Open Access

Selina Ferrara

• Acute myeloid leukemia (AML) is a neoplastic disease of an early myeloid precursor cell in hematopoiesis. It leads to the accumulation of monoclonal cells in the bone marrow and the peripheral blood, showing a differentiation block and deregulated self-renewal. Frequently, the leukemic cells exhibit genetic aberrations with reciprocal chromosomal translocations. These translocations induce the formation of a fusion protein, that can lead to new cellular functions and a transformation into a leukemic cell. Common chromosomal translocation in AML are t(8;21) or t(15;17), which cause the formation of the fusion proteins AML1/ETO and PML/RARα and determine the leukemic phenotype of the AML. The translocation t(6;9) leads to the formation of the fusion protein DEK/CAN and is of special interest, because of its association with mostly young patients and a very aggressive course of the disease. The fusion product induces leukemia in a small subset of hematopoietic stem cells, but its mechanism of leukemogenesis is greatly unknown. The intention of this work was to characterize the DEK/CAN-induced AML on a molecular genetic level to gain a deeper understanding of the disease pathogenesis. Therefore, gene expression analysis with polymerase chain reaction (PCR) and microarray analysis was performed. To detect DEK/CAN in different cell lines by PCR and real-time quantitative PCR (qPCR), specific primers and probes were designed, and a standardized workflow was established. Emphasis was placed on the optimization of RNA isolation, DNase treatment, cDNA synthesis with following PCR and qPCR, which enabled the detection of the fusion product DEK/CAN in the cell lines 32B, Phoenix and FKH-1. To quantify the fusion product DEK/CAN, the method of qPCR with absolute and relative quantification was used. Absolute quantification enabled the calculation of an exact copy number of the fusion transcript DEK/CAN with a detection limit of 50 copies/µl at a sensitivity of 10-6, which is of importance in determining the minimal residual disease (MRD) of patients with DEK/CAN-positive AML. MRD detection by qPCR is a highly sensitive diagnostic method to identify leukemic cells, even in low cell counts. This enables a thorough evaluation of the treatment response and allows an early detection of changes in the MRD level as part of the remission control. Additionally, a microarray gene expression analysis was performed to identify alterations in relevant target genes and associated signaling pathways in DEK/CAN-positive cells. Because of DEK/CAN’s potential to induce leukemia in a subset of hematopoietic stem cells, Sca+/Lin- cells of the bone marrow of C57Bl/6 mice were used and transfected with the gene products DEK/CAN and PML/RARα. Microarray analysis led to the identification of 16 different genes of interest, which demonstrated significant alterations of gene expression in DEK/CAN-positive cells. They were validated and quantified with TaqMan assay assisted qPCR. The elevated expression of the transcription factors TRIM25, HIF1α and ATF2, in DEK/CAN-positive cells, indicated an altered transcription factor activity and interaction with DNA in the nucleus. The localization of DEK/CAN in the nucleus emphasizes this assumption. Also, the upregulated expression of the nuclear export receptor XPO1 suggested changes in nuclear transport processes and impaired export activity in DEK/CAN-positive cells. Furthermore, the results demonstrated changes of gene expression in genes that are involved in the JAK/STAT signaling pathway. PTPRC, the Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type C, functions as a direct inhibitor of JAKs (Janus Kinases) and STATs (Signal Transducers and Activators of Transcription) and their associated signaling pathway. It was shown that the gene expression of PTPRC was significantly reduced in DEK/CAN-positive cells. This allowed the assumption, that the reduced expression of PTPRC led to a loss of inhibition and thus a consecutive hyperactivation of the JAK/STAT signaling pathway. This hypothesis was supported by an independent activation of PIM1, a target gene of STAT5 and the activation of LMO2, a direct target gene of JAK2. In addition, the transmembrane receptor CSF1R, which is directly involved in STAT activation, also showed an upregulation in gene expression. The results of this work show an activation of the JAK/STAT signaling pathway in DEK/CAN-positive cells, which may be a key mechanism in DEK/CAN-induced leukemogenesis. Considering treatment options in the future, the addition of targeted therapy, such as pan-JAK inhibitors, to the standard therapy, could be a chance to improve the overall survival rate and the prognosis of t(6;9)-positive AML.
• Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine neoplastische Erkrankung unreifer myeloischer Vorläuferzellen der Hämatopoese. Es kommt zur Anhäufung monoklonaler Zellen im Knochenmark und im peripheren Blut, welche eine Differenzierungsblockade und deregulierte Selbsterneuerung aufweisen. Häufig werden in den leukämischen Zellen genetische Veränderungen mit reziproken chromosomalen Translokationen festgestellt. Diese führen zur Bildung von Fusionsproteinen und können durch Veränderung zellulärer Eigenschaften eine Transformation in eine leukämische Zelle induzieren. Verbreitete chromosomale Translokationen in der AML sind t(8;21) oder t(15;17), welche zur Bildung der Fusionsproteine AML1/ETO und PML/RARα führen und den leukämischen Phänotyp der AML bestimmen. Die Translokation t(6;9) führt zur Bildung des Fusionsproteins DEK/CAN und ist von besonderer Relevanz, da sie häufig junge Patienten betrifft und aufgrund eines aggressiven Krankheitsverlaufes mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Fusionsprotein DEK/CAN eine Leukämie induzieren kann, jedoch ist der Mechanismus der Leukämogenese weitestgehend ungeklärt. Ziel dieser Arbeit war es, die DEK/CAN-induzierte AML auf molekulargenetischer Ebene zu charakterisieren, um ein tieferes Verständnis für die Krankheitsentstehung zu erlangen. Hierfür wurden Genexpressionsanalysen mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Microarray Analysen durchgeführt. Um DEK/CAN in verschiedenen Zelllinien mittels PCR und Real-time quantitative PCR (qPCR) nachweisen zu können wurden spezielle Primer und Sonden angefertigt, sowie ein standardisierter Arbeitsablauf etabliert. Im Fokus stand eine Optimierung von RNA Isolation, DNase Behandlung, cDNA Synthese mit anschließender PCR und qPCR, wodurch das Fusionsprotein DEK/CAN in den Zelllinien 32B, Phoenix und FKH-1 nachgewiesen werden konnte. Zur Quantifizierung des Genproduktes DEK/CAN wurde die Methode der qPCR mit absoluter und relativer Quantifizierung angewandt. Mit der absoluten Quantifizierung war es möglich eine exakte Kopienzahl des Fusionsproduktes DEK/CAN, mit einer minimalen Nachweisgrenze von 50 Kopien/µl, bei einer Sensitivität von 10-6, zu erfassen, was zur Bestimmung der minimalen Resterkrankung (MRD) bei Patienten mit DEK/CAN-positiver AML bedeutsam ist. Die MRD-Analyse mittels qPCR ist eine der sensitivsten diagnostischen Methoden um Leukämiezellen auch in geringer Kopienzahl detektieren zu können. Somit wird ermöglicht, das Therapieansprechen einzuschätzen und im Rahmen der Remissionskontrolle frühzeitig auf Veränderungen der Krankheitslast reagieren zu können. Des Weiteren wurde eine Microarray Genexpressionsanalyse durchgeführt, um alterierte relevante Zielgene und assoziierte Signalwege in DEK/CAN-positiven Zellen zu identifizieren. Da bereits gezeigt werden konnte, dass DEK/CAN eine leukämische Transformation in unreifen hämatopoetischen Stammzellen induziert, wurden Sca+/Lin- Zellen aus dem Knochenmark von C57B1/6 Mäusen entnommen, und retroviral mit den Genprodukten DEK/CAN und PML/RARα transfiziert. Aus der Microarray Analyse konnten insgesamt 16 verschiedene Zielgene identifiziert werden, welche signifikante Expressionsunterschiede in DEK/CAN-positiven Zellen aufwiesen. Diese wurden anschließend mittels TaqMan-assistierter qPCR validiert und quantifiziert. Eine erhöhte Genexpression der Transkriptionsfaktoren TRIM25, HIF1α and ATF2 deuteten darauf hin, dass DEK/CAN eine direkte Interaktion mit DNA und eine veränderte Aktivität von Transkriptionsfaktoren veranlassen könnte. Da DEK/CAN eine nukleäre Lokalisation aufweist, wäre ein Wirken des Fusionsproteins im Zellkern wahrscheinlich. Zudem zeigte sich in DEK/CAN-positiven Zellen eine erhöhte Expression des nukleären Exportrezeptors XPO1, was auf veränderte nukleäre Transportprozesse hindeuten könnte. Auffallend waren zudem mehrere Gene mit alterierter Genexpression, welche in den JAK/STAT Signalweg involviert sind. PTPRC, das Protein Tyrosin Phosphatase Rezeptor Typ C, fungiert als direkter Inhibitor von JAKs (Janus Kinasen) und STATs (Signal Transducers and Activators of Transcription) und deren assoziierten Signalweges. Es konnte gezeigt werden, dass die Genexpression von PTPRC in DEK/CAN-positiven Zellen signifikant reduziert war. Dies führte zu der Annahme, dass die verringerte PTPRC Expression zu einer aufgehobenen Inhibition und damit zu einer konsekutiven Hyperaktivität des JAK/STAT Signalweges führte. Diese Hypothese konnte durch eine gesteigerte Genexpression von PIM1, einem wesentlichen Zielgen von STAT5, sowie LMO2, einem direkten Zielgen von JAK2, untermauert werden. Auch zeigte sich eine gesteigerte Genexpression des Transmembranrezeptors CSF1R, der eine direkte STAT Aktivierung induziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass es in DEK/CAN-positiven Zellen zu einer Aktivierung des JAK/STAT Signalweges kommt, welcher eine relevante Rolle in der DEK/CAN-induzierten Leukämogenese spielen könnte...