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The current work investigated the association of trait anxiety and the neural efficiency of cognitive processing for affectively neutral (not threat-related) information. In a sample of 46 healthy volunteers, three fMRI experiments were conducted to test the prediction derived from attentional control theory (Eysenck et al., 2007) that high as compared to low trait-anxious individuals expend more neural effort on tasks requiring the top-down control of attention to reach a given level of performance. In a colour-word Stroop task requiring the inhibition of irrelevant stimulus information and associated responses as well as in a working-memorymanipulation task requiring the shifting of attention between items in working memory, trait anxiety (as measured with the State-Trait Anxiety Inventory; Spielberger et al., 1970) was positively associated with task-related increases in the activation of two adjacent regions in the right dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The finding that along with a stronger activation of this brain region commonly implicated in top-down control processes, the high-anxious subjects showed equal (working memory manipulation) or worse (Stroop) performance when compared to low-anxious subjects, does support the assumption that processing is less efficient in the high anxious. However, in contrast to the predictions, trait anxiety did not show a significant association with task-related brain activation in a task-switching paradigm requiring shifting between task sets. It is discussed how different attentional control demands of the task may account for differences in the effects of trait anxiety on overt behavioural performance and underlying neural processes. In addition to DLPFC activation, trait anxiety modulated the functional connectivity of distributed regions involved in processing of the Stroop and the working-memory-manipulation task. It is discussed how the observed differences in regional DLPFC activation and network connectivity relate to each other. A possible interpretation suggests that activation increases in the DLPFC reflect an attempt to compensate for suboptimal connectivity by investing more effort in prefrontally supported control processes. Overall, the current work shows an association of trait anxiety with the neural efficiency of cognitive processing in affectively neutral tasks involving attentional control. Furthermore, it suggests that investigations of neural efficiency should take into account difference in functional integration in addition to regional activation.
Entwicklung und Inbetriebnahme zweier supraleitender 217 MHz CH-Strukturen für das HELIAC-Projekt
(2019)
Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden zwei baugleiche CH-Strukturen für das im Bau befindliche HELIAC-Projekt (HELmholtz LInear ACcelerator) entwickelt und während der Produktion bis hin zu den finalen Kalttests bei 4.2 K begleitet. Zusammen mit der CH-Struktur des Demonstrator-Projektes ermöglichen sie die vollständige Inbetriebnahme und den ersten Strahltest des ersten Kryomoduls des HELIAC's, welcher aus vier Kryomodulen mit insgesamt 12 CH-Strukturen besteht. Im Vergleich zu bisherigen CH-Strukturen wurde das Design der Kavitäten im Rahmen dieser Dissertation grundlegend überarbeitet und optimiert. Durch die Entfernung der Girder und die konisch geformten Endkappen konnte die Stabilität der neuen CH-Strukturen deutlich erhöht werden, sodass die Drucksensitivität im Vergleich zur ersten CH-Kavität des Demonstrator-Projektes um ca. 80% reduziert werden konnte. Durch die nach außen gezogenen Lamellen der dynamischen Tuner konnte die mechanische Spannung sowie die benötigte Anzahl an Lamellen und damit das Risiko für das Auftreten von Multipacting reduziert werden. Das verringerte Risiko für Multipacting durch die entsprechenden Optimierungen der Kavitäten konnte durch die dauerhafte Überwindung aller Multipacting-Barrieren in den späteren Messungen verifiziert werden. Die Optimierung beider Kavitäten erfolgte dabei mit Hilfe der Simulationsprogramme CST Studio Suite und Ansys Workbench.
Beide Kavitäten wurden von der Firma Research Instruments (RI) gefertigt und während der gesamten Konstruktion durch diverse Zwischenmessungen überwacht. Nach jedem einzelnen Produktionsschritt wurden alle Einflüsse auf die Resonanzfrequenz so präzise ermittelt, dass die Zielfrequenz bei 4.2 K auf mehr als 1‰ genau erreicht werden konnte. Sowohl während der Zwischenmessungen als auch während den finalen Messungen bei 4.2 K wurden automatisierte Aufzeichnungsroutinen verwendet, welche eine sekundengenaue Auslese der Messdaten und damit eine hohe Messgenauigkeit ermöglichten. Im Hinblick auf die Komplexität der CH-Strukturen sind die geringen Abweichungen von der Zielfrequenz der direkte Beweis dafür, wie erfolgreich und präzise die Auswertungen und daraus folgenden Abschätzungen der einzelnen Zwischenmessungen waren. Insgesamt konnten bis auf die mechanischen Eigenmoden alle Ergebnisse der Simulationen durch entsprechende Messungen in guter Näherung verifiziert werden. In jeder Kavität wurden zwei dynamische Tuner verbaut, welche statische und dynamische Frequenzabweichungen im späteren Betrieb ausgleichen können. Die dynamischen Tuner wurden hinsichtlich ihrer mechanischen Stabilität und der erzeugbaren Frequenzänderung sowie ihrer mechanischen Eigenfrequenzen ausführlich mit Hilfe der Simulationsprogramme CST Studio Suite und Ansys Workbench untersucht und optimiert. Um die Ergebnisse der Simulationen zu überprüfen wurden ein eigens dafür entworfener und in der Werkstatt des Instituts für Angewandte Physik gefertigter Messaufbau verwendet, welcher es ermöglichte alle entscheidenden Eigenschaften der dynamischen Tuner präzise zu vermessen. Insgesamt stellen die ausführlichen Messungen mit Hilfe des entworfenen Aufbaus die bisher umfassendsten Messungen dynamischer Balgtuner innerhalb supraleitender CH-Strukturen dar und zeigen, mit welchen Abweichungen zwischen Simulationen und Messungen bei zukünftigen Kavitäten zu rechnen ist. Auch die Feldverteilung entlang der Strahlachse wurde während der Produktion der Kavitäten mit Hilfe der Störkörpermessmethode überprüft. Die dadurch ermittelten Werte stimmten mit einer maximalen Diskrepanz von 9% sehr gut mit den Simulationen überein.
Um eine möglichst gute Oberflächenqualität zu garantieren wurden an der Innenfläche beider Strukturen mindestens 200µm mit einer Mischung aus Fluss-, Salpeter und Phosphorsäure in mehreren Schritten abgetragen. Durch das Aufteilen der Behandlung in einzelne Schritte konnte der Einfluss der Oberflächenbehandlung auf die Resonanzfrequenz besser abgeschätzt und vorausgesehen werden. Dies führte, zusammen mit den Messungen zur Bestimmung der Drucksensitivität und der thermischen Kontraktion der Kavität beim Abkühlen, zu der hohen Übereinstimmung der gemessenen finalen Resonanzfrequenz mit der Zielfrequenz.
Die abschließenden Kalttests der beiden Kavitäten, ohne Heliummantel, wurden am Institut für Angewandte Physik der Johann Wolfgang Goethe Universität in einem vertikalen Bad-Kryostaten durchgeführt. Die erste CH-Struktur konnte erfolgreich bis zu einem maximalen Feldgradienten von 9.2 MV/m getestet werden, was einer effektiven Spannung von 3.37 MV entspricht. Die unbelastete Güte fiel dabei von anfangs 1.08 ∙ 109 auf 2.6 ∙ 108 ab. Die Vorgaben des HELIAC-Projektes liegen bei einem Beschleunigungsgradienten von 5.5 MV/m mit einer unbelasteten Güte von mindestens 3 ∙ 108. Diese Werte wurden von der ersten Kavität deutlich übertroffen, sodass sie für den Betrieb innerhalb des ersten Kryomoduls uneingeschränkt verwendet werden kann.
Bei der zweiten Kavität trat beim Abkühlen auf 4.2 K ein Vakuumleck auf, welches unter Raumtemperatur nicht detektierbar war. Aufgrund der schlechten Vakuumbedingungen innerhalb der Kavität konnten somit keine Messungen hinsichtlich der Leistungsfähigkeit durchgeführt werden, solange das Kaltleck vorhanden war. Ein erneuter Kalttest der Kavität nach Beseitigung des Lecks konnte zeitlich nicht mehr im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt werden und ist aus diesem Grund Gegenstand nachfolgender Untersuchungen.
Insgesamt stellen die Entwicklungen, Untersuchungen und Messungen im Rahmen der hier vorgestellten Dissertation einen entscheidenden Schritt zur Inbetriebnahme des ersten Kryomoduls des HELIAC's sowie der Entwicklung weiterer CH-Kavitäten dar. Das überarbeitete Design der CH-Strukturen hat sich als erfolgreich erwiesen, weswegen es als Ausgangspunkt für die Entwicklung aller nachfolgenden CH-Strukturen des HELIAC, bis hin zur Fertigstellung des kompletten Beschleunigers, verwendet wird.
Autophagy, together with the ubiquitin-proteasome system, is the main quality control pathway responsible for maintaining cell homeostasis. There are several types of autophagy distinguished by cargo selectivity and means of induction. This thesis focuses on macroautophagy, hereafter autophagy, where a double-layered membrane is formed originating from the endoplasmatic reticulum (ER) engulfing cargo selectively or unselectively. Subsequently, a vesicle forms around the cargo, an autophagosome, and eventually fuses with the lysosome leading to degradation of the vesicle content and release of the cargo “building blocks”. Basal autophagy continuously occurs, unselectively engulfing a portion of the cytoplasm. However, autophagy can also be induced by stress such as starvation, protein aggregation, damaged organelles, intracellular pathogens etc. In this case, the cargo is selectively targeted, and the fate of the autophagosome is the same as in basal autophagy. In recent years, interest in identifying mechanisms of autophagy regulation has risen due to its importance in neurodegenerative diseases and cancer. Given the complexity of the process, its execution is tightly regulated from initiation, autophagosome formation, expansion, closure, and finally fusion with the lysosome. Each of the steps involves different protein complexes, whose timely activity is orchestrated by post-translational modifications. One of them is ubiquitination. Ubiquitin is a small, 76-amino acid protein conjugated in a 3-step reaction to other proteins, in a reversible manner, meaning undone by deubiquitinases. Originally described as a degradation signal targeting proteins to the proteasome, today it is known it has various additional non-proteolytic functions, such as regulating a protein’s activity, localization, or interaction partners. The role of ubiquitin in autophagy has already been shown. However, given the reversibility and fine-tuning of the ubiquitin signal, many expected regulators remain unidentified. This work aimed to identify novel deubiquitinating enzymes that regulate autophagy. We identified ubiquitin-specific protease 11 (USP11) as a novel, negative regulator of autophagy. Loss of USP11 leads to an increase in autophagic flux, whereas overexpression of USP11 attenuates it. Moreover, this observation was reproducible in model organism Caenorhabditis elegans, emphasizing the importance of USP11 in autophagy regulation. To identify the mechanism of USP11-dependent autophagy regulation, we performed a USP11 interactome screen after 4 hour Torin1 treatment and identified a plethora of autophagy-related proteins. Following the most prominent hits, we have investigated versatile ways in which USP11 regulates autophagy. USP11 interacts with the PI3KC3 complex, the role of which is phosphorylating lipids of the ER, thereby initiating the formation of the autophagosomal membrane. Phosphorylated lipids serve as a recruitment signal for downstream effector proteins necessary for the membrane expansion. The core components of the complex are VPS34, the lipid kinase, ATG14, the protein responsible for targeting the complex to the ER, VPS15, a pseudokinase with a scaffolding role, Beclin1, a regulatory subunit, and NRBF2, the dimer-inducing subunit. We have found USP11 interacts with the complex and, based on its activity, USP11 influences post-translational status of all the aforementioned subunits, except for ATG14. Moreover, we have found that loss of USP11 leads to an increase in NRBF2 levels, whereas it does not change the levels of the other proteins. Given that the dimerization of the complex leads to an increase in complex activity, we investigated if the complex is more tightly formed in the absence of USP11, and if it is more active. We have found both to be the case. Although the exact mechanism of USP11-dependent PI3KC3 complex regulation remains to be identified, we found that loss of USP11 stimulates the complex formation and activity, likely contributing to the general effect of USP11 on autophagy flux. Additionally, we found that USP11 modulates levels of mTOR, the most upstream kinase in autophagy initiation steps and general multifaceted metabolism regulator. Loss of USP11 led to downregulation of mTOR levels, suggesting USP11 may rescue mTOR from proteasome-mediated degradation. Furthermore, we found mTOR to be differentially modified depending on the activity of USP11. However, it remains to be shown if USP11-dependent mTOR regulation contributes to the observed autophagy phenotype. Taken together, USP11 is a novel, versatile, negative regulator of autophagy, and an important addition to our knowledge on the regulation of autophagy by the ubiquitin system.
Ionenstrahlen werden in der Grundlagenforschung, in der Industrie und der Medizin verwendet. Um die Teilchen für die jeweiligen Anforderungen nutzbar zu machen, werden sie mit Ionenbeschleunigern je nach Anwendung auf eine bestimmte Energie beschleunigt. Eine Beschleunigeranlage besteht dabei aus einer Reihe von unterschiedlichen Elementen: Ionenquellen, Linearbeschleuniger, Kreisbeschleuniger, Fokussierelemente, Diagnosesysteme usw. In jeder dieser Kategorien gibt es wiederum verschiedene Realisierungsmöglichkeiten, je nach Anforderung des jeweiligen Abschnitts und der gesamten Anlage. Im Bereich der Linearbeschleuniger ist als Bindeglied zwischen Ionenquelle/Niederenergiebereich und Nachfolgebeschleuniger der Radiofrequenzquadrupol (RFQ) weit verbreitet. Dieser kann den aus der Quelle kommenden Gleichstromstrahl in Teilchenpakete (Bunche) formen und diese gleichzeitig auf die nächste Beschleunigerstufe angepasst vorbeschleunigen. Desweiteren wird der Teilchenstrahl innerhalb des RFQ kontinuierlich fokussiert, wodurch insbesondere bei diesen niedrigen Energien Strahlverluste minimiert werden. Bei hohem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis wird für schwere Ionen eine niedrige Resonanzfrequenz von deutlich unter 100 MHz benötigt. Dies führt zu längeren Beschleunigungszellen entlang der Elektroden, womit durch eine bessere Fokussierung auch höhere Strahlströme beschleunigt werden können. Im Allgemeinen bedeutet eine niedrigere Resonanzfrequenz aber auch einen größeren Querschnitt der Resonanzstruktur sowie einen längeren Beschleuniger. Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung unterschiedlicher RFQ-Strukturen für niedrige Frequenzen, wie sie beispielsweise im Linearbeschleunigerbereich der Gesellschaft für Schwerionenforschung (GSI) in Darmstadt Anwendung finden. Zunächst wird die Beschleunigeranlage des GSI Helmholtzzentrums für Schwerionenforschung in Darmstadt und dessen zur Zeit im Bau befindliche Erweiterung FAIR (Facility for Antiproton and Ion Research) kurz vorgestellt. Teil dieser Anlage ist der Hochstrominjektor genannte Anfangsbeschleuniger, der wiederum aus einem RFQ und zwei nachfolgenden Driftröhrenbeschleunigern besteht. Dieser Hochstrominjektor dient als Referenz für die vorliegende Arbeit. In Kapitel 3 wird kurz auf Linearbeschleuniger im Allgemeinen und auf das Grundprinzip und die Eigenschaften eines RFQ näher eingegangen. Anschließend werden verschiedene RFQ-Strukturkonzepte vorgestellt und die Strahldynamik in einem RFQ sowie charakteristische Resonatorgrößen beschrieben. Ausgangspunkt ist der aktuelle RFQ des Hochstrominjektors (Kapitel 4). Dieser IH-RFQ mit einer Betriebsfrequenz von 36 MHz ist seit vielen Jahren in Betrieb und soll für eine verbesserte Effizienz und Betriebssicherheit ein Upgrade erfahren. Dazu wurden Simulationen sowohl der bestehenden Struktur als auch mit Modifikationen durchgeführt und diese miteinander verglichen. Zur Entwicklung eines kompakten Resonators werden in Kapitel 5 verschiedene Splitring-RFQ-Modelle als Alternative zur IH-Struktur mittels Simulationen untersucht. Diese wurden für eine niedrigere Frequenz von 27 MHz entworfen, was der Frequenz des ursprünglichen Wideröe-Beschleunigers (Vorgänger des Hochstrominjektors HSI) entspricht und ebenso wie die 36 MHz des IH-RFQ eine Subharmonische der 108 MHz des Folgebeschleunigers ist. Abschließend wurde noch eine neue RFQ-Struktur, der Splitframe-RFQ, entworfen und untersucht. Auch dieser wurde für eine Frequenz von 27 MHz ausgelegt. Die Ergebnisse dieser Entwicklung, die eine Mischung aus einem Splitring- und einem klassischen 4-Rod-RFQ darstellt, befinden sich in Kapitel 6. Alle Feldsimulationen wurden mit dem Programm Microwave Studio von CST durchgeführt. Zusammenfassend werden die verschiedenen Konzepte anhand der charakteristischen Resonatorgrößen verglichen und ein Ausblick auf weiterführende Arbeiten gegeben.
Synaptopodin is the founding member of a family of actin-associated proline-rich proteins. It is present in a subset of telencephalic dendritic spines, where it is tightly associated with the dendritic spine apparatus, a putative calcium store. Synaptopodin-deficient mice lack the spine apparatus and show deficits in long-term potentiation and spatial memory. Thus, synaptopodin appears to play a role in synaptic plasticity. In the present thesis, three major questions were addressed: (1) What is the distribution of synaptopodin and the spine apparatus in identified hippocampal neurons? (2) Is the distribution of synaptopodin affected by denervation? (3) Is synaptopodin involved in the regulation of denervation-induced spine loss? The major findings of this thesis are: (1) Immunohistochemistry in the hippocampus of wildtype and EGFP-transgenic mice revealed significant layer-specific differences in the prevalence of synaptopodin at the level of individual neurons. (2) Light and electron microscopic analysis also revealed the presence of synaptopodin in axon initial segments of cortical and hippocampal principal neurons. There, it was found to be an essential component of the cisternal organelle, a putative axonal homologue of the dendritic spine apparatus. (3) Immunohistochemistry in the rat fascia dentata before and following entorhinal deafferentation revealed changes in synaptopodin expression in denervated and non-denervated layers of the hippocampus, suggesting that the distribution of synaptopodin in hippocampal neurons is regulated by presynaptic signals. (4) The dynamics of denervation-induced spine plasticity were studied in vitro using confocal live imaging of organotypic entorhino-hippocampal slice cultures. Whereas spines were remarkably stable under control conditions, spine loss and spine formation were seen following denervation. No significant differences were observed between cultures from wildtype and synaptopodin-deficient mice, suggesting that synaptopodin is not involved in lesion-induced spine plasticity. (5) Finally, a set of transgenic mice expressing fluorescently tagged synaptopodin were generated to facilitate future experiments on the dynamics and function of synaptopodin. In summary, this thesis presents novel findings on (1) the subcellular distribution of synaptopodin in spines and the axon initial segment, (2) the molecular composition of the cisternal organelle, and (3) the dynamics of spines and the spine apparatus organelle following deafferentation in vivo and in vitro.
Der Einfluss von Chemotherapie bei malignen pädiatrischen Erkrankungen auf kindliche Impftiter
(2021)
Hintergrund: Chemotherapie hat nicht nur einen Einfluss auf die Krebszellen, sondern auch auf das Immunsystem der Behandelten. In unserer Studie untersuchten wir den Impftiterverlust impfpräventablen Erkrankungen (Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster) bei Kindern und Jugendlichen, welche eine chemotherapeutische Behandlung wegen einer malignen Erkrankung erhielten.
Methoden: Eingeschlossen in die retrospektive Studie wurden Kinder, Jugendliche und junge Erwachsene im Alter bis zum 21. Lebensjahr, welche zwischen 2001 und 2010 an der Kinderklinik für Hämatologie und Onkologie der Universitätsklinik Frankfurt am Main therapiert wurden. Es erfolgte die Analyse von Antikörper-Titer für Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster zum Diagnosezeitpunkt und erneut bis zu 12 Monate nach Therapieende.
Ergebnis: Insgesamt konnten 195 Kinder und Jugendliche in die Studie eingeschlossen werden. 122 Probanden waren männlich, 73 weiblich. Die größte Patientengruppe war an ALL erkrankt (80 Patienten). Die übrigen Patienten verteilten sich auf 15 Patienten mit AML, 18 Patienten mit NHL, 22 Patienten mit Hodgkin Lymphom. 60 Patienten waren an soliden Tumoren erkrankt. Insgesamt haben 27%, 47%, 19% und 17% der Kinder und Jugendlichen ihren Impfschutz gegen Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster verloren. Hierbei zeigte sich eine Altersabhängigkeit. In der Auswertung zeigte sich bei jüngeren Kindern unter 7 Jahren häufiger ein Titerverlust als bei den älteren Kindern und Jugendlichen. Auch an ALL-erkrankte und behandelte Kinder und Jugendliche verloren häufiger ihren Impfschutz als die Patienten mit anderen untersuchten Krebserkrankungen (AML, NHL, M. Hodgkin, solide Tumore).
Fazit: Die Daten unserer retrospektiven Studie zeigen, dass eine signifikante Anzahl von Kindern und Jugendlichen durch eine chemotherapeutischen Behandlung ihre vorbestehenden Impftiter gegen impfpräventable Erkrankungen wie Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster verlieren. Dieser Verlust zeigt sich häufiger bei jüngeren Patienten und ALL-Patienten. Unsere Daten unterstreichen daher, wie wichtig es ist, Kinder und Jugendliche nach Beendigung der Chemotherapie erneut zu impfen, um einen neuen ausreichenden Impfschutz gegen Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster zu erhalten.
Das Feld der Hochenergie-Schwerionenforschung hat sich der Untersuchung des Quark-Gluon-Plasmas (QGP) gewidmet. Ein QGP ist ein sehr heißer und dichter Materiezustand, der kurz nach dem Urknall für einige Mikrosekunden das Universum füllte. Unter diesen extremen Bedingungen sind die fundamentalen Bausteine der Materie, die Quarks und Gluonen, quasi frei, also nicht in Hadronen eingeschlossen, wie es unter normalen Bedingungen der Fall ist. Hadronen sind Teilchen, die aus Quarks und Gluonen bestehen. Die bekanntesten Hadronen sind Protonen und Neutronen, die Bestandteile von Atomkernen, aus denen, zusammen mit Elektronen, die gesamte bekannte Materie aufgebaut ist.
Um ein QGP im Labor zu erzeugen, lässt man ultrarelativistische schwere Ionen, wie zum Beispiel Pb-208-Kerne, aufeinander prallen. Dies geschieht am CERN, dem größten Kernforschungszentrum der Welt. Der Teilchenbeschleuniger, welcher Protonen und Pb-Kerne beschleunigt und zur Kollision bringt, heißt Large Hadron Collider (LHC) und ist mit 27 km Umfang der größte der Welt. Bei einer einzigen Pb-Pb Kollision am LHC werden mehrere Tausend Teilchen und Antiteilchen erzeugt. Das dedizierte Experiment zur Untersuchung von Schwerionenkollisionen am LHC ist ALICE. ALICE ist mit mehreren Teilchendetektoren ausgerüstet, die es ermöglichen, tausende Teilchen gleichzeitig zu messen und zu identifizieren.
Unter den produzierten Teilchen befinden sich auch leichte Atomkerne, wenngleich diese nur sehr selten erzeugt werden. Die Anzahl der produzierten Teilchen pro Teilchensorte hängt nämlich von deren Masse ab. In Pb-Pb Kollisionen am LHC sinkt die Anzahl der produzierten (Anti)kerne exponentiell um einen Faktor 1/330 bei Hinzufügen jedes weiteren Nukleons. Die Menge an produzierten Teilchen pro Spezies stellt Informationen über den Produktionsmechanismus beim Übergang vom QGP zum Hadrongas zur Verfügung. Hierbei sind leichte (Anti)kerne von besonderem Interesse, da sie vergleichsweise groß sind und ihre Bindungsenergie bis zu zwei Größenordnungen kleiner ist als die Temperaturen, die bei der Erzeugung der Hadronen vorherrschen. Es ist bis heute noch nicht verstanden, wie leichte (Anti)kerne bei diesen Bedingungen erzeugt werden und überleben können.
Für diese Arbeit wurden ca. 270 Millionen Pb-Pb Kollisionen bei einer Schwerpunktsenergie von 5,02 TeV, die von ALICE im November 2018 aufgezeichnet wurden, analysiert. Es wurde die Produktion von (Anti)triton und (Anti)alpha untersucht. Wegen ihrer großen Masse werden beide Kerne sehr selten produziert, bei weitem nicht bei jeder Kollision. Antialpha ist der schwerste Antikern, der jemals gemessen wurde. Aufgrund dieser Seltenheit ist die Größe des zur Verfügung stehenden Datensatzes entscheidend. Es war möglich, das erste jemals gemessene Antialpha-Transversalimpulsspektrum zu extrahieren. Auch für (Anti)triton und Alpha wurden Transversalimpulsspektren bestimmt.
Die Ergebnisse wurden mit theoretischen Modellen und anderen ALICE Messungen verglichen.
Am Ende wird in einem Ausblick auf das kürzlich durchgeführte Upgrade der ALICE Spurendriftkammer (TPC) eingegangen. In der nächsten, bald startenden Datennahmeperiode wird der LHC seine Kollisionsrate erheblich erhöhen, was es ermöglichen wird, mehr als 100 mal so viele Daten wie bisher aufzuzeichnen. Hiervon werden die in dieser Arbeit beschriebenen (Anti)triton- und (Anti)alpha-Analysen beachtlich profitieren. Um mit den erheblich höheren Kollisionsraten zurecht zu kommen, mussten einige Detektoren, unter anderem die TPC, maßgeblich erneuert werden. In den ersten beiden Datennahmeperioden wurde die TPC mit Vieldrahtproportionalkammern betrieben. Diese sind allerdings viel zu langsam für die geplanten Kollisionsraten. Deshalb wurden sie im Jahr 2019, während einer langen Betriebspause des LHC, durch Quadrupel-GEM (Gas Electron Multiplier) Folien basierte Auslesekammern ersetzt, welche eine kontinuierliche Auslese der TPC ermöglichen. Da es sich um die erste jemals gebaute GEM TPC im Großformat handelt, war ein umfangreiches Forschungs- und Entwicklungs- (F&E) Programm notwendig, um die GEM Auslesekammern zu charakterisieren und zu testen. Im Rahmen dieses F&E Programms wurden am Anfang dieser Promotion systematische Messungen an einer kleinen Test TPC mit Quadrupel-GEM Auslese, die extra zu diesem Zweck gebaut worden war, durchgeführt. Hierbei wurde der Rückfluss der bei der Gasverstärkung erzeugten Ionen in das Driftvolumen der TPC und die Energieauflösung mit verschiedenen GEM Folien Typen und unterschiedlicher Anordnung gemessen. Das Ziel war, möglichst kleine Ionenrückflüsse bei möglichst guter Energieauflösung zu erreichen. Hierbei musste ein Kompromiss gefunden werden, da die beiden Größen sich gegenläufig verhalten. Es war jedoch möglich, mit mehreren GEM Konfigurationen Spannungseinstellungen zu identifizieren, bei denen beide Größen den gewünschten Anforderungen entsprachen.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von NCarboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch FormylmethanofuranDehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D ProtonenaustauschSpektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivoCO 2 Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 Methylentetrahydromethanopterin (Methylen H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 bildender MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über TransferNOEMessungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die ReSeitenStereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von MethylenH 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADPabhängiger MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMRspektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP ReSeitenspezifisch in Bezug auf MethylenH 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die ReSeite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu SHydroxymethylglutathion wurde mit EXSYMessungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSYMessungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion abhängiges FormaldehydaktivierendesEnzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der UbichinonBindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMRMethode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 CHSQCSpektren unter Verwendung von HRMASNMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMRspektroskopischen Methoden Protein LigandWechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
... Die drei Unternehmen, aus deren Geschichte hier erzählt wird, Bayer, Hoechst und Schering, waren bis zum Ende des Zweiten Weltkrieges Chemiekonzerne, die u.a. auch Arzneimittel herstellten und verkauften. Als erste Firma hat sich Schering nach dem Zweiten Weltkrieg weitgehend auf Pharmazeutika konzentriert und sich wie Hoechst am Ende des Jahrhunderts ganz von seinen Chemieaktivitäten getrennt. Allein Bayer bietet weiterhin eine breite Palette von chemischen Produkten an. ...
The power to dissociate : molecular function of the twin-ATPase ABCE1 in archaeal ribosome recycling
(2010)
Hepatitis B caused by infection with the hepatitis B virus (HBV) still ranks among the most challenging infectious diseases of our time. Despite the availability of an effective prophylactic vaccine, 240 million people worldwide are estimated to be chronically infected with HBV and are at risk of developing life-threatening liver diseases, including cirrhosis and liver cancer. The underlying pathogenic mechanisms of HBV-associated liver diseases are only incompletely understood. It is widely accepted that liver pathology results from long-term immune-mediated liver injury and inflammation as a consequence of inefficient viral elimination. This injury can be naturally compensated by liver regeneration. However, chronic liver damage and permanent inflammation debilitates the regenerative capacity of the liver and fosters fibrosis as well as accumulation of chromosomal aberrations, which both contribute to cirrhosis and liver cancer. Liver regeneration requires the presence of the redox-sensitive transcription factor Nrf2 and intact insulin receptor signaling. A lack of Nrf2 causes increased intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) that inactivate insulin receptor signaling and induce insulin resistance. Interestingly, HBV was observed to activate Nrf2 and the expression of Nrf2-regulated genes. This argues against an inhibitory effect of HBV on insulin receptor signaling by increased ROS levels. However, chronic HBV infection is associated with dysregulation of hepatocyte proliferation and retardation of liver regeneration. Hence, the aim of this thesis was to investigate the influence of HBV on the process of liver regeneration with respect to the insulin receptor signaling pathway. After short-term carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver damage, HBV transgenic mice present prolonged liver damage and impaired liver regeneration as reflected by reduced hepatocyte proliferation and increased apoptosis. Impaired hepatocyte proliferation in HBV transgenic mice correlates with diminished activation of the insulin receptor. It was further observed in vitro that the activation of Nrf2 by HBV induces increased levels of the insulin receptor mRNA and protein in HBV-expressing cells. Strikingly, stably HBV-expressing cells as well as primary mouse hepatocytes from HBV transgenic mice bind less insulin due to reduced amounts of insulin receptor on the cell surface. This is caused by intracellular retention of the insulin receptor in HBV-expressing cells as a consequence of increased amounts of the cellular trafficking factor α-taxilin. The reduced amounts of insulin receptor on the cell surface impair insulin sensitivity in HBV-expressing cells and inactivate downstream signaling cascades that initiate insulin-dependent gene expression and glucose uptake. As a consequence of impaired hepatocyte proliferation and liver regeneration, HBV transgenic mice exhibit increased development of fibrosis after long-term CCl4-induced liver damage. Taken together, in this thesis, a novel pathomechanism could be uncovered that includes inactivation of insulin receptor signaling by HBV via intracellular retention of the insulin receptor leading to impaired liver regeneration after liver damage and promotion of liver fibrosis. These findings significantly contribute to an enhanced understanding of HBV-associated liver pathogenesis.
Hintergrund: Die Thoraxsonographie ermöglicht in der Intensivmedizin die Diagnose von Pleuraerguss und Pneumothorax in Rückenlage mit ähnlicher Sensitivität und Spezifität wie ein Röntgenthorax. Bisher verfügbar war ein kombiniertes theoretisches und praktisches Training, um diese Diagnostik zu lehren, die vor allem von der Erkennung einer sich bewegenden Sonoanatomie abhängt. Die neuere Computertechnologie ermöglicht es nun, solche Sachverhalte zu zeigen, zu animieren und zu erklären.
Ziele: Entwicklung und Überprüfung eines E-Learning für die Thoraxsonographie in der Intensivmedizin.
Methoden: Ein animiertes interaktives, Internet-basiertes E-Learning wurde mit Flash und dem Web-Kit-Freiburg entwickelt. Das E-Learning wurde zur Vorbereitung eines DEGUM-zertifizierten Trainingsprogramms für Thoraxsonographie verwendet und danach von Ärzten mit visuellen Analogskalen (VAS) evaluiert (Studie A). Eine prospektive Lernerfolgsstudie wurde mit Medizinstudenten ohne praktisches Training unter Zuhilfenahme eines 20 Fragen umfassenden „Multiple-Choice“- Tests durchgeführt und nach 2 Wochen einer Nachhaltigkeitsüberprüfung unterzogen (Studie B). Alle Teilnehmer hatten kaum (A) oder keine (B) Vorkenntnisse in der Thoraxsonographie.
Ergebnisse: Das neu entwickelte E-Learning steht im Internet in Deutsch und Englisch zur Verfügung. Studie A: 34 Ärzte, die das E-Learning verwendeten, schätzten ihren Wissenszuwachs von Null auf 79,5% (Median, 95%-Konfidenzintervall 69%-88%, Min/Max 48/97).
Studie B: 29 Medizinstudenten erzielten eine Verbesserung von 11,7/20 auf 17/20 richtigen Antworten nach Anwendung des E-Learning (relative Steigerung 45%, p<0,0001 Wilcoxon's-matched-pairs-test). Nach 2 Wochen wurden noch 83% der Fragen richtig beantwortet (p<0,0001 vs. Pre-Test).
Schlussfolgerung: Die Grundlagen der Thoraxsonographie können mittels E-Learning mit einer hohen Effektivität vermittelt werden. Es eignet sich daher für ein „Blended- Learning“ Konzept.
Transport mechanism of a multidrug resistance protein investigated by pulsed EPR spectroscopy
(2019)
In human several diseases result from malfunctions of ATP-binding cassette (ABC) systems, which form one of the largest transport system superfamily. Many ABC exporters contain asymmetric nucleotide-binding sites (NBSs) and some of them are inhibited by the transported substrate.1 For the active transport of diverse chemically substrates across biological membranes, ABC transport complexes use the energy of ATP binding and subsequent hydrolysis. In this thesis, the heterodimeric ABC exporter TmrAB2,3 from Thermus thermophilus, a functional homolog of the human antigen translocation complex TAP, was investigated by using pulsed electron-electron double resonance (PELDOR/DEER) spectroscopy. In the presence of ATP, TmrAB exists in an equilibrium between inward- and outward-facing conformations. This equilibrium can be modulated by changing the ATP concentration, showing asymmetric behaviour in the open-to-close equilibrium between the consensus and the degenerate NBSs. At the degenerate NBS the closed conformation is more preferred and closure of one of the NBSs is sufficient to open the periplasmic gate at the transmembrane domain (TMD).3 By determining the temperature dependence of this conformational equilibrium, the thermodynamics of the energy coupling during ATP-induced conformational changes in TmrAB were investigated. The results demonstrate that ATP-binding alone drives the global conformational switching to the outward-facing state and allows the determination of the entropy and enthalpy changes for this step. With this knowledge, the Gibbs free energy of this ATP induced transition was calculated. Furthermore, an excess of substrate, meaning trans-inhibition of the transporter is resulting mechanistically in a reverse transition from the outward-facing state to an occluded conformation predominantly.3 This work unravels the central role of the reversible conformational equilibrium in the function and regulation of an ABC exporter. For the first time it is shown that the conformational thermodynamics of a large membrane protein complex can be investigated. The presented experiments give new possibilities to investigate other related medically important transporters with asymmetric NBSs or other similar protein complexes.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bindeeigenschaft des synaptischen Vesikelproteins SV31 zu den divalenten Metallionen Zn2+, Ni2+ sowie Cu2+ nachgewiesen und reproduziert werden. Die Bindung an Zn2+ wurde dabei sowohl in vitro an der Sepharosesäule als auch in vivo in NGF-differenzierten PC12-Zellen bestätigt (3.2.1 - 3.2.3). In einer Kollaboration mit dem Max-Planck-Institut für Biophysik wurde des Weiteren eine mögliche Zinktransportfunktion von SV31 untersucht. Dafür wurde die Ladungstranslokation durch myc-SV31-enthaltene CHO-Zellmembranen nach Zinkzugabe gemessen (3.2.5). Weiterhin konnte durch subzelluläre Fraktionierung von PC12-Zellen ein Verteilungsmuster des neuen Proteins in Mikrosomen unterschiedlicher Dichte dokumentiert werden. Durch die andauernde Expression von SV31-RFP in stabil transfizierten PC12-Zellen kommt es außerdem zur Beeinflussung des Expressionsmusters zahlreicher Markerproteine und damit einhergehend zu einer Dichteverschiebung somatischer Organellen (3.3.1 - 3.3.3). Kolokalisationsstudien von SV31 mit Markerproteinen zahlreicher Zellorganellen ergaben partielle Fluoreszenzüberlagerungen mit synaptischen Vesikelproteinen sowie eine Anreicherung von SV31 in Nähe der Plasmamembran. In diesem Zusammenhang zeigt sich ebenfalls eine Übereinstimmung der Lokalisation von SV31 mit den SNAREProteinen SNAP25 und Syntaxin1A (3.4.1 - 3.4.3). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erweitern nicht nur das Wissen um die funktionellen Eigenschaften von SV31, sie geben auch Anlass zum Nachdenken über mögliche Interaktionspartner des neuen Vesikelproteins. Die Fähigkeit zur Zinkbindung und -akkumulation auf präsynaptischer Seite rückt SV31, im Hinblick auf neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson, auch in einen medizinisch relevanten Kontext. Durch Deduktion der hier aufgezeigten Ergebnisse entsteht ein erweitertes Verständnis der Relevanz von SV31 als funktionelle, zinkbindende Einheit im Rahmen der synaptischen Transmission.
Primäres Ziel dieser Arbeit war es, einen direkten Beweis für die Annahme zuerbringen, dass eine starke Intensitätsabhängigkeit der N1/P2- Komponente des AEPs und im besonderen des tangentialen Dipols durch eine erniedrigte serotoninerge Neurotransmission verursacht wird. Gleichzeitig konnte als klinisch relevanter Effekt die mögliche Verwendbarkeit der Intensitätsabhängigkeit als biologischer Marker für das Aktivitätsniveau des serotoninergen Systems getestet werden. Durch das Studiendesign wurde zusätzlich die Überprüfung des allgemein postulierten Zusammenhanges zwischen einer impulsiv-aggressiven Persönlichkeitsstruktur und einer hohen Intensitätsabhängigkeit evozierter Potentiale als Nebenziel ermöglicht. Mit Hilfe in ihrer Zusammensetzung verschiedener Aminosäure-Mischungen, die eineperiphere Tryptophandepletion herbeiführen, sollte eine verminderte zentrale serotoninerge Neurotransmission erzielt werden.Die Intensitätsabhängigkeit des AEPs an den Tagen mit verminderter Verfügbarkeit des einzigen Präkursors von Serotonin, der essentiellen Aminosäure Tryptophan, wurde im Vergleich zu einem Kontrolltag überprüft, an dem nur ein Placebo verabreicht worden war.Dazu wurden 13 gesunde Probanden (7w, 6m) im Alter von 24-32 Jahren nach ausführlicher psychologischer Erfassung ihrer Persönlichkeitsstruktur einemdoppelblinden, placebokontrolliertem Cross-over Studiendesign unterworfen, in dem jede Versuchsperson die Aminosäure-Mischung Young 50 bzw. 100 und Moja als Tryptophandepletionstest (TDT) neben einem Placebo erhielt. Die Intensitätsabhängigkeit des AEPs am Kontrolltag wurde mit den bei der Voruntersuchung erhobenen Persönlichkeitsmerkmalen in Zusammenhang gesetzt. Das Hauptergebnis dieser Arbeit war eine positive Korrelation der Plasmatryptophanspiegels mit der Intensitätsabhängigkeit des tangentialen Dipols des N1/P2-Komplexes (r=0,46; p<0,05).Dies steht im Widerspruch zu den bisher veröffentlichten Arbeiten zu diesem Thema. Ein Grund für dieses konträre Resultat mag eine durch den TDT nicht herbeigeführte Erniedrigung der zentralen serotoninergen transmissiven Aktivität sein. Zudem wurden die meisten anderen Untersuchungen an Patienten, bei denen eine Störung im serotoninergen System von vornherein angenommen worden war, vorgenommen, was einen Hauptunterschied zu dieser Studie, die mit gesunden Probanden durchgeführt worden war, darstellt. Und ob bei normalen Probanden eine Tryptophandepletion es vermag, eine Erniedrigung serotoninerger Neurotransmission zuverursachen, bleibt fraglich. Auch ist die Intensitätsabhängigkeit des AEPs wohl nicht ein rein spezifischer, sondernhöchstens ein relativ spezifischer Parameter für die zentrale Aktivität serotoninerger Neurone. Sie kann also auch von anderen Transmittersystemen mit beeinflusst sein. Mit der unterschiedlichen Ausprägung der Intensitätsabhängigkeit des AEPs in den Hemisphären liess sich allerdings ein weiteres Indiz für eine funktionelle Seitenasymmetrie in der Reizverarbeitung und wohl auch im serotoninergen Stoffwechsel finden. Aber auch das Ergebnis, dass die Intensitätsabha"ngigkeit des radialen und tangentialen Dipols teilweise hochsignifikant negativ mit als eher aggressiv und impulsiv zu beurteilenden Eigenschaften korrelierte, widerspricht den bisherigen Studienergebnissen, nach der eine hohe serotoninerge Neurotransmission generell inhibierend auf das Verhalten wirke, und somit Aggressivitä"t und Impulsivität beiPersonen mit hoher Intensitätsabhängigkeit evozierter Potentiale auftreten müsste. Zweifel, ob die Intensitätsabhängigkeit wirklich den geeigneten Parameter zur Beurteilung des Aktivitätsniveaus im serotoninerge System darstellt, lassen das Ergebnis weniger widersprüchlich erscheinen. Ebenso erfordert die Komplexität des Zusammenspiels vieler verschiedener Modulatoren wohl eine enger gefasste Fragestellung, die auch andere Transmittersysteme, wie etwa das noradrenerge und dopaminerge, und Hormone, wie Testosteron oder Cortisol, mit einschliesst. Eine Beteiligung des serotoninergen Transmittersystems bei der Beeinflussungaggressiven und impulsiven Verhaltens lässt sich jedoch aus der Beobachtung vermuten, dass die Veränderung der Intensitätsabhängigkeit durch den Tryptophandepletionstestsich bei verschieden Persönlichkeitstypen anders verhielten. Neugierverhalten und Impulsivität zeigten eine signifikant negative Korrelation, mit der depletionsabhängigen Steigungsänderung (DSA"), Schadensvermeidung dagegen eine signifikant positive. Die Auswirkungen des TDT auf die Befindlichkeit und das Verhalten derteilnehmenden Probanden waren Themen einer anderen Arbeit (Sadigorsky, in Vorbereitung), ebenso wie die neuropharmakologischen Aspekte der Tryptophandepletion (Kewitz, in Vorbereitung). Durch die hier vorgestellten Ergebnisse erfährt die Hoffnung, einen biologischen Marker für einen für die Genese vieler psychiatrischer Störungen wichtigen Neurotransmitter gefunden zu haben, der nicht invasiv ist und schnell Einzug in dieklinische Routinediagnostik halten könnte, leider keinen Rückhalt. Zu viele Zweifel bestehen an der Aussagekraft und Spezifität dieses Funktionsparameters.
The light-harvesting complex of photosystem II (LHC-II) is the major antenna complex in plant photosynthesis. It accounts for roughly 30% of the total protein in plant chloroplasts, which makes it arguably the most abundant membrane protein on Earth, and binds about half of plant chlorophyll (Chl). The complex assembles as a trimer in the thylakoid membrane and binds a total of 54 pigment molecules, including 24 Chl a, 18 Chl b, 6 lutein (Lut), 3 neoxanthin (Neo) and 3 violaxanthin (Vio). LHC-II has five key roles in plant photosynthesis. It: (1) harvests sunlight and transmits excitation energy to the reaction centres of photosystems II and I, (2) regulates the amount of excitation energy reaching each of the two photosystems, (3) has a structural role in the architecture of the photosynthetic supercomplexes, (4) contributes to the tight appression of thylakoid membranes in chloroplast grana, and (5) protects the photosynthetic apparatus from photo damage by non photochemical quenching (NPQ). A major fraction of NPQ is accounted for its energy-dependent component qE. Despite being critical for plant survival and having been studied for decades, the exact details of how excess absorbed light energy is dissipated under qE conditions remain enigmatic. Today it is accepted that qE is regulated by the magnitude of the pH gradient (ΔpH) across the thylakoid membrane. It is also well documented that the drop in pH in the thylakoid lumen during high-light conditions activates the enzyme violaxanthin de-epoxidase (VDE), which converts the carotenoid Vio into zeaxanthin (Zea) as part of the xanthophyll cycle. Additionally, studies with Arabidopsis mutants revealed that the photosystem II subunit PsbS is necessary for qE. How these physiological responses switch LHC-II from the active, energy transmitting to the quenched, energy-dissipating state, in which the solar energy is not transmitted to the photosystems but instead dissipated as heat, remains unclear and is the subject of this thesis. From the results obtained during this doctoral work, five main conclusions can be drawn concerning the mechanism of qE: 1. Substitution of Vio by Zea in LHC-II is not sufficient for efficient dissipation of excess excitation energy. 2. Aggregation quenching of LHC-II does not require Vio, Neo nor a specific Chl pair. 3. With one exception, the pigment structure in LHC-II is rigid. 4. The two X-ray structures of LHC-II show the same energy transmitting state of the complex. 5. Crystalline LHC-II resembles the complex in the thylakoid membrane. Models of the aggregation quenching mechanism in vitro and the qE mechanism in vivo are presented as a corollary of this doctoral work. LHC-II aggregation quenching in vitro is attributed to the formation of energy sinks on the periphery of LHC-II through random interaction with other trimers, free pigments or impurities. A similar but unrelated process is proposed to occur in the thylakoid membrane, by which excess excitation energy is dissipated upon specific interaction between LHC-II and a PsbS monomer carrying Zea. At the end of this thesis, an innovative experimental model for the analysis of all key aspects of qE is proposed in order to finally solve the qE enigma, one of the last unresolved problems in photosynthesis research.
Mitochondrial membrane dynamics is increasingly implicated in various human diseases. Numerous studies show that the protein OPA1 plays a central role in determining mitochondrial ultrastructure and apoptotic remodeling of the inner mitochondrial membrane during Cytochrome c release and apoptosis. Crista junctions are crucial for the regulation of apoptotic Cytochrome c release. Previous publications suggest that OPA1 is required to maintain a normal structure of the inner mitochondrial membrane. The protein MIC60 (Mitofilin) appears to be an essential physical constituent of crista junctions and is also crucial for the general determination of mitochondrial ultrastructure. Furthermore, recent studies suggest that MIC60 is also implicated in Cytochrome c release during apoptosis.
In this regard, the question whether OPA1 is essential for crista junction formation was investigated. In addition to that, the interplay between OPA1 and MIC60 and its physiological role were analyzed. Electron microscopy of OPA1+/- and OPA1+/+ mice, as well as of OPA1-/- and OPA1+/+ MEFs clearly showed that OPA1 plays a role but is not essential for crista junction formation. In contrast to that, the results indicate that OPA1 is crucial to maintain a normal structure of the inner mitochondrial membrane. Immunogold experiments fit well to these observations as OPA1 was found equally distributed throughout the cristae membrane with only a minor part located at crista junctions. MIC60 localization studies showed a clear enrichment at crista junctions. Interaction studies revealed that endogenous OPA1 and MIC60 physically interact with each other. Analysis of protein levels upon OPA1 or MIC60 depletion indicate that both proteins play a dual role in cristae- and crista junction formation in which MIC60 is a physical constituent of crista junctions essential for their formation while OPA1 primarily has a regulatory impact on MIC60 function. Finally, apoptosis assays and cell viability measurements showed that knockout of OPA1 in MEFs leads to increased cellular resistance suggesting that the interplay of these proteins is important for the regulation of crista junction remodeling during apoptosis.
Besides its role in determining mitochondrial ultrastructure, OPA1 mediates inner membrane fusion of mitochondria thereby contributing to mitochondrial quality control. Additionally, proteolytic processing is crucial for the ability of OPA1 to distinguish between functional and dysfunctional mitochondria. Functional mitochondria are fused while dysfunctional mitochondria are not, a process termed selective mitochondrial fusion. Dysfunctional mitochondria were shown to be degraded by mitophagy in a fission-dependent manner. Numerous studies suggest that OPA1 and mitophagy are directly linked. However, this idea is still under debate. Mitophagy is also crucial for mitochondrial quality control, which directly impacts mitochondrial integrity. Furthermore, mitochondrial quality control has been linked to neurodegeneration as demonstrated by the observation that mutations in OPA1 cause the disorder ADOA-1.
In order to analyze a potential link between OPA1 and mitophagy, mitochondrial colocalization with LC3 was analyzed microscopically in primary adult skin fibroblasts isolated from OPA1+/- and OPA1+/+ mice in an age-dependent manner. Fibroblasts from young OPA1+/- mice showed increased colocalization of mitochondria with autophagosomes compared to fibroblasts from young wild type mice suggesting that OPA1 exerts an inhibitory role in mitophagy. This effect was even more pronounced in old mice, which also displayed higher mitophagy levels in general than young mice, consistent with the finding that old mice had higher Parkin levels than young mice. Mitochondrial fragmentation was elevated in fibroblasts from young and old OPA1+/- mice compared to control fibroblasts. However, extensive mitochondrial fusion, which occurred in fibroblasts from old wild type mice, was prevented in old OPA1+/- mice. Furthermore, old wild type mice had decreased numbers of crista junctions compared to young wild type mice, an effect that was not observed in OPA1+/- mice. Despite the observed age-dependent phenotypes in mitochondrial quality control and mitochondrial integrity, deletion of one allele of OPA1 had no influence on the life span in vivo. Analysis of the OPA1-dependent proteome of aging mice, which was performed in collaboration with Ansgar Poetsch and Carina Ramallo-Guevara from Bochum, showed that OPA1-dependent aging is accompanied by a reduction of proteins involved in autophagy. In contrast to that, a switch from glucose to fatty acid metabolism and alterations in apoptotic proteins were observed in both OPA1+/- and OPA1+/+ mice in an age-dependent manner indicating that the changes in proteins implicated in autophagy could be a compensatory response to the diminished inhibitory effect of OPA1 on mitophagy. On the other hand, increased mitochondrial degradation by mitophagy could be a cellular response to itself compensating for the loss of OPA1 mediated fusion thereby contributing to the observation that OPA1+/- and OPA1+/+ mice had no differences in life span. Furthermore, analysis of the OPA1-dependent proteome of aging mice revealed that OPA1, besides its role in mitochondrial fusion, could interact with the fission machinery: MFF and Neuronal pentraxin 1, two proteins involved in mitochondrial fission, were up-regulated in 12-month-old OPA1+/- mice suggesting that a reduced fission activity could contribute to mitochondrial hyperfusion in aged wild- type mice. Nonetheless, the exact nature of the possible interplays between OPA1 and these candidates remains to be investigated.
Apoptotic cell (AC)-derived factors alter the physiology of macrophages (M Phi s) towards a regulatory phenotype that is characterized by enhanced production of anti-inflammatory mediators, an attenuated pro-inflammatory cytokine profile and reduced nitric oxide (NO) formation. Impaired NO production in response to ACs or AC-conditioned medium (CM) is facilitated by arginase II (ARG II) expression, which competes with inducible NO synthase for L-arginine. In this study, I investigated the signaling pathway that allowed CM to upregulate ARG II in M Phi s. A sphingolipid, further identified as sphingosine-1-phosphate (S1P), was required but authentic S1P alone only produced small effects. S1P acted synergistically with a so far unidentified factor to elicit high ARG II expression. S1P signaled through S1P receptor 2 (S1P2), since the S1P2-antagonist JTE013 and siRNA knock-down of S1P2 prevented ARG II upregulation. Further, inhibition and knock-down of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) attenuated CM-mediated ARG II protein induction. Exploring ERK5-dependent transcriptional regulation, promoter deletion and luciferase reporter analysis of the murine ARG II promoter (mpARG II) suggested the involvement of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) responsive element binding protein (CREB). This was confirmed by EMSA analysis and decoyoligonucleotides scavenging CREB, thereby preventing it from activating target genes and thus, blocking ARG II expression. I concluded that AC-derived S1P binds to S1P2 and acts synergistically with other factors to activate ERK5 and concomitantly CREB. This signaling cascade shapes an anti-inflammatory M Phi phenotype by ARG II induction. Further investigations of ERK5-dependent CREB activation suggested an indirect mechanism implying that ERK5 inhibited phosphodiesterase 4 (PDE4) and thus, prevented hydrolysis of cAMP. Since S1P-dependent ERK5 activation presumably inhibited PDE4, subsequent cAMP accumulation led to enhanced PKA activity and CREB-mediated transcription. The unidentified factor(s) besides S1P probably provoked the required elevation of cAMP production in M Phi s. Indeed, pharmacological inhibition of cAMP-producing adenylyl cyclase with SQ22536 as well as cAMP-dependent protein kinase A (PKA) with KT5720 suggested cAMP to be involved in CM-mediated ARG II up-regulation. Furthermore, forskolin-dependent activation of adenyly cyclase and simultaneous rolipram-mediated inhibition of PDE4 mimicked CM-induced ARG II expression. Considering these findings, I propose that one or several unidentified factors in CM provoke cAMP production in M Phi s. In parallel, AC-derived S1P activates ERK5, which inhibits PDE4-dependent cAMP hydrolysis, further raising intracellular cAMP levels. Thus, unrestricted continuous cAMP signaling via PKA/CREB, results in a time-dependent and sustained ARG II induction.
Von den etwa 400 subgingival nachgewiesenen Mikroorganismen stehen nur wenige eng mit der Parodontitis in Verbindung. Zu diesen werden Aggregatibacter actinomycetemcomitans (AA), Porphyromonas gingivalis (PG), Tannerella forsythensis (TF) und Treponema denticola (TD) gezählt. Aggressive und generalisierte schwere chronische Parodontitiden, bei denen eine Infektion mit bestimmten Parodontalpathogenen, insbesondere AA, vorliegt, lassen sich nur durch systemische Gabe von Antibiotika zusätzlich zur mechanischen antiinfektiösen Therapie erfolgreich therapieren. Für den quantitativen und qualitativen Nachweis dieser Keime stehen in der Routinediagnostik kommerziell überwiegend molekularbiologische Methoden zur Verfügung. Je nachdem, welche Komplexe subgingivaler Mikroorganismen sich nachweisen lassen, werden unterschiedliche Antibiotikaregime vorgeschlagen. Dazu sollen Plaqueproben aus den jeweils tiefsten parodontalen Taschen mit Blutung oder Suppuration entnommen werden. Für die systemische Antibiotikagabe in der Therapie spezieller Parodontitisformen ist nicht die subgingivale Flora einzelner Taschen, sondern ein repräsentatives Bild der subgingivalen Flora des jeweiligen Patienten relevant. Deshalb werden aus Kostengründen dazu häufig Proben aus mehreren Taschen zusammengefasst und als sogenannte „gepoolte“ Probe ausgewertet. Ziele dieser Studie waren zu einem, die Übereinstimmung der Ergebnissen der Analyse gepoolter Proben mit den Ergebnissen der separaten Analyse dieser Proben zu überprüfen und zum anderen, ob der Nachweis bestimmter Bakterien die klinischen Diagnosen chronische bzw. aggressive Parodontitis ermöglicht. Insgesamt wurde bei 60 Patienten (33 weiblich) mit einer unbehandelten aggressiven (AgP: 30) oder generalisierten schweren chronischen Parodontitis (ChP: 30) subgingivale Plaque aus den 4 parodontalen Taschen mit der höchsten Sondierungstiefen entnommen. Jeweils 2 sterile Papierspitzen wurden gleichzeitig an den ausgewählten Stellen nach subgingival platziert. Anschließend wurde jeweils eine Papierspitze in ein separates Transportgefäß gegeben und die jeweils andere mit 3 weiteren des gleichen Patienten gepoolt (MT4). Der Inhalt jedes Gefäßes wurde mit einem von zwei kommerziellen Tests (RNS-Sondentest oder real time PCR) auf Aggregatibacter actinomycetemcomitans (AA), Porphyromonas gingivalis (PG), Tannerella forsythensis (TF) und Treponema denticola (TD) ausgewertet. Die logarithmierten Bakterienzahlen lagen für MT4 höher als für die separaten Analysen (P< 0,001). Bei der Nachweishäufigkeit aller untersuchten Keime kamen separate Analysen und MT4 zu vergleichbaren Ergebnissen. Für PG, TF und TD war die Übereinstimmung beider Strategien moderat (k > 0,4) bis ausgezeichnet (k > 0,75), für AA schlecht (k = 0,38). PG, TF, und TD wurden bei der Mehrheit der Patienten nachgewiesen (PG: 90%, TF/TD: 98%), während AA in nur 57% der Fälle vorkam. Die logarithmierten Bakterienzahlen für AA lagen bei separater Analyse statistisch signifikant höher bei der aggressiven Parodontitis (AgP) als bei der generalisiert schweren chronischen Parodontitis (ChP) (P=0,036). Dieser Unterschied konnte bei der gepoolten Analyse (MT4) statistisch nicht gesichert werden. TF, PG, und TD wurden mittels separater Analyse bei ChP in statistisch signifikant höheren Zahlen nachgewiesen als bei AgP, dies wurde mittels MT4 nur für TF bestätigt. AA wurde statistisch signifikant häufiger bei AgP als bei ChP mit separater Analyse nachgewiesen. Die Gesamtprävalenz und MT4 konnten diese Beobachtung nicht bestätigen. PG wurde mit allen Analysestrategien häufiger bei ChP als bei AgP nachgewiesen. Die Prävalenz von TF und TD ergab keinen statistisch signifikanten Unterscheid zwischen ChP und AgP. Unter Limitationen der vorliegenden Studie lassen sich folgende Schlussfolgerungen ziehen: 1) Bei gepoolter Analyse subgingivaler Plaqueproben werden die untersuchten Bakterien zumindest genauso häufig nachgewiesen wie bei separater Analyse, sodass die gepoolte Analyse für die mikrobiologische Routinediagnostik empfohlen werden kann. Es gibt allerdings eine deutliche Variabilität der Nachweishäufigkeit von Proben, die gleichzeitig entnommen wurden auf Patientenebene. Die Entnahme von 6 statt 4 Proben könnte die Variabilität möglicherweise reduzieren. 2) Der Nachweis von AA unterstützt die klinische Diagnose und beeinflusst die Therapieauswahl. Als alleiniger diagnostischer Test für AgP ist er aufgrund der geringen Sensitivität und des geringen positiven Vorhersagewertes allerdings nicht geeignet. Der Nachweis von PG, TF und TD eignet sich ebenfalls nicht als diagnostischer Test für AgP aufgrund der hohen Prävalenz dieser Keime sowohl bei AgP als auch bei generalisiert schwerer ChP.
This dissertation deals with the lexical, morphological, syntactic, and semantic properties of (VP )idioms and their behavior in combination with restrictive relative clauses, raising, constituent fronting, wh-movement, VP-ellipsis, pronominalization, the progressive form, verb placement, passivization, conjunction modification, and the N-after-N construction. It provides empirical evidence towards a combinatorial analysis of both semantically non-decomposable idioms (SNDIs) and semantically decomposable idioms (SDIs) and contributes to the (formal) formulation of such an account.
The Introduction (Chapter 1) first motivates why idioms are an exciting and challenging phenomenon and then gives a definition of the term idiom, a classification of idioms, and an overview of the wide spectrum of idiom analyses found in the linguistic literature.
Chapter 2, “Idioms as evidence for the proper analysis of relative clauses”, shows that the Modification Analysis beats the other two major analyses of restrictive relative clauses (RRCs), namely Raising and Matching, as (i) the latter two lead to a loss of numerous empirical generalizations in syntax and morphology, and (ii) contrary to the assumption in the literature, idioms in RRCs can, in fact, be licensed without literal syntactic movement of the RRC-head, which makes modification fully compatible with idiom reconstruction effects.
Chapter 3, “How frozen are frozen idioms?”, presents new empirical observations on the lexical, morphological, and syntactic flexibility of kick the bucket and displays that this idiom is not completely frozen with respect to its NP complement, the progressive form, and, in some contexts, even passivization. The chapter concludes that analyses of kick the bucket as a single lexical entry should be replaced by analyses of this and other SNDIs with a syntactically regular shape as consisting of individual word-level lexical entries that combine according to the standard rules of syntax.
This idea is taken up in Chapter 4, “The syntactic flexibility of semantically non-decomposable idioms”, which – based on the differences between English and German with regard to verb placement, constituent fronting, and passivization as well as a short outlook on Estonian and French – spells out a combinatorial analysis of SNDIs and augments it with a semantic analysis formulated in Lexical Resource Semantics, according to which some idiom parts make identical semantic contributions to the overall meaning of the idiom. The analysis further suggests that the syntactic flexibility of idioms is due to the semantic and pragmatic constraints on the involved constructions, rather than the syntactic encoding of the idioms.
Chapter 5, “Modification of literal meanings in semantically non-decomposable idioms”, reviews Ernst’s (1981) classical three types of idiom modification (internal, external, and conjunction) to then closely investigate the most challenging type, namely conjunction modification, in SNDIs. Based on naturally occurring examples of four SNDIs (two English, two German), it sketches an analysis in terms of two or more conjoined independent propositions, each of which can be the result of figurative reinterpretation. One of the propositions contains the idiomatic meaning, in (one of) the other(s), the meaning of the modifier applies to the literal meaning of the idiom’s noun.
Chapter 6, “Semantically decomposable idioms in the N-after-N construction”, offers a formal syntactic and semantic account of SDIs like pull strings in the N-after-N construction, as in Kim pulled string after string to get Alex into a good college. While the idiom contributes the type of entity at stake (‘string’ in the case of pull strings), N-after-N contributes that there are several instantiations of that type of entity and that these are subject to temporal or spatial succession. The chapter first summarizes the empirical properties of N-after-N, then provides an account of N-after-N in Head-driven Phrase Structure Grammar (HPSG), presents an updated version of the account of SDIs suggested in Chapter 2 within HPSG, and combines it with the HPSG account of N-after-N.
Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are rare neurological disorders that may be of genetic or infectious origin, but most frequently occur sporadically in humans. Their outcome is invariably fatal. The infectious agent has been defined as prion (from proteinaceous infectious only) in 1992 by Stanley B. Prusiner and represent mainly, if not solely, an abnormal, protease-resistant isoform (PrPSc) of a cellular protein, the prion protein or PrPC. According to the “protein only” hypothesis, the prion is devoid of informational nucleic acids and consists of an “infectious” protein that is capable of converting the normal host protein PrPC into a likeness of itself. TSEs can be distinguished from other neurodegenerative diseases because of their infectivity and transmission capability. The only organ system in which severe histopathological damage can be demonstrated as a consequence of infection with prions is the nervous system. The communal lesions are neuronal loss, spongiosis and astrogliosis, accompanied by an intra- and extracellular accumulation of PrPSc, occasionally in form of amyloid plaques. Even if a strong activation of microglia and astrocytes occurs, no immunological response is usually detectable as consequence of prion infection. Despite the considerable attention for its involvement in TSEs, the physiological role of the cellular, nonpathogenic isoform of PrPC, has not yet been determined. In the last years, several putative cellular functions have been attributed to PrPC: its localization in “lipid rafts” is consistent with a possible role in cell adhesion, transmembrane signalling or as a recognition molecule. Furthermore, PrPC has been implicated in protection against oxidative stress, copper metabolism, apoptosis, cell proliferation and in the regeneration of blood precursors stem cells in the adult. It has also been shown that PrPC interacts with the neuronal cell adhesion molecule NCAM, promoting neurite outgrowth. However, both the PrPC-mediated effects and the role of PrPC-dependent pathways on neuronal differentiation are still not elucidated. First objective of this Ph.D thesis was the establishment of a novel in vitro cellular model for the study of the role of PrPC in neuronal differentiation and neurite outgrowth. Furthermore, an additional goal of this project was the indentification of the PrPC domains responsible for the induction of neuronal differentiation. A novel PrPC-depleted cell line (PrP0/0 ML) was derived from murine primary PrP-knockout neuronal cells by SV40 large T antigen-mediated immortalization. A temperature sensitive form of this oncogenic protein was used, allowing a temperature-mediated regulation of its expression. This cell line was then characterised for its growth potential, for the expression of specific cellular markers and for its ability to differentiate. It was found that, under culture conditions promoting the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen, the cells expressed nestin, a specific marker of neuronal precursor cells. Therefore, the PrP0/0 ML cell line was identified as a potential neuronal stem cell line. In fact, under nonpermissive culture conditions when the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen is downregulated, the PrP0/0 ML cells differentiated into neurons. Noteworthy, maintenance of the cells in conditions that promote cell differentiation induced a progressive reduction in the expression levels of nestin, an event that strongly correlated with the appearance of the specific neuronal markers MAP-2b and NeuN. In order to investigate the role of PrPC in the process of neuronal differentiation, the PrP0/0 ML cells were then reconstituted for the expression of either the full-length PrP or a N-terminal truncated PrPC form (PrPdel32-134). The differentiation potential of both reconstituted cell lines under nonpermissive culture conditions was then compared with that of the parenteral PrP0/0 ML cells. This in vitro study clearly highlights that PrPC expression in the PrP0/0 ML cell line accelerates neuronal differentiation and that the N-terminal domain of the prion protein is not necessary for this PrP-mediated function. Prion diseases like BSE, vCJK, Kuru and the majority of iatrogenic cases of CJK are caused by a peripheral infection. Infectious prions accumulate in the central and peripheral nervous system as well as in extracerebral tissues, such as the secondary lymphoid organs and muscles. The prion pathogenesis is a dynamic process which can be defined temporary and spatially in different phases: i) infection and peripheral replication, ii) neuroinvasion, transport of prions from the periphery to the central nervous system (CNS), and iii) neurodegeneration. In the last years, progresses in the elucidation of the peripheral prion pathogenesis were achieved. The identification of the cell types involved in the lymphoreticular prion replication phase and the recognition of the role of the peripheral nervous system in the process of prion spread from the periphery to the CNS have elucidated some of the cellular mechanisms that are involved in prion uptake, replication and propagation. However, relatively little information is available about the mechanism(s) underlying intercellular prion transfer and tissue-to tissue prion spread. Microvesicles (MVs) are submicron vesicles (0,03-1 microm.) with a single membrane and are shed from most eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. The segregation of specific proteins is followed by blebbing of the membrane surface, leading to the formation of MVs and their release in the extracellular environment. MVs can be also secreted upon fusion of multivesicular endosomes with the plasma membrane (exosomes). The secretion of MVs is the result of a complex cellular process involving changes in the metabolism of lipids and proteins. The functional role of MVs is still largely unknown. However, there is evidence showing that they are important modulators of cell-to-cell communication, participate in a variety of intracellular adhesion processes and are able to induce cellular response(s). The release of PrPC and infectious PrPSc by prion infected epithelial, neuroglial and neuronal cells in association with exosomes has recently been highlighted. Furthermore, it has been shown that exosomes can propagate prion infectivity both in vitro and in vivo, suggesting that PrPSc-bearing exosomes may provide a mechanism for intercellular transmission of infectious prions in addition to cell-to-cell contact. Second objective of this Ph.D thesis was to determine the possible role of plasma membrane-derived microvesicles in the propagation and transmission of prions. The release of MVs was first studied in different murine neuronal cell lines. Here it is shown for the first time that neurons also shed plasma membrane derived MVs, in addition to exosomes. Immunoelectron microscopy and immunoblot analyses clearly demonstrated the presence of PrPC on the membrane of MVs released from PrPC-expressing cells. Characterization of lipid rafts components in MVs highlighted the presence of the ganglioside GM2, the tyrosine kinase p59Fyn, flotillin-2 and the neuronal protein GAP-43. In order to investigate whether MVs are involved in the intercellular transmission of prions, MVs were first isolated from two prion infected murine neuronal cell lines, namely the Neuro-2a PK1 and the N2a58 cells, and then used for in vitro and in vivo infection assays. Immunoblot analyses after proteinase K treatment demonstrated the association of PrPSc with the secreted MVs. The PrPSc-bearing MVs were then used to perform infection experiments on noninfected cells. By the use of cell blot assay, a method that allows the detection of PrPSc-amplification and -accumulation in cultured cells, the kinetic of prion infection in the de novo infected cells was followed. Noteworthy, it was found that PrPSc-bearing MVs were capable to transmit prions in vitro and to stably infect the recipient cells. In order to investigate the role of MVs in the transmission of infectivity in vivo, PrPSc-bearing MVs as well as MVs isolated from noninfected cells (as negative control) were injected intracerebrally in PrPC-overexpressing indicator mice (tga20). The development of clinical disease was followed in a time-dependent manner. Clinical symptoms could be observed only in the group of indicator mice inoculated with the PrPSc-bearing MVs, which then succumbed to desease. These findings clearly demonstrated that MVs are biological carriers of both PrPSc and prion infectivity. MVs could therefore participate in vivo in the processes of intercellular prion transmission and propagation.
Tunikaten produzieren eine Vielzahl an cytotoxischen und antimikrobiellen Verbindungen, die ihnen in ihrem Ökosystem zu überlebenswichtigen Vorteilen verhelfen. Wegen ihrer strukturellen Diversität und ihrer spezifischen Eigenschaften haben bislang einige dieser Sekundärstoffe Eingang in die pharmazeutische Industrie gefunden. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine umfassende Untersuchung des chemischen Potentials benthischer Ascidien der Nordsee. Die Eigenschaften der organischen Ascidienextrakte wurden anhand von vier Bioassays beschrieben. Die Assays fungierten gleichzeitig als Wegweiser zur Isolierung der aktiven Sekundärmetaboliten, der sich eine Strukturaufklärung mit spektroskopischen Methoden (NMR, MS, IR) anschloss. Es wurden Tests auf bewuchshemmende, antimikrobielle, cytotoxische und enzymhemmende Eigenschaften durchgeführt. Eingesetzt wurden organische Extrakte von 13 solitären und koloniebildenden Ascidienarten der nördlichen und südlichen Nordsee. In allen vier Assays zeigten mehrere oder alle Ascidienarten Aktivität. Es ließen sich keine Hinweise auf eine mit der Wuchsform der Arten korrelierte biologische Aktivität sammeln. In einem Freilandversuch zur Untersuchung der besiedlungshemmenden Wirkung der Extrakte konnte gezeigt werden, dass einige Ascidien eine chemische Abwehr von Algensporen oder Epibionten aufweisen, die artspezifisch unterschiedlich stark ausgeprägt ist. Alle Ascidienarten bewiesen antimikrobielle Aktivität, es ergaben sich aber sowohl in der Hemmhofbreite als auch in der Anzahl der gehemmten Bakterienstämme große artspezifische Unterschiede. Auffallend war, dass deutlich mehr Gram-positive sowie marine Bakterienstämme als Gram-negative bzw. nicht-marine Bakterienstämme inhibiert wurden. Im Gegensatz zur antimikrobiellen Aktivität wurden in den Assays zur Cytotoxizität und zur spezifischen Enzymhemmung lediglich bei jeweils vier Ascidienarten positive Effekte festgestellt. Durch die spezifische Anfärbung von Zellorganellen konnten morphologische Veränderungen, die durch die Ascidienmetaboliten in den Mausfibroblasten induziert wurden, sichtbar gemacht und der Einfluß der Extrakte auf das Cytoskelett und spezifische Zellfunktionen dokumentiert werden. Im Protein-Tyrosin-Kinase-Assay führte eine Bioassay-guided Fractionation von Extrakten der Ascidie Dendrodoa grossularia zur Isolierung der aktiven Substanz. Über spektroskopische Methoden sowie den Vergleich mit Literaturdaten konnte der enzymhemmende Metabolit als das Guanidinostyren Tubastrin identifiziert werden. Tubastrin wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals in Tunikaten nachgewiesen. Der Metabolit zeigte als Reinsubstanz nur geringe cytotoxische Effekte und keine antimikrobiellen Eigenschaften. Als weitere Metaboliten der Ascidien Dendrodoa grossularia und Ascidiella aspersa wurden Homarin, Betain, Adenosin und Inosin identifiziert. Keiner dieser Substanzen konnte in der vorliegenden Arbeit eine biologische Aktivität zugeordnet werden. Während Betain, Adenosin und Inosin Funktionen innerhalb des Primärmetabolismus besitzen oder als Zwischenprodukte in Synthesewege eingebunden sein können, stellt Homarin einen Sekundärmetaboliten dar, der in einer Vielzahl von marinen Organismen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Seine Aufgabe in Tunikaten muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden. Dass antimikrobielle Aktivität bei allen Ascidienarten gefunden wird, lässt auf eine grundlegende Bedeutung prokaryontischer Abwehr schließen. Die Unterschiede in der Stärke der Effekte aller Bioassays legen nahe, dass jede Ascidienart eine eigene Gesamtstrategie zur Verteidigung gegen Bewuchs und Fraßfeinde ausgebildet hat. Die aus den Laborversuchen erhaltenen Daten verdeutlichen eine weitreichende biologisch-chemische Aktivität von Aplidium punctum, Dendrodoa grossularia und Didemnum candidum, die neben der antimikrobiellen auch starke cytotoxische und/oder enzymhemmende Wirkung gezeigt haben. Die Lokalisation der aktiven Substanzen im Tier sowie eingehendere Versuche zur molekularen Wirkungsweise sind notwendig, die beobachteten Aktivitäten umfassend zu deuten und ihre Nutzbarkeit unter pharmakologischen Gesichtspunkten zu evaluieren.
Trait-dependent effects of biotic and abiotic filters on plant regeneration in Southern Ecuador
(2024)
Tropical forests have always fascinated scientists due to their unique biodiversity. However, our understanding of ecological processes shaping the complexity of tropical rainforests is still relatively poor. Plant regeneration is one of the processes that remain understudied in the tropics although this is a key process defining the structure, diversity and assembly of tropical plant communities. In my dissertation, I combine experimental, observational and trait-based approaches to identify processes shaping the assembly of seedling communities and compare associations between environmental conditions and plant traits across plant life stages. By working along a steep environmental gradient in the tropical mountains of Southern Ecuador, I was able to investigate how processes of plant regeneration vary in response to biotic and abiotic factors in tropical montane forests.
My dissertation comprises three complementary chapters, each addressing an individual research question. First, I studied how trait composition in plant communities varies in relation to the broad- and local-scale environmental conditions and across the plant life cycle. I measured key traits reflecting different ecological strategies of plants that correspond to three stages of the plant life cycle (i.e., adult trees, seed rain and recruiting seedlings). I worked on 81 subplots along an elevational gradient covering a large climatic gradient at three different elevations (1000, 2000 and 3000 m a.s.l.). In addition, I measured soil and light conditions at the local spatial scale within each subplot. My findings show that the trait composition of leaves, seeds and seedlings changed similarly across the elevational gradient, but that the different life stages responded differently to the local gradients in soil nutrients and light availability. Consequently, my findings highlight that trait-environment associations in plant communities differ between large and small spatial scales and across plant life stages.
Second, I investigated how seed size affects seedling recruitment in natural forests and in pastures in relation to abiotic and biotic factors. I set up a seed sowing experiment in both habitat types and sowed over 8,000 seeds belonging to seven tree species differing in seed size. I found that large-seeded species had higher proportions of recruitment in the forests compared to small-seeded species. However, small-seeded species tended to recruit better in pastures compared to large-seeded species. I showed that high surface temperature was the main driver of differences in seedling recruitment between habitats, because it limited seedling recruitment of large-seeded species. The results from this experiment show that pasture restoration requires seed addition of large-seeded species and active protection of recruiting seedlings in order to mitigate harmful conditions associated with high temperatures in deforested areas.
Third, I examined the associations between seedling beta-diversity and different abiotic and biotic factors between and within elevations. I applied beta-diversity partitioning to obtain two components of beta-diversity: species turnover and species richness differences. I associated these components of beta-diversity with biotic pressures by herbivores and fungal pathogens and environmental heterogeneity in light and soil conditions. I found that species turnover in seedling communities was positively associated with the dissimilarity in biotic pressures within elevations and with environmental heterogeneity between elevations. Further, I found that species richness differences increased primarily with increasing environmental heterogeneity within elevations. My findings show that the associations between beta-diversity of seedling communities and abiotic and biotic factors are scale-dependent, most likely due to differences in species sorting in response to biotic pressures and species coexistence in response to environmental heterogeneity.
My dissertation reveals that studying processes of community assembly at different plant life stages and spatial scales can yield new insights into patterns and processes of plant regeneration in tropical forests. I investigated how community assembly processes are governed by abiotic and biotic filtering across and within elevations. I also experimentally explored how the process of seedling recruitment depends on seed size-dependent interactions, and verified how these effects are associated with abiotic and biotic filtering. Identifying such processes is crucial to inform predictive models of environmental change on plant regeneration and successful forest restoration. Further exploration of plant functional traits and their associations with local-scale environmental conditions could effectively support local conservation efforts needed to enhance forest cover in the future and halt the accelerating loss of biodiversity.
Folgend auf den ersten Realisierungen von Bose-Einstein Kondensaten erschienen weitere innovative Experimente, die sich in den optischen Gittern gefangenen Quantengasen widmeten. In diesen zahlreichen, wissenschaftlichen Untersuchungen konnten die Eigenschaften von Bose-Einstein Kondensaten besser verstanden werden. Das Prinzip von Vielteilchensystemen, gefangen in einem periodischen Potential, bot eine Plattform zur Untersuchung weiterer Quantenphasen.
Eine konzeptionell einfache Modifikation von solchen Systemen erhält man durch die Kopplung der Grundzustände der gefangenen Teilchen an hoch angeregten Zuständen mithilfe einer externen Lichtquelle. Im Falle dessen, dass diese Zustände nahe der Ionisationsgrenze des Atoms liegen, spricht man von Rydberg-Zuständen und Atome, welche zu diesen Zuständen angeregt werden, bezeichnet man als Rydberg-Atome. Eines der vielen charakteristischen Eigenschaften von Rydberg-Atomen ist die Fähigkeit über große Entfernungen jenseits der atomaren Längenskalen zu wechselwirken. Im Rahmen von Vielteilchensystemen wurden dementsprechend Kristallstrukturen aus gefangenen Rydberg-Atomen experimentell beobachtet.
Nun stellt sich die Frage, was mit einem gefangenen Bose-Einstein Kondensat passiert, dessen Teilchen an langreichweitig wechselwirkenden Zuständen gekoppelt sind. Gibt es ein Parameterregime, in dem sowohl Kristallstruktur als auch Suprafluidität in solchen Systemen koexistieren können? Dies ist die zentrale Frage dieser Arbeit, die sich mit der Theorie von gefangenen Quantengasen gekoppelt an Rydberg-Zuständen auseinandersetzt.
Auswirkung der Chemisorption von Organothiolaten auf den elektrischen Widerstand dünner Goldfilme
(2018)
Hochgeordnete Monolagen von Organothiolaten auf Goldoberflächen bilden sich bei Kontakt einer Goldoberfläche mit einer Lösung eines Thiols oder Thioacetats spontan aus. Die Adsorption auf dünnen Metallfilmen mit Schichtdicken im Bereich von 25 - 100 nm führt zu einer Änderung des elektrischen Widerstandes des Films, die an Goldfilmen mit Schichtdicken von 25 - 40 nm über eine einfache Zweipunktmessung verfolgt wurde. Die Proportionalität der Widerstandsänderung mit der Menge an adsorbiertem Material konnte für die in dieser Arbeit verwendeten Dünnschichtsensoren bestätigt werden. Zu diesem Zweck wurden gleichzeitig Widerstands- und Oberflächenplasmonenresonanzmessungen an 40 nm starken Goldfilmen durchgeführt. In diesen Experimenten zeigt sich die Widerstandsmessung zur Beobachtung der Adsorptionskinetik als die überlegene Technologie.
Die durch Mikrokontaktdrucken und Freiätzen der gedruckten Strukturen hergestellten Sensoren zeigen eine individuelle Signalintensität. Die Normierung auf die maximale, durch Belegung mit Hexadecanthiol (HDT) oder Dodecanthiol erreichte, Signalstärke ermöglichte den Vergleich der maximalen Signalstärke von Thiolatmonolagen, die durch Belegung mit n-Alkanthiolen (CH_3(CH_2)_(n-1)-SH mit n = 12, 16, 19, 22 und 33, Cn), 11-Mercaptoundecyl-hexaethylenglycol (HSC11EG6OH), Adamantan-1-thiol (AdaSH), Triptycenthiol (TrpSH), Anthracen-2-thiol (Ant-0SH), Anthracen-2-alkanthiolen (Ant-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 5 und 10, Ant-nSH), p-Terphenyl-4-thiol (TP0SH), p-Terphenyl-4-alkanthiolen (TP-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 4, TPnSH) und p-Terphenyl-4-ethanthioacetat (TP2SAc) erzeugt wurden. Die Größe der Widerstandsänderung zeigt eine deutliche Abhängigkeit vom organischen Rest des Oberflächenadsorbats. Für die Verstärkung des Signals wurde die folgende Reihenfolge gefunden: Trp > Ada > Ant-0 > Ant-1 > TP0 > TP1 > Ant-2 > TP2 > Cn (n = 12 - 33) = C11EG6OH = Ant-n (n = 3 - 11) = TPn (n = 3, 4). Bei bekannter Verstärkung des Signals durch ein Adsorbat kann unabhängig von der Oberflächenrauigkeit die Oberflächenbedeckung durch Chemisorbate in einer Güte bestimmt werden, die der durch STM- und TEM-Messungen erreichten vergleichbar ist. Die Methode wurde angewendet, um Schichten von TP2SH und TP2SAc, die bei 20 und 60 °C aus ethanolischer Lösung abgeschieden wurden, zu vergleichen. Die Unterschiede in der Oberflächendichte, die durch eine Erhöhung der Abscheidungstemperatur zu beobachten sind, können durch eine Beschleunigung der Reaktion nach Arrhenius erklärt werden. Auch die Temperaturabhängigkeit der Abscheidungsgeschwindigkeit von HDT aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen, die in einem Bereich von -10 °C bis +30 °C betrachtet wurde, ist mit dem Arrhenius'schen Ansatz konform. Die Aktivierungsenergie der Adsorption von HDT auf Gold wurde auf E_a = 23 +-6 kJ/mol bestimmt.
Die Konzentrationsabhängigkeit der Abscheidung aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen wurde für HDT, AdaSH, TP2SH und TP2SAc untersucht. Um eine Präadsorption der Thiole vor dem eigentlichen Start der Messung zu verhindern, wurde eine Apparatur mit einem Diaphragma aus Aluminium entwickelt, das beim Start der Messung mit dem Sensor durchstoßen wird. Mit Ausnahme von TP2SH zeigen alle Adsorptive ein Adsorptions-Desorptions-Gleichgewicht. Die Adsorptionsisothermen bei 20 °C lassen sich am besten durch die Freundlich-Isotherme beschreiben. Während die Reaktionsordnung im Adsorbat für die Adsorption der Thiole nahe an 1 liegt, hat sie für die Adsorption von TP2SAc einen Wert von ca. 1/4. Damit ergibt sich für die Geschwindigkeitskonstante der Adsorption k_a(HDT) = (2,3 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(AdaSH) = (6,1 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(TP2SH) = (7,3 +-0,4) 10^3 L/(mol s) und k_a(TP2SAc) = (8 +-3) 10^-2 L^(1/4)/(mol^(1/4) s). Die Adsorptionskurven der Thiole weisen bei Konzentrationen unterhalb von 5 10^-5 mol/L einen linearen Bereich auf, der einer zwischenzeitlichen Diffusionskontrolle zugeordnet wird.
An die aufgenommenen Adsorptionskurven der Thiole wurden literaturbekannte Modelle numerisch angepasst und teilweise weiterentwickelt. Die Anpassung konnte durch die Einführung einer vor der Oberfläche gelagerten Diffusionsgrenzschicht, in welcher der zeitabhängige Verlauf der Analytkonzentration in einem System von 10 Schichten berechnet wurde, deutlich verbessert werden. Von allen getesteten Modellen zeigt nur die Adsorption mit Ausschlussmuster keine Konzentrationsabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante der Desorption. Dieses Modell bezieht den Verlust von Adsorptionsplätzen mit ein, die einem besetzten Adsorptionsplatz benachbart sind und durch das adsorbierte Teilchen verdeckt werden. Der daraus resultierende Zusammenhang zwischen der Konzentration freier Adsorptionsplätze und dem Bedeckungsgrad der Oberfläche Theta_F(Theta) ist abhängig vom Verhältnis der Stoßfrequenz zwischen den Teilchen und der Oberfläche zur Platzwechselfrequenz der Teilchen auf der Oberfläche. Zur Bestimmung von Theta_F(Theta) für die numerische Anpassung der Adsorptionskurven von HDT und TP2SH wurde die Oberflächenbesetzung in einem Monte-Carlo-Verfahren für eine Konzentrationsreihe in Zehnerpotenzschritten simuliert.
Wirksamkeit von Articain und Lidocain bei verschiedenen Verfahren der zahnärztlichen Lokalanästhesie
(2003)
Articain und Lidocain sind die in der Zahnheilkunde am häufigsten verwendete Lokalanästhetika. Beide Substanzen besitzen eine ähnliche lokalanästhetische Wirksamkeit, sind jedoch in unterschiedlich konzentrierter Lösung im Handel. Articain ist das einzige Lokalanästhetikum, das einerseits in hoher Konzentration (4 %), andererseits mit gering konzentriertem Adrenalin-Zusatz (1:200.000 und 1:400.000) verfügbar ist. Lokalanästhetika werden nach der Wirkung dosiert. Wenn die lokalanästhetische Wirkung aufgrund zu geringer Konzentration von Lokalanästhetikum oder Vasokonstriktor unzureichend ist, kann durch eine Nachinjektion in der Regel eine vollständige Wirkung erzielt werden. Da bei der intraligamentären Injektionstechnik nur sehr geringe Volumina in den engen Desmodontalspalt injiziert werden können, kann bei dieser Technik eine unzureichende Wirkung nicht durch eine Dosiserhöhung kompensiert werden. Daher erscheint für die intraligamentäre Anästhesie eine höher konzentrierte Lösung als geeignet. In einer Vergleichsuntersuchung sollte die lokalanästhetische Wirkung handelsüblicher Articain- und Lidocain-Lösungen für die intraligamentäre Anästhesie überprfüt werden. In einer 6-fach-cross-over-Untersuchung erfolgte bei 25 gesunden Probanden an einem Prämolaren eine Lokalanästhesie durch submuköse Infiltration und intraligamentäre Injektion mit 4 % Articain mit Adrenalin 1:200.000 bzw. 1:100.000 sowie 2 % Lidocain mit Adrenalin 1:100.000. Die Anästhesietiefe wurde mittels elektrischer Sensibilitätsprüfung bestimmt. Eine vollständige Anästhesie konnte bei Infiltrationsanästhesie in praktisch allen Fällen erzielt werden, die Anästhesiedauer zeigte zwischen den drei lokalanästhetischen Lösungen keine Unterschiede. Bei der intraligamentären Anästhesie zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den 4-prozentigen und der 2-prozentigen Lösung. Sowohl der Anteil der vollständigen Anästhesiewirkung als auch die Dauer der Anästhesie war bei den beiden 4-prozentigen Lösungen deutlich höher als bei der 2-prozentigen Lösung. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung sind 4- prozentige Articain-Lösungen für die intraligamentäre Anästhesie uneingeschränkt geeignet, wobei die Zubereitung mit der höheren Adrenalin-Konzentration keine Vorteile bietet. Die handelsübliche 2-prozentige Lidocain-Lösung ist aufgrund deutlich geringerer Wirksamkeit für diese Technik weniger geeignet.
Zwischen Juni 2006 und Juni 2007 wurde in unserem Zentrum bei 24 Patienten im Alter von 52 bis 86 Jahren und einem durchschnittlichen Alter von 73,9 ± 8,4 Jahren der interventionelle Verschluss des Vorhofohrs mit dem neuen WATCHMAN-Okkluder versucht. 61% der Patienten waren männlich, 39% weiblich. Im Mittel ergab der CHADS₂-Wert 2,6 ± 1,2 bei Werten zwischen 1 und 5. Damit lag das jährliche Schlaganfallrisiko bei 5,6 ± 3,0%. Die Ostienweite der Vorhofohren betrug zwischen 17,6mm und 26,4mm, der durchschnittliche Wert lag bei 21,8 ± 2,2mm. Die Länge der Vorhofohren variierte zwischen 25,0mm und 45,7mm bei einer mittleren Länge des Vorhofohrs von 33,5 ± 5,5mm. Watchman-Okkluder mit einem Schirmdurchmesser von 27mm waren mit 52% die am häufigsten implantierten Okkluder. Die technische Erfolgsrate betrug 95,8%. Die Implantation der Okkluder dauerte 43,9 ± 14,0 Minuten (19,0 bis 70,0 Minuten). Die Durchleuchtungszeiten betrugen 5,7 bis 18,1 Minuten (im Mittel 8,7 ± 3,0 Minuten). Es wurden zwischen 57 und 193ml Kontrastmittel während des Eingriffs benötigt (durchschnittlich 131 ± 44ml). Die postinterventionelle stationäre Krankenhausaufenthaltszeit betrug im Durchschnitt 2,8 ± 4,1 Tage (1 bis 21 Tage). Bei einer technischen Erfolgsrate des Eingriffs von 95,8% (23/24 Fällen) betrug die Verschlussrate 100%, so dass bei allen Patienten Marcumar abgesetzt werden konnte. Auch bei allen nachfolgenden transösophagealen Echo-Kontrolluntersuchungen betrug die Verschlussrate 100%. Der Unterschied der Verschlussrate war im Vergleich zu den Ergebnissen anderer Studien über interventionelle Vorhofohrverschlüsse statistisch nicht signifikant. In der vorliegenden Arbeit lag das nach dem CHADS₂-Score kalkulierte jährliche Risiko für ischämische Schlaganfälle bei 5,6%. Im gesamten Nachbeobachtungszeitraum von 37,6 Jahren bei einer mittleren Nachbeobachtung von 20,8 ± 3,3 Monaten traten in unserem Patientenkollektiv keine ischämischen Schlaganfälle auf. Bei einem Patienten trat nach 22 Monaten eine aphasische Episode mit begleitender Schwäche der rechten Körperseite auf. Bei diesem Ereignis kann eine TIA nicht ausgeschlossen werden. Dieses Ergebnis lässt sich mit den von Sick et al. publizierten Ergebnissen der multizentrischen Watchman-Studie [72] vergleichen. Innerhalb der Nachbeobachtungszeit traten keine Todesfälle und keine Okkluderembolisationen auf. Zwei Ereignisse (8,7%) traten innerhalb des ersten Monats nach der Implantation auf: Ein Patient entwickelte wenige Stunden nach dem Eingriff nach Beginn der Marcumarisierung eine rechtsseitige Kleinhirnblutung. Der INR-Wert einen Tag vor der Implantation hatte 2,0 betragen. Im Verlauf blieb eine leichte Schreibschwäche der rechten Hand zurück. Bei einem Patienten trat ein Perikarderguss auf. Nach einer Perikardiozentese sowie Absetzen von Aspirin und Marcumar war der Patient beschwerdefrei. Nach dem ersten Monat kam es bei mehreren Patienten zu Krankenhausaufenthalten: eine Humerusfraktur nach Sturz, eine gangränöse Pyodermie, eine entgleiste Hyperglykämie, eine Inguinalhernien-Operation, eine hypertensive Krise mit konsekutiver beatmungspflichtiger respiratorischer Insuffizienz, eine Defibrillator-Implantation nach rezidivierenden Synkopen, eine Pneumonie, drei exazerbierte COPDs, drei neu aufgetretene Belastungsdyspnoen, zwei NSTEMIs bei einem Patienten, ein Bänderriss, eine Defibrillatorimplantation, eine operative Spinalkanaldekompression, eine Schrittmacherimplantation, ein epileptischer Anfall, eine Überlaufinkontinenz, eine penetrierende Hornhautverletzung, eine sensorische Aphasie Die Patienten konnten in gutem Gesundheitszustand aus dem Krankenhaus entlassen werden.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit medizinischem Information-Retrieval in Volltext-Datenbanken und im World-Wide-Web. Information-Retrieval unterscheidet sich von Daten- oder Text-Retrieval dadurch, dass nicht nach Wörtern gesucht wird, die einem exakten Patternmatch folgend (Zeichen für Zeichen identisch) gefunden werden. Stattdessen wird eine vage Suchanfrage gestellt, bei der vielerlei Faktoren die Suchergebnisse beeinflussen können. So existieren von vielen Wörtern Schreibweisen-Variationen, wie etwa Cervix-Zervix. Auch kommen in medizinischen Texten, die im Routinebetrieb entstanden sind und die nicht korrekturgelesen wurden, viele Orthografie- bzw. Tipp-Fehler vor. Zusätzlich entstanden durch die Rechtschreibreform der deutschen Sprache weitere Schreibweisenvariationen (Elektrokardiograf-Elektrokardiograph). In der Medizin wird das Problem des Information-Retrieval noch dadurch vergrößert, dass eine Fach- und eine Umgangssprache existieren. So recherchiert ein Arzt als Kenner der Fachsprache nach “Tachykardie“, während ein Patient nach dem umgangssprachlichen “Herzrasen“ sucht. Für Information-Retrieval im World-Wide-Web ist die Nutzung von Suchmaschinen von elementarer Bedeutung. Auch Meta-Suchmaschinen haben sich etabliert. Darauf aufbauend wird das Modell einer thesaurus- und indexbasierten Meta-Suchmaschine entwickelt und implementiert. Dieses Modell bietet - im Vergleich zu klassischen Volltext- und Meta-Suchmaschinen - einige Vorteile. So entsteht z.B. nur sehr geringer Speicherplatzbedarf, es ergeben sich schnelle Zugriffszeiten, trotzdem wird kein eigener Crawler benötigt. Zur Lösung der Probleme werden Thesauri und die Fuzzy-Set-Theorie eingesetzt: * Die Theorie der unscharfen Mengenlehre (Fuzzy-Set-Theorie) wird genutzt, um Differenzen in der Schreibweise zu eliminieren. Dazu wird ein neuer Algorithmus entwickelt, der - basierend auf einem klassischen, etablierten Algorithmus - bessere Retrieval-Ergebnisse bei gleichzeitig geringerer Laufzeit ergibt. Er basiert auf Buchstabengruppen (sog. n-Gramme) und wurde am Beispiel der Größe n = 3 (Trigramme) implementiert und getestet. * Thesauri sind Datenbanken, die W¨orter und Relationen zwischen Wörtern enthalten. Sie werden in der vorliegenden Arbeit extensiv f¨ur Crawling, Ranking, Information-Retrieval und Meta-Suche eingesetzt. Fuzzy-Set-Theorie und Thesauri dienen zusammen der Modellierung des ungenauen Wissens für das Information-Retrieval. Test und Evaluation finden anhand von drei verschiedenen Textmengen statt. Die Suchmöglichkeiten für das Information-Retrieval werden komplex gestaltet. Es wird sowohl eine Operatorpriorität als auch Setzung von Prioritätsklammern ermöglicht. Dazu werden Techniken der formalen Sprachen und des Compilerbaus eingesetzt. Für die Ausgabe der Seiten werden spezifische Verfahren entwickelt, die Seite bezüglich der Relevanz zu bewerten, das sog. Ranking. Insgesamt werden drei verschiedene Ranking-Verfahren vorgestellt und implementiert. Die Realisierung erfolgt komplett XML-basiert mit einem Schwerpunkt auf XSLT. Als Ausgabeformate stehen XML, HTML und PDF zur Verfügung.
Classical Hodgkin lymphoma (cHL) is one of the most common malignant lymphomas in Western Europe. The nodular sclerosing subtype of cHL (NS cHL) is characterised by a proliferation of fibroblasts in the tumour microenvironment, leading to fibrotic bands surrounding the lymphoma infiltrate. Several studies have described a crosstalk between the tumour cells of cHL, the Hodgkin- and Reed-Sternberg (HRS) cells, and cancerassociated fibroblasts (CAF). However, to date a deep molecular understanding of these fibroblasts is lacking. Aim of the present study therefore was a comprehensive
characterisation of these fibroblasts. Moreover, only a few studies describe the interplay of HRS cells and CAF. The paracrine communication and direct interaction of these two
cellular fractions have been investigated within this study. Finally, the influence of a few HRS cells within a lymph node orchestrate the mere alteration of its architecture and
morphology. Gene expression and methylation profiles of fibroblasts isolated from primary lymph node suspensions revealed persistent differences between fibroblasts obtained from NS cHL and lymphadenitis. NS cHL derived fibroblasts exhibit a myofibroblastic - inflammatory phenotype characterised by MYOCD, CNN1 and IL-6 expression. TIMP3, an inhibitor of matrix metalloproteinases, was strongly upregulated in NS cHL fibroblasts, likely contributing to the accumulation of collagen in sclerotic bands of NS cHL. Treatment by luteolin could reverse this fibroblast phenotype and decrease TIMP3 secretion. NS cHL fibroblasts showed enhanced proliferation when they were exposed to soluble factors released from HRS cells. For HRS cells, soluble
factors from fibroblasts were not sufficient to protect them from Brentuximab-Vedotin(BV) induced cell death. However, HRS cells adherent to fibroblasts were protected from BV-induced injury. The cHL specific interaction of both cell fractions reveals an initiation of inflammatory key regulators such as IL13 and IL4. Among important adhesion molecules known from literature the blocking of integrin beta 1 solely interrupted the adhesion of HRS cells to CAF. In summary, this study proves the stable reprograming of CAF phenotype and expression derived from NS cHL. It presents a suitable in vitro model for studying the interaction of HRS cells and CAF by paracrine factors and adherence. Most importantly the observations confirm the importance of fibroblasts for HRS cells´ inflammatory niche and cell survival associated with TIMP3 which probably acts as a major factor to the typical accumulation of fibrosis observed in NS cHL.
Die Extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO) ist ein extrakorporales Organersatzverfahren, welches heutzutage insbesondere als Lungenersatzverfahren oder als kreislaufunterstützendes Verfahren zum Einsatz kommt. Seit dem ersten Einsatz 1971 im Rahmen eines posttraumatischen „Acute Respiratory Distress Syndrom“ (ARDS) ist die Zahl der ECMO-Behandlungen im kardiopulmonalen Bereich massiv gestiegen. Dennoch wird der Nutzen der ECMO kontrovers diskutiert. Die aktuellste randomisiert kontrollierte Studie aus dem Jahre 2018 konnte keinen signifikanten Nachweis erbringen, dass die Therapie des ARDS mittels einer ECMO einen Überlebensvorteil bringt. Randomisiert kontrollierte Studien bei Patienten mit kardiogenem Schock liegen zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht vor und für den Einsatz bei septischem Schock ist die Datenlage und Evidenz schwach. Angesichts der ungeklärten Evidenz und weil die ECMO ein komplexes, kostenintensives und mit Risiken verbundenes Verfahren ist, scheint eine sorgfältige Indikationsstellung unverzichtbar zu sein. Das Ziel unserer Studie war daher die Analyse der Mortalität bei Patienten mit Lungenversagen, kardiogenem Schock und septischem Schock. Darüber hinaus sollten mit der Mortalität assoziierte prognostische Variablen identifiziert werden. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob sich mit steigender Fallzahl eine Lernkurve beobachten lässt.
Zu diesem Zwecke führten wir eine retrospektive Kohortenstudie an 131 Patienten durch, die zwischen April 2011 und Juli 2016 in der Asklepios Klinik Langen mit einer ECMO behandelt wurden. Die Patienten wurden hierbei in die drei oben genannten Gruppen kategorisiert. Mithilfe logistischer Regression erfolgte die Identifizierung prognostischer Variablen. Eine Lernkurve wurde anhand des „non-risk-adjusted cumulative observed minus expected failure graph“-Verfahrens erstellt.
Die Analyse der Daten ergab eine Gesamtmortalität von 56%. Die Mortalität bei Patienten mit Lungenversagen, kardiogenem Schock und septischem Schock betrug 54%, 59% bzw. 58%. Bei Patienten mit Lungenversagen waren das Alter, das Jahr und weniger als 20 Fälle pro Jahr signifikant mit der Mortalität assoziiert. Bei Patienten mit kardiogenem Schock waren mit der Mortalität assoziierte Variablen das Alter, der SAPS II-Score, der pH-Wert, der Serumlaktatwert prä-ECMO, der Basenüberschuss prä-ECMO sowie eine Hyperlipidämie. Bei Patienten mit septischem Schock konnten keine mit der Mortalität assoziierten Variablen identifiziert werden. In der multivariaten Regressionsanalyse nach Modellabbau zeigten sich in der gesamten Kohorte das Alter, das prä-ECMO Serumlaktat sowie weniger als 20 Fälle pro Jahr als signifikant mit der Mortalität assoziierte Variablen. Patienten, die vor 2014 behandelt wurden, also in einem Zeitraum mit weniger als 20 ECMO-Fällen pro Jahr, hatten eine signifikant höhere Mortalität als Patienten die im Intervall 2014-2016 behandelt wurden. Mit steigender Fallzahl konnte eine Lernkurve nachgewiesen werden, die einen Wendepunkt im Jahr 2014 zeigte. Der im Jahr 2014 beginnende Abwärtstrend signalisierte eine geringere Sterblichkeitsrate als erwartet.
Zusammenfassend ist die Mortalität in allen Indikationen weiter hoch. Die Fallzahl und damit auch die Erfahrung scheint eine wichtige Rolle in Bezug auf die Mortalität zu spielen. Des Weiteren unterstützen unsere Ergebnisse frühere Studien, die einen Einfluss des Alters und des prä-ECMO Laktat-Wertes auf die Mortalität zeigen konnten.
Compared to all other organisms with 1 to 3 heat stress transcription factors (Hsfs) or Hsf-related factors, plants have extraordinarily large Hsf families with more than 20 Hsfs. Plant Hsfs are classified into three classes according to their oligomerization domains which is built of hydrophobic heptad repeats (HR) in two parts, HR-A and HR-B. Both parts may be immediately adjacent (class B), or they are separated by insertion of 21 (class A) and 7 amino acid residues (class C). In plant Hsf family, detailed investigations are so far limited to Hsfs A1a, A2, A3, A4d, A9, and B1. They strongly indicate functional diversification to be the main reason for the coexistence of multiple Hsfs. As an example the functional triad of HsfA1a, HsfA2, and HsfB1 is essential for all three phases of the hs response, (i) the triggering of the response by HsfA1a as master regulator, (ii) the maintenance and high efficiency of hs gene transcription by cooperation of HsfA1a with Hsfs A2 and B1, and finally, (iii) the restoration of house-keeping gene transcription during the recovery phase mediated by HsfB1 in cooperation with house-keeping transcription factors. The results presented in this thesis for Hsfs A4 and A5 open completely different aspects of functional diversification and cooperation of Hsfs. HsfA4 and HsfA5 homooligomerize and bind to corresponding HSE motifs. But in contrast to the highly active HsfA4, HsfA5 is completely inactive as transcriptional activator. Yeast two hybrid and GST pull-down techniques showed that both Hsfs have strong tendency for heterooligomerization. Using fluorescence microscopy the HsfA4/A5 heterooligomers were found to localize in the nucleus. These complexes are transcriptionally inactive due to the impairment of DNA binding. The repressor function of HsfA5 requires only its OD and no additional factors, e.g. a putative co-repressor recruited by the C-terminal domain, are involved. Evidently, the repressor effect mainly results from the interference with the oligomeric state of HsfA4b, which is essential for efficient DNA binding and activator functions. EST database search revealed that plants have a single HsfA5 and usually two A4-type Hsfs. Using bioinformatics tools, Hsfs A4 and A5 were found to be phylogenetically closely related and clearly distinct from the other members of the Hsf family. On the basis of RT-PCR and Microarray data the representatives of the A4/A5 group are well expressed in different plant tissues albeit at very different levels which change with the developmental stages and stress conditions In rice and Arabidopsis, HsfA4 functions as an anti-apoptotic factor for stress induced oxidative damages. Based on my results, I hypothesize that HsfA5 functions as a novel type of selective repressor, regulating the function of A4-type Hsfs in plants. Considering the high sequence conservation with in plant Hsf family, it is tempting to speculate that this role of Hsf4/A5 pair is a fundamental feature of the Hsf system in plants.
Das Ziel dieser prospektiven Studie war es , die technische Durchführbarkeit sowie klinische und radiologische Ergebnisse nach interkorporeller Fusion durch einen mit autologer Spongiosa gefüllten AcroMed Cervical I/F Cage (DePuy AcroMed
international, UK) nach ventraler zervikal er Diskektomie darzustellen. Über einen Zeitraum von 32 Monaten wur den in der Abteilung für Neurochirurgie (die zum Südharz-Krankenhaus Nordhausen gGmb H gehört) 50 aufeinander folgende Patienten operiert, bei welchen klinische Zeichen einer zervikalen Radikulopathie, Radikulomyelopathie oder einem Zervikalsyndrom mit monosegmentalen Bandscheibenvorfällen und/oder Spondylose nachzuweisen waren. Die Studie schloss 24 Frauen durchschnitt- lich 43.4 Jahre alt (25.4 – 59.7) und 26 Männer durchschnitt- lich 44.0 Jahre alt (29.8 – 64.6) ein. Die Dauer der Symptome betrug 1 bis 61 Monate (Mittel: 12.5 Monate). Alle Patienten wu rden prä- und postoperativ durch mich untersucht, ihre klinischen Beschwerden detailliert und standardisiert aufge- nommen. Alle Komplikationen wurden dokumentiert. Die funktio- nelle Behinderung wurde mittels Neck Pain Disability Index (NDI, Bereich 0-100) quantifiziert. Das klinische Ergebnis wurde get rennt vom Patienten und Untersucher als ausgezeich- net, gut, befri edigend oder schlecht unter Verwendung ODOM`S Kriterien eingeschätz t. Nach einer mittleren Nachuntersu- chungszeit von 14 Monaten (12-25 Monate) betrug der mittlere NDI 12,3 (0-84) gegenüber vor Operation 65.2 (44-88). Die Untersucher-Klassifikati on ergab 48% ausgezeichnete, 38% gute, 12% befriedigende und 2% schlechte Erge bnisse, 87.5% der ausgezeichneten und 89.5% der guten Gruppe kehrten zum Arbeits platz zurück. Im Vergleich ergab die Patienten-Klassifikation 58% ausgezeichnete, 32% gute, 8% befriedigende und 2% schlechte Ergebnisse, 93% der ausgezeichneten und 68.75% der guten Gruppe kehrten zum Arbeitsplatz zurück. Das Verfahren ist technisch einfach. Der Cervical I/F Cage steigert die zur Dekompression de r Nervenwurzel notwendige Höhe des Neuroforamens wirksam. Eine knöcherne Fusion wurde in 98% erreicht, die Keilform des Cages trägt zur Wiederherstel- lung der Lordose bei.
Seit mehr als 200 Jahren gibt es durch die Wissenschaftler der Wetterstation auf dem Hohenpeißenberg systematische Wetterbeobachtungen, doch erst seit wenigen Jahren gibt es unter den Klimaforschern einen Konsens, dass sich das Klima durch anthropogene Einflüsse schon verändert hat – und weiter verändern wird. Die bisherigen Auswirkungen, wie zum Beispiel ein globaler Temperaturanstieg von 0,85°C seit Beginn der Industrialisierung, sind heute gut belegbar. Mögliche zukünftige Entwicklungen des Klimas werden heute ebenso erforscht wie die Auswirkungen des Klimawandels auf Mensch und Umwelt. Zu diesen Auswirkungen gehören unter anderem Folgen für die Landwirtschaft. Durch veränderte Niederschläge und den Temperaturanstieg werden sich die Lebensbedingungen von Bodenorganismen und Anbaubedingungen für Pflanzen ändern. Letztendlich ist aufgrund dieser Veränderungen auch ein verstärkter Einsatz von Pestiziden zu erwarten. Allerdings wurde bisher kaum untersucht, ob der Einsatz von Pestiziden in der Landwirtschaft unter den Bedingungen des Klimawandels (konkret durch die Interaktion von klimatischen und chemischen Faktoren) ein erhöhtes Umweltrisiko für Bodenorganismen darstellt. Bisher werden klimatische Faktoren bei den Tests für die Zulassung von Pestiziden nicht berücksichtigt.
Daher wurde diese Fragestellung in der hier vorliegenden Dissertation am Beispiel der Effekte von zwei zugelassenen Pestiziden auf Bodenorganismen unter verschiedenen klimatischen Bedingungen untersucht. Konkret wurden dazu mit Labor- und Halbfreilandversuchen die Wirkung eines Insektizids und eines Fungizids in Interaktion von Temperatur und Bodenfeuchte auf Vertreter zweier Invertebratengruppen (Collembola: zwei Arten; Enchytraeidae: eine Art) untersucht.
In einem modifizierten Standardtest mit Collembolen erhöhte sich die Toxizität des Insektizids Lambda-Cyhalothrin, wenn die Exposition der beiden Arten bei einer erhöhten Bodenfeuchte stattfindet. Die kühl adaptierte Art Folsomia candida reagierte bei erhöhter Testtemperatur am empfindlichsten auf diese Testsubstanz: Die EC50 aus diesem Experiment lag bei 2,84 mg (a.s.)/kg Boden Trockengewicht (dw). Unter Standardbedingungen, wie sie in Tests für die Zulassung von Pestiziden angewandt werden, lag die EC50 von F. candida dagegen bei 8,65 mg a.s./kg dw.
Unter den gleichen Versuchsbedingungen wurde auch das Fungizid Pyrimethanil an Collembolen getestet. Hier erwies sich die Testsubstanz für beide Arten bei
gleichzeitigem Trockenstress und / oder erhöhter Temperatur als toxischer im Vergleich zu den Standard-Testbedingungen. Dabei zeigte F. candida mit einer EC50 von 28,3 mg a.s./kg dw die höchste Empfindlichkeit. Ohne die veränderten klimatischen Faktoren, betrug die EC50 von F. candida 52,3 mg a.s./kg dw.
In Reproduktionstests mit der Enchytraeen-Art Enchytraeus bigeminus wurde die Bodenfeuchte als klimatischer Faktor in Kombination mit jeweils einer Testsubstanz untersucht. Bei beiden Chemikalien reagierte E. bigeminus in trockenem Boden empfindlicher. Die ermittelten EC50 betrugen 1,34 mg a.s./kg dw für Lambda-Cyhalothrin und 437 mg a.s./kg dw für Pyrimethanil. Getestet unter Standardbedingungen lagen die EC50-Werte bei 3,79 bzw. 499 mg a.s./kg dw.
Neben den Laborexperimenten wurden Tests in „Terrestrischen Modellökosystemen“ (TME) mit den gleichen Chemikalien in Kombination mit variierender Bodenfeuchte als klimatischer Faktor vorgenommen. Diese Experimente wurden in Deutschland und in Portugal durchgeführt, um die Reaktion einer zentraleuropäischen und einer mediterranen Artengemeinschaft zu untersuchen. Aus der terrestrischen Lebensgemeinschaft wurden verschiedene Organismengruppen untersucht. Die Effekte auf Enchytraeen aus dem Experiment mit Pyrimethanil waren als Veröffentlichung Teil dieser Dissertation. In der portugiesischen Halbfreilandstudie wurden keine Effekte auf die Enchytraeen durch Pyrimethanil bei umweltrelevanten Konzentrationen festgestellt, jedoch beeinflusste die Bodenfeuchte die Zusammensetzung der Artengemeinschaft. Im deutschen TME-Experiment wurde eine verstärkte Wirkung des Fungizids in trockenem Boden festgestellt, d.h. die jeweiligen Effektkonzentrationen (niedrigste EC50 3,48 mg a.s./kg dw für Fridericia connata in trockenem Boden) lagen deutlich unterhalb der aus den Labortests mit Enchytraeus bigeminus bekannten Werten (499 mg a.s./kg dw).
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass klimatische Faktoren die Effekte von Pflanzenschutzmittel auf Bodenorganismen beeinflussen können. Für Laborversuche ist eine generelle Berücksichtigung von klimatischen Faktoren im Zulassungsverfahren aus heutiger Sicht zu weit gegriffen. Die TME-Versuche zeigten sich als geeignetes Testverfahren, interaktive Effekte von Pestiziden und Klima bzw. multiplen Stressoren generell auf Artengemeinschaften zu untersuchen. Für TME-Experimente wäre unter Beachtung der Vielzahl möglicher Fragestellungen, Endpunkte und moderner statistischer Auswerteverfahren eine internationale Richtlinie wünschenswert.
Acute myeloid leukemia (AML) is a hematopoietic cell disorder characterized by a block in differentiation and increased proliferation and survival of malignant blasts. Expansion of the malignant cell clone effects the normal production of blood cells and – if left untreated – leads to death. Receptor tyrosine kinases (RTKs) play an important role in the pathogenesis of AML, as they are either often mutated or overexpressed. In normal hematopoiesis, RTK signal termination is tightly controlled, and involves ubiquitination, internalization, endocytosis and degradation. Cbl proteins are E3 ligases and have been shown to ubiquitinate several activated RTKs, including Flt3 and Kit, targeting them for degradation. Recently, several Cbl mutations have been identified: Cbl-R420Q was identified in an AML patient and Cbl-70Z was identified in a mouse lymphoma model. In this thesis work, the role of these Cbl mutants in Kit signaling and in a mouse transplantation model was studied. Cbl mutants (Cbl-R420Q, Cbl-70Z) have the ability to transform the myeloid 32D cell line in cooperation with Kit WT. Cbl mutants along with Kit promoted interleukin-3 (IL3)-independent proliferation and enhanced the cell survival of 32D cells. In contrast, expression of the Cbl mutants alone did not confer IL3-independent growth. Stem cell factor (SCF, the Kit ligand) dependent growth was enhanced in the presence of Cbl mutants and Cbl mutants promoted colonogenic growth in the presence of Kit. Furthermore, Cbl mutants inhibited the ubiquitination of the activated Kit receptor. In addition, Cbl mutants inhibited the endocytosis of the activated Kit receptor. Retroviral expression of Cbl mutants in transplanted bone marrow induced a generalized mastocytosis, a myeloproliferative disease and, in rare care cases, myeloid leukemia. Splenomegaly was observed in the presence of Cbl mutants. Furthermore, mast cells with variable range of infiltration were noticed in all the vital organs (spleen, liver, bone marrow, lung, kidney, heart) of Cbl (mutant) transplanted mice. Almost all recipients of bone marrow cells transduced with Cbl mutants developed a lethal hematologic disorder with a mean latency of 341 days in the Cbl-R420Q group and 395 days in the Cbl-70Z group. This is the first published report on a hematological disease with Cbl mutants in a mouse model. Co-immunoprecipitation studies indicated that Cbl-70Z binds to Kit, even in the absence of Kit ligand. Cbl-R420Q also bound to Kit in the absence of SCF, albeit to a lesser extent. Association of Cbl mutants to Kit was enhanced in the presence of SCF. Signaling studies demonstrated the constitutive activation of Akt and Erk in the presence of Cbl mutants and Kit. In addition, Cbl mutants enhanced the SCF-dependent Kit, Akt and Erk activation. Cbl-70Z, in association with kinase-dead Kit (Kit-KD) or kinase-dead Flt3 (Flt3-KD), conferred IL3-independent growth and survival to the myeloid 32D cell line. Cbl-R420Q provided only a slight growth advantage in the presence of Kit-KD. As demonstrated by pharmacological inhibition studies, Akt activation was necessary for the transformation mediated by Cbl-70Z and Kit-KD / Flt3-KD. Cbl mutants enhanced the Src family kinases (SFKs) activity. The pharmacological inhibition of SFK activity inhibited the proliferation and colonogenic growth. Interaction was found between Cbl-70Z, SFKs and Kit-KD. The SFK member Fyn was identified to bind to Cbl. In addition, kinase activity of SFKs was necessary for binding to Cbl, since SFKs inhibition by PP-2 abolished the binding between the complex-binding partners. Dasatinib and PP-2, both SFK inhibitors, inhibited the Cbl and Akt phosphorylation indicating that Fyn acts upstream of Akt. Inhibition of Kit with imatinib reduced the proliferation of cells overexpressing Kit WT and Cbl-70Z much stronger compared with cells expressing Kit-KD and Cbl-70Z, but much less than the dual KIT/SFK inhibitor dasatinib. This indicated that Kit kinase activity was required but not essential. The data presented in this thesis work implies that both RTK and SFK inhibition may have to be targeted, in order to effectively prevent transformation. In summary, the present thesis work indicates an important role of Cbl, Kit and SFKs in myeloid transformation and deregulated signal transduction.
Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
Der Natrium-abhängige Kaliumkanal Slack (KNa1.1, Slo2.2, KCNT1) nimmt eine Schlüsselrolle in der Regulation neuronaler Erregbarkeit ein, indem er die Ausbildung und Feuerungsfrequenz von Aktionspotentialen kontrolliert. Sowohl in Mäusen als auch in Menschen wird Slack besonders hoch in nicht-peptidergen C-Faser-Neuronen exprimiert. Wissenschaftliche Erkenntnisse der letzten Jahre konnten die Beteiligung von Slack-Kanälen in der Signalverarbeitung neuropathischer Schmerzen, aber auch in verschiedenen Arten von Pruritus, feststellen. Dabei zeigen Slack-defiziente Mäuse ein verstärktes mechanisches Schmerzverhalten nach einer peripheren Nervenverletzung und ein erhöhtes Kratzverhalten in akuten Juckreiz-Modellen. Das als Slack-Aktivator identifizierte trizyklische Neuroleptikum Loxapin zeigt sowohl analgetische als auch antipruritische Effekte in Mäusen, jedoch ist sein klinischer Einsatz auf Grund schwerwiegender antipsychotischer Nebenwirkungen limitiert. Basierend auf Loxapins Leitstruktur wurden daher in dieser Arbeit neue Slack-Aktivatoren mit einem verbesserten pharmakologischen Profil designed und ihr Potential für die Therapie von Schmerzen sowie akutem und chronischem Pruritus in vivo untersucht.
Untersuchung hochmolekularer Proteinkomplexe in menschlichen Leukämien mittels Proteomics-Werkzeugen
(2009)
Funktionelle Multiproteinkomplexe stellen im Sinne von Proteomics das kleinste isolierbare Proteom dar. Die Untersuchung von Proteinkomplexen gibt uns die Möglichkeit, Funktionen innerhalb der Zelle oder des Zellkompartiments genauer zu verstehen. Erst durch das Verständnis der einzelnen kleinen Zusammenspiele innerhalb einer Zelle, können wir die Auswirkungen auf ein betreffendes Organ und damit auf den Körper betrachten. Wir erhalten dadurch auch Informationen über die Funktion von spezifischen Genen und können so Erklärungsansätze für Gendefekte finden und über mögliche Therapieansätze nachdenken. Neben den Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen und dem Nachweis von Protein-Interaktionen mittels Immunopräzipitationsexperimenten stellt die Massenspektrometrie seit den 90er Jahren ein essentielles Werkzeug der Proteom-Forschung dar. Sie entwickelte sich zu einem etablierten Verfahren für die Charakterisierung von Biomolekülen und ermöglicht die Identifizierung unbekannter Proteine eines Komplexes. Das MLL-Gen auf Chromosom 11 Bande q23 ist in zahlreiche, reziproke chromosomale Translokationen verwickelt, die mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert sind. Chromosomale Translokationen des MLL-Gens werden aufgrund ihrer sehr schlechten Prognose und Therapierbarkeit als Hochrisiko-Leukämien eingestuft. Bis heute konnten 64 Translokations-Partnergene identifiziert werden, wobei das AF4-Gen mit 42% bei allen untersuchten Leukämien und mit ca. 66% bei ALL (akute lymphatische Leukämie) den größten Prozentsatz ausmacht. Bei der Translokation t(4;11) sind das MLL-Gen auf Chromosom 11 und das AF4-Gen auf Chromosom 4 beteiligt. Akute Leukämien mit einer t(4;11)-Translokation treten häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und betreffen vorwiegend den lymphatischen Zweig des blutbildenden Systems. Durch die Translokation entstehen zwei neue Derivatchromosomen – Derivat 11 (MLL•AF4, der11) und Derivat 4 (AF4•MLL, der4). Beide Fusionsgene verfügen über einen intakten Leserahmen und führen zur Expression der zwei Fusionsproteine MLL•AF4 (der11) und AF4•MLL (der4). Der pathomolekulare Mechanismus der t(4;11)-vermittelten ALL ist bis heute noch nicht hinreichend geklärt. Funktionen des der11-Fusionsproteins werden zwar schon intensiv erforscht, aber es gibt noch keine Erkenntnisse über die Funktion des der4-Fusionsproteins. Ähnlich sah die Situation zu Beginn dieser Arbeit für das AF4-Protein aus. Während schon einige Daten zur Funktion des MLL-Multiproteinkomplexes vorlagen, gab es nur wenige Informationen über die Funktion von AF4. Im Zuge dieser Arbeit wurden der AF4- und der der4-Multiproteinkomplex mittels affinitätschromatographischer Methoden aus transient transfizierten 293T-Zellen erfolgreich isoliert. Eine Größenbestimmung der Komplexe über eine Größenausschlusschromatographiesäule ergab für beide Komplexe eine Größe von ca. 2 MDa. Die Charakterisierung der beteiligten Interaktionspartner erfolgte mittels nLC-MALDI-MS/MS, Western Blot Analyse und Immunopräzipitation. Es konnte gezeigt werden, dass AF4 zusammen mit den Proteinen ENL/AF9, CDK9, CCNT1, AF10, DOT1L und der RNA-Polymerase II in einem Komplex vorliegt. Bereits 2007 konnte dieser Komplex in einem Mausmodell isoliert werden. Damit fungiert der AF4-Komplex auch in humanen Zellen als Stimulator der RNA-Polymerase-II-abhängigen transkriptionellen Elongation und vermittelt eine DOT1L-abhängige H3K79-Methylierung, die einen aktiven Transkriptionsstatus aufrechterhält. Zusätzlich konnten 6 neue Interaktionspartner identifiziert werden (AF5q31, BDR4, DDX6, HEXIM1, NFkB1/RELA und NPM1). Die Anwesenheit von BRD4 und HEXIM1 lässt vermuten, dass der AF4-Komplex in einem aktiven und einem inaktiven Zustand vorliegen kann. Außerdem wird der AF4-Komplex möglicherweise über den NFkB-Signalweg reguliert bzw. durch die Anwesenheit von NFkB1 an dessen Zielgene rekrutiert. Die Untersuchung des der4-Komplexes zeigte, dass er sich aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt. So wurden die Proteine P-TEFb, HEXIM1, NFkB1, NPM1, DDX6 und das AF4 selbst aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, DPY-30, CBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex identifiziert. Der der4-Komplex weist somit partielle Eigenschaften des AF4- und MLL-Wildtyp-Proteins auf. Diese Eigenschaften sind ausreichend für eine kompetitive Situation zwischen dem der4-Komplex und den beiden AF4- und MLL-Wildtyp-Komplexen. Die Gleichgewichte dieser Wildtyp-Komplexe werden vermutlich gestört. Für beide Komplexe wurde mit Hilfe eines in vitro Histon-Methyltransferase-Assays eine Histon-Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen. Für den AF4-Komplex muss zusätzlich eine bisher noch unbekannte Methyltransferase-Aktivität angenommen werden, da eine Methylierung des Histons H3 in den ersten 46 Aminosäuren gezeigt werden konnte, die sich nicht auf die Methyltransferase-Aktivität des DOT1L-Proteins im AF4-Komplex zurückführen lässt. Die H3K4-Methyltransferase-Aktivität des der4-Komplexes wird auf die Anwesenheit des SET-Domänen-Komplexes (ASH2L, WDR5, RBBP5 und DPY-30) zurückgeführt. Im Zusammenhang mit dem AF4-Protein wurde auch der ENL-Komplex untersucht. Mittels Western Blot konnten die Interaktionspartner AF4, CDK9, CCNT1, RNA-Polymerase II, NFkB1 und RING1 identifiziert werden. Damit ist auch das ENL mit dem globalen positiven transkriptionellen Elongationsfaktor P-TEFb assoziiert und beeinflusst die RNA-Polymerase-II-abhängige transkriptionelle Elongation.
Um das Potential von modernen Arzneistoffe wie Nukleinsäuren und ihren Analoga ausnutzen zu können und sie an ihren Wirkort ins Zellinnere bringen können, benötigt man Transportvehikel, da sie selbst nur über eine schlechte Zellmembrangängigkeit verfügen. Bei der Entwicklung zukunftsträchtiger Arzneiformen spielen biokompatible, kolloidale Trägersysteme, die zielgerichtet bestimmte Gewebe / Zellen ansteuern, eine große Rolle. Ihre Aufgabe ist es dem Wirkstoff zur Überwindung von Zellmembranen zu verhelfen, wobei gleichzeitig ein Schutz vor enzymatischem Abbau gewährleistet wird. Zur Erhöhung der Zell- und Gewebeselektivität können die Träger dann mit diversen Targeting-Liganden bestückt werden. Als Trägerstoff können verschiedenste synthetische und natürliche Polymere eingesetzt werden. Zum Einsatz kamen hier die beiden natürlichen Proteine Gelatine und Albumin, die untoxisch, biokompatibel und bioabbaubar sind. Die partikulären Strukturen wurden durch Lösungsmittelzusatz zu einer wässrigen Proteinlösung in einem Desolvatationsprozess gewonnen. Der Nukleinsäureeinschluss erfolgte adsorptiv und kovalent in die Polymermatrix oder kovalent an die Oberfläche. Als Drug-Targeting-Ligand wurden aufgrund ihrer großen Spezifität, Selektivität und Variabilität Antikörper eingesetzt. Durch chemische Oberflächenmodifikationen wurde die Voraussetzung geschaffen, biotinylierte Strukturen kovalent an die Nanopartikeloberfläche zu binden, so dass ein spezifisches Drug-Targeting-System entstand. Die kolloidalen, proteinbasierten Nanopartikel wurden hinsichtlich ihrer verschiedenen physikalischen Parameter analysiert. Neben den Parametern wie Größe, Zetapotential, Morphologie und Stabilität wurde auch die Zelltoxizität untersucht. Das Antikörper-beladene Trägersystem wurde auf seine Funktionalität und Effizienz in Zellkultur getestet. Albumin Nanopartikel: Zur Schaffung eines universell einsetzbaren Trägersystems wurden auf der Nanopartikeloberfläche reaktive SH-Gruppen eingeführt. Der Einsatz eines bifunktionalen Crosslinkers schuf die Möglichkeit mit Avidin ein zweites Protein, welches einen stabilen Komplex mit Biotin bildet an die Oberfläche zu binden. Man verfügt jetzt über ein 200 – 350 nm große, negativ geladene und untoxische Trägerpartikel, die mit vielen unterschiedlichen biotinylierten Liganden verbunden werden können. Sie verfügen weiterhin über eine ausreichende Stabilität im Zellkulturmedium. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Oligonukleotid-Beladung der Nanopartikel wurde auf drei verschiedenen Bindungswegen vollzogen. Die Wirkstoffeinbindung erfolgte zum Ersten adsorptiv über elektrostatische Wechselwirkungen in die Trägermatrix beim partikelformenden Prozess selbst. Die folgende Einführung von Thiolgruppen und die Kopplung mit Avidin über einen bifunktionalen Crosslinker wurde erfolgreich umgesetzt. Zweitens wurde eine kovalente Wirkstoffverknüpfung wieder über einen bifunktionalen Crosslinker entwickelt. Dafür wurden durch die Umsetzung mit einem Spacer die freien Aminogruppen des Trägermaterials aktiviert. Das verwendete Oligonukleotid wurde mit einer Thiolgruppe versehen und so an das aktivierte HSA gebunden. Das gebildete lösliche Konjugat wurde wieder durch Desolvatation zu Nanopartikeln umgesetzt. Als dritte Möglichkeit erfolgte eine oberflächliche Komplexbildung über das Avidin-System mit biotinylierten Phosphorothioaten. Gelatine-Nanopartikel: Für die Herstellung der Nanopartikel wurde ein doppeltes Desolvatationsverfahren eingesetzt. Die Oberflächenmodifikationen wurden analog zu den Umsetzungsbedingungen von HSA-NP durchgeführt. Die Bindungsfähigkeit des NeutrAvidins kann auch hier wieder durch die Kopplung an die Partikeloberfläche und den Aufreinigungsprozess beeinträchtigt sein. Daher wurde eine Nachweisreaktion mit einem fluoreszenzmarkierten Biotinderivat etabliert und die Funktionsfähigkeit des Avidins nachgewiesen. Um ein spezifisches Drug-Targeting-System zu etablieren, wurde der Träger zur Überwindung der Zellmembranen mit zwei verschiedenen biotinylierten Antikörpern ausgestattet. Eingesetzt wurde ein biotinylierter anti-CD3-AK, der von T-Lymphozyten internalisiert wird und ein biotinylierter anti-Her2neu-AK (Trastuzumab). Für die Bestimmung der gebundenen Antikörpermenge wurden zwei Methoden etabliert und lieferten für beide Antikörper eine Bindungseffizienz von nahezu 100%. In den anschließenden Zellkulturversuchen konnte eindrucksvoll eine rezeptorvermittelte Zellaufnahme in Lymphozyten und Brustkrebszellen über die an Gelatine-Nanopartikel gekoppelten, spezifischen Drug-Targeting-Liganden anti-CD3 und Trastuzumab gezeigt werden.
Hauptziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Methode zur Isolierung und Kultivierung proximaler und distaler Tubuluszellen der menschlichen Niere. Dabei wurde neben einer hohen Zellausbeute besonderer Wert auf die Reinheit der Nierenzellkulturen gelegt. Um dieses Ziel zu erreichen wurden mehrere Isolationsschritte hintereinander durchgeführt. Um eine homogenen Zellsuspension aus dem Nierenexzisat zu erhalten wurde eine mechanische Zerkleinerung und anschließend eine enzymatische Andauung durchgeführt. Dabei war ein Enzymgemisch aus Collagenase IV und DNase I mit nachfolgender Andauung mit Hyaluronidase am erfolgreichsten. Um größere Zellverbände auszuschließen wurde das Zellgemisch anschließend durch ein Stahlsieb filtriert. Durch die Percoll Dichtegradientenzentrifugation konnten die Zellen in einem weiteren Schritt separiert werden. Dadurch konnten z.B Erythrozyten, Granulozyten und ein Teil der Lymphozyten verworfen werden. Durch die unterschiedliche Antigenstruktur der Oberflächenmembran proximaler und distaler Tubuluszellen konnten mit Hilfe von monoklonalen Primär und Sekundärantikörpern, welche magnetisch markiert waren, die proximalen und distalen Tubuluszellen separiert werden. Mit Hilfe dieses immunomagnetischen Verfahrens wurden erstmals proximale und distale Tubuluszellen der menschlichen Niere in hoher Reinheit und Vitalität isoliert. Damit zeigte sich dieses Verfahren, welches bisher fast ausschließlich zur Isolierung von Blutzellen eingesetzt wurde, auch bei der Isolierung von Tubuluszellen der menschlichen Niere als erfolgreich. Die zu verschiedenen Zeitpunkten der Zellisolierung eingesetzte Immunfluoreszenzfärbung zeigte, im Vergleich zum Durchlicht, nach der Percoll Dichtegradientenzentrifugation eine Markierung von ca. 30% der Zellen. Nach der Separierung der Zellen durch die Microbeads waren fast alle Zellen (95%) markiert. Die sich anschließende Kultivierung proximaler und distaler Tubuluszellen zeigte ein einheitliches Wachstumsmuster. Beide Zellarten zeigten nach 3-4 Tagen die Bildung kleiner Kolonien, und nach 7-10 Tagen die Bildung eines homogenen Monolayers. Nach ca. 20 Tagen zeigten die Zellen eine stärker werdende Granulierung des Zytoplasmas. Nach ca. 30 Tagen stellten die Zellen das Wachstum ein und starben ab. Um die Kulturen der proximalen und distalen Tubuluszellen zu charakterisieren wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Immunfluoreszenzfärbungen, und Enzymbestimmungen im Überstand und auf den Zellen direkt durchgeführt. Dabei konnten die charakteristischen Enzymmuster und Oberflächenantigene nur für eine Zeitspanne von ca. 7 Tagen in Kultur nachgewiesen werden.
Resorbierbare Osteosynthesen haben zwar schon vor längerer Zeit Einzug in die Dysgnathiechirurgie gehalten, müssen aber immer noch dem Vorwurf der Instabilität standhalten. Die vorgelegte Arbeit vergleicht ein modernes resorbierbares Osteosynthesesystem (INION CPS) mit konventionellen Titanminiplatten in der orthognathen Chirurgie. Insgesamt wurden die 50 Patienten der Studiengruppe neu untersucht, die Patienten der Kontrollgruppe mit Titanminiplatten rekrutierten sich aus einem bereits veröffentlichten Kollektiv des Autors. Die Beurteilung der Stabilität erfolgte radiologisch anhand von Fernröntgen-Seiten-Aufnahmen durch einen Vergleich von präoperativen Aufnahmen zu postoperativen und Verlaufsaufnahmen. Die zwei Hauptgruppen wurden dann zum einen nach Verlagerungsrichtung unterteilt als auch nach Art des Eingriffs (Monomaxillär vs. Bimaxillär). Zusätzlich wurden getrennt von diesen Gruppen noch Patienten mit Lippen-Kiefer-Gaumenspalte untersucht. Diese Studie konnte zeigen, dass die Stabilität von den untersuchten resorbierbaren Platten im Besonderen von der Richtung der Verlagerung abhängt. In einigen Verlagerungsrichtungen (Impaktion, horizontale Bewegung im Oberkiefer, Unterkiefervorverlagerung) sind die resorbierbaren Systeme gleichwertig, in anderen (Elongation, Unterkieferrückverlagerung) schneiden sie schlechter ab. Keinen Unterschied gibt es hingegen beim Vergleich der Art der Verlagerungen. Bei Risikopatienten die Vertikalbewegungen benötigen sollte allerdings zu Gunsten der Sicherheit lediglich mit Titanosteosynthesen versorgt werden. Eine Reihe von Studien konnte jedoch zeigen, dass gerade die neuesten resorbierbaren Materialien in ihren Eigenschaften kaum hinter denen der Titanplatten zurückstehen. Allerdings trägt auch weiterhin der höhere Preis der resorbierbaren Osteosynthesen zu deren zurückhaltendem Einsatz bei. Hier ist fraglich ob sich daran mittelfristig etwas ändern wird. Im Rahmen der Fragebogenuntersuchung zeigte sich, das heute mehr denn je mit dem Patienten offen über die Veränderung die diese Eingriffe mit sich bringen gesprochen werden sollte um übersteigerte oder falsche Hoffnungen abzubauen und dem Patienten das Gefühl der Entscheidungsfreiheit und Gleichberechtigung zu geben. Unstrittig ist die Frage nach der Notwendigkeit dieser Operationen. In welchem Umfang und mit welchem Budget die modernen Verfahren wie das MRT zur Basisdiagnostik und die virtuelle Planung als Ersatz für die konventionellen Röntgenbilder Einzug halten werden bleibt abzuwarten.
Osteosynthesematerialien aus resorbierbaren Materialien finden aufgrund ihrer zunehmenden biomechanischen Stabilität eine immer höhere Akzeptanz. Die vorgelegte Untersuchung vergleicht die knöcherne und okklusale Stabilität von solchen Osteosynthesesystemen aus resorbierbaren Materialien im Vergleich mit konventionellen Titanminiplatten in der orthognathen Chirurgie. Untersucht wurden 100 Patienten in einem Nachsorgezeitraum von bis zu 4 Jahren. Die Beurteilung erfolgte klinisch und röntgenologisch anhand von Fernröntgen-Seiten-Aufnahmen. In die Studie gingen ein fünfzig Patienten, die mit resorbierbaren Platten versorgt worden waren, 16 davon mit Polylactid-Polyglycolid Copolymer Platten und 34 Patienten mit 70:30 Poly-L/DL-Lactid Copolymer Platten; fünfzig weitere Patienten, versorgt mit einem Titanminiplattensystem wurden als Kontrollgruppe gewertet. Zunächst konnte gezeigt werden, dass die Gruppen zueinander homogen waren, es unterschieden sich die effektiven intraoperativen Bewegungen von Studien und Kontrollgruppe statistisch nicht signifikant, gleiches galt im Vergleich der resorbierbaren Platten untereinander. Bei der Datenauswertung konnte nachgewiesen werden, dass die absolute und relative Instabilität weder zwischen den Studiengruppen noch der Kontrollgruppe noch zwischen den resorbierbaren Plattensystemen untereinander signifikant unterschiedlich war. Die postoperative 1-Jahres Stabilität unterschied sich dabei ebenfalls nicht signifikant von der 4-Jahres Stabilität. Alle untersuchten Osteosynthesesysteme zeigten im Oberkiefer eine höhere Stabilität als im Unterkiefer und gleichzeitig eine größere Stabilität in der anterior-posterioren Richtung als in der inferior-superioren Richtung. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der klinischen Stabilität von PLGA oder P(L/DL)LA-Miniplatten gefunden. Allerdings konnte auch belegt werden, dass der Einsatz resorbierbarer Unterkieferosteosynthesen eine sehr gute Compliance des Patienten bezüglich geführter Okklusion und Nachsorge voraussetzte. Als nachteilig bei den resorbierbaren Systemen konnte sowohl für den Oberkiefer als auch für den Unterkiefer eine leicht erhöhte Mobilität bis zu 6 Wochen nach der Operation festgestellt werden, die jedoch in keinem Fall das operative Ergebnis beeinflusste. Vielmehr ermöglichten resorbierbare Osteosynthesen eine bessere postoperative okklusale Einstellung. Weiteren Nachteil der resorbierbaren Osteosynthesesysteme bedeuten die hohen Kosten, die heute noch weit über denen von Titanminiplatten liegen. Zukünftige Entwicklungen gehen dahin, das Plattendesign weiter zu optimieren, wie z.B. neuartige pinbasierte Fixationssysteme einzusetzen, wie sie in der Extremitätenchirurgie teils bereits benutzt werden. Fernziel für die Zukunft ist die Entwicklung eines resorbierbaren Osteosynthesesystems, das sich bei geringen Herstellungskosten und miniaturisiertem Plattendesign auch minimalinvasiv einbringen lässt.
Thema der Dissertation ist der signifikante pathognomische Ausdruck, also die Mimik von Figuren, die in den Jahren um 1600 ein großes Thema in der bildenden Kunst, den kunsttheoretischen Traktaten und der Kirche im Zuge der Gegenreformation war. In der künstlerischen Darstellung dieser Jahre lag ein besonderes Gewicht auf einer an rhetorischen Modellen angelehnten Ausdrucks- und Gebärdensprache der Figuren.
Mit der Mimik, deren Darstellung eine enorme Bandbreite entwickelt, wurde zunehmend gespielt und gezielt manipuliert. Und zwar von Seiten der Kunst wie auch der Kirche. Die Arbeit untersucht sowohl die äußeren Umstände unter denen sich eine zunehmende Schematisierung der Gesichtsausdrücke der Figuren entwickelte und die als Formelhaftigkeit zu beschreiben ist, als auch, wie diese von Seiten der Künstler gehandhabt wurde. Erstaunlich war die Feststellung, dass diese „mimischen Formeln“, die man - besonders durch ihr häufiges Auftreten- mit einem bestimmten Kontext verband, nun immer wieder in ganz anderen Zusammenhängen auftauchten und somit einer Figur oder Geschichte einen neuen Sinn gaben. Oft übertrafen sie gar den gesamten übrigen ikonografischen Apparat an Aussagekraft.
Die humane 5-LO ist das Schlüsselenzym in der LT-Biosynthese. LTs sind wichtige Entzündungsmediatoren und sind in einer Vielzahl von Krankheiten involviert, u. a. Asthma, Atherosklerose, rheumatische Arthritis, Sepsis, allergischen Reaktionen und in vielen Krebsarten. Die Struktur der 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 78 kDa. Sie ist in zwei Domänen unterteilt: die kleinere C2-ähnliche regulatorische Domäne (C2ld) und der größeren katalytischen Domäne. Die 5-LO besitzt NIS und NES, die für die zelluläre Lokalisation der 5-LO verantwortlich sind. Außerdem wird die Lokalisation noch von Phosphorylierungsstellen reguliert, die auf der katalytischen Domäne identifiziert werden konnten. 2011 konnten Häfner et al. zeigen, dass die 5-LO in der Lage ist Homodimere zu bilden.
Wie für die meisten anderen humanen Gene konnten auch bei der 5-LO alternative Spleißvarianten identifiziert werden. Schon 1992 konnten die ersten unterschiedlich gesüleißten Transkripte in Hirntumoren und differenzierten HL-60-Zellen gefunden werden. Später konnten weitere Isoformen in verschiedenen Zelllinien entdeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die alternativen Spleißvarianten 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht und charakterisiert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression des 5-LO-WT und deren Isoformen sowohl in B- und T-Zelllinien als auch primären B- und T-Zellen, monozytären Zelllinien und primäre Monozyten aus Patientenproben (RA und Sepsis) untersucht. Es wurde festgestellt, dass das Expressionsprofil der 5-LO-Varianten zellspezifisch ist. Im Vergleich zu den T-Zellen konnte in B-Zelllinien ein höheres Expressionslevel detektiert werden. Des Weiteren zeigte sich interessanterweise ein stark erhöhtes Expressionslevel in primären Monozyten von RA- und Sepsis-Patienten.
Untersuchungen der 5-LO-Aktivität ergaben unterschiedliche Ergebnisse, abhängig von der Transfektionsmethode. Als transiente Transfektion diente die Calciumphosphat-Methode. Für die stabile Integration der HEK293T-Zellen wurde die Sleeping Beauty-Methode gewählt. Hierfür wurden Proteine mit einem GFP bzw. mCherry-Tag (GFP-5-LO-WT, mCherry∆13, mCherry∆4, mCherryp12) verwendet, um diese mittels Konfokalmikroskop visualisieren zu können. Nach transienter Transfektion konnte eine Inhibition der 5-LO-Aktivität nach Kotransfektion mit jeweils einer Isoform gemessen werden. Nach stabiler Integration jedoch zeigte sich eine Steigerung der 5-LO-Produktbildung. Mit Hilfe von Western Blots wurden Expressionskontrollen angefertigt und die Menge des 5-LO-WT quantifiziert. In transient transfizierten Zellen wurde eine Erniedrigung der Expression des 5-LO-WT bestimmt, wohingegen in stabil integrierten Zellen ein Anstieg des 5-LO-WT als auch der Isoformen beobachtet werden konnte. Einerseits könnte dies einem Artefakt der Transfektionmethode zugrunde liegen, andererseits könnte es ein Hinweis darauf sein, dass sich die Proteine gegenseitig in ihrer Expression beeinflussen.
Ebenso wurde die Lokalisation der 5-LO und deren Isoformen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-LO überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, während alle alternativen Protein-Isoformen im Zytosol zu finden waren. Durch Ionophor-Behandlung wurde eine Translokation des 5-LO-WT an die Kernmembran detektiert, die Isoformen verblieben im Zytosol. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die Spleißvariante 5-LO∆13 mit höherer Ionophor-Konzentration ebenso in der Lage ist an die Kernmembran zu translozieren. Um eine mögliche Interaktion der 5-LO mit den Isoformen zu untersuchen, sollten alle Proteine im selben Zellkompartiment lokalisiert sein. Dafür wurden verschiedene Stimuli und Mutationen getestet. Mit der Mutante GFP-5-LO-S271A und dem Stressstimulus Sorbitol und den CaMKII/p38-Inhibotoren KN-93/SB203580 konnte eine Translokation in das Zytosol erreicht werden. Die Ergebnisse der anschließenden Aktivitätsassays zeigten, dass die Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivität der 5-LO ausüben.
Des Weiteren wurden die Phosphorylierungen an S523 und S271 von 5-LO-WT, 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die 5-LO-Proteine unterschiedliche Phosphorylierungsmuster aufweisen. Während 5-LO-WT und 5-LO∆4 eine schwache Phosphorylierung an S271 aufzeigen, konnte eine starke Phosphorylierung der 5-LO∆13 und 5-LOp12 detektiert werden. Im Vergleich dazu zeigte lediglich die Isoform 5-LOp12 eine sehr starke Bande an der Phosphorylierungsstelle S523. Bei beiden Phosphorylierungen konnten deutlich stärkere Signale nach Kotransfektion gemessen werden. Durch Klonierung eines P2A-Linkers zwischen 5-LO und des GFP-Tags, konnten die Isoformen vom 5-LO-WT in Western Blots voneinander getrennt werden. Dies zeigte, dass es zu einer Hochregulation der Expression der alternativen 5-LO-Varianten nach Kotransfektion mit dem WT führte, aber auch, dass die stärkere Phosphorylierung nach Kotransfektion unabhängig von der Proteinmenge ist.
Die Kommunikation von Zellen mit ihrer Umgebung wird durch Rezeptorproteine arrangiert, die sich in der Plasmamembran befinden. Membranrezeptoren werden durch die Bindung von extrazellulären Liganden, Pathogenen oder Zell-Zell-Interaktionen aktiviert, wodurch die Bildung eines aktiven Zustands gefördert wird, der eine intrazelluläre Reaktion einleitet. Eine Beschreibung auf molekularer Ebene, wie sich Membranrezeptoren in Proteinanordnungen organisieren und wie diese Proteinanordnungen eine spezifische funktionelle Aufgabe ausführen, ist der Ausgangspunkt für das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Gesundheit und Krankheit zugrunde liegen.
Die Fluoreszenzmikroskopie gibt Aufschluss über die Lage von Proteinen in Zellen, und mit der Einführung der höchstauflösenden Mikroskopie wurde der Nachweis einzelner Proteingruppierungen möglich. Eine Einschränkung der meisten Methoden der höchstauflösenden Mikroskopie ist, dass einzelne Komponenten einer Proteingruppierung optisch nicht aufgelöst werden können, was an der geringen Größe und dichten Packung der Bestandteile im Vergleich zur erreichbaren räumlichen Auflösung liegt. Eine Lösung, die für Einzelmolekül-Lokalisierungsmethoden gezeigt wurde, besteht darin, zusätzliche experimentelle Informationen in die Analyse zu implementieren, also „die Aufl sungsgrenze der höchstauflösenden Mikroskopie zu umgehen". Bei der Einzelmolekül-Bildgebung kann diese zusätzliche Information zum Beispiel die Kinetik von mehrfachen und wiederkehrenden
Emissionsereignissen sein, die bei einzelnen Fluorophoren beobachtet werden, was als "Blinken" bezeichnet wird. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer höchstauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethode zur Detektion von Proteinmonomeren und -dimeren in der Plasmamembran von Zellen durch die Verwendung der kinetischen Information.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden photoschaltbare fluoreszierende Proteine als Reporter verwendet, deren photoschaltbare Kinetik mit kinetischen Gleichungen analysiert wurden.
Synthetische, genetische und zelluläre Referenzproteine wurden konstruiert und dienten als Kalibrierungsreferenzen für monomere und dimere Proteine.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das kinetische Modell, das zur Annäherung des Häufigkeitshistogramms von Blinkereignissen einzelner Fluorophore verwendet wird, auf Oligomere höherer Ordnung erweitert. Ein Vergleich mit einem zuvor entwickelten Modell zeigte, dass das erweiterte Modell genauere Ergebnisse für Oligomere höherer Ordnung und Mischungen verschiedener Oligomere liefert. Zusätzlich wird die Anwesenheit von unerkannten Oligomeren berücksichtigt. Die erweiterte Theorie bietet somit die Grundlage, um größere Oligomere und Mischungen unterschiedlicher Stöchiometrie mit besserer Genauigkeit zu untersuchen.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode zur stöchiometrischen endogenen Markierung von Proteinen verwendet, um zwei Rezeptortyrosinkinasen, MET und EGFR, mit einem photoschaltbaren fluoreszierenden Protein zu markieren. Das Vorkommen von monomerem und dimerem MET-Rezeptor wurde auf der Plasmamembran von HEK293T- Zellen mittels quantitativer höchstauflösender Mikroskopie bestimmt. Der Diffusionskoeffizient und der Diffusionsmodus des MET-Rezeptors in lebenden HEK293T-Zellen wurden mit
Einzelpartikelverfolgung gemessen. Dieser Teil der Arbeit zeigte, dass die Kombination von CRISPR/Cas12a-gestützter endogener Markierung und Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Organisation und Dynamik von Membranproteinen ist.
Im vierten Teil dieser Arbeit wurde die Einzelmoleküldatenanalyse durch ein Softwaretool beschleunigt, das eine automatisierte und unvoreingenommene Detektion von Einzelmolekül-Emissionsereignissen ermöglicht. Der Anteil von Monomeren und Dimeren von fluoreszierenden Reportern wurde durch die Implementierung eines neuronalen Netzwerks bestimmt (die Software wurde von Alon Saguy geschrieben; Gruppe von Prof. Yoav Shechtman, Technion, Israel). Der oligomere Zustand der monomeren und dimeren Referenzproteine CD86 und CTLA-4 wurde erfolgreich bestimmt. Die automatisierte Detektion einzelner Proteingruppierungen ermöglichte die Analyse von MET-mEos4b in einzelnen Zellen, wodurch die Heterogenität zwischen den Zellen bestimmt und das Expressionsniveau des Rezeptors mit der Dimerisierung korreliert werden konnte.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit Ergebnisse zu elementaren Aspekten hin zu einer molekularen Quantifizierung von Proteinzahlen mittels Einzelmolekül-
Lokalisationsmikroskopie generiert, die fluoreszierende Reporter, stöchiometrische Markierung von zellulären Proteinen und Bildanalyse umfassen. Das Potential dieser
Entwicklungen wurde anhand der Beobachtung der Liganden-induzierten Verschiebung von monomeren zu dimeren MET-Rezeptoren in einzelnen HEK293T-Zellen gezeigt.
Im Rahmen unserer Arbeit haben wir die diagnostische Aussagekraft von dem Nukleären Matrix-Protein 22 (NMP22) bei Urothelkarzinomen anhand des Standard-Laborverfahrens „Two-Side-ELISA“ ( Enzym-Immunoassay) überprüft. Unsere Studie umfasste 107 Patienten, diese Anzahl erwies sich als ausreichend, um signifikante Ergebnisse über die Eignung des Tests zu erhalten. Unser repräsentatives Patientengut aus der Urologischen Klinik – mit dem Symptom Makrohämaturie – setzte sich aus benignen und malignen Harnwegserkrankungen, darunter 54 Harnblasenkarzinome, 8 Nierenbeckenkarzinome, 2 Ureterkarzinome und 43 benigne Harnwegserkrankungen (z.B. Zystitis, Urethritis, Pyelonephritis, Blasenhalssklerose, Harnleiter- und Blasenpapillome) zusammen. Patienten mit unterschiedlichen Stadien des Urothelkarzinoms G1, G2 und G3 wurden gezielt in unsere Studie aufgenommen. Die Tumorstadienklassifizierung erfolgte mit Hilfe der histologischen Untersuchungen nach der TNM-Klassifikation. Unsere gewonnenen histologischen Ergebnisse wurden mit den NMP22-Werten korreliert. Für die Ermittlung der NMP22-Levels bei den 107 gesammelten Urinproben wurde ein kommerzieller Kit verwendet (MATRITECH, WallacADL-GmbH, Freiburg, Deutschland). Die Aussagekraft des NMP22-Tests konnte anhand eigener Untersuchungen und durch Vergleich mit Untersuchungen in der Fachliteratur- anhand bestehender Vergleichskriterienbeurteilt werden. Die Auswertung erfolgte gemäß den in der Fachliteratur etablierten Kenngrößen Sensitivität und Spezifität. Die Sensitivität und Spezifität des NMP22-Tests in unserer Studie wurden bei einem von uns bestimmten Cut-off-Wert von 7,5 U/ml, der mit dem Cut-off-Wert vom NMP22-Kit Hersteller übereinstimmt, errechnet. Es zeigte sich eine Sensitivitätsabhängigkeit vom Grading. Der Bereich der Sensitivität bei dem Tumormarker NMP22 reichte von 38%-77%. Die Spezifität schwankte zwischen 66% und 80%. Die Spezifität bei den Patienten, die unter Harnwegsinfektionen litten betrug 42.9%. Die allgemeine Sensitivität des NMP22-Tests betrug bei den Blasentumoren 55.6 %. Die Sensitivität für die oberflächlichen Blasenkarzinome (Ta, T1) war 36%. Invasive Blasentumore wurden in 80% der Fälle entdeckt. Abhängig von dem Grading der Blasentumore fanden wir folgende Sensitivitäten des NMP22-Tests : G1 38%, G2 52% und G3 77%. Die Spezifität war 66.9%. Zusammenfassend können wir sagen, dass wir in Übereinstimmung mit allen uns bekannten Studien eine sehr hohe Sensitivität für den NMP22-Test bei Patienten mit invasivem Blasenkrebs finden. Im Grading 1 befinden sich allerdings in unserer Studie die meisten Werte im Normbereich. Aus diesem Grunde haben wir bei Urothelkarzinomen bei Grading 1 eine totale Einschränkung der Aussage des NMP22-Immunoassays und deshalb ist es für das Grading 1 nicht geeignet. NMP22 ist erst für die Früherkennung der Grading 2 und 3 der Blasenkrebse geeignet. Gutartige urologische Erkrankungen, wie die Zystitis oder andere Harnwegsinfektionen, führten zu falsch-positiven Ergebnissen. Unsere Schlussfolgerung ist, dass der NMP22-Test erst ab fortgeschrittenen Stadien, d.h. ab Grading 2 und Grading 3 echte positive Ergebnisse liefert und somit eine diagnostische Aussage macht. Unsere Werte für Sensitivität und Spezifität decken sich weitgehend mit den Angaben aus der Literatur. Unsere Studie hat gezeigt, dass zum gegenwärtigen Zeitpunkt die routinemäßige Anwendung des Harnblasentumormarkers NMP22 für die Primärdiagnostik von Urothelkarzinomen nicht geeignet ist. Zusammenfassend kann derzeit der NMP22 Test somit nicht die Zystoskopie und die Zytologie als Standarddiagnostik für die Frühdetektion von Blasentumoren ersetzen. Wegen der hohen Rate an falschpositiven Resultaten durch entzündliche Reizzustände der Blase bzw. benigne Harnwegserkrankungen wie z.B. Harnwegsinfekte und Harnsteine und wegen der sehr arbeits- und zeitaufwendigen Durchführung können wir den NMP22-ELISA-Test nicht zur routinemäßigen Blasenkrebsfrüherkennung empfehlen. Als Voraussetzung zur richtigen Interpretation der erhaltenen NMP22-Messwerte sollten bestimmte Ausschlusskriterien beachtet werden, so dass andere Ursachen für erhöhte NMP22- Messwerte weitestgehend ausgeschlossen werden können. Unter diesen Bedingungen erachten wir die Einsatzmöglichkeiten für den NMP22-Test als immunologischen nicht-invasiven Test in Verbindung mit der Zystoskopie und der Zytologie bei der Früherkennung von Blasentumoren als sinnvoll. Der Einsatz des NMP22-Tests könnte beispielsweise bei bereits erfolgreich behandelten Blasenkrebs-Patienten als Maßnahme zur Beobachtung in Verbindung mit der Zystoskopie und Zytologie sinnvoll sein. Alle Untersuchungen gemeinsam ermöglichen eine umfassende Diagnostik und eine höhere Sicherheit, und sie sind somit bei der Detektion des Harnblasenkarzinoms aussagekräftiger. Für die Zukunft sind nicht nur weitere randomisierte, prospektive Studien bedeutsam, die über ein geeignetes heterogenes, klinisch relevantes Patientengut verfügen, sondern auch die Vereinfachung der NMP22-Test Durchführung, so dass die Akzeptanz des Testsystems in Klinik und Praxis erhöht werden kann.
IL-18, a recently identified member of IL-1 family, is now recognized as an important regulator of innate and acquired immune responses. Therefore, the antitumor activities of IL-18 have been investigated. IL-18 has been shown to induce IFN-γ production by T, B, and NK cells, enhances NK cell activity, activates Fas ligandmediated apoptosis of the tumor cells, and improves the overall antitumor immunity. KG-1 cells were derived from a patient with acute myeloid leukemia (AML). IL-18 has been shown to induce IFN-γ production in those leukemic cells. TLR-3, in addition to its ability to recognize viral double stranded RNA, also can recognize the synthetic analogue poly(I:C) and induces type I IFN, inflammatory cytokine production, e.g TNF-α, and maturation of denderitic cells. In the present work the potential modulatory effect of PIC on IFN-γ and TNF-α production by KG-1 cells treated with IL-18 was investigated. Indeed, PIC strongly amplified the production of IFN-γ induced by IL-18 on mRNA and protein levels via NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Compared to IFN-γ, TNF-α showed different behaviour in KG-1 cells. On mRNA level I found only weak induction of TNF-α by IL-18 which was potentiated in the presence of PIC. Similarly, the release of TNF-α by IL-18 plus PIC required NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Furthermore, in the present work I found that TLR-3 is required for IFN-γ and TNF-α production. In addition, it is demonstrated by immunofluoresence that TLR-3 is localized in cytoplasm but not on the cell surface in KG-1 cells. Recently, it has been demonstrated that IFN-γ shows therapeutic potential as detected in AML blasts, specifically via inhibition of proliferation and induction of apoptosis. Thus our data could serve as a rationale for the clinical use of PIC and IL-18 in combination therapy. In search for new cytokines potentially modulated by the combination IL-18 plus PIC in KG-1 cells, cytokine antibody array analysis was performed. I found an upregulation of expected genes like IP-10 but most interestingly unexpected upregulation of PDGF-AA. Searching for detailed mechanisms of PDGF-AA induction, I found that neither p38 nor JNK is involved in PDGF-AA production but NF-κB is essential for the expression of PDGF-AA. Furthermore, I found that PDGF-AA is not able to increase the proliferation of KG-1 cells. PDGF and TGF-β are examples of signaling molecules which control the growth, survival, motility, and differentiation of cells. Therefore, the release of TGF-β by IL-18 plus PIC was monitored by ELISA. The level of TGF-β in cellular supernatants revealed that neither PIC nor IL-18 was able to significantly mediate release of TGF-β indicating that only PDGF-AA but not TGF-β is induced by PIC and IL-18 in KG-1 cells. To the best of our knowledge this is the first time that IL-18 or PIC is shown to induce the expression of PDGF-AA in KG-1 cells.