Open Access

Ilona Inkeri Ahonen

• Batten disease refers to neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs), which are inherited lysosomal storage diseases with diverse ages of onset and cause progressive neurodegeneration. The most common NCL is Juvenile NCL (JNCL), which begins in early childhood and is characterized by lysosomal accumulation of subunit c of the mitochondrial ATP synthase (subunit c). JNCL is caused by mutations in the gene CLN3. This gene encodes the CLN3 protein, a transmembrane protein of unknown structure. Localization of CLN3 is ambiguous, and its exact cellular function is not known. Thereby, it is unclear what mechanisms lead to neurodegeneration in JNCL. Models of JNCL present disturbed membrane bound organelles and cytoskeleton as well as impaired autophagy and lysosomal function. The JNCL gene defect that most patients harbor is deletion of the exons 7 and 8 of CLN3. In the Cln3Δex7/8/Δex7/8 mouse model of JNCL, this deletion has been introduced to the mouse Cln3 gene. The actin cytoskeleton consists of filaments formed through polymerization of actin and provides a framework which defines cellular morphology and also facilitates cell motility, cytokinesis, and cell surface remodeling. Rho GTPases are signaling proteins which regulate the assembly and dynamics of the actin cytoskeleton and play an important role in neuronal morphology. Rho GTPases need to be membrane-anchored in order to become active and initiate a signaling cascade. Their membrane anchorage is achieved through their geranylgeranyl tails, which they acquire through prenylation. Protein prenylation refers to the attachment of a geranylgeranyl or farnesyl group to the C-terminus of a protein. The enzyme geranylgeranyl transferase (GGTase) catalyzes geranylgeranylation, whereas geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) is the donor of the geranylgeranyl group. Cells produce GGPP as well as cholesterol and other lipids through the mevalonate pathway (MVA pathway). The aim of this study was to analyze how the JNCL gene defect affects cellular morphology, especially the actin cytoskeleton and Rho GTPases, and the MVA pathway which is connected with Rho GTPase activation. These important cellular components play crucial roles in neurons and are implicated in other neurodegenerative diseases, but have received little attention in JNCL. The immortalized CbCln3Δex7/8/Δex7/8 cerebellar precursor cell line from Cln3Δex7/8/Δex7/8 mice was used for the experiments and provides a genetically accurate, neuronal cell model of JNCL. CbCln3Δex7/8/Δex7/8 cells present subunit c accumulation only when aged at confluency, but sub-confluent cells display other phenotypes. The experiments of this study were performed both with confluency-aged and sub-confluent cells. Filamentous actin was visualized, and protein levels as well as membrane localization of several small Rho GTPases was analyzed biochemically. Also the protein levels of GGTase and the key enzymes of the mevalonate pathway were determined. Staining pattern of filamentous actin was disturbed in confluency-aged CbCln3Δex7/8/Δex7/8 cells. Additionally it was found out that these cells did not grow to wild-type size and exhibited an elongated peroxisomal morphology. Rho GTPases had reduced total levels and showed a tendency of decreased membrane localization. Levels of GGTase and the MVA pathway enzymes were altered. Results of sub-confluent CbCln3Δex7/8/Δex7/8 cells were similar with the exception of HMG-CoA reductase, which is the rate-limiting enzyme of the MVA pathway: while its level in confluency-aged CbCln3Δex7/8/Δex7/8 cells was increased, at sub-confluency it showed a reduced level. Also, in contrast with the confluency-aged cells, Rho GTPases presented a tendency of increased membrane localization. The results of this study reveal that the accurate JNCL gene defect alters cellular morphology and the activity of the MVA pathway in neuronal cells. Small cell size and disrupted architecture of the actin cytoskeleton are confirmed as neuronal JNCL phenotypes, and the peroxisome is introduced as a novel cellular component affected in JNCL. Through defects in endocytosis, autophagy, lysosomal and mitochondrial function, and cytoskeleton, the JNCL gene defect may prevent cells from growing to wild-type size. The JNCL gene defect may attenuate the MVA pathway via mitochondrial dysfunction and/or upregulation of degradative processes. Attenuation of the MVA pathway may contribute to impaired membrane rafts, which are an established phenotype of JNCL cells. As indicated by reduced GGTase level and supported by downregulation of lipid production through the MVA pathway, the JNCL gene defect might also decrease prenylation of proteins.
• Die Juvenile Batten-Krankheit oder Juvenile Neuronale Ceroid-Lipofuszinose (JNCL) ist eine neurodegenerative Erkrankung, welche im Kindesalter auftritt und durch eine intralysosomale Akkumulation von Speichermaterial (Ceroid-Lipofuszin) charakterisiert ist. Die Symptome von JNCL beinhalten den Verlust der Sehfähigkeit, den Verlust motorischer und kognitiver Fähigkeiten, Verhaltensprobleme und Epilepsie. JNCL führt gewöhnlich im dritten Lebensjahrzehnt zum Tod und kann nicht geheilt werden. JNCL wird autosomal-rezessiv vererbt und durch Mutationen im Gen CLN3 verursacht. Das CLN3-Gen kodiert das Protein CLN3, ein integrales Membranprotein, dessen Struktur und Funktion unklar sind. Als häufigste Ursache für JNCL ist eine 1,02 kb Deletion im CLN3-Gen bekannt, die bei >80% aller JNCL-Patienten vorkommt. Diese Mutation führt zur Deletion der Exone 7 und 8 im CLN3-Gen. Patientenzellen weisen eine mRNA-Expression des mutierten CLN3-Gens auf, aber ob tatsächlich ein verkürztes CLN3-Protein in diesen Zellen exprimiert wird, ist umstritten. Die Hauptkomponente des in JNCL akkumulierenden Speichermaterials ist die Untereinheit (Subunit) c der mitochondrialen Adenosintriphosphat-Synthase (Subunit c). Obwohl diese Akkumulation in verschiedenen Geweben gefunden werden kann, beeinflusst JNCL am stärksten das zentrale Nervensystem. Die Ursache hierfür ist nicht bekannt. Auch der Krankheitsmechanismus von JNCL ist unklar, es ist allerdings bekannt, dass er unabhängig von der Akkumulation auftritt. Informationen zu den zellulären Phänotypen des JNCL-Gendefekts werden durch die Analyse von Lymphoblasten und Fibroblasten von JNCL-Patienten gewonnen. Die Lymphoblasten zeigen einen defekten Arginintransport, und Patientenfibroblasten weisen einen erhöhten lysosomalen pH-Wert, sowie eine defekte Endozytose und Autophagozytose auf. Für JNCL gibt es verschiedene Modellsysteme, bei denen ein Homolog oder Ortholog von CLN3 nicht exprimiert wird. Zudem wurde für JNCL ein genetisch genaues Mausmodell entwickelt, bei dem die häufigste CLN3-Mutation in das murine Cln3-Gen eingefügt worden ist. Diese Cln3Δex7/8/Δex7/8 Maus zeigt mRNA-Expression des mutierten Cln3-Gens und eine schwere neurologische Erkrankung. Da durch JNCL besonders die neuronalen Zellen beeinflusst werden, ist es wichtig, die Auswirkung des JNCL-Gendefekts, auf die neuronalen Zellen zu analysieren. Hierzu wurde eine immortalisierte Zellinie entwickelt, die von zerebellären Progenitorzellen von Cln3Δex7/8/Δex7/8 Mausembryonen abstammt. Diese CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen sind homozygot für die häufigste JNCL-Mutation und stellen ein genetisch genaues Zellmodell für JNCL dar. Diese Zellen zeigen eine defekte Endozytose und Autophagozytose, sowie reduzierte intrazelluläre ATP-Mengen, welche auf eine mitochondriale Dysfunktion hinweisen. Um die Akkumulation vom Subunit c aufzuzeigen, müssen CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen „gealtert“ werden: das heißt, dass die Zellen erst sieben Tage nach erreichen von Konfluenz geerntet werden („Konfluenz-gealterte“ Zellen)...