling in Monozyten zu existieren, da Ramiprilat in diesen Zellen eine Aktivierung der JNK sowie eine Erhöhung der COX-2 Expression auslöst. Eine weiterer positiver Aspekt einer ACE-Inhibitor-Therapie ist, dass diese Medikamente die Ausbildung eines Diabetes mellitus Typ II verzögern. Experimente zur Ermittlung des zugrundeliegenden Mechanismus zeigten, dass die Behandlung von ACE-exprimierenden Monozyten oder Endothelzellen mit ACE-Inhibitoren zu einem erhöhten PPARgamma-Level in den Kernextrakten dieser Zellen führte. Allerdings scheint Ramiprilat die PPARgamma-Expression nur indirekt zu beeinflussen, denn die PPRE-Promotoraktivität wurde durch die Behandlung von Endothelzellen mit Ramiprilat, im Gegensatz zu der Inkubation mit dem PPARgamma-Agonisten Rosiglitazon, nicht beeinflusst. Eine Wechselwirkung zwischen ACE und PPARgamma scheint in der Tat naheliegend, da Patienten mit KHK infolge einer Ramipril-Behandlung eine erhöhte Plasmakonzentration von Adiponectin aufweisen, das in seiner Expression durch PPARgamma gesteigert wird und als Adipokin anti-inflammatorische und anti-atherogene Eigenschaften aufweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das ACE-Inhibitor-vermittelte ACE-Signalling durch eine Dimerisierung des ACE initiiert wird und zum Anstieg der Expression von ACE, COX-2 und CRBP-1 führt. Die gesteigerte CRBP-1-Bildung erhöht vermutlich die Bildung von PPAR/RXR-Heterodimeren, was in der vermehrten Expression von PPAR-regulierten Genen (z.B. Adiponectin) resultiert.