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Ziel der Arbeit war eine Festlegung geeigneter Rekonstruktionsparameter zur Optimierung der Bildqualität in der kardialen 4-Zeilen Spiral CT. 64 Patienten wurden an einem 4-Zeilen CT (Siemens Somatom Plus4 Volume Zoom) untersucht. Aufnahmeparameter waren 300mAs und 120 kV, 4x1mm Schichtkollimation, 1,5 mm Tischvorschub/Rotation und 500ms Rotationszeit. Rekonstruktionsparameter waren: 220mm FOV, 1,25mm effektive Schichtdicke, 0,6mm Inkrement und ein mittlerer Weichteilgewebskernel (B30f). In Abhängigkeit von der Herzfrequenz kam entweder ein Einsegment- (single-segment reconstruction SSR) (HF<65bpm) oder ein Mehrsegmentrekonstruktionsalgorithmus (multi-segment reconstruction MSR) (HF>65bpm) zur Anwendung. Für jeden Datensatz erfolgte zur Ermittlung des optimalen Rekonstruktionszeitpunktes eine mehrfache Bildrekonstruktion innerhalb des T-P-Intervalls (Ende der Systole bis Vorhofkontraktion) in Abständen von jeweils 50ms zueinander. Der Startpunkt jedes Rekonstruktionsintervalls wurde in absoluten Werten (ms) antegrad (a), das heißt vor der folgenden R-Zacke, und retrograd (r), das heißt nach der vorangehenden R-Zacke, festgelegt. Die unterschiedlichen Rekonstruktionsintervalle wurden des Weiteren zuvor definierten Intervallen (A-F), die jeweils bestimmten Ereignissen im Herzzyklus entsprechen, zugeordnet. Die Auswertung der Daten erfolgte auf verblindeten Filmplatten durch zwei unabhängige Untersucher in einer Konsensusentscheidung. Beurteilt wurde die Qualität der Bildgebung in Abstufungen von 1-4. Eine optimale Bildqualität entsprechend der Wertung 1 wurde als eindeutige Abgrenzbarkeit des Gefäßes von den umgebenden Strukturen, eine artefaktfreie Darstellung des Segment-Verlaufs und eine ausreichend gute Differenzierung von Gefäßlumen und -wand definiert. Für jeden Patienten und jedes Segment wurde neben dem Rekonstruktionszeitpunkt (in ms vor oder nach R) auch die Rekonstruktionstechnik (antegrad/retrograd) und der Rekonstruktionsalgorithmus (SSR/MSR) bestimmt, mit der eine optimale Bildqualität für das entsprechende Segment erreicht wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass sich keine optimalen Rekonstruktionszeitpunkte in Millisekunden für einzelne Koronarsegmente definieren lassen. Sobald einzelne Rekonstruktionszeitpunkte jedoch zusammengefasst und den Intervallen A-F zugeordnet werden, lässt sich in Abhängigkeit von der Herzfrequenz (HF) und Rekonstruktionstechnik (aSSR/aMSR/rSSR/rMSR) eine optimierte Bildqualität erzielen: - bei einer Herzfrequenz von HF<60bpm für alle Koronarsegmente mittels F/rSSR, - bei einer Herzfrequenz von HF<65bpm für die Segmente 1-4 und 11-15 mittels B/aSSR und für die Segmente 5-10 mittels F/rSSR und - bei einer Herzfrequenz HF>65bpm mittels B/aMSR. Für jeden Datensatz erfolgte zur Ermittlung des optimalen Rekonstruktionszeitpunktes eine mehrfache Bildrekonstruktion innerhalb des T-P-Intervalls (Ende der Systole bis Vorhofkontraktion) in Abständen von jeweils 50ms zueinander. Der Startpunkt jedes Rekonstruktionsintervalls wurde in absoluten Werten (ms) antegrad (a), das heißt vor der folgenden R-Zacke, und retrograd (r), das heißt nach der vorangehenden R-Zacke, festgelegt. Die unterschiedlichen Rekonstruktionsintervalle wurden des Weiteren zuvor definierten Intervallen (A-F), die jeweils bestimmten Ereignissen im Herzzyklus entsprechen, zugeordnet. Die Auswertung der Daten erfolgte auf verblindeten Filmplatten durch zwei unabhängige Untersucher in einer Konsensusentscheidung. Beurteilt wurde die Qualität der Bildgebung in Abstufungen von 1-4. Eine optimale Bildqualität entsprechend der Wertung 1 wurde als eindeutige Abgrenzbarkeit des Gefäßes von den umgebenden Strukturen, eine artefaktfreie Darstellung des Segment-Verlaufs und eine ausreichend gute Differenzierung von Gefäßlumen und –wand definiert. Für jeden Patienten und jedes Segment wurde neben dem Rekonstruktionszeitpunkt (in ms vor oder nach R) auch die Rekonstruktionstechnik (antegrad/retrograd) und der Rekonstruktionsalgorithmus (SSR/MSR) bestimmt, mit der eine optimale Bildqualität für das entsprechende Segment erreicht wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass sich keine optimalen Rekonstruktionszeitpunkte in Millisekunden für einzelne Koronarsegmente definieren lassen. Sobald einzelne Rekonstruktionszeitpunkte jedoch zusammengefasst und den Intervallen A-F zugeordnet werden, lässt sich in Abhängigkeit von der Herzfrequenz (HF) und Rekonstruktionstechnik (aSSR/aMSR/rSSR/rMSR) eine optimierte Bildqualität erzielen: - bei einer Herzfrequenz von HF<60bpm für alle Koronarsegmente mittels F/rSSR, - bei einer Herzfrequenz von HF<65bpm für die Segmente 1-4 und 11-15 mittels B/aSSR und für die Segmente 5-10 mittels F/rSSR und - bei einer Herzfrequenz HF>65bpm mittels B/aMSR.
A central concern in genetics is to identify mechanisms of transcriptional regulation. The aim is to unravel the mapping between the DNA sequence and gene expression. However, it turned out that this is extremely complex. Gene regulation is highly cell type-specific and even moderate changes in gene ex- pression can have functional consequences.
Important contributors to gene regulation are transcription factors (TFs), that are able to directly interact with the DNA. Often, a first step in understanding the effect of a TF on the gene’s regulation is to identify the genomic regions a TF binds to. Therefore, one needs to be aware of the TF’s binding preferences, which are commonly summarized in TF binding motifs. Although for many TFs the binding motif is experimentally validated, there is still a large number of TFs where no binding motif is known. There exist many tools that link TF binding motifs to TFs. We developed the method Massif that improves the performance of such tools by incorporating a domain score that uses the DNA binding domain of the studied TF as additional information.
TF binding sites are often enriched in regulatory elements (REMs) such as promoters or enhancers, where the latter can be located megabases away from its target gene. However, to understand the regulation of a gene it is crucial to know where the REMs of a gene are located. We introduced the EpiRegio webserver that holds REMs associated to target genes predicted across many cell types and tissues using STITCHIT, a previously established method. Our publicly available webserver enables to query for REMs associated to genes (gene query) and REMs overlapping genomic regions (region query). We illus- trated the usefulness of EpiRegio by pointing to a TF that occurs enriched in the REMs of differential expressed genes in circPLOD2 depleted pericytes. Further, we highlighted genes, which are affected by CRISPR-Cas induced mutations in non-coding genomic regions using EpiRegio’s region query. Non-coding genetic variants within REMs may alter gene expression by modifying TF binding sites, which can lead to various kinds of traits or diseases. To understand the underlying molecular mechanisms, one aims to evaluate the effect of such genetic variations on TF binding sites. We developed an accurate and fast statistical approach, that can assess whether a single nucleotide polymorphism (SNP) is regulatory. Further, we combined this approach with epigenetic data and additional analyses in our Sneep workflow. For instance, it enables to identify TFs whose binding preferences are affected by the analyzed SNPs, which is illustrated on eQTL datasets for different cell types. Additionally, we used our Sneep workflow to highlight cardiovascular disease genes using regulatory SNPs and REM-gene interactions.
Overall, the described results allow a better understanding of REM-gene interactions and their interplay with TFs on gene regulation.
Mit kombinatorisch-chemischer Synthese und einem Gel-shift Test wurden niedermolekulare, peptidische RNA-Liganden gefunden. Als Target-Moleküle dienten ein 23mer RNA-Oligonukleotid (CETP-RNA) aus der Cholesterol Ester Transfer Protein mRNA und ein 27mer RNA-Oligonukleotid aus der HIV-1 Transactivation response region (TAR) RNA (delta-TAR-RNA). Zudem wurde erstmals die Methode des Phage Display angewendet, um RNA-Liganden zu finden. Die aus beiden Screeningmethoden erhaltenen Liganden wurden mit verschiedenen biophysikalischen Methoden, insbesonders der NMR-Spektroskopie auf ihre Bindungseigenschaften und mittels in vitro und in vivo-Tests auf ihre physiologische Aktivität hin untersucht. Ein 16mer Peptid der Antennapedia Homeodomäne internalisiert rasch in Zellen verschiedener Kulturen. Im Screening gefundene Peptidliganden wurde über flexible Spacer (2 beta-Ala-Einheiten) mit diesen 16mer synthetisiert. Es wurde gezeigt, daß diese Peptide so in die Zielzellen und besonders in deren Zellkern gelangen. Basische delta-TAR-RNA-Liganden zeigen diese Verhalten auch ohne Transportersequenz. Die Ergebnisse des Phage-Display-Screenings sind widersprüchlich, da die so gefundenen RNA-Liganden mit den genutzen biophysikalischen Methoden (NMR, CD, Gelelektrophorese) keine größere Affinität an die delta-TAR-RNA zeigen. Im physiologischen Test haben diese Liganden dennoch eine HIV-1 inhibitorische Aktivität gezeigt. In einer humanen Makrophagenkultur, der Wirtszelle von HIV, wurden mit den Peptiden Thr-Pro- Glu-Leu-Pro-Trp-His-NH2 und Phe-His-Ser-Val-Gln-Ala-Leu das HIV-1 Wachstum um 20- 30% inhibiert. Diese Ergebnisse widersprechen den strukturellen Bindungsinfornmationen und sind deshalb fraglich. Ein Monitoring während der Panning-Prozedur wurde nicht durchgeführt. Es wurde auch nicht überprüft, wieviel RNA wirklich immobilisiert wurde. Aufgrund der sehr geringen Substanzmengen was das nicht möglich. In einem deutlich größerem Maßstab, könnten in Zukunft strukturelle Informationen über die immobilisierte RNA gewonnen werden, z. B. mit HR-MAS-NMR-Techniken. Die im Gel-shift-Screening gefundenen delta-TAR-RNA-Liganden des Gel-shift-Screening zeigen keine HIV-1 inhibitorische Aktivität. Die gefundenen Bindungskonstanten sind allerdings um eine Größenordnung kleiner als die der natürliche Bindungsregion Tat10, welche eine HIV-1 inhibitorische Wirkung besitzt. Die im Gel-Shift-Screening gefundenen CETP-RNA/Peptid-Paare mit den stärksten Affinitäten wurden mittels NMR-Spektroskopie und CD- und Gel-shift-Experimenten charakterisiert. Die Bindungskonstanten lagen im niedrig mikromolaren Bereich. Wie in 1D Jump Return-Experimenten gezeigt wurde, verschoben sich die Signale verschiedener Liganden in Gegenwart der CETP-RNA unterschiedlich stark. Zudem konnte eine Verbreiterung der Signale der Liganden festgestellt werden. Das Peptid Lys-Tyr-Lys-Leu- Tyr-Lys-Cys-NH2 zeigte bei der CETP-RNA den stärksten Effekt mit Bindungsaffinitäten von Kd = 32±2 mikro-M (CD-Titration). In 2D NOESY Experimenten zeigt der Peptid-Ligand Kreuz-Signale zu den Iminoprotonen der CETP-RNA. Da die Sekundärstruktur der CETPRNA ein Hairpin ist, sollte das Peptid somit Kontakt zu der Doppelstrang-Region haben. Dieses Peptid zeigt zudem einen deutlichen Effekt auf das CD-Verhalten seiner CETP-RNA. Offenbar wird die Basenpaarung der Sekundärstruktur unter Peptideinfluß geschwächt. Im physiologischem Test am Tiermodell einer transgenen Maus zeigt dieser Ligand eine Erniedrigung des Cholesterolester Transfers. In Zukunft könnte das Peptid Lys-Tyr-Lys-Leu- Tyr-Lys-Cys-NH2 mit z. B. unnatürlichen Aminosäuren modifiziert werden, um eine bessere physiologische Stabilität zu erhalten und dadurch möglicherweise die physiologische Aktivität zu erhöhen. Auch eine Leitstrukturoptimierung kann durchgeführt werden.
Octanoic acid (C8 FA) is a medium-chain fatty acid which, in nature, mainly occurs in palm kernel oil and coconuts. It is used in various products including cleaning agents, cosmetics, pesticides and herbicides as well as in foods for preservation or flavoring. Furthermore, it is investigated for medical treatments, for instance, of high cholesterol levels. The cultivation of palm oil plants has surged in the last years to satisfy an increasing market demand. However, concerns about extensive monocultures, which often come along with deforestation of rainforest, have driven the search for more environmentally friendly production methods. A biotechnological production with microbial organisms presents an attractive, more sustainable alternative.
Traditionally, the yeast Saccharomyces cerevisiae has been utilized by mankind in bread, wine, and beer making. Based on comprehensive knowledge about its metabolism and genetics, it can nowadays be metabolically engineered to produce a plethora of compounds of industrial interest. To produce octanoic acid, the cytosolic fatty acid synthase (FAS) of S. cerevisiae was utilized and engineered. Naturally, the yeast produces mostly long-chain fatty acids with chain lengths of C16 and C18, and only trace amounts of medium-chain fatty acids, i.e. C8-C14 fatty acids. To generate an S. cerevisiae strain that produces primarily octanoic acid, a mutated version of the FAS was generated (Gajewski et al., 2017) and the resulting S. cerevisiae FASR1834K strain was utilized in this work as a starting strain.
The goal of this thesis was to develop and implement strategies to improve the production level of this strain. The current mode of quantification of octanoic acid includes labor-intensive, low-throughput sample preparation and measurement – a main obstacle in generating and screening for improved strain variants. To this end, a main objective of this thesis was the development of a biosensor. The biosensor was based on the pPDR12 promotor, which is regulated by the transcription factor War1. Coupling pPDR12 to GFP as the reporter gene on a multicopy plasmid allowed in vivo detection via fluorescence intensity. The developed biosensor enabled rapid and facile quantification of the short- and medium-chain fatty acids C6, C7 and C8 fatty acids (Baumann et al., 2018). This is the first biosensor that can quantify externally supplied octanoic acid as well as octanoic acid present in the culture supernatant of producer strains with a high linear and dynamic range. Its reliability was validated by correlation of the biosensor signal to the octanoic acid concentrations extracted from culture supernatants as determined by gas chromatography. The biosensor’s ability to detect octanoic acid in a linear range of 0.01-0.75 mM (≈1-110 mg/L), which is within the production range of the starting strain, and a response of up to 10-fold increase in fluorescence after activation was demonstrated.
A high-throughput FACS (fluorescence-activated cell sorting) screening of an octanoic acid producer strain library was performed with the biosensor to detect improved strain variants (Baumann et al., 2020a). For this purpose, the biosensor was genomically integrated into an octanoic acid producer strain, resulting in drastically reduced single cell noise. The additional knockout of FAA2 successfully prevented medium-chain fatty acid degradation. A high-throughput screening protocol was designed to include iterative enrichment rounds which decreased false positives. The functionality of the biosensor on single cell level was validated by adding octanoic acid in the range of 0-80 mg/L and subsequent flow cytometric analysis. The biosensor-assisted FACS screening of a plasmid overexpression library of the yeast genome led to the detection of two genetic targets, FSH2 and KCS1, that in combined overexpression enhanced octanoic acid titers by 55 % compared to the parental strain. This was the first report of an effect of FSH2 and KCS1 on fatty acid titers. The presented method can also be utilized to screen other genetic libraries and is a means to facilitate future engineering efforts.
In growth tests, the previously reported toxicity of octanoic acid on S. cerevisiae was confirmed. Different strategies were harnessed to create more robust strains. An adaptive laboratory evolution (ALE) experiment was conducted and several rational targets including transporter- (PDR12, TPO1) and transcription factor-encoding genes (PDR1, PDR3, WAR1) as well as the mutated acetyl-CoA carboxylase encoding gene ACC1S1157A were overexpressed or knocked out in producer or non-producer strains, respectively. Despite contrary previous reports for other strain backgrounds, an enhanced robustness was not observable. Suspecting that the utilized laboratory strains have a natively low tolerance level, four industrial S. cerevisiae strains were evaluated in growth assays with octanoic acid and inherently more robust strains were detected, which are suitable future production hosts.
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H. salinarum ist einer von zwei archaealen Organismen, die synchronisiert werden können. Die Synchronisations-Methode konnte in dieser Arbeit optimiert werden. Nahezu 100 % aller Zellen teilen sich in einer Zeitspanne von einem Viertel der Generationszeit. Die Analyse zweier aufeinanderfolgender Zellzyklen zeigte, dass die Zellen sich auch im zweiten Zyklus synchron teilen. Die Zellsynchronisation wurde angewendet, um zellzyklusabhängige Vorgänge in H. salinarum auf unterschiedlichen Ebenen zu charakterisieren. Mittels DNA-Mikroarrays wurden Transkriptomänderungen untersucht. Nur 87 Gene zeigten zellzyklusspezifische Regulationen. Dies entspricht 3 % aller vorhergesagten offenen Leserahmen und ist somit im Vergleich zu allen anderen Organismen, deren Transkriptome untersucht wurden, deutlich geringer. Die Transkriptmengen von 15 ausgewählten Genen wurden mit Northern Blot Analysen verifiziert. Die regulierten Gene konnten in sieben Gruppen mit unterschiedlichen Transkriptprofilen eingeordnet werden. Gruppenspezifische DNA-Sequenzmotive wurden gefunden, von denen angenommen wird, dass sie in die zellzyklusspezifische Transkriptionsregulation involviert sind. Überraschenderweise wurden die meisten als Zellzyklusgene annotierten Gene konstitutiv transkribiert. Die Analyse zellzyklusabhängiger Proteomänderungen erfolgte mittels 2D-Gelelektrophorese. 1200 Proteine konnten reproduzierbar detektiert werden. Die meisten Proteine wurden konstitutiv exprimiert. Nur 30 Proteine zeigten eine zellzyklusabhängige Regulation. Dies entspricht 2,5 % der reproduzierbar detektierten Proteine. Es konnten unterschiedliche Expressionsprofile gefunden werden. Aus den Transkriptom- und Proteomanalysen folgt, dass auf Ebene der Genexpression nur wenige zellzyklusabhängige Regulationen existieren. Sekundäre Botenstoffe spielen eine wesentliche Rolle bei Signaltransduktionen und sind an Regulationen von Zellzyklen beteiligt. Eine Methode zur Messung intrazellulärer cAMP-Konzentration in H. salinarum konnte etabliert werden. Die basale cAMP-Konzentration von 200 µM in haloarchaealen Zellen ist bedeutend höher als die von Hefe. Synchrone Kulturen wurden auf die Oszillation des sekundären Botenstoffes hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Konzentration zellzyklusabhängig zweimal kurzfristig signifikant erhöht wird. Die cAMP-Konzentration steigt einmal vor und einmal direkt nach der Zellteilung an. cAMP könnte daher ein wichtiges Signal für das Fortschreiten des Zellzyklusses sein. Es konnte eine Methode zur Analyse der Replikation in H. salinarum entwickelt werden. Hierfür wurde das Basenanalogon BrdU und ein spezifischer Antikörper gegen dieses verwendet. Die Analyse synchroner Kulturen zeigte das überraschende Ergebnis, dass die Zellen ihre DNA während des gesamten Zellzyklusses zu replizieren scheinen. Vor allem die DNA-Synthese in synchronen Kulturen während der Teilungsphase der Zellen stellt einen völlig neuartigen Zellzyklusablauf dar. Für in vivo Analyse von Zellzyklusproteinen können diese mit GFP markiert und fluoreszenzmikroskopisch analysiert werden. Mit dieser Methode konnten wichtige zellzyklusabhängige Aspekte in anderen Arten aufgeklärt werden. Für einen GFP-Modellversuch wurde in dieser Arbeit ein Fusionsgen bestehend aus den offenen Leserahmen von bop (bacterio-opsin) und gfp (green fluorescent protein) erstellt. Die Expression des chromosomalen bop Gens und des plasmidkodierten bop-gfp Fusionsgens wurde mit Northern Blot Analysen nachgewiesen. Die Purpurmembranbiogenese wurde fluoreszenzmikroskopisch in lebenden H. salinarum Zellen untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Bildung der Purpurmembran ca. 15 Stunden nach Eintritt der Zellen in die stationäre Wachstumsphase beginnt. Innerhalb der folgenden sieben Stunden stieg sowohl die Anzahl an Zellen mit fluoreszierenden Signalen als auch die durchschnittliche Anzahl an Signalen pro Zelle gleichmäßig an. Die Ergebnisse zeigen, dass GFP-Fusionsproteine in H. salinarum z. B. zur Charakterisierung von differentieller Genexpression verwendet werden können. Des Weiteren könnten sie für die Untersuchung zellzyklusabhängiger Proteinlokalisation und für die Analyse der intrazellulären Verteilung putativer Cytoskelettproteine eingesetzt werden.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
Das Prostate-apoptosis-response-gene-4 (Par-4) sensibilisiert neoplastische Lymphozy-ten, deren Malignität durch eine Hemmung der Apoptosefähigkeit gekennnzeichnet ist, für apoptotische Stimuli. Vorhergehende Studien konnten zeigen, daß eine Überexpres-sion von Par-4 bei der Apoptoseinduktion durch Chemotherapeutika zu einer Downregulation von Bcl-2, einer Aktivierung von Caspase-3, einem verstärkten Abfall des Mi-tochondrialen Membranpotentials (MMP), sowie einer verstärkten PARP-Spaltung und dadurch zum programmierten Zelltod führt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere molekulare Mechanismen aufgezeigt werden, über die die apoptosesensibilisierende Wirkung von Par-4 vermittelt wird. Es konnte gezeigt werden, daß bei Behandlung mit Doxorubicin die Par 4 Überexpression außer zur stärkeren Aktivierung von Caspase-3 auch zur stärkeren Aktivierung von Caspase-8 und -9 führt. Außerdem kann eine Caspase 3 Inhibition bei Par-4 Überexpression durch eine alternative Aktivierung der Caspasen-6,-7,-8 und -9 umgangen werden. Dieses veränderte Caspasenaktivitätsmuster läßt sich mit einer Downregulation von Mitgliedern der Inhibitors of Apoptosis Proteins (IAPs) erklären. So konnte gezeigt werden, daß es bei Apoptoseinduktion unter Überexpression von Par-4 zur Downregulation von XIAP, cIAP1 und Survivin kommt. Diese Downregulation bleibt auch unter Caspase-3 Inhibition, sowie von XIAP und Survivin sogar unter allgemeiner Caspaseninhibition bestehen, das heißt sie ist nicht Caspase-3-, bzw. überhaupt nicht Caspasen-vermittelt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß es bei Überexpression von Par-4 unter Apoptoseinduktion mit Doxorubicin außer zum Abfall des MMPs auch zur verstärkten Ausschüttung von Cytochrom c und des Apoptosis In-ducing Factors (AIF) ins Cytosol kommt. Cytochrom c führt im Cytosol unter Bildung des Apoptosoms zur Aktivierung von Caspase-9, einem weiteren Mechanismus, der zur verstärkten Caspasenaktivität unter Par-4 Überexpression beiträgt. Die vermehrte Ausschüttung von Cytochrom c ist bedingt durch eine Translokation von tBid an die Mito-chondrienmembran. So ergaben die Untersuchungen, daß eine Par 4 Überexpression in neoplastischen T-Lymphozyten bei Behandlung mit Doxorubicin zur stärkeren Spaltung von Bid, einem Mitglied der proapoptotischen Bcl-2 Familie, sowie zur stärkeren Translokation des Bid Spaltproduktes (tBid) an die Mitochondrienmembran führt. Mit Hilfe der Immunfluoreszens konnte dargestellt werden, daß Bid in Par-4 überexprimierenden Zellen ein verändertes Verteilungsmuster im Cytosol aufweist und auf einen apoptotischen Reiz hin, verglichen mit den Par-4-negativen Zellen, vermehrt an die Mitochondrienmembran transloziert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß Bak und Bad, zwei weitere proapoptotische Mitgliederr der Bcl-2 Familie, durch Par 4 Überexpression Caspasen unabhängig verstärkt aktiviert werden. Bak wird durch das Bid-Spaltprodukt tBid aktiviert und führt ebenfalls zu einer verstärkten Cytochrom c Freisetzung ins Cytosol, wohingegen Bad seine proapoptotische Wirkung durch Bindung an antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie entfaltet. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, daß die Par-4 Überexpression in neoplastischen Lymphozyten bei Behandlung mit Doxorubicin zu einer Downregulation von Ras, welches zu den GTPasen zählt, führt. Diese Downregulation ist Caspasen-, jedoch nicht Caspase-3-abhängig. Hierbei besteht kein Zusammenhang zwischen der Expression von Ras und dem Tumorsupressorgen P53. Das heißt Par-4 entfaltet seine proapoptotische Wirkung über einen P53-unabhängigen Weg. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, daß Par 4 Überexpression in neoplastischen Lymphozyten zu einer verstärkten Sensibilität des Fas-Rezeptors führt, das heißt, es konnte bewiesen werden, daß der pro-apoptotische Effekt von Par 4 sowohl durch Chemotherapeutika, als auch über direkte Rezeptorstimulation ausgelöst werden kann. Insgesamt legt diese Arbeit die wesentlichen molekularen Mechanismen der pro-apoptotischen Wirkung von Par-4 in neoplastischen Lymphozyten dar.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird experimentell ein oszillatorischer Hall-Strom nachgewiesen, der sich in einem impulsiv optisch angeregten Halbleiterühergitter ausbildet, sobald sich dieses in einem statischen magnetischen Feld und einem dazu senkrechten statischen elektrischen Feld befindet. Das Übergitter dient dabei als Modellsystem für ein dreidimensionales Material und ermöglicht die Beobachtung eines unter dem Begriff "kohärenter Hall-Effekt" zusammengefassten Bewegungsverhaltens der Ladungsträger, das durch eine charakteristische Frequenzabhängigkeit des oszillatorischen Hall-Stromes von den äußeren Feldern gekennzeichnet ist. Dabei wird in der vorliegenden Arbeit das spezielle Bewegungsverhalten mit Hilfe eines semiklassischen Modells hergeleitet und diskutiert. Die zentrale Aussage des Modells ist die Existenz zweier scharf voneinander abgegrenzter Bewegungsregimes, (die sich durch eine entgegengesetzte Feldabhängigkeit der Oszillationsfrequenz auszeichnen. Am Übergang zwischen diesen beiden Regimes werden alle Oszillationen aufgrund einer gegen Null gehenden Frequenz unterdriickt. Dabei lässt sich im Gegensatz zum Ortsraum der Übergang zwischen den beiden Bewegungsregimes im k-Raum einfach klarmachen. Er wird durch die Überwindung der Mini-Brillouin-Zonengrenze durch das Ladungsträgerwellenpaket markiert und bestimmt, ob die Bewegungsform Bloch-oszillationsartig oder zyklotronartig ist. Der experimentelle Nachweis des kohärenten Hall-Effektes wird durch die Anwendung einer berührungsfreien optoelektronischen Technik ermöglicht, mit deren Hilfe das emittierte elektrische Feld der kohärenten, transienten Hall-Ströme zeitaufgelöst detektiert werden kann. Da diese Technik die Messung frei propagierender Strahlung im THz-Frequenzbereich gestattet, bezeichnet man die Methode als THiz-Emissionsspektroskopie. Im Gegensatz zum klassischen Hall-Effekt stellt sich der kohärente Hall-Effekt als Manifestation der Wellennatur (der Ladungsträger dar, die sich im Festkörper durch eine periodische Dispersionsrelation äußert,. Erst. die kohärente Präparation eines Ladungsträgerensembles ermöglicht dabei (die Beobachtung der mikroskopischen Vorgänge in Form einer transienten Bewegung, die, bedingt durch ultraschnelle Streuprozesse, auf kurzen Zeitskalen von etwa 1 ps dephasiert. Die Kohärenz wird dem System dabei mittels eines kurzen Laserpulses von etwa 100 fs Dauer aufgeprägt, mit dessen Hilfe die Ladungsträger im Übergitter optisch generiert werden. Diese Vorgehensweise ist mit der experimentellen Untersuchung von Bloch-Oszillationen vergleichbar, die ebenfalls erst durch die kohärente Präparation der Ladungsträger messbar werden. Die inkohärente Bewegung der Ladungsträger in einem Kristall unter dem Einfluss eines konstanten elektrischen Feldes wird bekanntermaßen durch das Ohmsche Gesetz beschrieben analog etwa der Beschreibung der IIall-Spannung beim klassischen Hall-Effekt.. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelingt der erste Nachweis des beschriebenen kohärenten Effektes und damit, der Beleg, dass es auch in dreidimensionalen Halbleitern, hier repräsentiert durch ein Übergitter, möglich ist, kohärente Signaturen des Hall-Effektes zu beobachteten. Im Gegensatz zu speziellen zweidimensionalen Strukturen, wie sie beim integralen und fraktionalen Quanten-Hall-Effekt verwendet werden, ist dies hier aufgrund des größeren Zustandsraumes und der dadurch bedeutenderen Dephasierungsprozesse nur auf sehr kurzen Zeitskalen realisierbar.
Molecular oxygen (O2) is essential for numerous metabolic processes. Not surprisingly, hypoxia and the resulting adaptations play a pivotal role in pathophysiology, e.g., in cancer or in inflammatory diseases. Of note, myeloid cells are known to accumulate in hypoxic regions such as tumor cores or rheumatoid arthritis joints and may contribute to disease progression. While most studies so far concentrated on transcriptional adaptation by the hypoxia-inducible factors (HIF) 1 and 2 under short term hypoxia, prolonged oxygen deprivation and alternative post-transcriptional regulation are rather poorly investigated.
Consequently, the aim of the study was to generate a comprehensive overview of mRNA de novo synthesis and degradation and its contribution to total mRNA changes in monocytic cells in the course of hypoxia.
To this end, I used thiol-linked alkylation for the metabolic sequencing of RNA (SLAM-Seq) to characterize RNA dynamics under hypoxia. Specifically, I labeled monocytic THP-1 cells under normoxia (N), acute hypoxia (AH; 8 h 1% O2), or chronic hypoxia (CH; 72 h 1% O2) with 4-thiouridine (4sU), which allows for transcriptome-wide identification of de novo synthesized mRNAs and estimation of their half-lives. Total mRNA expression analyses revealed that most changes occurred under CH. Considering that HIF accumulation and resulting transcriptional regulation was shown to decline again under CH, I further analyzed the impact of RNA stability on gene expression. I observed a global reduction in RNA half-lives under hypoxia, indicative for the attenuation of energy-consuming protein synthesis upon oxygen deprivation. Moreover, I observed a subgroup of hypoxic destabilized transcripts with resulting decreased mRNA expression under CH, which consisted of 59 nuclear-encoded mitochondrial mRNAs. This might prevent futile production of new mitochondria under conditions, where mitochondria are even actively degraded to prevent production of detrimental reactive oxygen species.
While stability-regulated transcripts were mainly destabilized under hypoxia, the vast majority of differentially de novo synthesized transcripts were upregulated.
Functional analyses revealed not only hypoxia, but also cholesterol homeostasis and inflammatory response as top enriched terms, corroborating findings on total mRNA level. Focusing on hypoxia-altered cholesterol metabolism, I observed an 9 accumulation of early and a decrease in late cholesterol precursors, which are separated by several oxygen-dependent enzymatic steps. Although total cholesterol levels were only slightly reduced, my data indicate locally lowered endoplasmic reticulum (ER) cholesterol levels under hypoxia, which cause feedback activation of the ER cholesterol-sensing transcription factor sterol regulatory element-binding protein 2 (SREBP2) and induction of cholesterol biosynthesis enzymes. Interestingly, a broad range of interferon-stimulated genes (ISGs), mainly known for their antiviral function, was also induced under hypoxia with similar kinetics as SREBP2 targets, suggesting an immunometabolic crosstalk. While the availability of certain cholesterol biosynthesis intermediates as well as a direct involvement of SREBP2 seemed rather unlikely to cause hypoxic ISG induction, changes in intracellular cholesterol distribution appeared crucial for the hypoxic induction of chemokine-ISGs. Mechanistically, I found that MyD88-dependent toll-like receptor 4 (TLR4) signaling contributes to enhanced hypoxic ISG induction, likely sensitized by changes in cholesterol dynamics. Importantly, hypoxia amplified induction of chemokine-ISGs in monocytes upon treatment with severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2) spike protein via TLR4 similarly as after addition of infectious virus, which might contribute to systemic inflammation in hypoxemic patients with severe coronavirus disease-2019 (COVID-19).
Taken together, I comprehensively analyzed RNA dynamics in hypoxic monocytes. Specifically, I identified RNA stability as a modulating mechanism to limit production of mitochondria under oxygen-restricted conditions. Moreover, I characterized the immunometabolic crosstalk between disturbed cholesterol homeostasis and spontaneous induction of interferon (IFN)-signaling in hypoxic monocytes, which might contribute to systemic inflammation in severe cases of COVID-19.
Zielsetzung: Evaluation der lokoregionären transarteriellen Chemoperfusion (TACP) bei nicht kurativ therapierbaren und unter systemischer Chemotherapie progredienten fortgeschrittenen Stadien, Rezidivtumoren oder Metastasen maligner Tumoren des Beckens, des Pankreas und der Leber anhand des lokalen Tumoransprechens, des Überlebens und des Ansprechens tumorassoziierter Symptome (Becken und Pankreas). Material und Methodik: Bei 24 Patienten wurden TACP des Beckens durchgeführt. Die behandelten Tumorentitäten waren kolorektales Karzinom (KRK) (n = 11), Ovarial- (n = 3), Cervix-, Mamma- (BC) (je n = 2), Magen-, Nebennieren-, Anal-, Prostata-, Nierenzell- und Gartner-Gang-Karzinom (je n = 1). Bei 40 Patienten wurden TACP des Pankreas bei Pankreaskarzinom durchgeführt (n = 28 fortgeschrittene Tumorstadien, n = 12 Lokalrezidive). Bei 55 Patienten wurden TACP der Leber durchgeführt. Die behandelten Tumorentitäten waren KRK, BC (je n = 12), cholangiozelluläres Karzinom (CCC) (n = 10), Pankreas- (n = 4), Ovarial- (n = 3), Magen-, Cervix-, Papillen- (je n = 2), Prostata-, Ösophaguskarzinom, Leiomyosarkom (je n = 1) und cancer of unknown primacy (CUP) (n = 5). Mitomycin C (6-8,5 mg/m²) wurde in Kombination mit Gemcitabine (1000-1500 mg/m²) über 1 h durch einen je nach Tumorlokalisation und -gefäßversorgung in der A. iliaca interna (Becken), dem Truncus coeliacus (Pankreas) oder der A. hepatica (Leber) platzierten Angiographiekatheter verabreicht. Mindestens 3 TACP wurden pro Patient in vierwöchigen Abständen ambulant durchgeführt. Danach wurde das Therapieansprechen evaluiert und über eine Weiterführung entschieden. Das radiologische Tumoransprechen wurde mittels MRT oder CT bestimmt und nach der RECIST-Klassifikation (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) in complete response (CR), partial response (PR), stable disease (SD) und progressive disease (PD) eingeteilt. Eine deutliche Verbesserung klinischer Symptome wurde als clinical response (Rc), eine Stabilisierung als clinical stable disease (SDc) und eine Verschlechterung bestehender oder ein Auftreten neuer Symptome als clinical progression (PDc) bewertet. Die Überlebenszeiten wurden nach der Kaplan-Meier-Methode berechnet. Ergebnisse: Bei allen Patienten konnten mindestens 3 TACP durchgeführt werden. Ein vorzeitiger Therapieabbruch oder eine Verlängerung der Therapieintervalle war bei keinem Patienten notwendig. Es kam zu keinen relevanten Komplikationen. Bei Patienten, bei denen eine TACP des Beckens durchgeführt wurde, konnten tumorassoziierte Beschwerden (Schmerzen, Blutungen etc.) in 54% (21/39 Einzelsymptome) gebessert werden. Radiologisch zeigten sich insg. 4 (17%) PR, 12 (50%) SD und 8 (33%) PD. Für Patienten mit KRK als größte Einzelgruppe betrug das radiologische Ansprechen 2 PR, 7 SD und 2 PD bei einem medianen Überleben von 11,5 Monaten. Tumorinduzierte Schmerzen konnten bei 20/32 (62,5%) der Patienten verringert werden, bei denen eine TACP des Pankreas durchgeführt wurde. Radiologisch fanden sich 3 (7,5%) CR, 9 (22,5%) PR, 16 (40%) SD und 12 (30%) PD. Das mediane Überleben lag bei 8,1 Monaten. Patienten mit Therapieansprechen (CR + PR) lebten signifikant länger als solche mit Tumorprogress (13,0 vs. 6,0 Monate; p = 0,013). Bei Patienten, bei denen eine TACP der Leber durchgeführt wurde, fanden sich insg. 1 CR, 19 PR, 19 SD und 16 PD. Davon entfielen 5 PR, 3 SD und 4 PD auf KRK, 1 CR, 4 PR und 6 SD auf BC und 2 PR, 2 SD und 6 PD auf CCC. Das mediane Überleben betrug 9,7 Monate bei KRK, 11,4 Monate bei BC und 6,0 Monate bei CCC. Schlussfolgerung: Die TACP mit Mitomycin/Gemcitabine stellt ein gut verträgliches, minimalinvasives, komplikationsarmes, ambulant einsetzbares Verfahren zur palliativen Therapie von fortgeschrittenen Stadien, Rezidivtumoren und Metastasen maligner Tumoren des Beckens, des Pankreas und der Leber dar. Es konnte sogar in multipel vorbehandelten, therapieresistenten Tumoren ein Ansprechen/eine Wachstumskontrolle (= CR+PR+SD) in 17%/67% (Becken), 30%/70% (Pankreas) bzw. 36%/71% (Leber) erzielt werden. Patienten mit Pankreaskarzinom, die auf die Therapie mit der TACP ansprachen, hatten einen signifikanten Überlebensvorteil gegenüber Patienten mit Tumorprogress. In 54% (Becken) bzw. 62,5% (Pankreas) konnten lokale tumorassoziierte Beschwerden gebessert werden. Aus diesen Gründen sollte die intraarterielle Chemotherapie als Option in der palliativen onkologischen Betreuung des Patienten in Erwägung gezogen werden.
Seit der Entdeckung der Spirochäten als Erreger der Lyme-Borreliose durch Willy Burgdorfer im Jahre 1982 wird an ihrer genotypischen und phänotypischen Differenzierung gearbeitet. Als humanpathogen gelten die drei Genospezies B. burgdorferi s. s., B. garinii und B. afzelii. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung einer schnellen und hochspezifischen Methode zur Subtypisierung der drei o.g. Genospezies und basiert auf einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) des Flagellin-Gens. Als Zielsequenz für die PCR wurde ein konservierter Genabschnitt gewählt, der einerseits so spezifisch ist, dass keine Amplifikation nahe verwandter Spirochäten stattfindet, andererseits phylogenetisch so konserviert vorliegt, dass alle drei humanpathogenen Genospezies erfaßt werden können. Die erhaltenen PCR-Amplifikate wurden zur Subtypisierung mit drei hochspezifischen Oligonukleotiden hybridisiert. In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 34 Borrelien-Isolate untersucht und eindeutig und reproduzierbar mittels Dot blot-Hybridisierung typisiert. Als entscheidender Parameter zeigte sich die gewählte Waschtemperatur. Sie lag für das Oligonukleotid Fla15 (spezifisch für B. garinii) bei 63,1 °C (+/- 0,2°C), für das Oligonukleotid Fla16 (spezifisch für B. afzelii) bei 67,1°C (+/- 0,2°C) und für das Oligonukleotid Fla8 (spezifisch für B. burgdorferi s. s.) bei 68,0°C (+/- 0,2°C). Die Zielsetzung der Arbeit, eine hochstringente Methode zur Subtypisierung von PCR-Amplifikaten des phylogenetisch konservierten Flagellin-Gens der Erreger der Lyme-Borreliose zu etablieren, konnte erfolgreich umgesetzt werden. Mit der in dieser Arbeit evaluierten und etablierten Methode für die Subtypisierung aller drei humanpathogenen Borrelien-Genospezies eröffnet sich die Möglichkeit, epidemiologische Studien mit klinischen Untersuchungsmaterialien durchzuführen und der Frage nachzugehen, ob die Hypothese des Organotropismus bei der Lyme-Borreliose aufrecht erhalten werden kann.
In der vorliegenden Arbeit untersuchen wir die Verteilung der Nullstellen Dirichletscher L-Reihen auf oder in der Nähe der kritischen Geraden. Diese Funktionen und ihre Nullstellen stehen im Mittelpunkt des Interesses bei einer Vielzahl klassischer zahlentheoretischer Fragestellungen; beispielsweise besagt die Verallgemeinerte Riemannsche Vermutung, daß sämtliche Nullstellen dieser Funktionen auf der kritischen Geraden liegen. Unsere Ergebnisse gehen unter anderem über die besten bislang bekannten Abschätzungen - für den Anteil der Nullstellen der Dirichletschen L-Reihen, die auf der kritischen Geraden liegen, - für den Anteil einfacher beziehungsweise m-facher Nullstellen sowie - über Nullstellen in der Nähe der kritischen Geraden hinaus. Wir setzen hiermit Arbeiten von A. Selberg, N. Levinson, J. B. Conrey und anderen fort und verallgemeinern Ergebnisse, die für die Riemannsche #-Funktion gültig sind, auf alle Dirichletschen LReihen beziehungsweise verbessern bisherige Resultate. Nach einer ausführlicheren Darstellung der Hintergründe zeigen wir einen Satz über Mittelwerte "geglätteter" L-Reihen, d.h. mit einem geeigneten Dirichlet-Polynom multiplizierte L-Reihen. Solche Mittelwertsätze stellen ein wesentliches Hilfsmittel zur Untersuchung der Nullstellenverteilung dar. Die in unserem Hauptsatz gegebene asymptotische Darstellung dieses Mittelwertes können wir dann nutzen, um die genannten Ergebnisse herzuleiten.
The simultaneous inhibition of HDACs and BET proteins has shown promising anti-proliferative effects against different cancer types, including the difficult to treat pancreatic cancer. In this work, the strategy of concurrently targeting HDACs and BET proteins was pursued by developing different types of dual inhibitors.
By developing a novel scaffold that selectively inhibits HDAC1/2 together with BET proteins in cells, an effective tool for the investigation of pancreatic cancer, and other diseases which are sensitive to epigenetic processes, was created. The compound’s small size further gives the opportunity to further develop the inhibitor towards optimized pharmacokinetic properties, potentially resulting in a drug for cancer treatment.
A second novel approach that was pursued, was the development of a small-molecule degrader, targeting HDACs and BET proteins. Through synthesizing a variety of different molecules, a compound that was capable of lowering BRD4 levels and, at the same time, increasing histone acetylation was developed. While additional mechanistic investigations are needed to verify the degradation, the potent antiproliferative effects in pancreatic cancer cells encourage further studies following this alternative new strategy.
Terahertz (THz) physics are an emerging field of research dealing with electromagnetic radiation in the far-infrared to microwave region. The development of innovative technologies for the generation and detection of THz radiation has only in the recent past led to a tremendous rise of both fundamental research as well as investigation of possible fields of application for THz radiation. The most prominent reason has long been the scarce accessibility of the THz region of the electromagnetic spectrum - commonly loosely located between 0.1 and 30 THz - to broad research, and it was mostly limited to astronomy and high energy physics facilities. Over the recent years, numerous novel concepts on both the source and detector side have been proposed and successfully implemented to overcome this so-called THz gap. New technology has become available and paved the way for wide-spread experimental laboratory work and accompanying theoretical investigations. First application studies have emerged and in some cases even commercial development of the field of THz physics is on the rise. Despite these enormous progresses, a continuing demand for more efficient THz detectors still impels current technological research. Relatively low source powers are often a major limiting factor and the request for new detection concepts, their understanding and implementation, as well as the optimization on a device basis has been and still remains in place. One of these concepts is the use of field-effect transistors (FETs) high above their conventional cut-off frequencies as electronic THz detectors. The concept has been proposed in a number of theoretical publications by M. Dyakonov and M. Shur in the early 1990's, who pioneered to show that under certain boundary conditions, non-linear collective excitations of the charge carrier system of a two-dimensional electron gas (2DEG) by incident THz radiation can exhibit rectifying behaviour - a detection principle, which has become known as plasma wave or plasmonic mixing. Up until this day, the concept has been successfully implemented in many device realizations - most advanced in established silicon CMOS technology - and stands on the edge of becoming commercially available on a large scale. The main direction of the work presented in this thesis was the modeling and experimental characterization of antenna-coupled FETs for THz detection - termed TeraFETs in this and the author's previous works - which have been implemented in different material systems. The materials presented in this thesis are AlGaN/GaN HEMTs and graphene FETs. In a number of scientific collaborations, TeraFETs were designed based on a hydrodynamic transport model, fabricated in the respective materials, and characterized mainly in the lower THz frequency region from 0.2 to 1.2 THz. The theoretical description of the plasma wave mixing mechanism in TeraFETs, as initiated by Dyakonov and Shur, was based on a fluid-dynamic transport model for charge carriers in the transistor channel. The THz radiation induces propagating charge density oscillations (plasma waves) in the 2DEG, which via non-linear self-mixing cause rectification of the incident THz signals. Over the course of this work, it became evident in the on-going detector characterization experiments that this original theoretical model of the detection process widely applied in the respective literature does not suffice to describe some of the experimental findings in TeraFET detection signals. Thorough measurements showed signal contributions, which are identified in this work to be of thermoelectric origin arising from an inherent asymmetric local heating of charge carriers in the devices. Depending on the material, these contributions constituted a mere side effect to plasmonic detection (AlGaN/GaN) or even reached a comparable magnitude (graphene FETs). To include these effects in the detector model, the original reduced fluid-dynamic description was extended to a hydrodynamic transport model. The model yields at the current stage a reasonable qualitative agreement to the measured THz detection signals. This thesis presents the formulation of a hydrodynamic charge carrier transport model and its specific implementation in a circuit simulation tool. A second modeling aspect is that the transport equations cover only the intrinsic plasmonic detection process in the active gated part of the TeraFET's transistor channel. In order to model and simulate the behavior of real devices, extrinsic detector parts such as ungated channel regions, parasitic resistances and capacitances, integrated antenna impedance, and others must be considered. The implemented detector model allows to simulate THz detection in real devices with the above influences included. Besides presentation of the detector model, experimental THz characterization of the fabricated TeraFETs is presented in this work. Careful device design yielded record detection performance for detectors in both investigated materials. The respective results are shown and the experimental observations of the thermoelectric effect in TeraFETs are compared to modeling results. It is the goal of this work to provide a framework for further theoretical and experimental studies of the plasmonic and thermoelectric effect in TeraFETs, which could eventually lead to a new type of THz detectors particularly exploiting the thermoelectric effect to enhance the sensitivity of today's plasmonic TeraFETs.
Glutamat ist einer der wichtigsten erregenden Neurotransmitter im zentralen Nervensystem (ZNS), der unter anderem metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) aktiviert. Die Signalübertragung der mGluRs erfolgt indirekt durch Aktivierung intrazellulär gekoppelter heterotrimerer G-Proteine, die daraufhin zelluläre Signalprozesse beeinflussen. Es sind acht verschiedene mGluRs bekannt, die in drei Gruppen gegliedert werden, welche sich in ihrer Lokalisation, ihrer Struktur und ihren pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden. Die hauptsächlich präsynaptisch lokalisierten Gruppe III mGluRs sind an der Regulation der Neurotransmission an exzitatorischen Synapsen beteiligt. Sie fungieren als Autorezeptoren, die rückkoppelnd die Glutamatausschüttung hemmen. Um eine möglichst exakte Übersetzung der extrazellulären Glutamatsignale durch mGluRs zu gewährleisten, muss die Signaltransduktion dieser Rezeptoren sehr genau kontrolliert und reguliert werden. Als Regulatoren der Signalübertragung verschiedener G-Protein gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) haben sich Vertreter der RGS-(Regulators of G protein Signalling)-Proteinfamilie erwiesen. RGS-Proteine können direkten Einfluss auf die Kinetik der Signalübermittlung eines GPCRs nehmen. RGS-Proteine beschleunigen mittels ihrer GAP (GTPase Accelerating Protein)-Funktion die GTP-Hydrolyse, wodurch die Geschwindigkeit der Inaktivierung der Ga-Untereinheit und somit der Signalantwort des GPCRs deutlich erhöht wird. Bis heute wurden mehr als 30 verschiedene RGS-Proteine beschrieben, die alle eine konservierte RGS-Domäne besitzen, die die Bindung an die Ga-Untereinheit des G-Proteins und die GAP-Aktivität vermittelt. Für einige GPCRs wurde bereits eine spezifische und selektive Interaktion sowie Regulation durch bestimmte RGS-Proteine gezeigt. An Gruppe III mGluRs gab es bisher keine einschlägigen Untersuchungen, außer am in der Retina exprimierten mGluR6, der jedoch einen Sonderfall innerhalb dieser Rezeptorgruppe darstellt. Deshalb sollte in dieser Dissertation untersucht werden, ob Gruppe III mGluRs, mit besonderem Augenmerk auf eine der zwei bekannten Spleißvarianten des mGluR7 (mGluR7a), durch ein oder auch mehrere Mitglieder der RGS-Familie reguliert werden können. Zwei Vertreter der RGS-Protein Familie, RGS3 und RGS4, die beide im Gehirn exprimiert werden, wurden als potentielle Kandidaten ausgewählt. Biochemische Interaktionsanalysen dieser Dissertation zeigten, dass sowohl RGS3 als auch RGS4 direkt an mGluR7a binden. Die Bindung zwischen mGluR7a und RGS3 bzw. RGS4 war in Abwesenheit von Ca2+ deutlich verstärkt. Da Calmodulin (CaM) in Anwesenheit von Ca2+ sowohl an mGluR7a als auch an RGS3 und RGS4 bindet, wurde postuliert, dass gebundenes Ca2+/CaM ein räumliches Hindernis für die Wechselwirkung zwischen Rezeptor und RGS-Protein darstellen könnte. Die Daten dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die Bindung von Ca2+/CaM an den C-Terminus des mGluR7a die Interaktion zwischen dem Rezeptor und RGS4 abschwächt. Ein physiologischer Effekt der beiden RGS-Proteine auf die mGluR7a-vermittelte Signalübermittlung wurde zunächst in transfizierten HEK-Zellen nachgewiesen. Hierzu wurde die Signalantwort des mGluR7a in An- und Abwesenheit von RGS3 oder RGS4 durch Bestimmung der Menge der sekundären Botenstoffe gemessen und verglichen. RGS3 sowie RGS4 beschleunigten in diesem System durch ihre GAP-Aktivität die GTP-Hydrolyse an der Ga-UE und damit die Inaktivierung der Signaltransduktion des Rezeptors. Mittels hochauflösender Elektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass RGS3 und RGS4 wie auch mGluR7a in vivo an der präsynaptischen Membran kortikaler Maus-Neuronen zu finden sind. Da die Proteine in den Nervenzellen kolokalisieren, sollte die Interaktion und Regulation, die in vitro nachgewiesen wurde, auch in vivo möglich sein. Ein in vivo-Nachweis des regulatorischen Effektes von RGS4 auf die Signaltransduktion der Gruppe III mGluRs bzw. des mGluR7a erfolgte durch Vergleich der Signalantworten dieser Rezeptoren in kultivierten kortikalen Neuronen aus Wildtyp- und RGS4-defizienten Mäusen. Mit dem Gruppe III mGluR-spezifischen Agonisten L-AP4 konnte im Vergleich zu den Wildtyp-Neuronen keine Antwort der mGluRs in den RGS4-defizienten Nervenzellen gemessen werden. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass die Signalübermittlung der Gruppe III mGluRs bzw. des mGluR7a ohne das RGS4-Protein nicht korrekt ablaufen kann. Zusammenfassend kann mit den Daten der vorliegenden Arbeit das bereits bestehende Modell eines mGluR7a-Signalkomplexes erweitert werden: Dabei bildet der Rezeptor bereits vor Stimulation durch einen Agonisten einen Komplex mit dem G-Protein und nachgeschalteten Effektoren, die durch den Rezeptor beeinflusst werden. Durch eine solche lokale Organisation funktionell zusammengehöriger Proteine, die die Initiation (wie das G-Protein) und Termination (wie die RGS-Proteine) der Signaltransduktion bewirken, wird eine schnelle und feinregulierte Signalübermittlung gewährleistet.
Ziel: Ziel dieser Studie war es die Verweildauerraten, sowie die komplikationslosen Verweil-dauerraten von rein zahn, rein implantat und kombiniert zahn-implantatgetragenen Galvano-Konusprothesen auf keramischen Primärteilen im Oberkiefer zu untersuchen. Zusätzlich wurden durchgeführte Reparaturen, sowie die Patientenzufriedenheit ausgewertet.
Methode: 83 Patienten, welche im Zeitraum von 1999-2012 am ZZMK eine Galvano-Konusprothese im Oberkiefer erhalten haben wurden retrospektiv nachuntersucht. Die Patientenzufriedenheit wurde anhand eines Fragebogens erhoben, welcher mittels 22 Fragen die Bereiche „Ästhetik“, „Prothesenhalt-bzw. funktion“ und die „Reinigungsmöglichkeit der Prothese“ aus Patientensicht evaluiert. Als Zielereignis der Kaplan-Meier Verweildaueranalyse wurde die erste Reparatur, das Versagen der Prothese, sowie der Pfeiler- bzw. der Implantatverlust definiert. Reparatur- und Nachsorgemaßnahmen wurden deskriptiv erhoben.
Ergebnisse: Es konnten 83 Prothesen und 477 Pfeiler nachuntersucht werden. Der mittlere Beobachtungszeitraum betrug 3,9 Jahre. Die 3- ,5- und 10- Jahres Verweildauerraten der Prothesen lagen bei 98,2%, 95,5% bzw. 70,7%. Die konstruktionsbezogene Pfeilerüberlebensrate bis zum ersten Pfeilerzahnverlust betrug 98,2% nach 3 Jahren, 92,9% nach 5 Jahren und 29,2% nach 10 Jahren. Die häufigste Ursache eines Versagens war der Mehrfachverlust von Pfeilern (n=5). Eine Prothese versagte aufgrund eines Gerüstbruchs (n=1). Es konnte keine signifikanten Unterschiede in der Verweildauerrate bis zum Prothesenverlust, sowie in der komplikationslosen Verweildauerrate zwischen rein zahn, rein implantat und kombiniert zahn-implantagetragenen Prothesen festgestellt werden. Zu den häufigsten Reparaturen zählten Erweiterungen nach Pfeilerverlusten, Verblendreparaturen, Dezementierungen der Primärkronen und Frakturen von Prothesenzähnen. Die häufigste Nachsorgemaßnahme war die Druckstellenentfernung. Die Patientenzufriedenheit mit der Galvano-Konusprothese erwies sich als sehr hoch. Die Ästhetik, der Prothesenhalt und die Reinigungsmöglichkeit des Zahnersatzes wurden unabhängig der Verankerungsart durchgängig positiv bewertet.
Schlussfolgerung: Die Galvano-Konusprothese hat sich als hochwertiger herausnehmbarer Zahnersatz bewährt, welcher hohe Verweildauerraten aufweist und dessen Reparaturanfälligkeit vergleichbar mit anderen Doppelkronenversorgungen ist.
For thousands of years, S. cerevisiae has been employed by humans in brewing and baking. Nowadays, this budding yeast is more than that: it is a well investigated model organism and an established workhorse in biotechnology. S. cerevisiae serves as a production host for various applications such as i) bioethanol production ii) the biosynthesis of hormones including insulin or iii) cannabinoid biosynthesis. Hereby, the robustness of S. cerevisiae and its high tolerances regarding pH and salt concentrations qualifies it for a wide range of industrial applications. Moreover, products of S. cerevisiae are generally recognised as safe (GRAS), enabling diverse biotechnological applications. Various mechanisms for genetic engineering of S. cerevisiae are applicable and the engineering process itself is straightforward since methods are established and widely known. Due to the wide range of industrial applications of S. cerevisiae, this organism is an ideal candidate for applied research and implementation of the recombinant biosynthesis of tocochromanols in this study.
Tocochromanols encompass tocotrienols and tocopherols, which are lipid-soluble compounds that are commonly associated with vitamin E activity. Hereby, α-tocopherol is the most prevalent form, as it is an essential nutrient in the diet of humans and animals. Naturally, tocochromanols are almost exclusively synthesised by photoautotrophic organisms such as plants or cyanobacteria. They consist of an aromatic head group and a polyprenyl side chain which is saturated in tocopherols and 3-fold unsaturated in tocotrienols. The methylation status of the chromanol ring distinguishes α-, β-, γ- and δ-tocochromanol. All forms of tocochromanols represent a group of powerful antioxidants, scavenging reactive oxygen species (ROS) and preventing the propagation of lipid oxidation in lipophilic environments. Recently, attention has been drawn to tocotrienols, due to their benefits in neuroprotection as well as cholesterol-lowering and anti-cancer properties. Consequently, tocochromanols are valuable additives in the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries.
The metabolic engineering strategy of S. cerevisiae to enable tocochromanol biosynthesis was started in a preceding master thesis with the provision of the aromatic moiety, homogentisic acid (HGA), from the aromatic amino acid biosynthesis. Hereby, the upregulation and redirection of the native pathway was essential. Therefore, a strain with an engineered aromatic amino acid pathway for improved 4 hydroxyphenylpyruvate (HPP) production (MRY33) was utilised from Reifenrath and Boles (2018). Furthermore, a heterologous hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) was required to convert HPP into HGA. Thus, several heterologous HPPDs were expressed and characterised regarding their HGA production within the previous study. The best variant originated from Yarrowia lipolytica, YlHPPD, and was integrated into the genome of MRY33. The resulting strain JBY2, produced 435 mg/L HGA in a shake flask fermentation.
This work was started with the genetically highly modified strain JBY2, whose genome already contained a large number of genes artificially expressed behind strong promoters. For further strain development, it was advantageous to maintain a high degree of sequence variability in order to prevent genomic instabilities due to sequence homologies. Thus, 17 artificial promoters (AP1-AP17) were characterised regarding their strength of expression by the yellow fluorescent protein (YFP). These sequences were also part of a patent that was filed during this work (WO2023094429A1).
The key point of this study was the development of a metabolic engineering strategy for the strain JBY2. First, the sufficient supply of the second precursor, the polyprenyl side chain, was investigated. Natively, S. cerevisiae produces the precursor, geranylgeranyl diphosphate (GGPP), from the isopentenyl diphosphate pathway. However, without further engineering, GGPP was barely detectable in JBY2 (< 0.1 mg/L). Thus, engineering of the isopentenyl diphosphate biosynthesis was necessary. The limiting enzyme of the mevalonate pathway was the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR), which is encoded by HMG1. Therefore, a truncation for feedback-resistance and its overexpression by a promoter exchange was performed. Furthermore, the promoter of the gene for the squalene synthase (pERG9) was exchanged by the ergosterol sensitive promoter pERG1 to limit the metabolic flux of the mevalonate pathway into the ergosterol pathway. The native GGPP synthase (BTS1) was another limitation that was observed throughout this study. To overcome this bottleneck, plasmid-based and integrative overexpression of the native BTS1 and a codon optimised BTS1 were investigated. Other strategies to improve GGPP production were the deletion of the gene for the diacylglycerol pyrophosphate phosphatase (DPP1) to prevent excessive dephosphorylation of GGPP to geranylgeraniol (GGOH), and the overexpression of the farnesyl pyrophosphate synthetase, encoded by ERG20. However, the best improvements of the GGPP biosynthesis, inferred through GGOH measurements, were achieved from the screening of several heterologous GGPP synthases in S. cerevisiae. The best performing strain was JBY61 (JBY2, hmg1Δ::pTDH3-HMG1tr[1573–3165], pERG9Δ::pERG1, ChrIV-49293-49345Δ::pTDH3-XdcrtE-tSSA1_LEU2), bearing the heterologous GGPP synthase crtE of Xanthophyllomyces dendrorhous and produced 64.23 mg/L GGOH. Consequently, this engineering strategy improved the GGOH production by a factor of 642 compared to the parent strain JBY2.
Das ebenso schnelle wie unspektakuläre Ende der fast ein halbes Jahrhundert andauernden globalen Auseinandersetzung zwischen den divergierenden Gesellschaftssystemen im Rahmen des Kalten Krieges hat das wissenschaftliche Interesse der Geschichtsforschung zunehmend auf die Phase der Entstehung und Formierung dieses Konflikts gelenkt. Ein wichtiger Teilaspekt in der Formationsphase des Kalten Krieges war die Planung und Durchführung der Aufstellung von Streitkräften in der Bundesrepublik Deutschland und der Deutschen Demokratischen Republik und deren Integration in die antagonistischen Bündnissysteme NATO und Warschauer Pakt, die fast zeitgleich Mitte der 50er Jahre ihren völkerrechtlich verbindlichen Abschluß fanden. ...
This thesis presents a first-of-its-kind phenomenological framework that formally describes the development of acquired epilepsy and the role of the neuro-immune axis in this development. Formulated as a system of nonlinear differential equations, the model describes the interaction of processes such as neuroinflammation, blood- brain barrier disruption, neuronal death, circuit remodeling, and epileptic seizures. The model allows for the simulation of epilepsy development courses caused by a variety of neurological injuries. The simulation results are in agreement with ex- perimental findings from three distinct animal models of epileptogenesis. Simula- tions capture injury-specific temporal patterns of seizure occurrence, neuroinflam- mation, blood-brain barrier leakage, and progression of neuronal death. In addition, the model provides insights into phenomena related to epileptogenesis such as the emergence of paradoxically long time scales of disease development after injury, the dose-dependence of epileptogenesis features on injury severity, and the variability of clinical outcomes in subjects exposed to identical injury. Moreover, the developed framework allows for the simulation of therapeutic interventions, which provides insights into the injury-specificity of prominent intervention strategies. Thus, the model can be used as an in silico tool for the generation of testable predictions, which may aid pre-clinical research for the development of epilepsy treatments.
This research was conducted in the Rwenzori Region of the Western Branch, East African Rift System (EARS). The EARS is a tectonic structure extending over a length of more than 3000 km from the Afar Triple Junction, in Ethiopia, to Lake Malawi in the south. The Western Rift System is a roughly NE to ENE trending sector of the EARS, which runs along the western boundary of Uganda and the neighboring Democratic Republic of Congo (D.R.C). It stretches 2100 km from Nimule, NW on Uganda-Sudan border, extending to Lake Malawi in the SE of Africa. The unusual uplift of the Rwenzori Mountains within an extensional regime and the mechanisms associated with the high frequency of seismic activity in the region was hardly understood and therefore, had remained a subject of contention that needed to be critically addressed in detail. To my knowledge, this was probably the first study to be performed and documented in great depth within the domains of seismic noise variation, seismic anisotropy and b value analyses beneath the Rwenzori Region. After about six years of operation (2006-2012), the seismology group of the RIFTLINK Research Project (www.riftlink.org) acquired a vast amount of high-quality, digital data that were collected using a seismic network of well calibrated seismic equipment. The project was divided into two phases. Phase I, that operated between February 2006 - September 2007, consisted of thirty-two temporary seismic stations, which were selectively spread out in the Rwenzori Region on the Ugandan side, to detect and record extremely weak as well as strong naturally occurring earthquakes. The seismic equipment used included EDL and REFTEK digitizers, which were coupled with Güralp and MARK sensors respectively (REFTEKS: only short-period MARK sensors, EDLs: short-period MARK plus few broadband Güralp Sensors). Exactly 22375 earthquakes were recorded. The data were processed using the SEISAN software package. About 14413 earthquakes were carefully localized using the velocity model of Bram (1975) that implements a Vp=Vs ratio fixed at 1.74. Phase II, that extended between 2009-2012 consisted of thirty-two seismic stations, which were spread out around the Rwenzori Mountains, both on the Ugandan side and the neighboring D.R.C. Only Taurus digitizers that were coupled with Trillium sensors were used in the D.R.C. On the Ugandan side however, both EDL and Taurus digitizers, which were coupled with Trillium and Güralp sensors were used. ...
Panama, a small country between the major continents of North and South America, is one of the lesser studied regions in Central America, but is recognized for its mega-biodiversity. This is particularly true for Eastern Panama, which I am considering as the easternmost portion of the country, covering the area from the Chepo, which is also the beginning of the San Blas mountain range, towards east, up to the Darien Mountain range on the border with its neighboring country Colombia. In the lowland region I visited two physiographic areas: the Isthmian-Atlantic Moist Forests (IAMF) and the Chocó-Darién Moist Forests (CDMF). In the IAMF I worked at the localities of Río Mono, Wacuco, La Moneda, Arretí, Metetí, Filo del Tallo, and Laguna de Matusagaratí. In the CDMF I visited the localities of Cruce de Mono, Cana, Garachiné, Sambú, and Pavarandó. And I have worked in the highlands of Darién (DM), Majé (MM), Jingurudó-Sapo (JSM), Pirre (PM) and San Blas (SSM) in the highlands.
Before my research, 138 reptile and 104 amphibian species had been reported for EP. From 2008 to 2013, I collected specimens to evaluate the diversity of amphibians and reptiles for this region. I applied an integrative approach to evaluate the taxonomy, diversity, biogeography, and conservation of the herpetofauna of EP. I included analyses of morphometrics, molecular genetics (e.g. barcoding), biogeography, bioacoustics (in anurans), hemipenial morphology (in squamates), and ecology. This is the first regional evaluation of the biodiversity in EP applying integrative taxonomy. Aside from morphological and bioacoustic data, my work is based on the barcoding of 608 specimens, from which I obtained 16S mtDNA for 486 specimens and COI mtDNA for 455. In total I have got sequences for 69.2 %of the amphibian and 48.6 % of the reptile species present in EP. For the morphological analyses, I compared 1597 specimens, including my samples complemented by specimens obtained from various museums. The bioacoustic data were obtained from the analysis of 1504 calls of 27 species of frogs. Based on specimens collected in EP and according to external morphology, I could identify 65 species of amphibians and 72 reptiles, but after applying an integrative approach these numbers increased to 79 amphibians and 88 reptiles described species within my collected specimens. Additionally, I uncovered 33 taxonomic units that could not be assigned to any described species until now, 22 of them represent confirmed candidate species (CCS), and 11 were classified as Unconfirmed candidate species (UCS). Thus, increasing the known species of amphibian by 19.4 % and of reptiles by 4.8 %. Currently, there are 145 reptiles and 129 amphibians known to occur in EP. Based on my results, I have initiated several projects to solve taxonomic uncertanties, including the species of the genera Bolitoglossa, Diasporus, Dactyloa, Ecnomiohyla, Lepidoblepharis, and the taxonomic status of the species Pristimantis caryophyllaceus and Norops tropidogaster.
Out of the 22 CCS I found, I described nine species new to science with type locality in EP, six amphibians and four reptiles. Among these is a new species of Bolitoglossa described from Cerro Chucantí, Cordillera de Majé, Provincia de Darién, Panama. Additionally, I include comments on the other species of congeneric salamanders known to occur in the region. Among the tink frogs, only Diasporus quidditus was known to occur in EP. During my field work I collected six additional species of this genus, four of which are new to science, plus two species new for this region.
I also described one new species of Dactyloa (giant anole lizards) related to the former D. chocorum. I synonymized D. chocorum with D. purpurescens, and included information about the other species of the group from EP. The new species of Dactyloa resembles D. ibanezi, D. limon, and D. purpurescens in external morphology but differs from these species in dewlap coloration, dorsal color pattern, morphometrics, and scalation. I discovered one species of the genus Ecnomiohyla, which exhibits significant genetic distances (16S mtDNA gene) and morphological differences to all known Ecnomiohyla species. Along with the description of the new Ecnomiohyla species, I provide detailed comparisons of morphological and molecular characters of almost all members of the genus in Lower Central America, as well as an identification key for the entire genus. Two new species of the genus Lepidoblepharis from EP were described. In the corresponding work, I include an analysis of Lepidoblepharis spp. in the region, including phylogeography and taxonomy. One of the new species, Lepidoblepharis emberawoundule, can be differentiated from most species in the genus by its small size and its low number of lamellae under the fourth toe and finger. The other species described from EP, Lepidoblepharis rufigularis, can be differentiated from all species in the genus by its small size and the reddish throat in males.
Antibiotic resistance of pathogenic bacteria is a major worldwide problem. Bacteria can resist antibiotics by active efflux due to multidrug efflux pumps. The focus of this study has been the mycobacterial multidrug transporter TBsmr because it belongs to the small multidrug resistance (SMR) family whose members are a paradigm to study multidrug efflux due to their small size. SMR proteins are typically 11-12 kDa in size and have a four-transmembrane helix topology. They bind cationic, lipophilic antibiotics such as ethidium bromide (EtBr) and TPP+, and transport them across the membrane in exchange for protons. To understand the molecular mechanism of multidrug resistance, we have to gain information about the structure and function of these proteins. The research described in this thesis aimed to deduce details about the topology, transport cycle and key residues of TBsmr using biophysical techniques. Solid-state NMR (ssNMR) can provide detailed insight into structural organization and dynamical properties of these systems. However, a major bottleneck is the preparation of mg amounts of isotope labeled protein. In case of proteoliposomes, the problem is compounded by the presence of lipids which have to fit into the small active volume of the ssNMR rotor. In Chapter 3, an enhanced protein preparation is described which yields large amounts of TBsmr reconstituted in a native lipid environment suitable for further functional and structual studies. The achieved high protein-to-lipid ratios made a further characterization by ssNMR feasible. The transport activity and oligomeric state of the reconstituted protein in different types of lipid was studied as shown in Chapter 4. The exact oligomeric state of native SMR proteins is still uncertain but a number of biochemical and biophysical studies in detergent suggest that the minimal functional unit capable of binding substrate is a dimer. However, binding assays are not ideal since a protein may bind substrate without completing the transport cycle which can only be shown for reconstituted protein in transport assays.By combining functional data of a TPP+ transport assay with information about theoligomeric state of reconstituted TBsmr obtained by freeze-fracture electron microscopy, it could be shown that lipids affect the function and the oligomeric state of the protein, and that the TBsmr dimer is the minimal functional unit necessary for transport. The transport cycle must involve various conformational states of the protein needed for substrate binding, translocation and release. A fluorescent substrate will therefore experience a significant change of environment while being transported, which influences its fluorescence properties. Thus the substrate itself can report intermediate states that form during the transport cycle. In Chapter 5, the existence of such a substrate-transporter complex for the TBsmr and its substrate EtBr could be shown. The pH gradient needed for antiport has been generated by co-reconstituting TBsmr with bacteriorhodopsin. The measurements have shown the formation of a pH-dependant, transient substrate-protein complex between binding and release of EtBr. This state was further characterized by determining the Kd, by inhibiting EtBr transport through titration with non-fluorescent substrate and by fluorescence anisotropy measurements. The findings support a model with a single occluded intermediate state in which the substrate is highly immobile. Liquid-state NMR is a useful tool to monitor protein-ligand interactions by chemical shift mapping and thus identify and characterize important residues in the protein which are involved in substrate binding. In agreement with previous studies (Krueger-Koplin et al., 2004), the detergent LPPG was found to be highly suitable for liquid-state NMR studies of the membrane protein TBsmr and 42% of the residues could be assigned, as reported in Chapter 6. However, no specific interactions with EtBr were found. This observation was confirmed by LILBID mass spectrometry which showed that TBsmr was predominantly in the non-functional monomeric state. Functional protein was prepared in proteoliposomes which can be investigated by solidstate NMR (Chapter 7). Besides the essential E13, the aromatic residues W63, Y40, and Y60 have been shown to be directly involved in drug binding and transport. Different isotope labeling strategies were evaluated to improve the quality of the NMR spectra to identify and characterize these key residues. In a single tryptophan mutant of reconstituted TBsmr W30A, the binding of ethidium bromide could be detected by 13C solid-state NMR. The measurements have revealed two populations of the conserved W63 residue with distinct backbone structures in the presence of substrate. There is a controversy about the parallel or anti-parallel arrangement of the protomers in the EmrE dimer (Schuldiner, 2007) but this structural asymmetry is consistent with both a parallel and anti-parallel topology.
The current work investigated the association of trait anxiety and the neural efficiency of cognitive processing for affectively neutral (not threat-related) information. In a sample of 46 healthy volunteers, three fMRI experiments were conducted to test the prediction derived from attentional control theory (Eysenck et al., 2007) that high as compared to low trait-anxious individuals expend more neural effort on tasks requiring the top-down control of attention to reach a given level of performance. In a colour-word Stroop task requiring the inhibition of irrelevant stimulus information and associated responses as well as in a working-memorymanipulation task requiring the shifting of attention between items in working memory, trait anxiety (as measured with the State-Trait Anxiety Inventory; Spielberger et al., 1970) was positively associated with task-related increases in the activation of two adjacent regions in the right dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The finding that along with a stronger activation of this brain region commonly implicated in top-down control processes, the high-anxious subjects showed equal (working memory manipulation) or worse (Stroop) performance when compared to low-anxious subjects, does support the assumption that processing is less efficient in the high anxious. However, in contrast to the predictions, trait anxiety did not show a significant association with task-related brain activation in a task-switching paradigm requiring shifting between task sets. It is discussed how different attentional control demands of the task may account for differences in the effects of trait anxiety on overt behavioural performance and underlying neural processes. In addition to DLPFC activation, trait anxiety modulated the functional connectivity of distributed regions involved in processing of the Stroop and the working-memory-manipulation task. It is discussed how the observed differences in regional DLPFC activation and network connectivity relate to each other. A possible interpretation suggests that activation increases in the DLPFC reflect an attempt to compensate for suboptimal connectivity by investing more effort in prefrontally supported control processes. Overall, the current work shows an association of trait anxiety with the neural efficiency of cognitive processing in affectively neutral tasks involving attentional control. Furthermore, it suggests that investigations of neural efficiency should take into account difference in functional integration in addition to regional activation.
Entwicklung und Inbetriebnahme zweier supraleitender 217 MHz CH-Strukturen für das HELIAC-Projekt
(2019)
Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden zwei baugleiche CH-Strukturen für das im Bau befindliche HELIAC-Projekt (HELmholtz LInear ACcelerator) entwickelt und während der Produktion bis hin zu den finalen Kalttests bei 4.2 K begleitet. Zusammen mit der CH-Struktur des Demonstrator-Projektes ermöglichen sie die vollständige Inbetriebnahme und den ersten Strahltest des ersten Kryomoduls des HELIAC's, welcher aus vier Kryomodulen mit insgesamt 12 CH-Strukturen besteht. Im Vergleich zu bisherigen CH-Strukturen wurde das Design der Kavitäten im Rahmen dieser Dissertation grundlegend überarbeitet und optimiert. Durch die Entfernung der Girder und die konisch geformten Endkappen konnte die Stabilität der neuen CH-Strukturen deutlich erhöht werden, sodass die Drucksensitivität im Vergleich zur ersten CH-Kavität des Demonstrator-Projektes um ca. 80% reduziert werden konnte. Durch die nach außen gezogenen Lamellen der dynamischen Tuner konnte die mechanische Spannung sowie die benötigte Anzahl an Lamellen und damit das Risiko für das Auftreten von Multipacting reduziert werden. Das verringerte Risiko für Multipacting durch die entsprechenden Optimierungen der Kavitäten konnte durch die dauerhafte Überwindung aller Multipacting-Barrieren in den späteren Messungen verifiziert werden. Die Optimierung beider Kavitäten erfolgte dabei mit Hilfe der Simulationsprogramme CST Studio Suite und Ansys Workbench.
Beide Kavitäten wurden von der Firma Research Instruments (RI) gefertigt und während der gesamten Konstruktion durch diverse Zwischenmessungen überwacht. Nach jedem einzelnen Produktionsschritt wurden alle Einflüsse auf die Resonanzfrequenz so präzise ermittelt, dass die Zielfrequenz bei 4.2 K auf mehr als 1‰ genau erreicht werden konnte. Sowohl während der Zwischenmessungen als auch während den finalen Messungen bei 4.2 K wurden automatisierte Aufzeichnungsroutinen verwendet, welche eine sekundengenaue Auslese der Messdaten und damit eine hohe Messgenauigkeit ermöglichten. Im Hinblick auf die Komplexität der CH-Strukturen sind die geringen Abweichungen von der Zielfrequenz der direkte Beweis dafür, wie erfolgreich und präzise die Auswertungen und daraus folgenden Abschätzungen der einzelnen Zwischenmessungen waren. Insgesamt konnten bis auf die mechanischen Eigenmoden alle Ergebnisse der Simulationen durch entsprechende Messungen in guter Näherung verifiziert werden. In jeder Kavität wurden zwei dynamische Tuner verbaut, welche statische und dynamische Frequenzabweichungen im späteren Betrieb ausgleichen können. Die dynamischen Tuner wurden hinsichtlich ihrer mechanischen Stabilität und der erzeugbaren Frequenzänderung sowie ihrer mechanischen Eigenfrequenzen ausführlich mit Hilfe der Simulationsprogramme CST Studio Suite und Ansys Workbench untersucht und optimiert. Um die Ergebnisse der Simulationen zu überprüfen wurden ein eigens dafür entworfener und in der Werkstatt des Instituts für Angewandte Physik gefertigter Messaufbau verwendet, welcher es ermöglichte alle entscheidenden Eigenschaften der dynamischen Tuner präzise zu vermessen. Insgesamt stellen die ausführlichen Messungen mit Hilfe des entworfenen Aufbaus die bisher umfassendsten Messungen dynamischer Balgtuner innerhalb supraleitender CH-Strukturen dar und zeigen, mit welchen Abweichungen zwischen Simulationen und Messungen bei zukünftigen Kavitäten zu rechnen ist. Auch die Feldverteilung entlang der Strahlachse wurde während der Produktion der Kavitäten mit Hilfe der Störkörpermessmethode überprüft. Die dadurch ermittelten Werte stimmten mit einer maximalen Diskrepanz von 9% sehr gut mit den Simulationen überein.
Um eine möglichst gute Oberflächenqualität zu garantieren wurden an der Innenfläche beider Strukturen mindestens 200µm mit einer Mischung aus Fluss-, Salpeter und Phosphorsäure in mehreren Schritten abgetragen. Durch das Aufteilen der Behandlung in einzelne Schritte konnte der Einfluss der Oberflächenbehandlung auf die Resonanzfrequenz besser abgeschätzt und vorausgesehen werden. Dies führte, zusammen mit den Messungen zur Bestimmung der Drucksensitivität und der thermischen Kontraktion der Kavität beim Abkühlen, zu der hohen Übereinstimmung der gemessenen finalen Resonanzfrequenz mit der Zielfrequenz.
Die abschließenden Kalttests der beiden Kavitäten, ohne Heliummantel, wurden am Institut für Angewandte Physik der Johann Wolfgang Goethe Universität in einem vertikalen Bad-Kryostaten durchgeführt. Die erste CH-Struktur konnte erfolgreich bis zu einem maximalen Feldgradienten von 9.2 MV/m getestet werden, was einer effektiven Spannung von 3.37 MV entspricht. Die unbelastete Güte fiel dabei von anfangs 1.08 ∙ 109 auf 2.6 ∙ 108 ab. Die Vorgaben des HELIAC-Projektes liegen bei einem Beschleunigungsgradienten von 5.5 MV/m mit einer unbelasteten Güte von mindestens 3 ∙ 108. Diese Werte wurden von der ersten Kavität deutlich übertroffen, sodass sie für den Betrieb innerhalb des ersten Kryomoduls uneingeschränkt verwendet werden kann.
Bei der zweiten Kavität trat beim Abkühlen auf 4.2 K ein Vakuumleck auf, welches unter Raumtemperatur nicht detektierbar war. Aufgrund der schlechten Vakuumbedingungen innerhalb der Kavität konnten somit keine Messungen hinsichtlich der Leistungsfähigkeit durchgeführt werden, solange das Kaltleck vorhanden war. Ein erneuter Kalttest der Kavität nach Beseitigung des Lecks konnte zeitlich nicht mehr im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt werden und ist aus diesem Grund Gegenstand nachfolgender Untersuchungen.
Insgesamt stellen die Entwicklungen, Untersuchungen und Messungen im Rahmen der hier vorgestellten Dissertation einen entscheidenden Schritt zur Inbetriebnahme des ersten Kryomoduls des HELIAC's sowie der Entwicklung weiterer CH-Kavitäten dar. Das überarbeitete Design der CH-Strukturen hat sich als erfolgreich erwiesen, weswegen es als Ausgangspunkt für die Entwicklung aller nachfolgenden CH-Strukturen des HELIAC, bis hin zur Fertigstellung des kompletten Beschleunigers, verwendet wird.
Autophagy, together with the ubiquitin-proteasome system, is the main quality control pathway responsible for maintaining cell homeostasis. There are several types of autophagy distinguished by cargo selectivity and means of induction. This thesis focuses on macroautophagy, hereafter autophagy, where a double-layered membrane is formed originating from the endoplasmatic reticulum (ER) engulfing cargo selectively or unselectively. Subsequently, a vesicle forms around the cargo, an autophagosome, and eventually fuses with the lysosome leading to degradation of the vesicle content and release of the cargo “building blocks”. Basal autophagy continuously occurs, unselectively engulfing a portion of the cytoplasm. However, autophagy can also be induced by stress such as starvation, protein aggregation, damaged organelles, intracellular pathogens etc. In this case, the cargo is selectively targeted, and the fate of the autophagosome is the same as in basal autophagy. In recent years, interest in identifying mechanisms of autophagy regulation has risen due to its importance in neurodegenerative diseases and cancer. Given the complexity of the process, its execution is tightly regulated from initiation, autophagosome formation, expansion, closure, and finally fusion with the lysosome. Each of the steps involves different protein complexes, whose timely activity is orchestrated by post-translational modifications. One of them is ubiquitination. Ubiquitin is a small, 76-amino acid protein conjugated in a 3-step reaction to other proteins, in a reversible manner, meaning undone by deubiquitinases. Originally described as a degradation signal targeting proteins to the proteasome, today it is known it has various additional non-proteolytic functions, such as regulating a protein’s activity, localization, or interaction partners. The role of ubiquitin in autophagy has already been shown. However, given the reversibility and fine-tuning of the ubiquitin signal, many expected regulators remain unidentified. This work aimed to identify novel deubiquitinating enzymes that regulate autophagy. We identified ubiquitin-specific protease 11 (USP11) as a novel, negative regulator of autophagy. Loss of USP11 leads to an increase in autophagic flux, whereas overexpression of USP11 attenuates it. Moreover, this observation was reproducible in model organism Caenorhabditis elegans, emphasizing the importance of USP11 in autophagy regulation. To identify the mechanism of USP11-dependent autophagy regulation, we performed a USP11 interactome screen after 4 hour Torin1 treatment and identified a plethora of autophagy-related proteins. Following the most prominent hits, we have investigated versatile ways in which USP11 regulates autophagy. USP11 interacts with the PI3KC3 complex, the role of which is phosphorylating lipids of the ER, thereby initiating the formation of the autophagosomal membrane. Phosphorylated lipids serve as a recruitment signal for downstream effector proteins necessary for the membrane expansion. The core components of the complex are VPS34, the lipid kinase, ATG14, the protein responsible for targeting the complex to the ER, VPS15, a pseudokinase with a scaffolding role, Beclin1, a regulatory subunit, and NRBF2, the dimer-inducing subunit. We have found USP11 interacts with the complex and, based on its activity, USP11 influences post-translational status of all the aforementioned subunits, except for ATG14. Moreover, we have found that loss of USP11 leads to an increase in NRBF2 levels, whereas it does not change the levels of the other proteins. Given that the dimerization of the complex leads to an increase in complex activity, we investigated if the complex is more tightly formed in the absence of USP11, and if it is more active. We have found both to be the case. Although the exact mechanism of USP11-dependent PI3KC3 complex regulation remains to be identified, we found that loss of USP11 stimulates the complex formation and activity, likely contributing to the general effect of USP11 on autophagy flux. Additionally, we found that USP11 modulates levels of mTOR, the most upstream kinase in autophagy initiation steps and general multifaceted metabolism regulator. Loss of USP11 led to downregulation of mTOR levels, suggesting USP11 may rescue mTOR from proteasome-mediated degradation. Furthermore, we found mTOR to be differentially modified depending on the activity of USP11. However, it remains to be shown if USP11-dependent mTOR regulation contributes to the observed autophagy phenotype. Taken together, USP11 is a novel, versatile, negative regulator of autophagy, and an important addition to our knowledge on the regulation of autophagy by the ubiquitin system.
Ionenstrahlen werden in der Grundlagenforschung, in der Industrie und der Medizin verwendet. Um die Teilchen für die jeweiligen Anforderungen nutzbar zu machen, werden sie mit Ionenbeschleunigern je nach Anwendung auf eine bestimmte Energie beschleunigt. Eine Beschleunigeranlage besteht dabei aus einer Reihe von unterschiedlichen Elementen: Ionenquellen, Linearbeschleuniger, Kreisbeschleuniger, Fokussierelemente, Diagnosesysteme usw. In jeder dieser Kategorien gibt es wiederum verschiedene Realisierungsmöglichkeiten, je nach Anforderung des jeweiligen Abschnitts und der gesamten Anlage. Im Bereich der Linearbeschleuniger ist als Bindeglied zwischen Ionenquelle/Niederenergiebereich und Nachfolgebeschleuniger der Radiofrequenzquadrupol (RFQ) weit verbreitet. Dieser kann den aus der Quelle kommenden Gleichstromstrahl in Teilchenpakete (Bunche) formen und diese gleichzeitig auf die nächste Beschleunigerstufe angepasst vorbeschleunigen. Desweiteren wird der Teilchenstrahl innerhalb des RFQ kontinuierlich fokussiert, wodurch insbesondere bei diesen niedrigen Energien Strahlverluste minimiert werden. Bei hohem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis wird für schwere Ionen eine niedrige Resonanzfrequenz von deutlich unter 100 MHz benötigt. Dies führt zu längeren Beschleunigungszellen entlang der Elektroden, womit durch eine bessere Fokussierung auch höhere Strahlströme beschleunigt werden können. Im Allgemeinen bedeutet eine niedrigere Resonanzfrequenz aber auch einen größeren Querschnitt der Resonanzstruktur sowie einen längeren Beschleuniger. Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung unterschiedlicher RFQ-Strukturen für niedrige Frequenzen, wie sie beispielsweise im Linearbeschleunigerbereich der Gesellschaft für Schwerionenforschung (GSI) in Darmstadt Anwendung finden. Zunächst wird die Beschleunigeranlage des GSI Helmholtzzentrums für Schwerionenforschung in Darmstadt und dessen zur Zeit im Bau befindliche Erweiterung FAIR (Facility for Antiproton and Ion Research) kurz vorgestellt. Teil dieser Anlage ist der Hochstrominjektor genannte Anfangsbeschleuniger, der wiederum aus einem RFQ und zwei nachfolgenden Driftröhrenbeschleunigern besteht. Dieser Hochstrominjektor dient als Referenz für die vorliegende Arbeit. In Kapitel 3 wird kurz auf Linearbeschleuniger im Allgemeinen und auf das Grundprinzip und die Eigenschaften eines RFQ näher eingegangen. Anschließend werden verschiedene RFQ-Strukturkonzepte vorgestellt und die Strahldynamik in einem RFQ sowie charakteristische Resonatorgrößen beschrieben. Ausgangspunkt ist der aktuelle RFQ des Hochstrominjektors (Kapitel 4). Dieser IH-RFQ mit einer Betriebsfrequenz von 36 MHz ist seit vielen Jahren in Betrieb und soll für eine verbesserte Effizienz und Betriebssicherheit ein Upgrade erfahren. Dazu wurden Simulationen sowohl der bestehenden Struktur als auch mit Modifikationen durchgeführt und diese miteinander verglichen. Zur Entwicklung eines kompakten Resonators werden in Kapitel 5 verschiedene Splitring-RFQ-Modelle als Alternative zur IH-Struktur mittels Simulationen untersucht. Diese wurden für eine niedrigere Frequenz von 27 MHz entworfen, was der Frequenz des ursprünglichen Wideröe-Beschleunigers (Vorgänger des Hochstrominjektors HSI) entspricht und ebenso wie die 36 MHz des IH-RFQ eine Subharmonische der 108 MHz des Folgebeschleunigers ist. Abschließend wurde noch eine neue RFQ-Struktur, der Splitframe-RFQ, entworfen und untersucht. Auch dieser wurde für eine Frequenz von 27 MHz ausgelegt. Die Ergebnisse dieser Entwicklung, die eine Mischung aus einem Splitring- und einem klassischen 4-Rod-RFQ darstellt, befinden sich in Kapitel 6. Alle Feldsimulationen wurden mit dem Programm Microwave Studio von CST durchgeführt. Zusammenfassend werden die verschiedenen Konzepte anhand der charakteristischen Resonatorgrößen verglichen und ein Ausblick auf weiterführende Arbeiten gegeben.
Synaptopodin is the founding member of a family of actin-associated proline-rich proteins. It is present in a subset of telencephalic dendritic spines, where it is tightly associated with the dendritic spine apparatus, a putative calcium store. Synaptopodin-deficient mice lack the spine apparatus and show deficits in long-term potentiation and spatial memory. Thus, synaptopodin appears to play a role in synaptic plasticity. In the present thesis, three major questions were addressed: (1) What is the distribution of synaptopodin and the spine apparatus in identified hippocampal neurons? (2) Is the distribution of synaptopodin affected by denervation? (3) Is synaptopodin involved in the regulation of denervation-induced spine loss? The major findings of this thesis are: (1) Immunohistochemistry in the hippocampus of wildtype and EGFP-transgenic mice revealed significant layer-specific differences in the prevalence of synaptopodin at the level of individual neurons. (2) Light and electron microscopic analysis also revealed the presence of synaptopodin in axon initial segments of cortical and hippocampal principal neurons. There, it was found to be an essential component of the cisternal organelle, a putative axonal homologue of the dendritic spine apparatus. (3) Immunohistochemistry in the rat fascia dentata before and following entorhinal deafferentation revealed changes in synaptopodin expression in denervated and non-denervated layers of the hippocampus, suggesting that the distribution of synaptopodin in hippocampal neurons is regulated by presynaptic signals. (4) The dynamics of denervation-induced spine plasticity were studied in vitro using confocal live imaging of organotypic entorhino-hippocampal slice cultures. Whereas spines were remarkably stable under control conditions, spine loss and spine formation were seen following denervation. No significant differences were observed between cultures from wildtype and synaptopodin-deficient mice, suggesting that synaptopodin is not involved in lesion-induced spine plasticity. (5) Finally, a set of transgenic mice expressing fluorescently tagged synaptopodin were generated to facilitate future experiments on the dynamics and function of synaptopodin. In summary, this thesis presents novel findings on (1) the subcellular distribution of synaptopodin in spines and the axon initial segment, (2) the molecular composition of the cisternal organelle, and (3) the dynamics of spines and the spine apparatus organelle following deafferentation in vivo and in vitro.
Der Einfluss von Chemotherapie bei malignen pädiatrischen Erkrankungen auf kindliche Impftiter
(2021)
Hintergrund: Chemotherapie hat nicht nur einen Einfluss auf die Krebszellen, sondern auch auf das Immunsystem der Behandelten. In unserer Studie untersuchten wir den Impftiterverlust impfpräventablen Erkrankungen (Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster) bei Kindern und Jugendlichen, welche eine chemotherapeutische Behandlung wegen einer malignen Erkrankung erhielten.
Methoden: Eingeschlossen in die retrospektive Studie wurden Kinder, Jugendliche und junge Erwachsene im Alter bis zum 21. Lebensjahr, welche zwischen 2001 und 2010 an der Kinderklinik für Hämatologie und Onkologie der Universitätsklinik Frankfurt am Main therapiert wurden. Es erfolgte die Analyse von Antikörper-Titer für Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster zum Diagnosezeitpunkt und erneut bis zu 12 Monate nach Therapieende.
Ergebnis: Insgesamt konnten 195 Kinder und Jugendliche in die Studie eingeschlossen werden. 122 Probanden waren männlich, 73 weiblich. Die größte Patientengruppe war an ALL erkrankt (80 Patienten). Die übrigen Patienten verteilten sich auf 15 Patienten mit AML, 18 Patienten mit NHL, 22 Patienten mit Hodgkin Lymphom. 60 Patienten waren an soliden Tumoren erkrankt. Insgesamt haben 27%, 47%, 19% und 17% der Kinder und Jugendlichen ihren Impfschutz gegen Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster verloren. Hierbei zeigte sich eine Altersabhängigkeit. In der Auswertung zeigte sich bei jüngeren Kindern unter 7 Jahren häufiger ein Titerverlust als bei den älteren Kindern und Jugendlichen. Auch an ALL-erkrankte und behandelte Kinder und Jugendliche verloren häufiger ihren Impfschutz als die Patienten mit anderen untersuchten Krebserkrankungen (AML, NHL, M. Hodgkin, solide Tumore).
Fazit: Die Daten unserer retrospektiven Studie zeigen, dass eine signifikante Anzahl von Kindern und Jugendlichen durch eine chemotherapeutischen Behandlung ihre vorbestehenden Impftiter gegen impfpräventable Erkrankungen wie Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster verlieren. Dieser Verlust zeigt sich häufiger bei jüngeren Patienten und ALL-Patienten. Unsere Daten unterstreichen daher, wie wichtig es ist, Kinder und Jugendliche nach Beendigung der Chemotherapie erneut zu impfen, um einen neuen ausreichenden Impfschutz gegen Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster zu erhalten.
Das Feld der Hochenergie-Schwerionenforschung hat sich der Untersuchung des Quark-Gluon-Plasmas (QGP) gewidmet. Ein QGP ist ein sehr heißer und dichter Materiezustand, der kurz nach dem Urknall für einige Mikrosekunden das Universum füllte. Unter diesen extremen Bedingungen sind die fundamentalen Bausteine der Materie, die Quarks und Gluonen, quasi frei, also nicht in Hadronen eingeschlossen, wie es unter normalen Bedingungen der Fall ist. Hadronen sind Teilchen, die aus Quarks und Gluonen bestehen. Die bekanntesten Hadronen sind Protonen und Neutronen, die Bestandteile von Atomkernen, aus denen, zusammen mit Elektronen, die gesamte bekannte Materie aufgebaut ist.
Um ein QGP im Labor zu erzeugen, lässt man ultrarelativistische schwere Ionen, wie zum Beispiel Pb-208-Kerne, aufeinander prallen. Dies geschieht am CERN, dem größten Kernforschungszentrum der Welt. Der Teilchenbeschleuniger, welcher Protonen und Pb-Kerne beschleunigt und zur Kollision bringt, heißt Large Hadron Collider (LHC) und ist mit 27 km Umfang der größte der Welt. Bei einer einzigen Pb-Pb Kollision am LHC werden mehrere Tausend Teilchen und Antiteilchen erzeugt. Das dedizierte Experiment zur Untersuchung von Schwerionenkollisionen am LHC ist ALICE. ALICE ist mit mehreren Teilchendetektoren ausgerüstet, die es ermöglichen, tausende Teilchen gleichzeitig zu messen und zu identifizieren.
Unter den produzierten Teilchen befinden sich auch leichte Atomkerne, wenngleich diese nur sehr selten erzeugt werden. Die Anzahl der produzierten Teilchen pro Teilchensorte hängt nämlich von deren Masse ab. In Pb-Pb Kollisionen am LHC sinkt die Anzahl der produzierten (Anti)kerne exponentiell um einen Faktor 1/330 bei Hinzufügen jedes weiteren Nukleons. Die Menge an produzierten Teilchen pro Spezies stellt Informationen über den Produktionsmechanismus beim Übergang vom QGP zum Hadrongas zur Verfügung. Hierbei sind leichte (Anti)kerne von besonderem Interesse, da sie vergleichsweise groß sind und ihre Bindungsenergie bis zu zwei Größenordnungen kleiner ist als die Temperaturen, die bei der Erzeugung der Hadronen vorherrschen. Es ist bis heute noch nicht verstanden, wie leichte (Anti)kerne bei diesen Bedingungen erzeugt werden und überleben können.
Für diese Arbeit wurden ca. 270 Millionen Pb-Pb Kollisionen bei einer Schwerpunktsenergie von 5,02 TeV, die von ALICE im November 2018 aufgezeichnet wurden, analysiert. Es wurde die Produktion von (Anti)triton und (Anti)alpha untersucht. Wegen ihrer großen Masse werden beide Kerne sehr selten produziert, bei weitem nicht bei jeder Kollision. Antialpha ist der schwerste Antikern, der jemals gemessen wurde. Aufgrund dieser Seltenheit ist die Größe des zur Verfügung stehenden Datensatzes entscheidend. Es war möglich, das erste jemals gemessene Antialpha-Transversalimpulsspektrum zu extrahieren. Auch für (Anti)triton und Alpha wurden Transversalimpulsspektren bestimmt.
Die Ergebnisse wurden mit theoretischen Modellen und anderen ALICE Messungen verglichen.
Am Ende wird in einem Ausblick auf das kürzlich durchgeführte Upgrade der ALICE Spurendriftkammer (TPC) eingegangen. In der nächsten, bald startenden Datennahmeperiode wird der LHC seine Kollisionsrate erheblich erhöhen, was es ermöglichen wird, mehr als 100 mal so viele Daten wie bisher aufzuzeichnen. Hiervon werden die in dieser Arbeit beschriebenen (Anti)triton- und (Anti)alpha-Analysen beachtlich profitieren. Um mit den erheblich höheren Kollisionsraten zurecht zu kommen, mussten einige Detektoren, unter anderem die TPC, maßgeblich erneuert werden. In den ersten beiden Datennahmeperioden wurde die TPC mit Vieldrahtproportionalkammern betrieben. Diese sind allerdings viel zu langsam für die geplanten Kollisionsraten. Deshalb wurden sie im Jahr 2019, während einer langen Betriebspause des LHC, durch Quadrupel-GEM (Gas Electron Multiplier) Folien basierte Auslesekammern ersetzt, welche eine kontinuierliche Auslese der TPC ermöglichen. Da es sich um die erste jemals gebaute GEM TPC im Großformat handelt, war ein umfangreiches Forschungs- und Entwicklungs- (F&E) Programm notwendig, um die GEM Auslesekammern zu charakterisieren und zu testen. Im Rahmen dieses F&E Programms wurden am Anfang dieser Promotion systematische Messungen an einer kleinen Test TPC mit Quadrupel-GEM Auslese, die extra zu diesem Zweck gebaut worden war, durchgeführt. Hierbei wurde der Rückfluss der bei der Gasverstärkung erzeugten Ionen in das Driftvolumen der TPC und die Energieauflösung mit verschiedenen GEM Folien Typen und unterschiedlicher Anordnung gemessen. Das Ziel war, möglichst kleine Ionenrückflüsse bei möglichst guter Energieauflösung zu erreichen. Hierbei musste ein Kompromiss gefunden werden, da die beiden Größen sich gegenläufig verhalten. Es war jedoch möglich, mit mehreren GEM Konfigurationen Spannungseinstellungen zu identifizieren, bei denen beide Größen den gewünschten Anforderungen entsprachen.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von NCarboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch FormylmethanofuranDehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D ProtonenaustauschSpektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivoCO 2 Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 Methylentetrahydromethanopterin (Methylen H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 bildender MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über TransferNOEMessungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die ReSeitenStereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von MethylenH 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADPabhängiger MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMRspektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP ReSeitenspezifisch in Bezug auf MethylenH 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die ReSeite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu SHydroxymethylglutathion wurde mit EXSYMessungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSYMessungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion abhängiges FormaldehydaktivierendesEnzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der UbichinonBindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMRMethode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 CHSQCSpektren unter Verwendung von HRMASNMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMRspektroskopischen Methoden Protein LigandWechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
... Die drei Unternehmen, aus deren Geschichte hier erzählt wird, Bayer, Hoechst und Schering, waren bis zum Ende des Zweiten Weltkrieges Chemiekonzerne, die u.a. auch Arzneimittel herstellten und verkauften. Als erste Firma hat sich Schering nach dem Zweiten Weltkrieg weitgehend auf Pharmazeutika konzentriert und sich wie Hoechst am Ende des Jahrhunderts ganz von seinen Chemieaktivitäten getrennt. Allein Bayer bietet weiterhin eine breite Palette von chemischen Produkten an. ...
The power to dissociate : molecular function of the twin-ATPase ABCE1 in archaeal ribosome recycling
(2010)
Hepatitis B caused by infection with the hepatitis B virus (HBV) still ranks among the most challenging infectious diseases of our time. Despite the availability of an effective prophylactic vaccine, 240 million people worldwide are estimated to be chronically infected with HBV and are at risk of developing life-threatening liver diseases, including cirrhosis and liver cancer. The underlying pathogenic mechanisms of HBV-associated liver diseases are only incompletely understood. It is widely accepted that liver pathology results from long-term immune-mediated liver injury and inflammation as a consequence of inefficient viral elimination. This injury can be naturally compensated by liver regeneration. However, chronic liver damage and permanent inflammation debilitates the regenerative capacity of the liver and fosters fibrosis as well as accumulation of chromosomal aberrations, which both contribute to cirrhosis and liver cancer. Liver regeneration requires the presence of the redox-sensitive transcription factor Nrf2 and intact insulin receptor signaling. A lack of Nrf2 causes increased intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) that inactivate insulin receptor signaling and induce insulin resistance. Interestingly, HBV was observed to activate Nrf2 and the expression of Nrf2-regulated genes. This argues against an inhibitory effect of HBV on insulin receptor signaling by increased ROS levels. However, chronic HBV infection is associated with dysregulation of hepatocyte proliferation and retardation of liver regeneration. Hence, the aim of this thesis was to investigate the influence of HBV on the process of liver regeneration with respect to the insulin receptor signaling pathway. After short-term carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver damage, HBV transgenic mice present prolonged liver damage and impaired liver regeneration as reflected by reduced hepatocyte proliferation and increased apoptosis. Impaired hepatocyte proliferation in HBV transgenic mice correlates with diminished activation of the insulin receptor. It was further observed in vitro that the activation of Nrf2 by HBV induces increased levels of the insulin receptor mRNA and protein in HBV-expressing cells. Strikingly, stably HBV-expressing cells as well as primary mouse hepatocytes from HBV transgenic mice bind less insulin due to reduced amounts of insulin receptor on the cell surface. This is caused by intracellular retention of the insulin receptor in HBV-expressing cells as a consequence of increased amounts of the cellular trafficking factor α-taxilin. The reduced amounts of insulin receptor on the cell surface impair insulin sensitivity in HBV-expressing cells and inactivate downstream signaling cascades that initiate insulin-dependent gene expression and glucose uptake. As a consequence of impaired hepatocyte proliferation and liver regeneration, HBV transgenic mice exhibit increased development of fibrosis after long-term CCl4-induced liver damage. Taken together, in this thesis, a novel pathomechanism could be uncovered that includes inactivation of insulin receptor signaling by HBV via intracellular retention of the insulin receptor leading to impaired liver regeneration after liver damage and promotion of liver fibrosis. These findings significantly contribute to an enhanced understanding of HBV-associated liver pathogenesis.
Hintergrund: Die Thoraxsonographie ermöglicht in der Intensivmedizin die Diagnose von Pleuraerguss und Pneumothorax in Rückenlage mit ähnlicher Sensitivität und Spezifität wie ein Röntgenthorax. Bisher verfügbar war ein kombiniertes theoretisches und praktisches Training, um diese Diagnostik zu lehren, die vor allem von der Erkennung einer sich bewegenden Sonoanatomie abhängt. Die neuere Computertechnologie ermöglicht es nun, solche Sachverhalte zu zeigen, zu animieren und zu erklären.
Ziele: Entwicklung und Überprüfung eines E-Learning für die Thoraxsonographie in der Intensivmedizin.
Methoden: Ein animiertes interaktives, Internet-basiertes E-Learning wurde mit Flash und dem Web-Kit-Freiburg entwickelt. Das E-Learning wurde zur Vorbereitung eines DEGUM-zertifizierten Trainingsprogramms für Thoraxsonographie verwendet und danach von Ärzten mit visuellen Analogskalen (VAS) evaluiert (Studie A). Eine prospektive Lernerfolgsstudie wurde mit Medizinstudenten ohne praktisches Training unter Zuhilfenahme eines 20 Fragen umfassenden „Multiple-Choice“- Tests durchgeführt und nach 2 Wochen einer Nachhaltigkeitsüberprüfung unterzogen (Studie B). Alle Teilnehmer hatten kaum (A) oder keine (B) Vorkenntnisse in der Thoraxsonographie.
Ergebnisse: Das neu entwickelte E-Learning steht im Internet in Deutsch und Englisch zur Verfügung. Studie A: 34 Ärzte, die das E-Learning verwendeten, schätzten ihren Wissenszuwachs von Null auf 79,5% (Median, 95%-Konfidenzintervall 69%-88%, Min/Max 48/97).
Studie B: 29 Medizinstudenten erzielten eine Verbesserung von 11,7/20 auf 17/20 richtigen Antworten nach Anwendung des E-Learning (relative Steigerung 45%, p<0,0001 Wilcoxon's-matched-pairs-test). Nach 2 Wochen wurden noch 83% der Fragen richtig beantwortet (p<0,0001 vs. Pre-Test).
Schlussfolgerung: Die Grundlagen der Thoraxsonographie können mittels E-Learning mit einer hohen Effektivität vermittelt werden. Es eignet sich daher für ein „Blended- Learning“ Konzept.
Transport mechanism of a multidrug resistance protein investigated by pulsed EPR spectroscopy
(2019)
In human several diseases result from malfunctions of ATP-binding cassette (ABC) systems, which form one of the largest transport system superfamily. Many ABC exporters contain asymmetric nucleotide-binding sites (NBSs) and some of them are inhibited by the transported substrate.1 For the active transport of diverse chemically substrates across biological membranes, ABC transport complexes use the energy of ATP binding and subsequent hydrolysis. In this thesis, the heterodimeric ABC exporter TmrAB2,3 from Thermus thermophilus, a functional homolog of the human antigen translocation complex TAP, was investigated by using pulsed electron-electron double resonance (PELDOR/DEER) spectroscopy. In the presence of ATP, TmrAB exists in an equilibrium between inward- and outward-facing conformations. This equilibrium can be modulated by changing the ATP concentration, showing asymmetric behaviour in the open-to-close equilibrium between the consensus and the degenerate NBSs. At the degenerate NBS the closed conformation is more preferred and closure of one of the NBSs is sufficient to open the periplasmic gate at the transmembrane domain (TMD).3 By determining the temperature dependence of this conformational equilibrium, the thermodynamics of the energy coupling during ATP-induced conformational changes in TmrAB were investigated. The results demonstrate that ATP-binding alone drives the global conformational switching to the outward-facing state and allows the determination of the entropy and enthalpy changes for this step. With this knowledge, the Gibbs free energy of this ATP induced transition was calculated. Furthermore, an excess of substrate, meaning trans-inhibition of the transporter is resulting mechanistically in a reverse transition from the outward-facing state to an occluded conformation predominantly.3 This work unravels the central role of the reversible conformational equilibrium in the function and regulation of an ABC exporter. For the first time it is shown that the conformational thermodynamics of a large membrane protein complex can be investigated. The presented experiments give new possibilities to investigate other related medically important transporters with asymmetric NBSs or other similar protein complexes.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bindeeigenschaft des synaptischen Vesikelproteins SV31 zu den divalenten Metallionen Zn2+, Ni2+ sowie Cu2+ nachgewiesen und reproduziert werden. Die Bindung an Zn2+ wurde dabei sowohl in vitro an der Sepharosesäule als auch in vivo in NGF-differenzierten PC12-Zellen bestätigt (3.2.1 - 3.2.3). In einer Kollaboration mit dem Max-Planck-Institut für Biophysik wurde des Weiteren eine mögliche Zinktransportfunktion von SV31 untersucht. Dafür wurde die Ladungstranslokation durch myc-SV31-enthaltene CHO-Zellmembranen nach Zinkzugabe gemessen (3.2.5). Weiterhin konnte durch subzelluläre Fraktionierung von PC12-Zellen ein Verteilungsmuster des neuen Proteins in Mikrosomen unterschiedlicher Dichte dokumentiert werden. Durch die andauernde Expression von SV31-RFP in stabil transfizierten PC12-Zellen kommt es außerdem zur Beeinflussung des Expressionsmusters zahlreicher Markerproteine und damit einhergehend zu einer Dichteverschiebung somatischer Organellen (3.3.1 - 3.3.3). Kolokalisationsstudien von SV31 mit Markerproteinen zahlreicher Zellorganellen ergaben partielle Fluoreszenzüberlagerungen mit synaptischen Vesikelproteinen sowie eine Anreicherung von SV31 in Nähe der Plasmamembran. In diesem Zusammenhang zeigt sich ebenfalls eine Übereinstimmung der Lokalisation von SV31 mit den SNAREProteinen SNAP25 und Syntaxin1A (3.4.1 - 3.4.3). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erweitern nicht nur das Wissen um die funktionellen Eigenschaften von SV31, sie geben auch Anlass zum Nachdenken über mögliche Interaktionspartner des neuen Vesikelproteins. Die Fähigkeit zur Zinkbindung und -akkumulation auf präsynaptischer Seite rückt SV31, im Hinblick auf neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson, auch in einen medizinisch relevanten Kontext. Durch Deduktion der hier aufgezeigten Ergebnisse entsteht ein erweitertes Verständnis der Relevanz von SV31 als funktionelle, zinkbindende Einheit im Rahmen der synaptischen Transmission.
Primäres Ziel dieser Arbeit war es, einen direkten Beweis für die Annahme zuerbringen, dass eine starke Intensitätsabhängigkeit der N1/P2- Komponente des AEPs und im besonderen des tangentialen Dipols durch eine erniedrigte serotoninerge Neurotransmission verursacht wird. Gleichzeitig konnte als klinisch relevanter Effekt die mögliche Verwendbarkeit der Intensitätsabhängigkeit als biologischer Marker für das Aktivitätsniveau des serotoninergen Systems getestet werden. Durch das Studiendesign wurde zusätzlich die Überprüfung des allgemein postulierten Zusammenhanges zwischen einer impulsiv-aggressiven Persönlichkeitsstruktur und einer hohen Intensitätsabhängigkeit evozierter Potentiale als Nebenziel ermöglicht. Mit Hilfe in ihrer Zusammensetzung verschiedener Aminosäure-Mischungen, die eineperiphere Tryptophandepletion herbeiführen, sollte eine verminderte zentrale serotoninerge Neurotransmission erzielt werden.Die Intensitätsabhängigkeit des AEPs an den Tagen mit verminderter Verfügbarkeit des einzigen Präkursors von Serotonin, der essentiellen Aminosäure Tryptophan, wurde im Vergleich zu einem Kontrolltag überprüft, an dem nur ein Placebo verabreicht worden war.Dazu wurden 13 gesunde Probanden (7w, 6m) im Alter von 24-32 Jahren nach ausführlicher psychologischer Erfassung ihrer Persönlichkeitsstruktur einemdoppelblinden, placebokontrolliertem Cross-over Studiendesign unterworfen, in dem jede Versuchsperson die Aminosäure-Mischung Young 50 bzw. 100 und Moja als Tryptophandepletionstest (TDT) neben einem Placebo erhielt. Die Intensitätsabhängigkeit des AEPs am Kontrolltag wurde mit den bei der Voruntersuchung erhobenen Persönlichkeitsmerkmalen in Zusammenhang gesetzt. Das Hauptergebnis dieser Arbeit war eine positive Korrelation der Plasmatryptophanspiegels mit der Intensitätsabhängigkeit des tangentialen Dipols des N1/P2-Komplexes (r=0,46; p<0,05).Dies steht im Widerspruch zu den bisher veröffentlichten Arbeiten zu diesem Thema. Ein Grund für dieses konträre Resultat mag eine durch den TDT nicht herbeigeführte Erniedrigung der zentralen serotoninergen transmissiven Aktivität sein. Zudem wurden die meisten anderen Untersuchungen an Patienten, bei denen eine Störung im serotoninergen System von vornherein angenommen worden war, vorgenommen, was einen Hauptunterschied zu dieser Studie, die mit gesunden Probanden durchgeführt worden war, darstellt. Und ob bei normalen Probanden eine Tryptophandepletion es vermag, eine Erniedrigung serotoninerger Neurotransmission zuverursachen, bleibt fraglich. Auch ist die Intensitätsabhängigkeit des AEPs wohl nicht ein rein spezifischer, sondernhöchstens ein relativ spezifischer Parameter für die zentrale Aktivität serotoninerger Neurone. Sie kann also auch von anderen Transmittersystemen mit beeinflusst sein. Mit der unterschiedlichen Ausprägung der Intensitätsabhängigkeit des AEPs in den Hemisphären liess sich allerdings ein weiteres Indiz für eine funktionelle Seitenasymmetrie in der Reizverarbeitung und wohl auch im serotoninergen Stoffwechsel finden. Aber auch das Ergebnis, dass die Intensitätsabha"ngigkeit des radialen und tangentialen Dipols teilweise hochsignifikant negativ mit als eher aggressiv und impulsiv zu beurteilenden Eigenschaften korrelierte, widerspricht den bisherigen Studienergebnissen, nach der eine hohe serotoninerge Neurotransmission generell inhibierend auf das Verhalten wirke, und somit Aggressivitä"t und Impulsivität beiPersonen mit hoher Intensitätsabhängigkeit evozierter Potentiale auftreten müsste. Zweifel, ob die Intensitätsabhängigkeit wirklich den geeigneten Parameter zur Beurteilung des Aktivitätsniveaus im serotoninerge System darstellt, lassen das Ergebnis weniger widersprüchlich erscheinen. Ebenso erfordert die Komplexität des Zusammenspiels vieler verschiedener Modulatoren wohl eine enger gefasste Fragestellung, die auch andere Transmittersysteme, wie etwa das noradrenerge und dopaminerge, und Hormone, wie Testosteron oder Cortisol, mit einschliesst. Eine Beteiligung des serotoninergen Transmittersystems bei der Beeinflussungaggressiven und impulsiven Verhaltens lässt sich jedoch aus der Beobachtung vermuten, dass die Veränderung der Intensitätsabhängigkeit durch den Tryptophandepletionstestsich bei verschieden Persönlichkeitstypen anders verhielten. Neugierverhalten und Impulsivität zeigten eine signifikant negative Korrelation, mit der depletionsabhängigen Steigungsänderung (DSA"), Schadensvermeidung dagegen eine signifikant positive. Die Auswirkungen des TDT auf die Befindlichkeit und das Verhalten derteilnehmenden Probanden waren Themen einer anderen Arbeit (Sadigorsky, in Vorbereitung), ebenso wie die neuropharmakologischen Aspekte der Tryptophandepletion (Kewitz, in Vorbereitung). Durch die hier vorgestellten Ergebnisse erfährt die Hoffnung, einen biologischen Marker für einen für die Genese vieler psychiatrischer Störungen wichtigen Neurotransmitter gefunden zu haben, der nicht invasiv ist und schnell Einzug in dieklinische Routinediagnostik halten könnte, leider keinen Rückhalt. Zu viele Zweifel bestehen an der Aussagekraft und Spezifität dieses Funktionsparameters.
The light-harvesting complex of photosystem II (LHC-II) is the major antenna complex in plant photosynthesis. It accounts for roughly 30% of the total protein in plant chloroplasts, which makes it arguably the most abundant membrane protein on Earth, and binds about half of plant chlorophyll (Chl). The complex assembles as a trimer in the thylakoid membrane and binds a total of 54 pigment molecules, including 24 Chl a, 18 Chl b, 6 lutein (Lut), 3 neoxanthin (Neo) and 3 violaxanthin (Vio). LHC-II has five key roles in plant photosynthesis. It: (1) harvests sunlight and transmits excitation energy to the reaction centres of photosystems II and I, (2) regulates the amount of excitation energy reaching each of the two photosystems, (3) has a structural role in the architecture of the photosynthetic supercomplexes, (4) contributes to the tight appression of thylakoid membranes in chloroplast grana, and (5) protects the photosynthetic apparatus from photo damage by non photochemical quenching (NPQ). A major fraction of NPQ is accounted for its energy-dependent component qE. Despite being critical for plant survival and having been studied for decades, the exact details of how excess absorbed light energy is dissipated under qE conditions remain enigmatic. Today it is accepted that qE is regulated by the magnitude of the pH gradient (ΔpH) across the thylakoid membrane. It is also well documented that the drop in pH in the thylakoid lumen during high-light conditions activates the enzyme violaxanthin de-epoxidase (VDE), which converts the carotenoid Vio into zeaxanthin (Zea) as part of the xanthophyll cycle. Additionally, studies with Arabidopsis mutants revealed that the photosystem II subunit PsbS is necessary for qE. How these physiological responses switch LHC-II from the active, energy transmitting to the quenched, energy-dissipating state, in which the solar energy is not transmitted to the photosystems but instead dissipated as heat, remains unclear and is the subject of this thesis. From the results obtained during this doctoral work, five main conclusions can be drawn concerning the mechanism of qE: 1. Substitution of Vio by Zea in LHC-II is not sufficient for efficient dissipation of excess excitation energy. 2. Aggregation quenching of LHC-II does not require Vio, Neo nor a specific Chl pair. 3. With one exception, the pigment structure in LHC-II is rigid. 4. The two X-ray structures of LHC-II show the same energy transmitting state of the complex. 5. Crystalline LHC-II resembles the complex in the thylakoid membrane. Models of the aggregation quenching mechanism in vitro and the qE mechanism in vivo are presented as a corollary of this doctoral work. LHC-II aggregation quenching in vitro is attributed to the formation of energy sinks on the periphery of LHC-II through random interaction with other trimers, free pigments or impurities. A similar but unrelated process is proposed to occur in the thylakoid membrane, by which excess excitation energy is dissipated upon specific interaction between LHC-II and a PsbS monomer carrying Zea. At the end of this thesis, an innovative experimental model for the analysis of all key aspects of qE is proposed in order to finally solve the qE enigma, one of the last unresolved problems in photosynthesis research.
Mitochondrial membrane dynamics is increasingly implicated in various human diseases. Numerous studies show that the protein OPA1 plays a central role in determining mitochondrial ultrastructure and apoptotic remodeling of the inner mitochondrial membrane during Cytochrome c release and apoptosis. Crista junctions are crucial for the regulation of apoptotic Cytochrome c release. Previous publications suggest that OPA1 is required to maintain a normal structure of the inner mitochondrial membrane. The protein MIC60 (Mitofilin) appears to be an essential physical constituent of crista junctions and is also crucial for the general determination of mitochondrial ultrastructure. Furthermore, recent studies suggest that MIC60 is also implicated in Cytochrome c release during apoptosis.
In this regard, the question whether OPA1 is essential for crista junction formation was investigated. In addition to that, the interplay between OPA1 and MIC60 and its physiological role were analyzed. Electron microscopy of OPA1+/- and OPA1+/+ mice, as well as of OPA1-/- and OPA1+/+ MEFs clearly showed that OPA1 plays a role but is not essential for crista junction formation. In contrast to that, the results indicate that OPA1 is crucial to maintain a normal structure of the inner mitochondrial membrane. Immunogold experiments fit well to these observations as OPA1 was found equally distributed throughout the cristae membrane with only a minor part located at crista junctions. MIC60 localization studies showed a clear enrichment at crista junctions. Interaction studies revealed that endogenous OPA1 and MIC60 physically interact with each other. Analysis of protein levels upon OPA1 or MIC60 depletion indicate that both proteins play a dual role in cristae- and crista junction formation in which MIC60 is a physical constituent of crista junctions essential for their formation while OPA1 primarily has a regulatory impact on MIC60 function. Finally, apoptosis assays and cell viability measurements showed that knockout of OPA1 in MEFs leads to increased cellular resistance suggesting that the interplay of these proteins is important for the regulation of crista junction remodeling during apoptosis.
Besides its role in determining mitochondrial ultrastructure, OPA1 mediates inner membrane fusion of mitochondria thereby contributing to mitochondrial quality control. Additionally, proteolytic processing is crucial for the ability of OPA1 to distinguish between functional and dysfunctional mitochondria. Functional mitochondria are fused while dysfunctional mitochondria are not, a process termed selective mitochondrial fusion. Dysfunctional mitochondria were shown to be degraded by mitophagy in a fission-dependent manner. Numerous studies suggest that OPA1 and mitophagy are directly linked. However, this idea is still under debate. Mitophagy is also crucial for mitochondrial quality control, which directly impacts mitochondrial integrity. Furthermore, mitochondrial quality control has been linked to neurodegeneration as demonstrated by the observation that mutations in OPA1 cause the disorder ADOA-1.
In order to analyze a potential link between OPA1 and mitophagy, mitochondrial colocalization with LC3 was analyzed microscopically in primary adult skin fibroblasts isolated from OPA1+/- and OPA1+/+ mice in an age-dependent manner. Fibroblasts from young OPA1+/- mice showed increased colocalization of mitochondria with autophagosomes compared to fibroblasts from young wild type mice suggesting that OPA1 exerts an inhibitory role in mitophagy. This effect was even more pronounced in old mice, which also displayed higher mitophagy levels in general than young mice, consistent with the finding that old mice had higher Parkin levels than young mice. Mitochondrial fragmentation was elevated in fibroblasts from young and old OPA1+/- mice compared to control fibroblasts. However, extensive mitochondrial fusion, which occurred in fibroblasts from old wild type mice, was prevented in old OPA1+/- mice. Furthermore, old wild type mice had decreased numbers of crista junctions compared to young wild type mice, an effect that was not observed in OPA1+/- mice. Despite the observed age-dependent phenotypes in mitochondrial quality control and mitochondrial integrity, deletion of one allele of OPA1 had no influence on the life span in vivo. Analysis of the OPA1-dependent proteome of aging mice, which was performed in collaboration with Ansgar Poetsch and Carina Ramallo-Guevara from Bochum, showed that OPA1-dependent aging is accompanied by a reduction of proteins involved in autophagy. In contrast to that, a switch from glucose to fatty acid metabolism and alterations in apoptotic proteins were observed in both OPA1+/- and OPA1+/+ mice in an age-dependent manner indicating that the changes in proteins implicated in autophagy could be a compensatory response to the diminished inhibitory effect of OPA1 on mitophagy. On the other hand, increased mitochondrial degradation by mitophagy could be a cellular response to itself compensating for the loss of OPA1 mediated fusion thereby contributing to the observation that OPA1+/- and OPA1+/+ mice had no differences in life span. Furthermore, analysis of the OPA1-dependent proteome of aging mice revealed that OPA1, besides its role in mitochondrial fusion, could interact with the fission machinery: MFF and Neuronal pentraxin 1, two proteins involved in mitochondrial fission, were up-regulated in 12-month-old OPA1+/- mice suggesting that a reduced fission activity could contribute to mitochondrial hyperfusion in aged wild- type mice. Nonetheless, the exact nature of the possible interplays between OPA1 and these candidates remains to be investigated.
Apoptotic cell (AC)-derived factors alter the physiology of macrophages (M Phi s) towards a regulatory phenotype that is characterized by enhanced production of anti-inflammatory mediators, an attenuated pro-inflammatory cytokine profile and reduced nitric oxide (NO) formation. Impaired NO production in response to ACs or AC-conditioned medium (CM) is facilitated by arginase II (ARG II) expression, which competes with inducible NO synthase for L-arginine. In this study, I investigated the signaling pathway that allowed CM to upregulate ARG II in M Phi s. A sphingolipid, further identified as sphingosine-1-phosphate (S1P), was required but authentic S1P alone only produced small effects. S1P acted synergistically with a so far unidentified factor to elicit high ARG II expression. S1P signaled through S1P receptor 2 (S1P2), since the S1P2-antagonist JTE013 and siRNA knock-down of S1P2 prevented ARG II upregulation. Further, inhibition and knock-down of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) attenuated CM-mediated ARG II protein induction. Exploring ERK5-dependent transcriptional regulation, promoter deletion and luciferase reporter analysis of the murine ARG II promoter (mpARG II) suggested the involvement of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) responsive element binding protein (CREB). This was confirmed by EMSA analysis and decoyoligonucleotides scavenging CREB, thereby preventing it from activating target genes and thus, blocking ARG II expression. I concluded that AC-derived S1P binds to S1P2 and acts synergistically with other factors to activate ERK5 and concomitantly CREB. This signaling cascade shapes an anti-inflammatory M Phi phenotype by ARG II induction. Further investigations of ERK5-dependent CREB activation suggested an indirect mechanism implying that ERK5 inhibited phosphodiesterase 4 (PDE4) and thus, prevented hydrolysis of cAMP. Since S1P-dependent ERK5 activation presumably inhibited PDE4, subsequent cAMP accumulation led to enhanced PKA activity and CREB-mediated transcription. The unidentified factor(s) besides S1P probably provoked the required elevation of cAMP production in M Phi s. Indeed, pharmacological inhibition of cAMP-producing adenylyl cyclase with SQ22536 as well as cAMP-dependent protein kinase A (PKA) with KT5720 suggested cAMP to be involved in CM-mediated ARG II up-regulation. Furthermore, forskolin-dependent activation of adenyly cyclase and simultaneous rolipram-mediated inhibition of PDE4 mimicked CM-induced ARG II expression. Considering these findings, I propose that one or several unidentified factors in CM provoke cAMP production in M Phi s. In parallel, AC-derived S1P activates ERK5, which inhibits PDE4-dependent cAMP hydrolysis, further raising intracellular cAMP levels. Thus, unrestricted continuous cAMP signaling via PKA/CREB, results in a time-dependent and sustained ARG II induction.
Von den etwa 400 subgingival nachgewiesenen Mikroorganismen stehen nur wenige eng mit der Parodontitis in Verbindung. Zu diesen werden Aggregatibacter actinomycetemcomitans (AA), Porphyromonas gingivalis (PG), Tannerella forsythensis (TF) und Treponema denticola (TD) gezählt. Aggressive und generalisierte schwere chronische Parodontitiden, bei denen eine Infektion mit bestimmten Parodontalpathogenen, insbesondere AA, vorliegt, lassen sich nur durch systemische Gabe von Antibiotika zusätzlich zur mechanischen antiinfektiösen Therapie erfolgreich therapieren. Für den quantitativen und qualitativen Nachweis dieser Keime stehen in der Routinediagnostik kommerziell überwiegend molekularbiologische Methoden zur Verfügung. Je nachdem, welche Komplexe subgingivaler Mikroorganismen sich nachweisen lassen, werden unterschiedliche Antibiotikaregime vorgeschlagen. Dazu sollen Plaqueproben aus den jeweils tiefsten parodontalen Taschen mit Blutung oder Suppuration entnommen werden. Für die systemische Antibiotikagabe in der Therapie spezieller Parodontitisformen ist nicht die subgingivale Flora einzelner Taschen, sondern ein repräsentatives Bild der subgingivalen Flora des jeweiligen Patienten relevant. Deshalb werden aus Kostengründen dazu häufig Proben aus mehreren Taschen zusammengefasst und als sogenannte „gepoolte“ Probe ausgewertet. Ziele dieser Studie waren zu einem, die Übereinstimmung der Ergebnissen der Analyse gepoolter Proben mit den Ergebnissen der separaten Analyse dieser Proben zu überprüfen und zum anderen, ob der Nachweis bestimmter Bakterien die klinischen Diagnosen chronische bzw. aggressive Parodontitis ermöglicht. Insgesamt wurde bei 60 Patienten (33 weiblich) mit einer unbehandelten aggressiven (AgP: 30) oder generalisierten schweren chronischen Parodontitis (ChP: 30) subgingivale Plaque aus den 4 parodontalen Taschen mit der höchsten Sondierungstiefen entnommen. Jeweils 2 sterile Papierspitzen wurden gleichzeitig an den ausgewählten Stellen nach subgingival platziert. Anschließend wurde jeweils eine Papierspitze in ein separates Transportgefäß gegeben und die jeweils andere mit 3 weiteren des gleichen Patienten gepoolt (MT4). Der Inhalt jedes Gefäßes wurde mit einem von zwei kommerziellen Tests (RNS-Sondentest oder real time PCR) auf Aggregatibacter actinomycetemcomitans (AA), Porphyromonas gingivalis (PG), Tannerella forsythensis (TF) und Treponema denticola (TD) ausgewertet. Die logarithmierten Bakterienzahlen lagen für MT4 höher als für die separaten Analysen (P< 0,001). Bei der Nachweishäufigkeit aller untersuchten Keime kamen separate Analysen und MT4 zu vergleichbaren Ergebnissen. Für PG, TF und TD war die Übereinstimmung beider Strategien moderat (k > 0,4) bis ausgezeichnet (k > 0,75), für AA schlecht (k = 0,38). PG, TF, und TD wurden bei der Mehrheit der Patienten nachgewiesen (PG: 90%, TF/TD: 98%), während AA in nur 57% der Fälle vorkam. Die logarithmierten Bakterienzahlen für AA lagen bei separater Analyse statistisch signifikant höher bei der aggressiven Parodontitis (AgP) als bei der generalisiert schweren chronischen Parodontitis (ChP) (P=0,036). Dieser Unterschied konnte bei der gepoolten Analyse (MT4) statistisch nicht gesichert werden. TF, PG, und TD wurden mittels separater Analyse bei ChP in statistisch signifikant höheren Zahlen nachgewiesen als bei AgP, dies wurde mittels MT4 nur für TF bestätigt. AA wurde statistisch signifikant häufiger bei AgP als bei ChP mit separater Analyse nachgewiesen. Die Gesamtprävalenz und MT4 konnten diese Beobachtung nicht bestätigen. PG wurde mit allen Analysestrategien häufiger bei ChP als bei AgP nachgewiesen. Die Prävalenz von TF und TD ergab keinen statistisch signifikanten Unterscheid zwischen ChP und AgP. Unter Limitationen der vorliegenden Studie lassen sich folgende Schlussfolgerungen ziehen: 1) Bei gepoolter Analyse subgingivaler Plaqueproben werden die untersuchten Bakterien zumindest genauso häufig nachgewiesen wie bei separater Analyse, sodass die gepoolte Analyse für die mikrobiologische Routinediagnostik empfohlen werden kann. Es gibt allerdings eine deutliche Variabilität der Nachweishäufigkeit von Proben, die gleichzeitig entnommen wurden auf Patientenebene. Die Entnahme von 6 statt 4 Proben könnte die Variabilität möglicherweise reduzieren. 2) Der Nachweis von AA unterstützt die klinische Diagnose und beeinflusst die Therapieauswahl. Als alleiniger diagnostischer Test für AgP ist er aufgrund der geringen Sensitivität und des geringen positiven Vorhersagewertes allerdings nicht geeignet. Der Nachweis von PG, TF und TD eignet sich ebenfalls nicht als diagnostischer Test für AgP aufgrund der hohen Prävalenz dieser Keime sowohl bei AgP als auch bei generalisiert schwerer ChP.
This dissertation deals with the lexical, morphological, syntactic, and semantic properties of (VP )idioms and their behavior in combination with restrictive relative clauses, raising, constituent fronting, wh-movement, VP-ellipsis, pronominalization, the progressive form, verb placement, passivization, conjunction modification, and the N-after-N construction. It provides empirical evidence towards a combinatorial analysis of both semantically non-decomposable idioms (SNDIs) and semantically decomposable idioms (SDIs) and contributes to the (formal) formulation of such an account.
The Introduction (Chapter 1) first motivates why idioms are an exciting and challenging phenomenon and then gives a definition of the term idiom, a classification of idioms, and an overview of the wide spectrum of idiom analyses found in the linguistic literature.
Chapter 2, “Idioms as evidence for the proper analysis of relative clauses”, shows that the Modification Analysis beats the other two major analyses of restrictive relative clauses (RRCs), namely Raising and Matching, as (i) the latter two lead to a loss of numerous empirical generalizations in syntax and morphology, and (ii) contrary to the assumption in the literature, idioms in RRCs can, in fact, be licensed without literal syntactic movement of the RRC-head, which makes modification fully compatible with idiom reconstruction effects.
Chapter 3, “How frozen are frozen idioms?”, presents new empirical observations on the lexical, morphological, and syntactic flexibility of kick the bucket and displays that this idiom is not completely frozen with respect to its NP complement, the progressive form, and, in some contexts, even passivization. The chapter concludes that analyses of kick the bucket as a single lexical entry should be replaced by analyses of this and other SNDIs with a syntactically regular shape as consisting of individual word-level lexical entries that combine according to the standard rules of syntax.
This idea is taken up in Chapter 4, “The syntactic flexibility of semantically non-decomposable idioms”, which – based on the differences between English and German with regard to verb placement, constituent fronting, and passivization as well as a short outlook on Estonian and French – spells out a combinatorial analysis of SNDIs and augments it with a semantic analysis formulated in Lexical Resource Semantics, according to which some idiom parts make identical semantic contributions to the overall meaning of the idiom. The analysis further suggests that the syntactic flexibility of idioms is due to the semantic and pragmatic constraints on the involved constructions, rather than the syntactic encoding of the idioms.
Chapter 5, “Modification of literal meanings in semantically non-decomposable idioms”, reviews Ernst’s (1981) classical three types of idiom modification (internal, external, and conjunction) to then closely investigate the most challenging type, namely conjunction modification, in SNDIs. Based on naturally occurring examples of four SNDIs (two English, two German), it sketches an analysis in terms of two or more conjoined independent propositions, each of which can be the result of figurative reinterpretation. One of the propositions contains the idiomatic meaning, in (one of) the other(s), the meaning of the modifier applies to the literal meaning of the idiom’s noun.
Chapter 6, “Semantically decomposable idioms in the N-after-N construction”, offers a formal syntactic and semantic account of SDIs like pull strings in the N-after-N construction, as in Kim pulled string after string to get Alex into a good college. While the idiom contributes the type of entity at stake (‘string’ in the case of pull strings), N-after-N contributes that there are several instantiations of that type of entity and that these are subject to temporal or spatial succession. The chapter first summarizes the empirical properties of N-after-N, then provides an account of N-after-N in Head-driven Phrase Structure Grammar (HPSG), presents an updated version of the account of SDIs suggested in Chapter 2 within HPSG, and combines it with the HPSG account of N-after-N.
Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are rare neurological disorders that may be of genetic or infectious origin, but most frequently occur sporadically in humans. Their outcome is invariably fatal. The infectious agent has been defined as prion (from proteinaceous infectious only) in 1992 by Stanley B. Prusiner and represent mainly, if not solely, an abnormal, protease-resistant isoform (PrPSc) of a cellular protein, the prion protein or PrPC. According to the “protein only” hypothesis, the prion is devoid of informational nucleic acids and consists of an “infectious” protein that is capable of converting the normal host protein PrPC into a likeness of itself. TSEs can be distinguished from other neurodegenerative diseases because of their infectivity and transmission capability. The only organ system in which severe histopathological damage can be demonstrated as a consequence of infection with prions is the nervous system. The communal lesions are neuronal loss, spongiosis and astrogliosis, accompanied by an intra- and extracellular accumulation of PrPSc, occasionally in form of amyloid plaques. Even if a strong activation of microglia and astrocytes occurs, no immunological response is usually detectable as consequence of prion infection. Despite the considerable attention for its involvement in TSEs, the physiological role of the cellular, nonpathogenic isoform of PrPC, has not yet been determined. In the last years, several putative cellular functions have been attributed to PrPC: its localization in “lipid rafts” is consistent with a possible role in cell adhesion, transmembrane signalling or as a recognition molecule. Furthermore, PrPC has been implicated in protection against oxidative stress, copper metabolism, apoptosis, cell proliferation and in the regeneration of blood precursors stem cells in the adult. It has also been shown that PrPC interacts with the neuronal cell adhesion molecule NCAM, promoting neurite outgrowth. However, both the PrPC-mediated effects and the role of PrPC-dependent pathways on neuronal differentiation are still not elucidated. First objective of this Ph.D thesis was the establishment of a novel in vitro cellular model for the study of the role of PrPC in neuronal differentiation and neurite outgrowth. Furthermore, an additional goal of this project was the indentification of the PrPC domains responsible for the induction of neuronal differentiation. A novel PrPC-depleted cell line (PrP0/0 ML) was derived from murine primary PrP-knockout neuronal cells by SV40 large T antigen-mediated immortalization. A temperature sensitive form of this oncogenic protein was used, allowing a temperature-mediated regulation of its expression. This cell line was then characterised for its growth potential, for the expression of specific cellular markers and for its ability to differentiate. It was found that, under culture conditions promoting the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen, the cells expressed nestin, a specific marker of neuronal precursor cells. Therefore, the PrP0/0 ML cell line was identified as a potential neuronal stem cell line. In fact, under nonpermissive culture conditions when the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen is downregulated, the PrP0/0 ML cells differentiated into neurons. Noteworthy, maintenance of the cells in conditions that promote cell differentiation induced a progressive reduction in the expression levels of nestin, an event that strongly correlated with the appearance of the specific neuronal markers MAP-2b and NeuN. In order to investigate the role of PrPC in the process of neuronal differentiation, the PrP0/0 ML cells were then reconstituted for the expression of either the full-length PrP or a N-terminal truncated PrPC form (PrPdel32-134). The differentiation potential of both reconstituted cell lines under nonpermissive culture conditions was then compared with that of the parenteral PrP0/0 ML cells. This in vitro study clearly highlights that PrPC expression in the PrP0/0 ML cell line accelerates neuronal differentiation and that the N-terminal domain of the prion protein is not necessary for this PrP-mediated function. Prion diseases like BSE, vCJK, Kuru and the majority of iatrogenic cases of CJK are caused by a peripheral infection. Infectious prions accumulate in the central and peripheral nervous system as well as in extracerebral tissues, such as the secondary lymphoid organs and muscles. The prion pathogenesis is a dynamic process which can be defined temporary and spatially in different phases: i) infection and peripheral replication, ii) neuroinvasion, transport of prions from the periphery to the central nervous system (CNS), and iii) neurodegeneration. In the last years, progresses in the elucidation of the peripheral prion pathogenesis were achieved. The identification of the cell types involved in the lymphoreticular prion replication phase and the recognition of the role of the peripheral nervous system in the process of prion spread from the periphery to the CNS have elucidated some of the cellular mechanisms that are involved in prion uptake, replication and propagation. However, relatively little information is available about the mechanism(s) underlying intercellular prion transfer and tissue-to tissue prion spread. Microvesicles (MVs) are submicron vesicles (0,03-1 microm.) with a single membrane and are shed from most eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. The segregation of specific proteins is followed by blebbing of the membrane surface, leading to the formation of MVs and their release in the extracellular environment. MVs can be also secreted upon fusion of multivesicular endosomes with the plasma membrane (exosomes). The secretion of MVs is the result of a complex cellular process involving changes in the metabolism of lipids and proteins. The functional role of MVs is still largely unknown. However, there is evidence showing that they are important modulators of cell-to-cell communication, participate in a variety of intracellular adhesion processes and are able to induce cellular response(s). The release of PrPC and infectious PrPSc by prion infected epithelial, neuroglial and neuronal cells in association with exosomes has recently been highlighted. Furthermore, it has been shown that exosomes can propagate prion infectivity both in vitro and in vivo, suggesting that PrPSc-bearing exosomes may provide a mechanism for intercellular transmission of infectious prions in addition to cell-to-cell contact. Second objective of this Ph.D thesis was to determine the possible role of plasma membrane-derived microvesicles in the propagation and transmission of prions. The release of MVs was first studied in different murine neuronal cell lines. Here it is shown for the first time that neurons also shed plasma membrane derived MVs, in addition to exosomes. Immunoelectron microscopy and immunoblot analyses clearly demonstrated the presence of PrPC on the membrane of MVs released from PrPC-expressing cells. Characterization of lipid rafts components in MVs highlighted the presence of the ganglioside GM2, the tyrosine kinase p59Fyn, flotillin-2 and the neuronal protein GAP-43. In order to investigate whether MVs are involved in the intercellular transmission of prions, MVs were first isolated from two prion infected murine neuronal cell lines, namely the Neuro-2a PK1 and the N2a58 cells, and then used for in vitro and in vivo infection assays. Immunoblot analyses after proteinase K treatment demonstrated the association of PrPSc with the secreted MVs. The PrPSc-bearing MVs were then used to perform infection experiments on noninfected cells. By the use of cell blot assay, a method that allows the detection of PrPSc-amplification and -accumulation in cultured cells, the kinetic of prion infection in the de novo infected cells was followed. Noteworthy, it was found that PrPSc-bearing MVs were capable to transmit prions in vitro and to stably infect the recipient cells. In order to investigate the role of MVs in the transmission of infectivity in vivo, PrPSc-bearing MVs as well as MVs isolated from noninfected cells (as negative control) were injected intracerebrally in PrPC-overexpressing indicator mice (tga20). The development of clinical disease was followed in a time-dependent manner. Clinical symptoms could be observed only in the group of indicator mice inoculated with the PrPSc-bearing MVs, which then succumbed to desease. These findings clearly demonstrated that MVs are biological carriers of both PrPSc and prion infectivity. MVs could therefore participate in vivo in the processes of intercellular prion transmission and propagation.
Tunikaten produzieren eine Vielzahl an cytotoxischen und antimikrobiellen Verbindungen, die ihnen in ihrem Ökosystem zu überlebenswichtigen Vorteilen verhelfen. Wegen ihrer strukturellen Diversität und ihrer spezifischen Eigenschaften haben bislang einige dieser Sekundärstoffe Eingang in die pharmazeutische Industrie gefunden. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine umfassende Untersuchung des chemischen Potentials benthischer Ascidien der Nordsee. Die Eigenschaften der organischen Ascidienextrakte wurden anhand von vier Bioassays beschrieben. Die Assays fungierten gleichzeitig als Wegweiser zur Isolierung der aktiven Sekundärmetaboliten, der sich eine Strukturaufklärung mit spektroskopischen Methoden (NMR, MS, IR) anschloss. Es wurden Tests auf bewuchshemmende, antimikrobielle, cytotoxische und enzymhemmende Eigenschaften durchgeführt. Eingesetzt wurden organische Extrakte von 13 solitären und koloniebildenden Ascidienarten der nördlichen und südlichen Nordsee. In allen vier Assays zeigten mehrere oder alle Ascidienarten Aktivität. Es ließen sich keine Hinweise auf eine mit der Wuchsform der Arten korrelierte biologische Aktivität sammeln. In einem Freilandversuch zur Untersuchung der besiedlungshemmenden Wirkung der Extrakte konnte gezeigt werden, dass einige Ascidien eine chemische Abwehr von Algensporen oder Epibionten aufweisen, die artspezifisch unterschiedlich stark ausgeprägt ist. Alle Ascidienarten bewiesen antimikrobielle Aktivität, es ergaben sich aber sowohl in der Hemmhofbreite als auch in der Anzahl der gehemmten Bakterienstämme große artspezifische Unterschiede. Auffallend war, dass deutlich mehr Gram-positive sowie marine Bakterienstämme als Gram-negative bzw. nicht-marine Bakterienstämme inhibiert wurden. Im Gegensatz zur antimikrobiellen Aktivität wurden in den Assays zur Cytotoxizität und zur spezifischen Enzymhemmung lediglich bei jeweils vier Ascidienarten positive Effekte festgestellt. Durch die spezifische Anfärbung von Zellorganellen konnten morphologische Veränderungen, die durch die Ascidienmetaboliten in den Mausfibroblasten induziert wurden, sichtbar gemacht und der Einfluß der Extrakte auf das Cytoskelett und spezifische Zellfunktionen dokumentiert werden. Im Protein-Tyrosin-Kinase-Assay führte eine Bioassay-guided Fractionation von Extrakten der Ascidie Dendrodoa grossularia zur Isolierung der aktiven Substanz. Über spektroskopische Methoden sowie den Vergleich mit Literaturdaten konnte der enzymhemmende Metabolit als das Guanidinostyren Tubastrin identifiziert werden. Tubastrin wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals in Tunikaten nachgewiesen. Der Metabolit zeigte als Reinsubstanz nur geringe cytotoxische Effekte und keine antimikrobiellen Eigenschaften. Als weitere Metaboliten der Ascidien Dendrodoa grossularia und Ascidiella aspersa wurden Homarin, Betain, Adenosin und Inosin identifiziert. Keiner dieser Substanzen konnte in der vorliegenden Arbeit eine biologische Aktivität zugeordnet werden. Während Betain, Adenosin und Inosin Funktionen innerhalb des Primärmetabolismus besitzen oder als Zwischenprodukte in Synthesewege eingebunden sein können, stellt Homarin einen Sekundärmetaboliten dar, der in einer Vielzahl von marinen Organismen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Seine Aufgabe in Tunikaten muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden. Dass antimikrobielle Aktivität bei allen Ascidienarten gefunden wird, lässt auf eine grundlegende Bedeutung prokaryontischer Abwehr schließen. Die Unterschiede in der Stärke der Effekte aller Bioassays legen nahe, dass jede Ascidienart eine eigene Gesamtstrategie zur Verteidigung gegen Bewuchs und Fraßfeinde ausgebildet hat. Die aus den Laborversuchen erhaltenen Daten verdeutlichen eine weitreichende biologisch-chemische Aktivität von Aplidium punctum, Dendrodoa grossularia und Didemnum candidum, die neben der antimikrobiellen auch starke cytotoxische und/oder enzymhemmende Wirkung gezeigt haben. Die Lokalisation der aktiven Substanzen im Tier sowie eingehendere Versuche zur molekularen Wirkungsweise sind notwendig, die beobachteten Aktivitäten umfassend zu deuten und ihre Nutzbarkeit unter pharmakologischen Gesichtspunkten zu evaluieren.
Trait-dependent effects of biotic and abiotic filters on plant regeneration in Southern Ecuador
(2024)
Tropical forests have always fascinated scientists due to their unique biodiversity. However, our understanding of ecological processes shaping the complexity of tropical rainforests is still relatively poor. Plant regeneration is one of the processes that remain understudied in the tropics although this is a key process defining the structure, diversity and assembly of tropical plant communities. In my dissertation, I combine experimental, observational and trait-based approaches to identify processes shaping the assembly of seedling communities and compare associations between environmental conditions and plant traits across plant life stages. By working along a steep environmental gradient in the tropical mountains of Southern Ecuador, I was able to investigate how processes of plant regeneration vary in response to biotic and abiotic factors in tropical montane forests.
My dissertation comprises three complementary chapters, each addressing an individual research question. First, I studied how trait composition in plant communities varies in relation to the broad- and local-scale environmental conditions and across the plant life cycle. I measured key traits reflecting different ecological strategies of plants that correspond to three stages of the plant life cycle (i.e., adult trees, seed rain and recruiting seedlings). I worked on 81 subplots along an elevational gradient covering a large climatic gradient at three different elevations (1000, 2000 and 3000 m a.s.l.). In addition, I measured soil and light conditions at the local spatial scale within each subplot. My findings show that the trait composition of leaves, seeds and seedlings changed similarly across the elevational gradient, but that the different life stages responded differently to the local gradients in soil nutrients and light availability. Consequently, my findings highlight that trait-environment associations in plant communities differ between large and small spatial scales and across plant life stages.
Second, I investigated how seed size affects seedling recruitment in natural forests and in pastures in relation to abiotic and biotic factors. I set up a seed sowing experiment in both habitat types and sowed over 8,000 seeds belonging to seven tree species differing in seed size. I found that large-seeded species had higher proportions of recruitment in the forests compared to small-seeded species. However, small-seeded species tended to recruit better in pastures compared to large-seeded species. I showed that high surface temperature was the main driver of differences in seedling recruitment between habitats, because it limited seedling recruitment of large-seeded species. The results from this experiment show that pasture restoration requires seed addition of large-seeded species and active protection of recruiting seedlings in order to mitigate harmful conditions associated with high temperatures in deforested areas.
Third, I examined the associations between seedling beta-diversity and different abiotic and biotic factors between and within elevations. I applied beta-diversity partitioning to obtain two components of beta-diversity: species turnover and species richness differences. I associated these components of beta-diversity with biotic pressures by herbivores and fungal pathogens and environmental heterogeneity in light and soil conditions. I found that species turnover in seedling communities was positively associated with the dissimilarity in biotic pressures within elevations and with environmental heterogeneity between elevations. Further, I found that species richness differences increased primarily with increasing environmental heterogeneity within elevations. My findings show that the associations between beta-diversity of seedling communities and abiotic and biotic factors are scale-dependent, most likely due to differences in species sorting in response to biotic pressures and species coexistence in response to environmental heterogeneity.
My dissertation reveals that studying processes of community assembly at different plant life stages and spatial scales can yield new insights into patterns and processes of plant regeneration in tropical forests. I investigated how community assembly processes are governed by abiotic and biotic filtering across and within elevations. I also experimentally explored how the process of seedling recruitment depends on seed size-dependent interactions, and verified how these effects are associated with abiotic and biotic filtering. Identifying such processes is crucial to inform predictive models of environmental change on plant regeneration and successful forest restoration. Further exploration of plant functional traits and their associations with local-scale environmental conditions could effectively support local conservation efforts needed to enhance forest cover in the future and halt the accelerating loss of biodiversity.
Folgend auf den ersten Realisierungen von Bose-Einstein Kondensaten erschienen weitere innovative Experimente, die sich in den optischen Gittern gefangenen Quantengasen widmeten. In diesen zahlreichen, wissenschaftlichen Untersuchungen konnten die Eigenschaften von Bose-Einstein Kondensaten besser verstanden werden. Das Prinzip von Vielteilchensystemen, gefangen in einem periodischen Potential, bot eine Plattform zur Untersuchung weiterer Quantenphasen.
Eine konzeptionell einfache Modifikation von solchen Systemen erhält man durch die Kopplung der Grundzustände der gefangenen Teilchen an hoch angeregten Zuständen mithilfe einer externen Lichtquelle. Im Falle dessen, dass diese Zustände nahe der Ionisationsgrenze des Atoms liegen, spricht man von Rydberg-Zuständen und Atome, welche zu diesen Zuständen angeregt werden, bezeichnet man als Rydberg-Atome. Eines der vielen charakteristischen Eigenschaften von Rydberg-Atomen ist die Fähigkeit über große Entfernungen jenseits der atomaren Längenskalen zu wechselwirken. Im Rahmen von Vielteilchensystemen wurden dementsprechend Kristallstrukturen aus gefangenen Rydberg-Atomen experimentell beobachtet.
Nun stellt sich die Frage, was mit einem gefangenen Bose-Einstein Kondensat passiert, dessen Teilchen an langreichweitig wechselwirkenden Zuständen gekoppelt sind. Gibt es ein Parameterregime, in dem sowohl Kristallstruktur als auch Suprafluidität in solchen Systemen koexistieren können? Dies ist die zentrale Frage dieser Arbeit, die sich mit der Theorie von gefangenen Quantengasen gekoppelt an Rydberg-Zuständen auseinandersetzt.
Auswirkung der Chemisorption von Organothiolaten auf den elektrischen Widerstand dünner Goldfilme
(2018)
Hochgeordnete Monolagen von Organothiolaten auf Goldoberflächen bilden sich bei Kontakt einer Goldoberfläche mit einer Lösung eines Thiols oder Thioacetats spontan aus. Die Adsorption auf dünnen Metallfilmen mit Schichtdicken im Bereich von 25 - 100 nm führt zu einer Änderung des elektrischen Widerstandes des Films, die an Goldfilmen mit Schichtdicken von 25 - 40 nm über eine einfache Zweipunktmessung verfolgt wurde. Die Proportionalität der Widerstandsänderung mit der Menge an adsorbiertem Material konnte für die in dieser Arbeit verwendeten Dünnschichtsensoren bestätigt werden. Zu diesem Zweck wurden gleichzeitig Widerstands- und Oberflächenplasmonenresonanzmessungen an 40 nm starken Goldfilmen durchgeführt. In diesen Experimenten zeigt sich die Widerstandsmessung zur Beobachtung der Adsorptionskinetik als die überlegene Technologie.
Die durch Mikrokontaktdrucken und Freiätzen der gedruckten Strukturen hergestellten Sensoren zeigen eine individuelle Signalintensität. Die Normierung auf die maximale, durch Belegung mit Hexadecanthiol (HDT) oder Dodecanthiol erreichte, Signalstärke ermöglichte den Vergleich der maximalen Signalstärke von Thiolatmonolagen, die durch Belegung mit n-Alkanthiolen (CH_3(CH_2)_(n-1)-SH mit n = 12, 16, 19, 22 und 33, Cn), 11-Mercaptoundecyl-hexaethylenglycol (HSC11EG6OH), Adamantan-1-thiol (AdaSH), Triptycenthiol (TrpSH), Anthracen-2-thiol (Ant-0SH), Anthracen-2-alkanthiolen (Ant-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 5 und 10, Ant-nSH), p-Terphenyl-4-thiol (TP0SH), p-Terphenyl-4-alkanthiolen (TP-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 4, TPnSH) und p-Terphenyl-4-ethanthioacetat (TP2SAc) erzeugt wurden. Die Größe der Widerstandsänderung zeigt eine deutliche Abhängigkeit vom organischen Rest des Oberflächenadsorbats. Für die Verstärkung des Signals wurde die folgende Reihenfolge gefunden: Trp > Ada > Ant-0 > Ant-1 > TP0 > TP1 > Ant-2 > TP2 > Cn (n = 12 - 33) = C11EG6OH = Ant-n (n = 3 - 11) = TPn (n = 3, 4). Bei bekannter Verstärkung des Signals durch ein Adsorbat kann unabhängig von der Oberflächenrauigkeit die Oberflächenbedeckung durch Chemisorbate in einer Güte bestimmt werden, die der durch STM- und TEM-Messungen erreichten vergleichbar ist. Die Methode wurde angewendet, um Schichten von TP2SH und TP2SAc, die bei 20 und 60 °C aus ethanolischer Lösung abgeschieden wurden, zu vergleichen. Die Unterschiede in der Oberflächendichte, die durch eine Erhöhung der Abscheidungstemperatur zu beobachten sind, können durch eine Beschleunigung der Reaktion nach Arrhenius erklärt werden. Auch die Temperaturabhängigkeit der Abscheidungsgeschwindigkeit von HDT aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen, die in einem Bereich von -10 °C bis +30 °C betrachtet wurde, ist mit dem Arrhenius'schen Ansatz konform. Die Aktivierungsenergie der Adsorption von HDT auf Gold wurde auf E_a = 23 +-6 kJ/mol bestimmt.
Die Konzentrationsabhängigkeit der Abscheidung aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen wurde für HDT, AdaSH, TP2SH und TP2SAc untersucht. Um eine Präadsorption der Thiole vor dem eigentlichen Start der Messung zu verhindern, wurde eine Apparatur mit einem Diaphragma aus Aluminium entwickelt, das beim Start der Messung mit dem Sensor durchstoßen wird. Mit Ausnahme von TP2SH zeigen alle Adsorptive ein Adsorptions-Desorptions-Gleichgewicht. Die Adsorptionsisothermen bei 20 °C lassen sich am besten durch die Freundlich-Isotherme beschreiben. Während die Reaktionsordnung im Adsorbat für die Adsorption der Thiole nahe an 1 liegt, hat sie für die Adsorption von TP2SAc einen Wert von ca. 1/4. Damit ergibt sich für die Geschwindigkeitskonstante der Adsorption k_a(HDT) = (2,3 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(AdaSH) = (6,1 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(TP2SH) = (7,3 +-0,4) 10^3 L/(mol s) und k_a(TP2SAc) = (8 +-3) 10^-2 L^(1/4)/(mol^(1/4) s). Die Adsorptionskurven der Thiole weisen bei Konzentrationen unterhalb von 5 10^-5 mol/L einen linearen Bereich auf, der einer zwischenzeitlichen Diffusionskontrolle zugeordnet wird.
An die aufgenommenen Adsorptionskurven der Thiole wurden literaturbekannte Modelle numerisch angepasst und teilweise weiterentwickelt. Die Anpassung konnte durch die Einführung einer vor der Oberfläche gelagerten Diffusionsgrenzschicht, in welcher der zeitabhängige Verlauf der Analytkonzentration in einem System von 10 Schichten berechnet wurde, deutlich verbessert werden. Von allen getesteten Modellen zeigt nur die Adsorption mit Ausschlussmuster keine Konzentrationsabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante der Desorption. Dieses Modell bezieht den Verlust von Adsorptionsplätzen mit ein, die einem besetzten Adsorptionsplatz benachbart sind und durch das adsorbierte Teilchen verdeckt werden. Der daraus resultierende Zusammenhang zwischen der Konzentration freier Adsorptionsplätze und dem Bedeckungsgrad der Oberfläche Theta_F(Theta) ist abhängig vom Verhältnis der Stoßfrequenz zwischen den Teilchen und der Oberfläche zur Platzwechselfrequenz der Teilchen auf der Oberfläche. Zur Bestimmung von Theta_F(Theta) für die numerische Anpassung der Adsorptionskurven von HDT und TP2SH wurde die Oberflächenbesetzung in einem Monte-Carlo-Verfahren für eine Konzentrationsreihe in Zehnerpotenzschritten simuliert.
Wirksamkeit von Articain und Lidocain bei verschiedenen Verfahren der zahnärztlichen Lokalanästhesie
(2003)
Articain und Lidocain sind die in der Zahnheilkunde am häufigsten verwendete Lokalanästhetika. Beide Substanzen besitzen eine ähnliche lokalanästhetische Wirksamkeit, sind jedoch in unterschiedlich konzentrierter Lösung im Handel. Articain ist das einzige Lokalanästhetikum, das einerseits in hoher Konzentration (4 %), andererseits mit gering konzentriertem Adrenalin-Zusatz (1:200.000 und 1:400.000) verfügbar ist. Lokalanästhetika werden nach der Wirkung dosiert. Wenn die lokalanästhetische Wirkung aufgrund zu geringer Konzentration von Lokalanästhetikum oder Vasokonstriktor unzureichend ist, kann durch eine Nachinjektion in der Regel eine vollständige Wirkung erzielt werden. Da bei der intraligamentären Injektionstechnik nur sehr geringe Volumina in den engen Desmodontalspalt injiziert werden können, kann bei dieser Technik eine unzureichende Wirkung nicht durch eine Dosiserhöhung kompensiert werden. Daher erscheint für die intraligamentäre Anästhesie eine höher konzentrierte Lösung als geeignet. In einer Vergleichsuntersuchung sollte die lokalanästhetische Wirkung handelsüblicher Articain- und Lidocain-Lösungen für die intraligamentäre Anästhesie überprfüt werden. In einer 6-fach-cross-over-Untersuchung erfolgte bei 25 gesunden Probanden an einem Prämolaren eine Lokalanästhesie durch submuköse Infiltration und intraligamentäre Injektion mit 4 % Articain mit Adrenalin 1:200.000 bzw. 1:100.000 sowie 2 % Lidocain mit Adrenalin 1:100.000. Die Anästhesietiefe wurde mittels elektrischer Sensibilitätsprüfung bestimmt. Eine vollständige Anästhesie konnte bei Infiltrationsanästhesie in praktisch allen Fällen erzielt werden, die Anästhesiedauer zeigte zwischen den drei lokalanästhetischen Lösungen keine Unterschiede. Bei der intraligamentären Anästhesie zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den 4-prozentigen und der 2-prozentigen Lösung. Sowohl der Anteil der vollständigen Anästhesiewirkung als auch die Dauer der Anästhesie war bei den beiden 4-prozentigen Lösungen deutlich höher als bei der 2-prozentigen Lösung. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung sind 4- prozentige Articain-Lösungen für die intraligamentäre Anästhesie uneingeschränkt geeignet, wobei die Zubereitung mit der höheren Adrenalin-Konzentration keine Vorteile bietet. Die handelsübliche 2-prozentige Lidocain-Lösung ist aufgrund deutlich geringerer Wirksamkeit für diese Technik weniger geeignet.
Zwischen Juni 2006 und Juni 2007 wurde in unserem Zentrum bei 24 Patienten im Alter von 52 bis 86 Jahren und einem durchschnittlichen Alter von 73,9 ± 8,4 Jahren der interventionelle Verschluss des Vorhofohrs mit dem neuen WATCHMAN-Okkluder versucht. 61% der Patienten waren männlich, 39% weiblich. Im Mittel ergab der CHADS₂-Wert 2,6 ± 1,2 bei Werten zwischen 1 und 5. Damit lag das jährliche Schlaganfallrisiko bei 5,6 ± 3,0%. Die Ostienweite der Vorhofohren betrug zwischen 17,6mm und 26,4mm, der durchschnittliche Wert lag bei 21,8 ± 2,2mm. Die Länge der Vorhofohren variierte zwischen 25,0mm und 45,7mm bei einer mittleren Länge des Vorhofohrs von 33,5 ± 5,5mm. Watchman-Okkluder mit einem Schirmdurchmesser von 27mm waren mit 52% die am häufigsten implantierten Okkluder. Die technische Erfolgsrate betrug 95,8%. Die Implantation der Okkluder dauerte 43,9 ± 14,0 Minuten (19,0 bis 70,0 Minuten). Die Durchleuchtungszeiten betrugen 5,7 bis 18,1 Minuten (im Mittel 8,7 ± 3,0 Minuten). Es wurden zwischen 57 und 193ml Kontrastmittel während des Eingriffs benötigt (durchschnittlich 131 ± 44ml). Die postinterventionelle stationäre Krankenhausaufenthaltszeit betrug im Durchschnitt 2,8 ± 4,1 Tage (1 bis 21 Tage). Bei einer technischen Erfolgsrate des Eingriffs von 95,8% (23/24 Fällen) betrug die Verschlussrate 100%, so dass bei allen Patienten Marcumar abgesetzt werden konnte. Auch bei allen nachfolgenden transösophagealen Echo-Kontrolluntersuchungen betrug die Verschlussrate 100%. Der Unterschied der Verschlussrate war im Vergleich zu den Ergebnissen anderer Studien über interventionelle Vorhofohrverschlüsse statistisch nicht signifikant. In der vorliegenden Arbeit lag das nach dem CHADS₂-Score kalkulierte jährliche Risiko für ischämische Schlaganfälle bei 5,6%. Im gesamten Nachbeobachtungszeitraum von 37,6 Jahren bei einer mittleren Nachbeobachtung von 20,8 ± 3,3 Monaten traten in unserem Patientenkollektiv keine ischämischen Schlaganfälle auf. Bei einem Patienten trat nach 22 Monaten eine aphasische Episode mit begleitender Schwäche der rechten Körperseite auf. Bei diesem Ereignis kann eine TIA nicht ausgeschlossen werden. Dieses Ergebnis lässt sich mit den von Sick et al. publizierten Ergebnissen der multizentrischen Watchman-Studie [72] vergleichen. Innerhalb der Nachbeobachtungszeit traten keine Todesfälle und keine Okkluderembolisationen auf. Zwei Ereignisse (8,7%) traten innerhalb des ersten Monats nach der Implantation auf: Ein Patient entwickelte wenige Stunden nach dem Eingriff nach Beginn der Marcumarisierung eine rechtsseitige Kleinhirnblutung. Der INR-Wert einen Tag vor der Implantation hatte 2,0 betragen. Im Verlauf blieb eine leichte Schreibschwäche der rechten Hand zurück. Bei einem Patienten trat ein Perikarderguss auf. Nach einer Perikardiozentese sowie Absetzen von Aspirin und Marcumar war der Patient beschwerdefrei. Nach dem ersten Monat kam es bei mehreren Patienten zu Krankenhausaufenthalten: eine Humerusfraktur nach Sturz, eine gangränöse Pyodermie, eine entgleiste Hyperglykämie, eine Inguinalhernien-Operation, eine hypertensive Krise mit konsekutiver beatmungspflichtiger respiratorischer Insuffizienz, eine Defibrillator-Implantation nach rezidivierenden Synkopen, eine Pneumonie, drei exazerbierte COPDs, drei neu aufgetretene Belastungsdyspnoen, zwei NSTEMIs bei einem Patienten, ein Bänderriss, eine Defibrillatorimplantation, eine operative Spinalkanaldekompression, eine Schrittmacherimplantation, ein epileptischer Anfall, eine Überlaufinkontinenz, eine penetrierende Hornhautverletzung, eine sensorische Aphasie Die Patienten konnten in gutem Gesundheitszustand aus dem Krankenhaus entlassen werden.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit medizinischem Information-Retrieval in Volltext-Datenbanken und im World-Wide-Web. Information-Retrieval unterscheidet sich von Daten- oder Text-Retrieval dadurch, dass nicht nach Wörtern gesucht wird, die einem exakten Patternmatch folgend (Zeichen für Zeichen identisch) gefunden werden. Stattdessen wird eine vage Suchanfrage gestellt, bei der vielerlei Faktoren die Suchergebnisse beeinflussen können. So existieren von vielen Wörtern Schreibweisen-Variationen, wie etwa Cervix-Zervix. Auch kommen in medizinischen Texten, die im Routinebetrieb entstanden sind und die nicht korrekturgelesen wurden, viele Orthografie- bzw. Tipp-Fehler vor. Zusätzlich entstanden durch die Rechtschreibreform der deutschen Sprache weitere Schreibweisenvariationen (Elektrokardiograf-Elektrokardiograph). In der Medizin wird das Problem des Information-Retrieval noch dadurch vergrößert, dass eine Fach- und eine Umgangssprache existieren. So recherchiert ein Arzt als Kenner der Fachsprache nach “Tachykardie“, während ein Patient nach dem umgangssprachlichen “Herzrasen“ sucht. Für Information-Retrieval im World-Wide-Web ist die Nutzung von Suchmaschinen von elementarer Bedeutung. Auch Meta-Suchmaschinen haben sich etabliert. Darauf aufbauend wird das Modell einer thesaurus- und indexbasierten Meta-Suchmaschine entwickelt und implementiert. Dieses Modell bietet - im Vergleich zu klassischen Volltext- und Meta-Suchmaschinen - einige Vorteile. So entsteht z.B. nur sehr geringer Speicherplatzbedarf, es ergeben sich schnelle Zugriffszeiten, trotzdem wird kein eigener Crawler benötigt. Zur Lösung der Probleme werden Thesauri und die Fuzzy-Set-Theorie eingesetzt: * Die Theorie der unscharfen Mengenlehre (Fuzzy-Set-Theorie) wird genutzt, um Differenzen in der Schreibweise zu eliminieren. Dazu wird ein neuer Algorithmus entwickelt, der - basierend auf einem klassischen, etablierten Algorithmus - bessere Retrieval-Ergebnisse bei gleichzeitig geringerer Laufzeit ergibt. Er basiert auf Buchstabengruppen (sog. n-Gramme) und wurde am Beispiel der Größe n = 3 (Trigramme) implementiert und getestet. * Thesauri sind Datenbanken, die W¨orter und Relationen zwischen Wörtern enthalten. Sie werden in der vorliegenden Arbeit extensiv f¨ur Crawling, Ranking, Information-Retrieval und Meta-Suche eingesetzt. Fuzzy-Set-Theorie und Thesauri dienen zusammen der Modellierung des ungenauen Wissens für das Information-Retrieval. Test und Evaluation finden anhand von drei verschiedenen Textmengen statt. Die Suchmöglichkeiten für das Information-Retrieval werden komplex gestaltet. Es wird sowohl eine Operatorpriorität als auch Setzung von Prioritätsklammern ermöglicht. Dazu werden Techniken der formalen Sprachen und des Compilerbaus eingesetzt. Für die Ausgabe der Seiten werden spezifische Verfahren entwickelt, die Seite bezüglich der Relevanz zu bewerten, das sog. Ranking. Insgesamt werden drei verschiedene Ranking-Verfahren vorgestellt und implementiert. Die Realisierung erfolgt komplett XML-basiert mit einem Schwerpunkt auf XSLT. Als Ausgabeformate stehen XML, HTML und PDF zur Verfügung.
Classical Hodgkin lymphoma (cHL) is one of the most common malignant lymphomas in Western Europe. The nodular sclerosing subtype of cHL (NS cHL) is characterised by a proliferation of fibroblasts in the tumour microenvironment, leading to fibrotic bands surrounding the lymphoma infiltrate. Several studies have described a crosstalk between the tumour cells of cHL, the Hodgkin- and Reed-Sternberg (HRS) cells, and cancerassociated fibroblasts (CAF). However, to date a deep molecular understanding of these fibroblasts is lacking. Aim of the present study therefore was a comprehensive
characterisation of these fibroblasts. Moreover, only a few studies describe the interplay of HRS cells and CAF. The paracrine communication and direct interaction of these two
cellular fractions have been investigated within this study. Finally, the influence of a few HRS cells within a lymph node orchestrate the mere alteration of its architecture and
morphology. Gene expression and methylation profiles of fibroblasts isolated from primary lymph node suspensions revealed persistent differences between fibroblasts obtained from NS cHL and lymphadenitis. NS cHL derived fibroblasts exhibit a myofibroblastic - inflammatory phenotype characterised by MYOCD, CNN1 and IL-6 expression. TIMP3, an inhibitor of matrix metalloproteinases, was strongly upregulated in NS cHL fibroblasts, likely contributing to the accumulation of collagen in sclerotic bands of NS cHL. Treatment by luteolin could reverse this fibroblast phenotype and decrease TIMP3 secretion. NS cHL fibroblasts showed enhanced proliferation when they were exposed to soluble factors released from HRS cells. For HRS cells, soluble
factors from fibroblasts were not sufficient to protect them from Brentuximab-Vedotin(BV) induced cell death. However, HRS cells adherent to fibroblasts were protected from BV-induced injury. The cHL specific interaction of both cell fractions reveals an initiation of inflammatory key regulators such as IL13 and IL4. Among important adhesion molecules known from literature the blocking of integrin beta 1 solely interrupted the adhesion of HRS cells to CAF. In summary, this study proves the stable reprograming of CAF phenotype and expression derived from NS cHL. It presents a suitable in vitro model for studying the interaction of HRS cells and CAF by paracrine factors and adherence. Most importantly the observations confirm the importance of fibroblasts for HRS cells´ inflammatory niche and cell survival associated with TIMP3 which probably acts as a major factor to the typical accumulation of fibrosis observed in NS cHL.
Die Extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO) ist ein extrakorporales Organersatzverfahren, welches heutzutage insbesondere als Lungenersatzverfahren oder als kreislaufunterstützendes Verfahren zum Einsatz kommt. Seit dem ersten Einsatz 1971 im Rahmen eines posttraumatischen „Acute Respiratory Distress Syndrom“ (ARDS) ist die Zahl der ECMO-Behandlungen im kardiopulmonalen Bereich massiv gestiegen. Dennoch wird der Nutzen der ECMO kontrovers diskutiert. Die aktuellste randomisiert kontrollierte Studie aus dem Jahre 2018 konnte keinen signifikanten Nachweis erbringen, dass die Therapie des ARDS mittels einer ECMO einen Überlebensvorteil bringt. Randomisiert kontrollierte Studien bei Patienten mit kardiogenem Schock liegen zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht vor und für den Einsatz bei septischem Schock ist die Datenlage und Evidenz schwach. Angesichts der ungeklärten Evidenz und weil die ECMO ein komplexes, kostenintensives und mit Risiken verbundenes Verfahren ist, scheint eine sorgfältige Indikationsstellung unverzichtbar zu sein. Das Ziel unserer Studie war daher die Analyse der Mortalität bei Patienten mit Lungenversagen, kardiogenem Schock und septischem Schock. Darüber hinaus sollten mit der Mortalität assoziierte prognostische Variablen identifiziert werden. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob sich mit steigender Fallzahl eine Lernkurve beobachten lässt.
Zu diesem Zwecke führten wir eine retrospektive Kohortenstudie an 131 Patienten durch, die zwischen April 2011 und Juli 2016 in der Asklepios Klinik Langen mit einer ECMO behandelt wurden. Die Patienten wurden hierbei in die drei oben genannten Gruppen kategorisiert. Mithilfe logistischer Regression erfolgte die Identifizierung prognostischer Variablen. Eine Lernkurve wurde anhand des „non-risk-adjusted cumulative observed minus expected failure graph“-Verfahrens erstellt.
Die Analyse der Daten ergab eine Gesamtmortalität von 56%. Die Mortalität bei Patienten mit Lungenversagen, kardiogenem Schock und septischem Schock betrug 54%, 59% bzw. 58%. Bei Patienten mit Lungenversagen waren das Alter, das Jahr und weniger als 20 Fälle pro Jahr signifikant mit der Mortalität assoziiert. Bei Patienten mit kardiogenem Schock waren mit der Mortalität assoziierte Variablen das Alter, der SAPS II-Score, der pH-Wert, der Serumlaktatwert prä-ECMO, der Basenüberschuss prä-ECMO sowie eine Hyperlipidämie. Bei Patienten mit septischem Schock konnten keine mit der Mortalität assoziierten Variablen identifiziert werden. In der multivariaten Regressionsanalyse nach Modellabbau zeigten sich in der gesamten Kohorte das Alter, das prä-ECMO Serumlaktat sowie weniger als 20 Fälle pro Jahr als signifikant mit der Mortalität assoziierte Variablen. Patienten, die vor 2014 behandelt wurden, also in einem Zeitraum mit weniger als 20 ECMO-Fällen pro Jahr, hatten eine signifikant höhere Mortalität als Patienten die im Intervall 2014-2016 behandelt wurden. Mit steigender Fallzahl konnte eine Lernkurve nachgewiesen werden, die einen Wendepunkt im Jahr 2014 zeigte. Der im Jahr 2014 beginnende Abwärtstrend signalisierte eine geringere Sterblichkeitsrate als erwartet.
Zusammenfassend ist die Mortalität in allen Indikationen weiter hoch. Die Fallzahl und damit auch die Erfahrung scheint eine wichtige Rolle in Bezug auf die Mortalität zu spielen. Des Weiteren unterstützen unsere Ergebnisse frühere Studien, die einen Einfluss des Alters und des prä-ECMO Laktat-Wertes auf die Mortalität zeigen konnten.
Compared to all other organisms with 1 to 3 heat stress transcription factors (Hsfs) or Hsf-related factors, plants have extraordinarily large Hsf families with more than 20 Hsfs. Plant Hsfs are classified into three classes according to their oligomerization domains which is built of hydrophobic heptad repeats (HR) in two parts, HR-A and HR-B. Both parts may be immediately adjacent (class B), or they are separated by insertion of 21 (class A) and 7 amino acid residues (class C). In plant Hsf family, detailed investigations are so far limited to Hsfs A1a, A2, A3, A4d, A9, and B1. They strongly indicate functional diversification to be the main reason for the coexistence of multiple Hsfs. As an example the functional triad of HsfA1a, HsfA2, and HsfB1 is essential for all three phases of the hs response, (i) the triggering of the response by HsfA1a as master regulator, (ii) the maintenance and high efficiency of hs gene transcription by cooperation of HsfA1a with Hsfs A2 and B1, and finally, (iii) the restoration of house-keeping gene transcription during the recovery phase mediated by HsfB1 in cooperation with house-keeping transcription factors. The results presented in this thesis for Hsfs A4 and A5 open completely different aspects of functional diversification and cooperation of Hsfs. HsfA4 and HsfA5 homooligomerize and bind to corresponding HSE motifs. But in contrast to the highly active HsfA4, HsfA5 is completely inactive as transcriptional activator. Yeast two hybrid and GST pull-down techniques showed that both Hsfs have strong tendency for heterooligomerization. Using fluorescence microscopy the HsfA4/A5 heterooligomers were found to localize in the nucleus. These complexes are transcriptionally inactive due to the impairment of DNA binding. The repressor function of HsfA5 requires only its OD and no additional factors, e.g. a putative co-repressor recruited by the C-terminal domain, are involved. Evidently, the repressor effect mainly results from the interference with the oligomeric state of HsfA4b, which is essential for efficient DNA binding and activator functions. EST database search revealed that plants have a single HsfA5 and usually two A4-type Hsfs. Using bioinformatics tools, Hsfs A4 and A5 were found to be phylogenetically closely related and clearly distinct from the other members of the Hsf family. On the basis of RT-PCR and Microarray data the representatives of the A4/A5 group are well expressed in different plant tissues albeit at very different levels which change with the developmental stages and stress conditions In rice and Arabidopsis, HsfA4 functions as an anti-apoptotic factor for stress induced oxidative damages. Based on my results, I hypothesize that HsfA5 functions as a novel type of selective repressor, regulating the function of A4-type Hsfs in plants. Considering the high sequence conservation with in plant Hsf family, it is tempting to speculate that this role of Hsf4/A5 pair is a fundamental feature of the Hsf system in plants.
Das Ziel dieser prospektiven Studie war es , die technische Durchführbarkeit sowie klinische und radiologische Ergebnisse nach interkorporeller Fusion durch einen mit autologer Spongiosa gefüllten AcroMed Cervical I/F Cage (DePuy AcroMed
international, UK) nach ventraler zervikal er Diskektomie darzustellen. Über einen Zeitraum von 32 Monaten wur den in der Abteilung für Neurochirurgie (die zum Südharz-Krankenhaus Nordhausen gGmb H gehört) 50 aufeinander folgende Patienten operiert, bei welchen klinische Zeichen einer zervikalen Radikulopathie, Radikulomyelopathie oder einem Zervikalsyndrom mit monosegmentalen Bandscheibenvorfällen und/oder Spondylose nachzuweisen waren. Die Studie schloss 24 Frauen durchschnitt- lich 43.4 Jahre alt (25.4 – 59.7) und 26 Männer durchschnitt- lich 44.0 Jahre alt (29.8 – 64.6) ein. Die Dauer der Symptome betrug 1 bis 61 Monate (Mittel: 12.5 Monate). Alle Patienten wu rden prä- und postoperativ durch mich untersucht, ihre klinischen Beschwerden detailliert und standardisiert aufge- nommen. Alle Komplikationen wurden dokumentiert. Die funktio- nelle Behinderung wurde mittels Neck Pain Disability Index (NDI, Bereich 0-100) quantifiziert. Das klinische Ergebnis wurde get rennt vom Patienten und Untersucher als ausgezeich- net, gut, befri edigend oder schlecht unter Verwendung ODOM`S Kriterien eingeschätz t. Nach einer mittleren Nachuntersu- chungszeit von 14 Monaten (12-25 Monate) betrug der mittlere NDI 12,3 (0-84) gegenüber vor Operation 65.2 (44-88). Die Untersucher-Klassifikati on ergab 48% ausgezeichnete, 38% gute, 12% befriedigende und 2% schlechte Erge bnisse, 87.5% der ausgezeichneten und 89.5% der guten Gruppe kehrten zum Arbeits platz zurück. Im Vergleich ergab die Patienten-Klassifikation 58% ausgezeichnete, 32% gute, 8% befriedigende und 2% schlechte Ergebnisse, 93% der ausgezeichneten und 68.75% der guten Gruppe kehrten zum Arbeitsplatz zurück. Das Verfahren ist technisch einfach. Der Cervical I/F Cage steigert die zur Dekompression de r Nervenwurzel notwendige Höhe des Neuroforamens wirksam. Eine knöcherne Fusion wurde in 98% erreicht, die Keilform des Cages trägt zur Wiederherstel- lung der Lordose bei.
Seit mehr als 200 Jahren gibt es durch die Wissenschaftler der Wetterstation auf dem Hohenpeißenberg systematische Wetterbeobachtungen, doch erst seit wenigen Jahren gibt es unter den Klimaforschern einen Konsens, dass sich das Klima durch anthropogene Einflüsse schon verändert hat – und weiter verändern wird. Die bisherigen Auswirkungen, wie zum Beispiel ein globaler Temperaturanstieg von 0,85°C seit Beginn der Industrialisierung, sind heute gut belegbar. Mögliche zukünftige Entwicklungen des Klimas werden heute ebenso erforscht wie die Auswirkungen des Klimawandels auf Mensch und Umwelt. Zu diesen Auswirkungen gehören unter anderem Folgen für die Landwirtschaft. Durch veränderte Niederschläge und den Temperaturanstieg werden sich die Lebensbedingungen von Bodenorganismen und Anbaubedingungen für Pflanzen ändern. Letztendlich ist aufgrund dieser Veränderungen auch ein verstärkter Einsatz von Pestiziden zu erwarten. Allerdings wurde bisher kaum untersucht, ob der Einsatz von Pestiziden in der Landwirtschaft unter den Bedingungen des Klimawandels (konkret durch die Interaktion von klimatischen und chemischen Faktoren) ein erhöhtes Umweltrisiko für Bodenorganismen darstellt. Bisher werden klimatische Faktoren bei den Tests für die Zulassung von Pestiziden nicht berücksichtigt.
Daher wurde diese Fragestellung in der hier vorliegenden Dissertation am Beispiel der Effekte von zwei zugelassenen Pestiziden auf Bodenorganismen unter verschiedenen klimatischen Bedingungen untersucht. Konkret wurden dazu mit Labor- und Halbfreilandversuchen die Wirkung eines Insektizids und eines Fungizids in Interaktion von Temperatur und Bodenfeuchte auf Vertreter zweier Invertebratengruppen (Collembola: zwei Arten; Enchytraeidae: eine Art) untersucht.
In einem modifizierten Standardtest mit Collembolen erhöhte sich die Toxizität des Insektizids Lambda-Cyhalothrin, wenn die Exposition der beiden Arten bei einer erhöhten Bodenfeuchte stattfindet. Die kühl adaptierte Art Folsomia candida reagierte bei erhöhter Testtemperatur am empfindlichsten auf diese Testsubstanz: Die EC50 aus diesem Experiment lag bei 2,84 mg (a.s.)/kg Boden Trockengewicht (dw). Unter Standardbedingungen, wie sie in Tests für die Zulassung von Pestiziden angewandt werden, lag die EC50 von F. candida dagegen bei 8,65 mg a.s./kg dw.
Unter den gleichen Versuchsbedingungen wurde auch das Fungizid Pyrimethanil an Collembolen getestet. Hier erwies sich die Testsubstanz für beide Arten bei
gleichzeitigem Trockenstress und / oder erhöhter Temperatur als toxischer im Vergleich zu den Standard-Testbedingungen. Dabei zeigte F. candida mit einer EC50 von 28,3 mg a.s./kg dw die höchste Empfindlichkeit. Ohne die veränderten klimatischen Faktoren, betrug die EC50 von F. candida 52,3 mg a.s./kg dw.
In Reproduktionstests mit der Enchytraeen-Art Enchytraeus bigeminus wurde die Bodenfeuchte als klimatischer Faktor in Kombination mit jeweils einer Testsubstanz untersucht. Bei beiden Chemikalien reagierte E. bigeminus in trockenem Boden empfindlicher. Die ermittelten EC50 betrugen 1,34 mg a.s./kg dw für Lambda-Cyhalothrin und 437 mg a.s./kg dw für Pyrimethanil. Getestet unter Standardbedingungen lagen die EC50-Werte bei 3,79 bzw. 499 mg a.s./kg dw.
Neben den Laborexperimenten wurden Tests in „Terrestrischen Modellökosystemen“ (TME) mit den gleichen Chemikalien in Kombination mit variierender Bodenfeuchte als klimatischer Faktor vorgenommen. Diese Experimente wurden in Deutschland und in Portugal durchgeführt, um die Reaktion einer zentraleuropäischen und einer mediterranen Artengemeinschaft zu untersuchen. Aus der terrestrischen Lebensgemeinschaft wurden verschiedene Organismengruppen untersucht. Die Effekte auf Enchytraeen aus dem Experiment mit Pyrimethanil waren als Veröffentlichung Teil dieser Dissertation. In der portugiesischen Halbfreilandstudie wurden keine Effekte auf die Enchytraeen durch Pyrimethanil bei umweltrelevanten Konzentrationen festgestellt, jedoch beeinflusste die Bodenfeuchte die Zusammensetzung der Artengemeinschaft. Im deutschen TME-Experiment wurde eine verstärkte Wirkung des Fungizids in trockenem Boden festgestellt, d.h. die jeweiligen Effektkonzentrationen (niedrigste EC50 3,48 mg a.s./kg dw für Fridericia connata in trockenem Boden) lagen deutlich unterhalb der aus den Labortests mit Enchytraeus bigeminus bekannten Werten (499 mg a.s./kg dw).
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass klimatische Faktoren die Effekte von Pflanzenschutzmittel auf Bodenorganismen beeinflussen können. Für Laborversuche ist eine generelle Berücksichtigung von klimatischen Faktoren im Zulassungsverfahren aus heutiger Sicht zu weit gegriffen. Die TME-Versuche zeigten sich als geeignetes Testverfahren, interaktive Effekte von Pestiziden und Klima bzw. multiplen Stressoren generell auf Artengemeinschaften zu untersuchen. Für TME-Experimente wäre unter Beachtung der Vielzahl möglicher Fragestellungen, Endpunkte und moderner statistischer Auswerteverfahren eine internationale Richtlinie wünschenswert.
Acute myeloid leukemia (AML) is a hematopoietic cell disorder characterized by a block in differentiation and increased proliferation and survival of malignant blasts. Expansion of the malignant cell clone effects the normal production of blood cells and – if left untreated – leads to death. Receptor tyrosine kinases (RTKs) play an important role in the pathogenesis of AML, as they are either often mutated or overexpressed. In normal hematopoiesis, RTK signal termination is tightly controlled, and involves ubiquitination, internalization, endocytosis and degradation. Cbl proteins are E3 ligases and have been shown to ubiquitinate several activated RTKs, including Flt3 and Kit, targeting them for degradation. Recently, several Cbl mutations have been identified: Cbl-R420Q was identified in an AML patient and Cbl-70Z was identified in a mouse lymphoma model. In this thesis work, the role of these Cbl mutants in Kit signaling and in a mouse transplantation model was studied. Cbl mutants (Cbl-R420Q, Cbl-70Z) have the ability to transform the myeloid 32D cell line in cooperation with Kit WT. Cbl mutants along with Kit promoted interleukin-3 (IL3)-independent proliferation and enhanced the cell survival of 32D cells. In contrast, expression of the Cbl mutants alone did not confer IL3-independent growth. Stem cell factor (SCF, the Kit ligand) dependent growth was enhanced in the presence of Cbl mutants and Cbl mutants promoted colonogenic growth in the presence of Kit. Furthermore, Cbl mutants inhibited the ubiquitination of the activated Kit receptor. In addition, Cbl mutants inhibited the endocytosis of the activated Kit receptor. Retroviral expression of Cbl mutants in transplanted bone marrow induced a generalized mastocytosis, a myeloproliferative disease and, in rare care cases, myeloid leukemia. Splenomegaly was observed in the presence of Cbl mutants. Furthermore, mast cells with variable range of infiltration were noticed in all the vital organs (spleen, liver, bone marrow, lung, kidney, heart) of Cbl (mutant) transplanted mice. Almost all recipients of bone marrow cells transduced with Cbl mutants developed a lethal hematologic disorder with a mean latency of 341 days in the Cbl-R420Q group and 395 days in the Cbl-70Z group. This is the first published report on a hematological disease with Cbl mutants in a mouse model. Co-immunoprecipitation studies indicated that Cbl-70Z binds to Kit, even in the absence of Kit ligand. Cbl-R420Q also bound to Kit in the absence of SCF, albeit to a lesser extent. Association of Cbl mutants to Kit was enhanced in the presence of SCF. Signaling studies demonstrated the constitutive activation of Akt and Erk in the presence of Cbl mutants and Kit. In addition, Cbl mutants enhanced the SCF-dependent Kit, Akt and Erk activation. Cbl-70Z, in association with kinase-dead Kit (Kit-KD) or kinase-dead Flt3 (Flt3-KD), conferred IL3-independent growth and survival to the myeloid 32D cell line. Cbl-R420Q provided only a slight growth advantage in the presence of Kit-KD. As demonstrated by pharmacological inhibition studies, Akt activation was necessary for the transformation mediated by Cbl-70Z and Kit-KD / Flt3-KD. Cbl mutants enhanced the Src family kinases (SFKs) activity. The pharmacological inhibition of SFK activity inhibited the proliferation and colonogenic growth. Interaction was found between Cbl-70Z, SFKs and Kit-KD. The SFK member Fyn was identified to bind to Cbl. In addition, kinase activity of SFKs was necessary for binding to Cbl, since SFKs inhibition by PP-2 abolished the binding between the complex-binding partners. Dasatinib and PP-2, both SFK inhibitors, inhibited the Cbl and Akt phosphorylation indicating that Fyn acts upstream of Akt. Inhibition of Kit with imatinib reduced the proliferation of cells overexpressing Kit WT and Cbl-70Z much stronger compared with cells expressing Kit-KD and Cbl-70Z, but much less than the dual KIT/SFK inhibitor dasatinib. This indicated that Kit kinase activity was required but not essential. The data presented in this thesis work implies that both RTK and SFK inhibition may have to be targeted, in order to effectively prevent transformation. In summary, the present thesis work indicates an important role of Cbl, Kit and SFKs in myeloid transformation and deregulated signal transduction.
Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
Der Natrium-abhängige Kaliumkanal Slack (KNa1.1, Slo2.2, KCNT1) nimmt eine Schlüsselrolle in der Regulation neuronaler Erregbarkeit ein, indem er die Ausbildung und Feuerungsfrequenz von Aktionspotentialen kontrolliert. Sowohl in Mäusen als auch in Menschen wird Slack besonders hoch in nicht-peptidergen C-Faser-Neuronen exprimiert. Wissenschaftliche Erkenntnisse der letzten Jahre konnten die Beteiligung von Slack-Kanälen in der Signalverarbeitung neuropathischer Schmerzen, aber auch in verschiedenen Arten von Pruritus, feststellen. Dabei zeigen Slack-defiziente Mäuse ein verstärktes mechanisches Schmerzverhalten nach einer peripheren Nervenverletzung und ein erhöhtes Kratzverhalten in akuten Juckreiz-Modellen. Das als Slack-Aktivator identifizierte trizyklische Neuroleptikum Loxapin zeigt sowohl analgetische als auch antipruritische Effekte in Mäusen, jedoch ist sein klinischer Einsatz auf Grund schwerwiegender antipsychotischer Nebenwirkungen limitiert. Basierend auf Loxapins Leitstruktur wurden daher in dieser Arbeit neue Slack-Aktivatoren mit einem verbesserten pharmakologischen Profil designed und ihr Potential für die Therapie von Schmerzen sowie akutem und chronischem Pruritus in vivo untersucht.
Untersuchung hochmolekularer Proteinkomplexe in menschlichen Leukämien mittels Proteomics-Werkzeugen
(2009)
Funktionelle Multiproteinkomplexe stellen im Sinne von Proteomics das kleinste isolierbare Proteom dar. Die Untersuchung von Proteinkomplexen gibt uns die Möglichkeit, Funktionen innerhalb der Zelle oder des Zellkompartiments genauer zu verstehen. Erst durch das Verständnis der einzelnen kleinen Zusammenspiele innerhalb einer Zelle, können wir die Auswirkungen auf ein betreffendes Organ und damit auf den Körper betrachten. Wir erhalten dadurch auch Informationen über die Funktion von spezifischen Genen und können so Erklärungsansätze für Gendefekte finden und über mögliche Therapieansätze nachdenken. Neben den Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen und dem Nachweis von Protein-Interaktionen mittels Immunopräzipitationsexperimenten stellt die Massenspektrometrie seit den 90er Jahren ein essentielles Werkzeug der Proteom-Forschung dar. Sie entwickelte sich zu einem etablierten Verfahren für die Charakterisierung von Biomolekülen und ermöglicht die Identifizierung unbekannter Proteine eines Komplexes. Das MLL-Gen auf Chromosom 11 Bande q23 ist in zahlreiche, reziproke chromosomale Translokationen verwickelt, die mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert sind. Chromosomale Translokationen des MLL-Gens werden aufgrund ihrer sehr schlechten Prognose und Therapierbarkeit als Hochrisiko-Leukämien eingestuft. Bis heute konnten 64 Translokations-Partnergene identifiziert werden, wobei das AF4-Gen mit 42% bei allen untersuchten Leukämien und mit ca. 66% bei ALL (akute lymphatische Leukämie) den größten Prozentsatz ausmacht. Bei der Translokation t(4;11) sind das MLL-Gen auf Chromosom 11 und das AF4-Gen auf Chromosom 4 beteiligt. Akute Leukämien mit einer t(4;11)-Translokation treten häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und betreffen vorwiegend den lymphatischen Zweig des blutbildenden Systems. Durch die Translokation entstehen zwei neue Derivatchromosomen – Derivat 11 (MLL•AF4, der11) und Derivat 4 (AF4•MLL, der4). Beide Fusionsgene verfügen über einen intakten Leserahmen und führen zur Expression der zwei Fusionsproteine MLL•AF4 (der11) und AF4•MLL (der4). Der pathomolekulare Mechanismus der t(4;11)-vermittelten ALL ist bis heute noch nicht hinreichend geklärt. Funktionen des der11-Fusionsproteins werden zwar schon intensiv erforscht, aber es gibt noch keine Erkenntnisse über die Funktion des der4-Fusionsproteins. Ähnlich sah die Situation zu Beginn dieser Arbeit für das AF4-Protein aus. Während schon einige Daten zur Funktion des MLL-Multiproteinkomplexes vorlagen, gab es nur wenige Informationen über die Funktion von AF4. Im Zuge dieser Arbeit wurden der AF4- und der der4-Multiproteinkomplex mittels affinitätschromatographischer Methoden aus transient transfizierten 293T-Zellen erfolgreich isoliert. Eine Größenbestimmung der Komplexe über eine Größenausschlusschromatographiesäule ergab für beide Komplexe eine Größe von ca. 2 MDa. Die Charakterisierung der beteiligten Interaktionspartner erfolgte mittels nLC-MALDI-MS/MS, Western Blot Analyse und Immunopräzipitation. Es konnte gezeigt werden, dass AF4 zusammen mit den Proteinen ENL/AF9, CDK9, CCNT1, AF10, DOT1L und der RNA-Polymerase II in einem Komplex vorliegt. Bereits 2007 konnte dieser Komplex in einem Mausmodell isoliert werden. Damit fungiert der AF4-Komplex auch in humanen Zellen als Stimulator der RNA-Polymerase-II-abhängigen transkriptionellen Elongation und vermittelt eine DOT1L-abhängige H3K79-Methylierung, die einen aktiven Transkriptionsstatus aufrechterhält. Zusätzlich konnten 6 neue Interaktionspartner identifiziert werden (AF5q31, BDR4, DDX6, HEXIM1, NFkB1/RELA und NPM1). Die Anwesenheit von BRD4 und HEXIM1 lässt vermuten, dass der AF4-Komplex in einem aktiven und einem inaktiven Zustand vorliegen kann. Außerdem wird der AF4-Komplex möglicherweise über den NFkB-Signalweg reguliert bzw. durch die Anwesenheit von NFkB1 an dessen Zielgene rekrutiert. Die Untersuchung des der4-Komplexes zeigte, dass er sich aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt. So wurden die Proteine P-TEFb, HEXIM1, NFkB1, NPM1, DDX6 und das AF4 selbst aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, DPY-30, CBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex identifiziert. Der der4-Komplex weist somit partielle Eigenschaften des AF4- und MLL-Wildtyp-Proteins auf. Diese Eigenschaften sind ausreichend für eine kompetitive Situation zwischen dem der4-Komplex und den beiden AF4- und MLL-Wildtyp-Komplexen. Die Gleichgewichte dieser Wildtyp-Komplexe werden vermutlich gestört. Für beide Komplexe wurde mit Hilfe eines in vitro Histon-Methyltransferase-Assays eine Histon-Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen. Für den AF4-Komplex muss zusätzlich eine bisher noch unbekannte Methyltransferase-Aktivität angenommen werden, da eine Methylierung des Histons H3 in den ersten 46 Aminosäuren gezeigt werden konnte, die sich nicht auf die Methyltransferase-Aktivität des DOT1L-Proteins im AF4-Komplex zurückführen lässt. Die H3K4-Methyltransferase-Aktivität des der4-Komplexes wird auf die Anwesenheit des SET-Domänen-Komplexes (ASH2L, WDR5, RBBP5 und DPY-30) zurückgeführt. Im Zusammenhang mit dem AF4-Protein wurde auch der ENL-Komplex untersucht. Mittels Western Blot konnten die Interaktionspartner AF4, CDK9, CCNT1, RNA-Polymerase II, NFkB1 und RING1 identifiziert werden. Damit ist auch das ENL mit dem globalen positiven transkriptionellen Elongationsfaktor P-TEFb assoziiert und beeinflusst die RNA-Polymerase-II-abhängige transkriptionelle Elongation.
Um das Potential von modernen Arzneistoffe wie Nukleinsäuren und ihren Analoga ausnutzen zu können und sie an ihren Wirkort ins Zellinnere bringen können, benötigt man Transportvehikel, da sie selbst nur über eine schlechte Zellmembrangängigkeit verfügen. Bei der Entwicklung zukunftsträchtiger Arzneiformen spielen biokompatible, kolloidale Trägersysteme, die zielgerichtet bestimmte Gewebe / Zellen ansteuern, eine große Rolle. Ihre Aufgabe ist es dem Wirkstoff zur Überwindung von Zellmembranen zu verhelfen, wobei gleichzeitig ein Schutz vor enzymatischem Abbau gewährleistet wird. Zur Erhöhung der Zell- und Gewebeselektivität können die Träger dann mit diversen Targeting-Liganden bestückt werden. Als Trägerstoff können verschiedenste synthetische und natürliche Polymere eingesetzt werden. Zum Einsatz kamen hier die beiden natürlichen Proteine Gelatine und Albumin, die untoxisch, biokompatibel und bioabbaubar sind. Die partikulären Strukturen wurden durch Lösungsmittelzusatz zu einer wässrigen Proteinlösung in einem Desolvatationsprozess gewonnen. Der Nukleinsäureeinschluss erfolgte adsorptiv und kovalent in die Polymermatrix oder kovalent an die Oberfläche. Als Drug-Targeting-Ligand wurden aufgrund ihrer großen Spezifität, Selektivität und Variabilität Antikörper eingesetzt. Durch chemische Oberflächenmodifikationen wurde die Voraussetzung geschaffen, biotinylierte Strukturen kovalent an die Nanopartikeloberfläche zu binden, so dass ein spezifisches Drug-Targeting-System entstand. Die kolloidalen, proteinbasierten Nanopartikel wurden hinsichtlich ihrer verschiedenen physikalischen Parameter analysiert. Neben den Parametern wie Größe, Zetapotential, Morphologie und Stabilität wurde auch die Zelltoxizität untersucht. Das Antikörper-beladene Trägersystem wurde auf seine Funktionalität und Effizienz in Zellkultur getestet. Albumin Nanopartikel: Zur Schaffung eines universell einsetzbaren Trägersystems wurden auf der Nanopartikeloberfläche reaktive SH-Gruppen eingeführt. Der Einsatz eines bifunktionalen Crosslinkers schuf die Möglichkeit mit Avidin ein zweites Protein, welches einen stabilen Komplex mit Biotin bildet an die Oberfläche zu binden. Man verfügt jetzt über ein 200 – 350 nm große, negativ geladene und untoxische Trägerpartikel, die mit vielen unterschiedlichen biotinylierten Liganden verbunden werden können. Sie verfügen weiterhin über eine ausreichende Stabilität im Zellkulturmedium. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Oligonukleotid-Beladung der Nanopartikel wurde auf drei verschiedenen Bindungswegen vollzogen. Die Wirkstoffeinbindung erfolgte zum Ersten adsorptiv über elektrostatische Wechselwirkungen in die Trägermatrix beim partikelformenden Prozess selbst. Die folgende Einführung von Thiolgruppen und die Kopplung mit Avidin über einen bifunktionalen Crosslinker wurde erfolgreich umgesetzt. Zweitens wurde eine kovalente Wirkstoffverknüpfung wieder über einen bifunktionalen Crosslinker entwickelt. Dafür wurden durch die Umsetzung mit einem Spacer die freien Aminogruppen des Trägermaterials aktiviert. Das verwendete Oligonukleotid wurde mit einer Thiolgruppe versehen und so an das aktivierte HSA gebunden. Das gebildete lösliche Konjugat wurde wieder durch Desolvatation zu Nanopartikeln umgesetzt. Als dritte Möglichkeit erfolgte eine oberflächliche Komplexbildung über das Avidin-System mit biotinylierten Phosphorothioaten. Gelatine-Nanopartikel: Für die Herstellung der Nanopartikel wurde ein doppeltes Desolvatationsverfahren eingesetzt. Die Oberflächenmodifikationen wurden analog zu den Umsetzungsbedingungen von HSA-NP durchgeführt. Die Bindungsfähigkeit des NeutrAvidins kann auch hier wieder durch die Kopplung an die Partikeloberfläche und den Aufreinigungsprozess beeinträchtigt sein. Daher wurde eine Nachweisreaktion mit einem fluoreszenzmarkierten Biotinderivat etabliert und die Funktionsfähigkeit des Avidins nachgewiesen. Um ein spezifisches Drug-Targeting-System zu etablieren, wurde der Träger zur Überwindung der Zellmembranen mit zwei verschiedenen biotinylierten Antikörpern ausgestattet. Eingesetzt wurde ein biotinylierter anti-CD3-AK, der von T-Lymphozyten internalisiert wird und ein biotinylierter anti-Her2neu-AK (Trastuzumab). Für die Bestimmung der gebundenen Antikörpermenge wurden zwei Methoden etabliert und lieferten für beide Antikörper eine Bindungseffizienz von nahezu 100%. In den anschließenden Zellkulturversuchen konnte eindrucksvoll eine rezeptorvermittelte Zellaufnahme in Lymphozyten und Brustkrebszellen über die an Gelatine-Nanopartikel gekoppelten, spezifischen Drug-Targeting-Liganden anti-CD3 und Trastuzumab gezeigt werden.
Hauptziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Methode zur Isolierung und Kultivierung proximaler und distaler Tubuluszellen der menschlichen Niere. Dabei wurde neben einer hohen Zellausbeute besonderer Wert auf die Reinheit der Nierenzellkulturen gelegt. Um dieses Ziel zu erreichen wurden mehrere Isolationsschritte hintereinander durchgeführt. Um eine homogenen Zellsuspension aus dem Nierenexzisat zu erhalten wurde eine mechanische Zerkleinerung und anschließend eine enzymatische Andauung durchgeführt. Dabei war ein Enzymgemisch aus Collagenase IV und DNase I mit nachfolgender Andauung mit Hyaluronidase am erfolgreichsten. Um größere Zellverbände auszuschließen wurde das Zellgemisch anschließend durch ein Stahlsieb filtriert. Durch die Percoll Dichtegradientenzentrifugation konnten die Zellen in einem weiteren Schritt separiert werden. Dadurch konnten z.B Erythrozyten, Granulozyten und ein Teil der Lymphozyten verworfen werden. Durch die unterschiedliche Antigenstruktur der Oberflächenmembran proximaler und distaler Tubuluszellen konnten mit Hilfe von monoklonalen Primär und Sekundärantikörpern, welche magnetisch markiert waren, die proximalen und distalen Tubuluszellen separiert werden. Mit Hilfe dieses immunomagnetischen Verfahrens wurden erstmals proximale und distale Tubuluszellen der menschlichen Niere in hoher Reinheit und Vitalität isoliert. Damit zeigte sich dieses Verfahren, welches bisher fast ausschließlich zur Isolierung von Blutzellen eingesetzt wurde, auch bei der Isolierung von Tubuluszellen der menschlichen Niere als erfolgreich. Die zu verschiedenen Zeitpunkten der Zellisolierung eingesetzte Immunfluoreszenzfärbung zeigte, im Vergleich zum Durchlicht, nach der Percoll Dichtegradientenzentrifugation eine Markierung von ca. 30% der Zellen. Nach der Separierung der Zellen durch die Microbeads waren fast alle Zellen (95%) markiert. Die sich anschließende Kultivierung proximaler und distaler Tubuluszellen zeigte ein einheitliches Wachstumsmuster. Beide Zellarten zeigten nach 3-4 Tagen die Bildung kleiner Kolonien, und nach 7-10 Tagen die Bildung eines homogenen Monolayers. Nach ca. 20 Tagen zeigten die Zellen eine stärker werdende Granulierung des Zytoplasmas. Nach ca. 30 Tagen stellten die Zellen das Wachstum ein und starben ab. Um die Kulturen der proximalen und distalen Tubuluszellen zu charakterisieren wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Immunfluoreszenzfärbungen, und Enzymbestimmungen im Überstand und auf den Zellen direkt durchgeführt. Dabei konnten die charakteristischen Enzymmuster und Oberflächenantigene nur für eine Zeitspanne von ca. 7 Tagen in Kultur nachgewiesen werden.
Resorbierbare Osteosynthesen haben zwar schon vor längerer Zeit Einzug in die Dysgnathiechirurgie gehalten, müssen aber immer noch dem Vorwurf der Instabilität standhalten. Die vorgelegte Arbeit vergleicht ein modernes resorbierbares Osteosynthesesystem (INION CPS) mit konventionellen Titanminiplatten in der orthognathen Chirurgie. Insgesamt wurden die 50 Patienten der Studiengruppe neu untersucht, die Patienten der Kontrollgruppe mit Titanminiplatten rekrutierten sich aus einem bereits veröffentlichten Kollektiv des Autors. Die Beurteilung der Stabilität erfolgte radiologisch anhand von Fernröntgen-Seiten-Aufnahmen durch einen Vergleich von präoperativen Aufnahmen zu postoperativen und Verlaufsaufnahmen. Die zwei Hauptgruppen wurden dann zum einen nach Verlagerungsrichtung unterteilt als auch nach Art des Eingriffs (Monomaxillär vs. Bimaxillär). Zusätzlich wurden getrennt von diesen Gruppen noch Patienten mit Lippen-Kiefer-Gaumenspalte untersucht. Diese Studie konnte zeigen, dass die Stabilität von den untersuchten resorbierbaren Platten im Besonderen von der Richtung der Verlagerung abhängt. In einigen Verlagerungsrichtungen (Impaktion, horizontale Bewegung im Oberkiefer, Unterkiefervorverlagerung) sind die resorbierbaren Systeme gleichwertig, in anderen (Elongation, Unterkieferrückverlagerung) schneiden sie schlechter ab. Keinen Unterschied gibt es hingegen beim Vergleich der Art der Verlagerungen. Bei Risikopatienten die Vertikalbewegungen benötigen sollte allerdings zu Gunsten der Sicherheit lediglich mit Titanosteosynthesen versorgt werden. Eine Reihe von Studien konnte jedoch zeigen, dass gerade die neuesten resorbierbaren Materialien in ihren Eigenschaften kaum hinter denen der Titanplatten zurückstehen. Allerdings trägt auch weiterhin der höhere Preis der resorbierbaren Osteosynthesen zu deren zurückhaltendem Einsatz bei. Hier ist fraglich ob sich daran mittelfristig etwas ändern wird. Im Rahmen der Fragebogenuntersuchung zeigte sich, das heute mehr denn je mit dem Patienten offen über die Veränderung die diese Eingriffe mit sich bringen gesprochen werden sollte um übersteigerte oder falsche Hoffnungen abzubauen und dem Patienten das Gefühl der Entscheidungsfreiheit und Gleichberechtigung zu geben. Unstrittig ist die Frage nach der Notwendigkeit dieser Operationen. In welchem Umfang und mit welchem Budget die modernen Verfahren wie das MRT zur Basisdiagnostik und die virtuelle Planung als Ersatz für die konventionellen Röntgenbilder Einzug halten werden bleibt abzuwarten.
Osteosynthesematerialien aus resorbierbaren Materialien finden aufgrund ihrer zunehmenden biomechanischen Stabilität eine immer höhere Akzeptanz. Die vorgelegte Untersuchung vergleicht die knöcherne und okklusale Stabilität von solchen Osteosynthesesystemen aus resorbierbaren Materialien im Vergleich mit konventionellen Titanminiplatten in der orthognathen Chirurgie. Untersucht wurden 100 Patienten in einem Nachsorgezeitraum von bis zu 4 Jahren. Die Beurteilung erfolgte klinisch und röntgenologisch anhand von Fernröntgen-Seiten-Aufnahmen. In die Studie gingen ein fünfzig Patienten, die mit resorbierbaren Platten versorgt worden waren, 16 davon mit Polylactid-Polyglycolid Copolymer Platten und 34 Patienten mit 70:30 Poly-L/DL-Lactid Copolymer Platten; fünfzig weitere Patienten, versorgt mit einem Titanminiplattensystem wurden als Kontrollgruppe gewertet. Zunächst konnte gezeigt werden, dass die Gruppen zueinander homogen waren, es unterschieden sich die effektiven intraoperativen Bewegungen von Studien und Kontrollgruppe statistisch nicht signifikant, gleiches galt im Vergleich der resorbierbaren Platten untereinander. Bei der Datenauswertung konnte nachgewiesen werden, dass die absolute und relative Instabilität weder zwischen den Studiengruppen noch der Kontrollgruppe noch zwischen den resorbierbaren Plattensystemen untereinander signifikant unterschiedlich war. Die postoperative 1-Jahres Stabilität unterschied sich dabei ebenfalls nicht signifikant von der 4-Jahres Stabilität. Alle untersuchten Osteosynthesesysteme zeigten im Oberkiefer eine höhere Stabilität als im Unterkiefer und gleichzeitig eine größere Stabilität in der anterior-posterioren Richtung als in der inferior-superioren Richtung. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der klinischen Stabilität von PLGA oder P(L/DL)LA-Miniplatten gefunden. Allerdings konnte auch belegt werden, dass der Einsatz resorbierbarer Unterkieferosteosynthesen eine sehr gute Compliance des Patienten bezüglich geführter Okklusion und Nachsorge voraussetzte. Als nachteilig bei den resorbierbaren Systemen konnte sowohl für den Oberkiefer als auch für den Unterkiefer eine leicht erhöhte Mobilität bis zu 6 Wochen nach der Operation festgestellt werden, die jedoch in keinem Fall das operative Ergebnis beeinflusste. Vielmehr ermöglichten resorbierbare Osteosynthesen eine bessere postoperative okklusale Einstellung. Weiteren Nachteil der resorbierbaren Osteosynthesesysteme bedeuten die hohen Kosten, die heute noch weit über denen von Titanminiplatten liegen. Zukünftige Entwicklungen gehen dahin, das Plattendesign weiter zu optimieren, wie z.B. neuartige pinbasierte Fixationssysteme einzusetzen, wie sie in der Extremitätenchirurgie teils bereits benutzt werden. Fernziel für die Zukunft ist die Entwicklung eines resorbierbaren Osteosynthesesystems, das sich bei geringen Herstellungskosten und miniaturisiertem Plattendesign auch minimalinvasiv einbringen lässt.
Thema der Dissertation ist der signifikante pathognomische Ausdruck, also die Mimik von Figuren, die in den Jahren um 1600 ein großes Thema in der bildenden Kunst, den kunsttheoretischen Traktaten und der Kirche im Zuge der Gegenreformation war. In der künstlerischen Darstellung dieser Jahre lag ein besonderes Gewicht auf einer an rhetorischen Modellen angelehnten Ausdrucks- und Gebärdensprache der Figuren.
Mit der Mimik, deren Darstellung eine enorme Bandbreite entwickelt, wurde zunehmend gespielt und gezielt manipuliert. Und zwar von Seiten der Kunst wie auch der Kirche. Die Arbeit untersucht sowohl die äußeren Umstände unter denen sich eine zunehmende Schematisierung der Gesichtsausdrücke der Figuren entwickelte und die als Formelhaftigkeit zu beschreiben ist, als auch, wie diese von Seiten der Künstler gehandhabt wurde. Erstaunlich war die Feststellung, dass diese „mimischen Formeln“, die man - besonders durch ihr häufiges Auftreten- mit einem bestimmten Kontext verband, nun immer wieder in ganz anderen Zusammenhängen auftauchten und somit einer Figur oder Geschichte einen neuen Sinn gaben. Oft übertrafen sie gar den gesamten übrigen ikonografischen Apparat an Aussagekraft.
Die humane 5-LO ist das Schlüsselenzym in der LT-Biosynthese. LTs sind wichtige Entzündungsmediatoren und sind in einer Vielzahl von Krankheiten involviert, u. a. Asthma, Atherosklerose, rheumatische Arthritis, Sepsis, allergischen Reaktionen und in vielen Krebsarten. Die Struktur der 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 78 kDa. Sie ist in zwei Domänen unterteilt: die kleinere C2-ähnliche regulatorische Domäne (C2ld) und der größeren katalytischen Domäne. Die 5-LO besitzt NIS und NES, die für die zelluläre Lokalisation der 5-LO verantwortlich sind. Außerdem wird die Lokalisation noch von Phosphorylierungsstellen reguliert, die auf der katalytischen Domäne identifiziert werden konnten. 2011 konnten Häfner et al. zeigen, dass die 5-LO in der Lage ist Homodimere zu bilden.
Wie für die meisten anderen humanen Gene konnten auch bei der 5-LO alternative Spleißvarianten identifiziert werden. Schon 1992 konnten die ersten unterschiedlich gesüleißten Transkripte in Hirntumoren und differenzierten HL-60-Zellen gefunden werden. Später konnten weitere Isoformen in verschiedenen Zelllinien entdeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die alternativen Spleißvarianten 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht und charakterisiert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression des 5-LO-WT und deren Isoformen sowohl in B- und T-Zelllinien als auch primären B- und T-Zellen, monozytären Zelllinien und primäre Monozyten aus Patientenproben (RA und Sepsis) untersucht. Es wurde festgestellt, dass das Expressionsprofil der 5-LO-Varianten zellspezifisch ist. Im Vergleich zu den T-Zellen konnte in B-Zelllinien ein höheres Expressionslevel detektiert werden. Des Weiteren zeigte sich interessanterweise ein stark erhöhtes Expressionslevel in primären Monozyten von RA- und Sepsis-Patienten.
Untersuchungen der 5-LO-Aktivität ergaben unterschiedliche Ergebnisse, abhängig von der Transfektionsmethode. Als transiente Transfektion diente die Calciumphosphat-Methode. Für die stabile Integration der HEK293T-Zellen wurde die Sleeping Beauty-Methode gewählt. Hierfür wurden Proteine mit einem GFP bzw. mCherry-Tag (GFP-5-LO-WT, mCherry∆13, mCherry∆4, mCherryp12) verwendet, um diese mittels Konfokalmikroskop visualisieren zu können. Nach transienter Transfektion konnte eine Inhibition der 5-LO-Aktivität nach Kotransfektion mit jeweils einer Isoform gemessen werden. Nach stabiler Integration jedoch zeigte sich eine Steigerung der 5-LO-Produktbildung. Mit Hilfe von Western Blots wurden Expressionskontrollen angefertigt und die Menge des 5-LO-WT quantifiziert. In transient transfizierten Zellen wurde eine Erniedrigung der Expression des 5-LO-WT bestimmt, wohingegen in stabil integrierten Zellen ein Anstieg des 5-LO-WT als auch der Isoformen beobachtet werden konnte. Einerseits könnte dies einem Artefakt der Transfektionmethode zugrunde liegen, andererseits könnte es ein Hinweis darauf sein, dass sich die Proteine gegenseitig in ihrer Expression beeinflussen.
Ebenso wurde die Lokalisation der 5-LO und deren Isoformen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-LO überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, während alle alternativen Protein-Isoformen im Zytosol zu finden waren. Durch Ionophor-Behandlung wurde eine Translokation des 5-LO-WT an die Kernmembran detektiert, die Isoformen verblieben im Zytosol. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die Spleißvariante 5-LO∆13 mit höherer Ionophor-Konzentration ebenso in der Lage ist an die Kernmembran zu translozieren. Um eine mögliche Interaktion der 5-LO mit den Isoformen zu untersuchen, sollten alle Proteine im selben Zellkompartiment lokalisiert sein. Dafür wurden verschiedene Stimuli und Mutationen getestet. Mit der Mutante GFP-5-LO-S271A und dem Stressstimulus Sorbitol und den CaMKII/p38-Inhibotoren KN-93/SB203580 konnte eine Translokation in das Zytosol erreicht werden. Die Ergebnisse der anschließenden Aktivitätsassays zeigten, dass die Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivität der 5-LO ausüben.
Des Weiteren wurden die Phosphorylierungen an S523 und S271 von 5-LO-WT, 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die 5-LO-Proteine unterschiedliche Phosphorylierungsmuster aufweisen. Während 5-LO-WT und 5-LO∆4 eine schwache Phosphorylierung an S271 aufzeigen, konnte eine starke Phosphorylierung der 5-LO∆13 und 5-LOp12 detektiert werden. Im Vergleich dazu zeigte lediglich die Isoform 5-LOp12 eine sehr starke Bande an der Phosphorylierungsstelle S523. Bei beiden Phosphorylierungen konnten deutlich stärkere Signale nach Kotransfektion gemessen werden. Durch Klonierung eines P2A-Linkers zwischen 5-LO und des GFP-Tags, konnten die Isoformen vom 5-LO-WT in Western Blots voneinander getrennt werden. Dies zeigte, dass es zu einer Hochregulation der Expression der alternativen 5-LO-Varianten nach Kotransfektion mit dem WT führte, aber auch, dass die stärkere Phosphorylierung nach Kotransfektion unabhängig von der Proteinmenge ist.
Die Kommunikation von Zellen mit ihrer Umgebung wird durch Rezeptorproteine arrangiert, die sich in der Plasmamembran befinden. Membranrezeptoren werden durch die Bindung von extrazellulären Liganden, Pathogenen oder Zell-Zell-Interaktionen aktiviert, wodurch die Bildung eines aktiven Zustands gefördert wird, der eine intrazelluläre Reaktion einleitet. Eine Beschreibung auf molekularer Ebene, wie sich Membranrezeptoren in Proteinanordnungen organisieren und wie diese Proteinanordnungen eine spezifische funktionelle Aufgabe ausführen, ist der Ausgangspunkt für das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Gesundheit und Krankheit zugrunde liegen.
Die Fluoreszenzmikroskopie gibt Aufschluss über die Lage von Proteinen in Zellen, und mit der Einführung der höchstauflösenden Mikroskopie wurde der Nachweis einzelner Proteingruppierungen möglich. Eine Einschränkung der meisten Methoden der höchstauflösenden Mikroskopie ist, dass einzelne Komponenten einer Proteingruppierung optisch nicht aufgelöst werden können, was an der geringen Größe und dichten Packung der Bestandteile im Vergleich zur erreichbaren räumlichen Auflösung liegt. Eine Lösung, die für Einzelmolekül-Lokalisierungsmethoden gezeigt wurde, besteht darin, zusätzliche experimentelle Informationen in die Analyse zu implementieren, also „die Aufl sungsgrenze der höchstauflösenden Mikroskopie zu umgehen". Bei der Einzelmolekül-Bildgebung kann diese zusätzliche Information zum Beispiel die Kinetik von mehrfachen und wiederkehrenden
Emissionsereignissen sein, die bei einzelnen Fluorophoren beobachtet werden, was als "Blinken" bezeichnet wird. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer höchstauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethode zur Detektion von Proteinmonomeren und -dimeren in der Plasmamembran von Zellen durch die Verwendung der kinetischen Information.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden photoschaltbare fluoreszierende Proteine als Reporter verwendet, deren photoschaltbare Kinetik mit kinetischen Gleichungen analysiert wurden.
Synthetische, genetische und zelluläre Referenzproteine wurden konstruiert und dienten als Kalibrierungsreferenzen für monomere und dimere Proteine.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das kinetische Modell, das zur Annäherung des Häufigkeitshistogramms von Blinkereignissen einzelner Fluorophore verwendet wird, auf Oligomere höherer Ordnung erweitert. Ein Vergleich mit einem zuvor entwickelten Modell zeigte, dass das erweiterte Modell genauere Ergebnisse für Oligomere höherer Ordnung und Mischungen verschiedener Oligomere liefert. Zusätzlich wird die Anwesenheit von unerkannten Oligomeren berücksichtigt. Die erweiterte Theorie bietet somit die Grundlage, um größere Oligomere und Mischungen unterschiedlicher Stöchiometrie mit besserer Genauigkeit zu untersuchen.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode zur stöchiometrischen endogenen Markierung von Proteinen verwendet, um zwei Rezeptortyrosinkinasen, MET und EGFR, mit einem photoschaltbaren fluoreszierenden Protein zu markieren. Das Vorkommen von monomerem und dimerem MET-Rezeptor wurde auf der Plasmamembran von HEK293T- Zellen mittels quantitativer höchstauflösender Mikroskopie bestimmt. Der Diffusionskoeffizient und der Diffusionsmodus des MET-Rezeptors in lebenden HEK293T-Zellen wurden mit
Einzelpartikelverfolgung gemessen. Dieser Teil der Arbeit zeigte, dass die Kombination von CRISPR/Cas12a-gestützter endogener Markierung und Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Organisation und Dynamik von Membranproteinen ist.
Im vierten Teil dieser Arbeit wurde die Einzelmoleküldatenanalyse durch ein Softwaretool beschleunigt, das eine automatisierte und unvoreingenommene Detektion von Einzelmolekül-Emissionsereignissen ermöglicht. Der Anteil von Monomeren und Dimeren von fluoreszierenden Reportern wurde durch die Implementierung eines neuronalen Netzwerks bestimmt (die Software wurde von Alon Saguy geschrieben; Gruppe von Prof. Yoav Shechtman, Technion, Israel). Der oligomere Zustand der monomeren und dimeren Referenzproteine CD86 und CTLA-4 wurde erfolgreich bestimmt. Die automatisierte Detektion einzelner Proteingruppierungen ermöglichte die Analyse von MET-mEos4b in einzelnen Zellen, wodurch die Heterogenität zwischen den Zellen bestimmt und das Expressionsniveau des Rezeptors mit der Dimerisierung korreliert werden konnte.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit Ergebnisse zu elementaren Aspekten hin zu einer molekularen Quantifizierung von Proteinzahlen mittels Einzelmolekül-
Lokalisationsmikroskopie generiert, die fluoreszierende Reporter, stöchiometrische Markierung von zellulären Proteinen und Bildanalyse umfassen. Das Potential dieser
Entwicklungen wurde anhand der Beobachtung der Liganden-induzierten Verschiebung von monomeren zu dimeren MET-Rezeptoren in einzelnen HEK293T-Zellen gezeigt.
Im Rahmen unserer Arbeit haben wir die diagnostische Aussagekraft von dem Nukleären Matrix-Protein 22 (NMP22) bei Urothelkarzinomen anhand des Standard-Laborverfahrens „Two-Side-ELISA“ ( Enzym-Immunoassay) überprüft. Unsere Studie umfasste 107 Patienten, diese Anzahl erwies sich als ausreichend, um signifikante Ergebnisse über die Eignung des Tests zu erhalten. Unser repräsentatives Patientengut aus der Urologischen Klinik – mit dem Symptom Makrohämaturie – setzte sich aus benignen und malignen Harnwegserkrankungen, darunter 54 Harnblasenkarzinome, 8 Nierenbeckenkarzinome, 2 Ureterkarzinome und 43 benigne Harnwegserkrankungen (z.B. Zystitis, Urethritis, Pyelonephritis, Blasenhalssklerose, Harnleiter- und Blasenpapillome) zusammen. Patienten mit unterschiedlichen Stadien des Urothelkarzinoms G1, G2 und G3 wurden gezielt in unsere Studie aufgenommen. Die Tumorstadienklassifizierung erfolgte mit Hilfe der histologischen Untersuchungen nach der TNM-Klassifikation. Unsere gewonnenen histologischen Ergebnisse wurden mit den NMP22-Werten korreliert. Für die Ermittlung der NMP22-Levels bei den 107 gesammelten Urinproben wurde ein kommerzieller Kit verwendet (MATRITECH, WallacADL-GmbH, Freiburg, Deutschland). Die Aussagekraft des NMP22-Tests konnte anhand eigener Untersuchungen und durch Vergleich mit Untersuchungen in der Fachliteratur- anhand bestehender Vergleichskriterienbeurteilt werden. Die Auswertung erfolgte gemäß den in der Fachliteratur etablierten Kenngrößen Sensitivität und Spezifität. Die Sensitivität und Spezifität des NMP22-Tests in unserer Studie wurden bei einem von uns bestimmten Cut-off-Wert von 7,5 U/ml, der mit dem Cut-off-Wert vom NMP22-Kit Hersteller übereinstimmt, errechnet. Es zeigte sich eine Sensitivitätsabhängigkeit vom Grading. Der Bereich der Sensitivität bei dem Tumormarker NMP22 reichte von 38%-77%. Die Spezifität schwankte zwischen 66% und 80%. Die Spezifität bei den Patienten, die unter Harnwegsinfektionen litten betrug 42.9%. Die allgemeine Sensitivität des NMP22-Tests betrug bei den Blasentumoren 55.6 %. Die Sensitivität für die oberflächlichen Blasenkarzinome (Ta, T1) war 36%. Invasive Blasentumore wurden in 80% der Fälle entdeckt. Abhängig von dem Grading der Blasentumore fanden wir folgende Sensitivitäten des NMP22-Tests : G1 38%, G2 52% und G3 77%. Die Spezifität war 66.9%. Zusammenfassend können wir sagen, dass wir in Übereinstimmung mit allen uns bekannten Studien eine sehr hohe Sensitivität für den NMP22-Test bei Patienten mit invasivem Blasenkrebs finden. Im Grading 1 befinden sich allerdings in unserer Studie die meisten Werte im Normbereich. Aus diesem Grunde haben wir bei Urothelkarzinomen bei Grading 1 eine totale Einschränkung der Aussage des NMP22-Immunoassays und deshalb ist es für das Grading 1 nicht geeignet. NMP22 ist erst für die Früherkennung der Grading 2 und 3 der Blasenkrebse geeignet. Gutartige urologische Erkrankungen, wie die Zystitis oder andere Harnwegsinfektionen, führten zu falsch-positiven Ergebnissen. Unsere Schlussfolgerung ist, dass der NMP22-Test erst ab fortgeschrittenen Stadien, d.h. ab Grading 2 und Grading 3 echte positive Ergebnisse liefert und somit eine diagnostische Aussage macht. Unsere Werte für Sensitivität und Spezifität decken sich weitgehend mit den Angaben aus der Literatur. Unsere Studie hat gezeigt, dass zum gegenwärtigen Zeitpunkt die routinemäßige Anwendung des Harnblasentumormarkers NMP22 für die Primärdiagnostik von Urothelkarzinomen nicht geeignet ist. Zusammenfassend kann derzeit der NMP22 Test somit nicht die Zystoskopie und die Zytologie als Standarddiagnostik für die Frühdetektion von Blasentumoren ersetzen. Wegen der hohen Rate an falschpositiven Resultaten durch entzündliche Reizzustände der Blase bzw. benigne Harnwegserkrankungen wie z.B. Harnwegsinfekte und Harnsteine und wegen der sehr arbeits- und zeitaufwendigen Durchführung können wir den NMP22-ELISA-Test nicht zur routinemäßigen Blasenkrebsfrüherkennung empfehlen. Als Voraussetzung zur richtigen Interpretation der erhaltenen NMP22-Messwerte sollten bestimmte Ausschlusskriterien beachtet werden, so dass andere Ursachen für erhöhte NMP22- Messwerte weitestgehend ausgeschlossen werden können. Unter diesen Bedingungen erachten wir die Einsatzmöglichkeiten für den NMP22-Test als immunologischen nicht-invasiven Test in Verbindung mit der Zystoskopie und der Zytologie bei der Früherkennung von Blasentumoren als sinnvoll. Der Einsatz des NMP22-Tests könnte beispielsweise bei bereits erfolgreich behandelten Blasenkrebs-Patienten als Maßnahme zur Beobachtung in Verbindung mit der Zystoskopie und Zytologie sinnvoll sein. Alle Untersuchungen gemeinsam ermöglichen eine umfassende Diagnostik und eine höhere Sicherheit, und sie sind somit bei der Detektion des Harnblasenkarzinoms aussagekräftiger. Für die Zukunft sind nicht nur weitere randomisierte, prospektive Studien bedeutsam, die über ein geeignetes heterogenes, klinisch relevantes Patientengut verfügen, sondern auch die Vereinfachung der NMP22-Test Durchführung, so dass die Akzeptanz des Testsystems in Klinik und Praxis erhöht werden kann.
IL-18, a recently identified member of IL-1 family, is now recognized as an important regulator of innate and acquired immune responses. Therefore, the antitumor activities of IL-18 have been investigated. IL-18 has been shown to induce IFN-γ production by T, B, and NK cells, enhances NK cell activity, activates Fas ligandmediated apoptosis of the tumor cells, and improves the overall antitumor immunity. KG-1 cells were derived from a patient with acute myeloid leukemia (AML). IL-18 has been shown to induce IFN-γ production in those leukemic cells. TLR-3, in addition to its ability to recognize viral double stranded RNA, also can recognize the synthetic analogue poly(I:C) and induces type I IFN, inflammatory cytokine production, e.g TNF-α, and maturation of denderitic cells. In the present work the potential modulatory effect of PIC on IFN-γ and TNF-α production by KG-1 cells treated with IL-18 was investigated. Indeed, PIC strongly amplified the production of IFN-γ induced by IL-18 on mRNA and protein levels via NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Compared to IFN-γ, TNF-α showed different behaviour in KG-1 cells. On mRNA level I found only weak induction of TNF-α by IL-18 which was potentiated in the presence of PIC. Similarly, the release of TNF-α by IL-18 plus PIC required NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Furthermore, in the present work I found that TLR-3 is required for IFN-γ and TNF-α production. In addition, it is demonstrated by immunofluoresence that TLR-3 is localized in cytoplasm but not on the cell surface in KG-1 cells. Recently, it has been demonstrated that IFN-γ shows therapeutic potential as detected in AML blasts, specifically via inhibition of proliferation and induction of apoptosis. Thus our data could serve as a rationale for the clinical use of PIC and IL-18 in combination therapy. In search for new cytokines potentially modulated by the combination IL-18 plus PIC in KG-1 cells, cytokine antibody array analysis was performed. I found an upregulation of expected genes like IP-10 but most interestingly unexpected upregulation of PDGF-AA. Searching for detailed mechanisms of PDGF-AA induction, I found that neither p38 nor JNK is involved in PDGF-AA production but NF-κB is essential for the expression of PDGF-AA. Furthermore, I found that PDGF-AA is not able to increase the proliferation of KG-1 cells. PDGF and TGF-β are examples of signaling molecules which control the growth, survival, motility, and differentiation of cells. Therefore, the release of TGF-β by IL-18 plus PIC was monitored by ELISA. The level of TGF-β in cellular supernatants revealed that neither PIC nor IL-18 was able to significantly mediate release of TGF-β indicating that only PDGF-AA but not TGF-β is induced by PIC and IL-18 in KG-1 cells. To the best of our knowledge this is the first time that IL-18 or PIC is shown to induce the expression of PDGF-AA in KG-1 cells.
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine aggressive Erkrankung des Knochenmarks, welche die Hämatopoese beeinträchtigt und zu Knochenmarksversagen führt. Trotz des Fortschritts in der AML-Therapie bleibt die Prognose für die meisten Patienten schlecht, sodass neue Therapieansätze für die Behandlung dringend benötigt werden. Autophagie, ein kataboler Abbauprozess von zellulären Komponenten, ist nachweislich an der Entstehung von AML beteiligt. Als zentraler Regulator von Zellüberleben, Homöostase und Stoffwechsel, dient die Autophagie als Nährstoffquelle durch die Wiederverwertung von Makromolekülen während begrenzter Energieversorgung. AML-Zellen benötigen ein konstantes Nährstoff- und Energieniveau, um ihre Vermehrung aufrechtzuerhalten. Dies wird durch eine Umstellung von Stoffwechselwegen, insbesondere des mitochondrialen Stoffwechsels einschließlich der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) und des Tricarbonsäurezyklus (TCA), erreicht.
Mehrere Studien haben die Hemmung der Autophagie für die Behandlung von Krebs als vielversprechenden Ansatz vorgestellt. Doch eine Monotherapie mit Autophagie-Inhibitoren erzielte nur eine geringfügige Wirksamkeit. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Entstehung von Kompensationsmechanismen, die zum Ausgleich der Autophagie-Hemmung in Krebszellen entstehen. Bis heute sind diese Kompensationsmechanismen kaum untersucht. Ziel dieser Arbeit ist es, ein geeignetes Autophagie-Gen zu identifizieren, mit dem sich die Rolle der Autophagie-Hemmung für das Überleben von AML-Zellen untersuchen lässt. Zusätzlich sollen die kompensatorischen Mechanismen, die durch die Autophagie-Hemmung in AML-Zellen entstehen können, untersucht werden, um neue metabolische Angriffspunkte zu identifizieren, die für Kombinationstherapien genutzt werden können.
Zu Beginn der Arbeit wurde ein gezielter CRISPR/Cas9 Screen in zwei humanen AML-Zelllinien durchgeführt, um Autophagie-Gene zu identifizieren, deren Verlust eine Proliferationsstörung in AML-Zellen verursacht, welche überwunden werden kann. Validierungsexperimente zeigten, dass der Verlust von ATG3 das Zellwachstum signifikant verminderte. Außerdem zeigte die Messung des Autophagie-Fluxes, dass der Verlust von ATG3 die Autophagie stark beeinträchtigte. Dies wurde durch eine Western-Blot-Analyse, die eine beeinträchtigte LC3-Lipidierung zeigte, und durch eine Immunfluoreszenzanalyse der Autophagosomen-Bildung mittels konfokaler Mikroskopie, die eine geringere Anzahl von Autophagosomen in ATG3-defizienten Zellen ergab, bestätigt. Deshalb wurde der Knockdown von ATG3 in AML Zellen verwendet, um die Mechanismen, die zum Ausgleichen der Autophagie-Hemmung entstehen, zu untersuchen. Zuerst wurde die Zellproliferation in fünf verschiedenen AML Zelllinien über sieben Tage betrachtet. In allen Zellenlinien führte der Verlust von ATG3 mittels small hairpin RNA zu verminderter Zellproliferation. Diese Ergebnisse zeigen die wichtige Rolle von ATG3 in der Autophagie und dass Autophagie-Hemmung durch ATG3-Verlust das Wachstum von AML-Zellen beeinträchtigt.
Da der Verlust von ATG3 die Proliferation von AML-Zellen beeinträchtigte, wurde eine Zellzyklusanalyse durchgeführt. Eine reduzierte S-Phase bestätigte die verminderte Proliferation in ATG3-depletierten AML-Zellen, doch der Zellzyklus war grundsätzlich nicht gestoppt. Darüber hinaus ergab die Analyse der Apoptose, dass diese unter dem Verlust von ATG3 erhöht war, aber etwa 50% der Zellen blieben vital. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass AML-Zellen trotz des Verlusts der ATG3-abhängigen Autophagie weiter proliferieren können.
Um die Mechanismen zur Kompensation der Autophagie-Hemmung zu untersuchen, wurden die Auswirkungen des ATG3-Verlusts auf die mitochondriale Homöostase untersucht. Die Mitophagie sowie das mitochondriale Membranpotenzial und die Masse unterschieden sich zwischen Kontroll- und ATG3-depletierten AML-Zellen nicht, was darauf hindeutet, dass die mitochondriale Homöostase durch den Verlust von ATG3 nicht beeinträchtigt ist. Als nächstes wurde die mitochondriale Funktion durch Messung des ATP-Spiegels und der OXPHOS untersucht. Die ATP-Level und die OXPHOS waren nach dem Verlust von ATG3 in AML-Zellen erhöht, was auf eine gesteigerte mitochondriale Aktivität bei Autophagie-Defizienz hinweist.
Algorithms and data structures constitute the theoretical foundations of computer science and are an integral part of any classical computer science curriculum. Due to their high level of abstraction, the understanding of algorithms is of crucial concern to the vast majority of novice students. To facilitate the understanding and teaching of algorithms, a new research field termed "algorithm visualisation" evolved in the early 1980's. This field is concerned with innovating techniques and concepts for the development of effective algorithm visualisations for teaching, study, and research purposes. Due to the large number of requirements that high-quality algorithm visualisations need to meet, developing and deploying effective algorithm visualisations from scratch is often deemed to be an arduous, time-consuming task, which necessitates high-level skills in didactics, design, programming and evaluation. A substantial part of this thesis is devoted to the problems and solutions related to the automation of three-dimensional visual simulation of algorithms. The scientific contribution of the research presented in this work lies in addressing three concerns: - Identifying and investigating the issues related to the full automation of visual simulations. - Developing an automation-based approach to minimising the effort required for creating effective visual simulations. - Designing and implementing a rich environment for the visualisation of arbitrary algorithms and data structures in 3D. The presented research in this thesis is of considerable interest to (1) researchers anxious to facilitate the development process of algorithm visualisations, (2) educators concerned with adopting algorithm visualisations as a teaching aid and (3) students interested in developing their own algorithm animations.
During my PhD, I was applying the clumped isotope technique to modern brachiopods and fossil belemnites, and I conducted methodological work. Carbonate clumped isotope thermometry is a tool to reconstruct carbonate precipitation temperatures. In contrast to oxygen isotope thermometry, i.e., the δ18O-thermometer, the carbonate clumped isotope thermometer does not require an estimate for the oxygen isotope composition of the seawater, as it considers the fractionation of isotopes exclusively amongst carbonate isotopologues. The ∆47 value of a carbonate expresses the abundance of the 13C–18O bond bearing carbonate isotopologue, within the carbonate, relative to its random distribution. In thermodynamic equilibrium, the ∆47 value of a given carbonate is solely a function of the carbonate precipitation temperature. However, kinetic isotope fractionations, i.e., vital effects, driven by diffusion, pH or incomplete oxygen isotope exchange between water and dissolved inorganic carbonate species can cause the carbonate to be precipitated with isotopic compositions that are offset from those predicted for thermodynamic equilibrium.
Brachiopods serve as important geochemical archives of past climate conditions. To investigate the nature and significance of kinetic controls on brachiopod shell δ18O and ∆47 values, in collaboration with the BASE-LiNE Earth ITN, I analysed the bulk and clumped isotope compositions of eighteen modern brachiopod shells, collected from different geographic locations and water depths that cover a substantial range of growth temperatures. Growth temperatures and seawater δ18O values for each brachiopod were independently determined. Most of the analysed brachiopods exhibit combined offsets from clumped and oxygen isotope equilibrium, and there is a significant negative correlation between the offset values. The observed correlation slope between offset ∆47 and offset δ18O point to the importance of kinetic effects associated with Knudsen diffusion and incomplete hydration and hydroxylation of CO2 (aq), occurring during biomineralisation. The correlations between the growth rates of the analysed brachiopods and both the offset ∆47 and the offset δ18O values provide further arguments for the presence of kinetic effects. In conclusion, the oxygen and clumped isotope composition of modern brachiopod shells are affected by growth rate-induced kinetic effects that hinder their use for palaeoceanography.
The Compressed Baryonic Matter (CBM) is one of the core experiments at the future Facility for Anti-proton and Ion Research (FAIR), Darmstadt, Germany. Its goal is to investigate nuclear matter characteristics at high net-baryon densities and moderate temperatures. The Silicon Tracking System (STS) is a central detector system of CBM.
It is placed inside a 1Tm magnet and operated at a temperature of about −10 °C to keep radiation-induced bulk current in the 300μm double-sided microstrip silicon sensors low. The design of the STS aims to minimize the material budget in the detector acceptance (2.5° < θ < 25°). In order to do so, the readout electronics is placed outside the active area, and the analog signals are transported via ultra-thin micro-cables. The STS comprises eight tracking stations with 876 modules. Each module is assembled on a carbon fiber ladder, which is subsequently mounted in the C-shaped aluminum frame.
The scope of the thesis focused on developing a modular control system framework that can be implemented for different sizes of experimental setups. The developed framework was used for setups that required a remote operation, like the irradiation of the powering modules for the front-end electronics (FEE), but also in laboratory-based setups where the automation and archiving were needed (thermal cycling of the STS electronics).
The low voltage powering modules will be placed in the vicinity of the experiment, therefore they will experience a total dose of up to 40mGy over the 10 years of STS lifetime.
To estimate the effects of the radiation on the low-voltage module performance, a dedicated irradiation campaign took place. It aimed at estimating the rate of radiation induced soft errors, that lead to the switch off of the FEE.
Regular power cycles of multiple front-end boards (FEBs) pose a risk to the experiment operation. Firstly, such behavior could negatively influence the physics performance but also have deteriorating effects on the hardware. It was further assessed what are the limitations of the FEBs with respect to the thermal cycling and the mechanical stress. The results served as an indication of possible failure modes of the FEB at the end of STS lifetime. Failure modes after repeated cycles and potential reasons were determined (e.g., Coefficient of Thermal Expansion (CTE) difference between the materials).
Due to the conditions inside the STS efficient temperature and humidity monitoring and control are required to avoid icing or water condensation on the electronics or silicon sensors. The most important properties of a suitable sensor candidate are resilience to the magnetic field, ionizing radiation tolerance, and fairly small size.
A general strategy for ambient parameters monitoring inside the STS was developed, and potential sensor candidates were chosen. To characterize the chosen relative humidity sensors the developed control framework was introduced. A sampling system with a ceramic sensor and Fiber Optic Sensors (FOS) were identified as reliable solutions for the distributed sensing system. Additionally, the industrial capacitive sensors will be used as a reference during the commissioning.
Two different designs of FOS were tested: a hygrometer and 5 sensors multiplexed in an array. The FOS hygrometer turned out to be a more reliable solution. One of the possible reasons for a worse performance is a relatively low distance between the subsequent sensors (15 cm) and a thicker coating. The results obtained from the time response study pointed out that the thinner coating of about 15μm should be a good compromise between the humidity sensitivity and the time response.
The implementation of the containerized-based control system framework for the mSTS is described in detail. The deployed EPICS-based framework proved to be a reliable solution and ensured the safety of the detector for almost 1.5 years. Moreover, the data related to the performance of the detector modules were analyzed and significant progress in the quality of modules was noted. Obtained data was also used to estimate the total fluence, which was based on the leakage current changes.
The developed framework provided a unique opportunity to automate and control different experimental setups which provided crucial data for the STS. Furthermore, the work underlines the importance of such a system and outlines the next steps toward the realization of a reliable Detector Control System for STS.
RNA research is very important since RNA molecules are involved in various gene regulatory mechanisms as well as pathways of cell physiology and disease development.1 RNAs have evolved from being considered as carriers of genetic information from DNA to proteins, with the three major types of RNA involved in protein synthesis, including messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA).2 In addition to the RNAs involved in protein synthesis numerous regulatory non-coding RNAs (ncRNAs) have been discovered in the transcriptome. The regulatory ncRNAs are classified into small ncRNAs (sncRNAs) with transcripts less than 200 nucleotides (nt) and long non-coding RNAs (lncRNAs) with more than 200 nt.3
LncRNAs represent the most diverse and versatile class of ncRNAs that can regulate cellular functions of chromatin modification, transcription, and post-transcription through multiple mechanisms.4 They are involved in the formation of RNA:protein, RNA:RNA and RNA:DNA complexes as part of their gene regulatory mechanism.4,5 The RNA:DNA interactions can be divided into RNA:DNA heteroduplex formation, also called R-loops, and RNA:DNA:DNA triplex formation. In triplex formation, RNA binds to the major groove of double-stranded DNA through Hoogsteen or reverse Hoogsteen hydrogen bonding, resulting in parallel or anti-parallel triplexes, respectively. In vitro studies have confirmed the formation of RNA:DNA:DNA triplexes.6 However, the extent to which these interactions occur in cells and their effects on cellular function are still not understood, which is why these structures are so exciting to study (Chapter I RNA:DNA:DNA Triplexes).
This cumulative thesis investigates several functional and regulatory important RNAs. The first project involves the improved biochemical and biophysical characterization of RNA:DNA:DNA triplex formation between lncRNAs of interest and their target genes. Triplex formation was confirmed by a series of experiments including electromobility shift assays (EMSA), thermal melting assays, circular dichroism (CD), and liquid state nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The following is a summary of the main findings of these publications.
In research article 5.1, the oxygen-sensitive HIF1α-AS1 was identified as a functionally important triplex-forming lncRNA in human endothelial cells using a combination of bioinformatics techniques, RNA/DNA pulldown, and biophysical experiments. Through RNA:DNA:DNA triplex formation, endogenous HIF1α-AS1 decreases the expression of several genes, including EPH receptor A2 (EPHA2) and adrenomedullin (ADM), by acting as an adaptor for the repressive human silencing hub (HUSH) complex, which has been studied by our collaborators in the groups of Leisegang and Brandes.
2) Triplex formation between HIF1α-AS1 and the target genes EPHA2 and ADM was investigated in biochemical and biophysical studies. The EMSA results indicated that HIF1α-AS1 forms a low mobility RNA:DNA:DNA triplex complex with the EPHA2 DNA target sequence. The CD spectrum of the triplex showed distinct features compared to the EPHA2 DNA duplex and the RNA:DNA heteroduplex. Melting curve analysis revealed a biphasic melting transition for triplexes, with a first melting point corresponding to the dissociation of the RNA strand with melting of the Hoogsteen hydrogen bonds. The second, higher melting temperature corresponds to the melting of stronger Watson-Crick base pairing. Stabilized triplexes were formed using an intramolecular EPHA2 DNA duplex hairpin construct in which both DNA strands were attached to a 5 nucleotide (nt) thymidine linker. This approach allowed improved triplex formation with lower RNA equivalents and higher melting temperatures. By NMR spectroscopy, the triplex characteristic signals were observed in the 1H NMR spectrum, the imino signals in a spectral region between 9 and 12 ppm resulting from the Hoogsteen base pairing. To elucidate the structural and sequence specific Hoogsteen base pairs 2D 1H,1H-NOESY measurements of the EPHA2 DNA duplex and the HIF1α-AS1:EPHA2 triplex were performed. The 1H,1H-NOESY spectrum of the HIF1α-AS1:EPHA2 triplex with a 10-fold excess of RNA was semi-quantitatively analyzed for changes in the DNA duplex spectrum. We discovered, strong and moderate attenuation of cross peak intensities in the imino region of the NOESY spectrum. This attenuation was proposed to result from weakening of Watson-Crick base pairing by Hoogsteen hydrogen bonding induced by RNA binding. The Hoogsteen interactions can be mapped based on the analysis of the cross peak attenuation in the NOESY spectra, which we used to generate a structural model of the RNA:DNA:DNA triplex. These biophysical results support the physiological function of HIF1α as a triplex-forming lncRNA that recruits the HUSH-epigenetic silencing complex to specific target genes such as EPHA2 and ADM, thereby silencing their gene expression through RNA:DNA:DNA triplex formation.
The Alborz Mountains are forming a ~100 km wide, E-W trending mountain chain where individual summits are up to 5000 m in elevation. The Alborz Mountains range are part of the Alpine orogen and are straddling a 2000 km wide area S of the Caspian Sea. The rocks of the Alborz Mountains consist of Neogen sediments, which are affected by folding and faulting. In the western part of the Alborz Mountains the folds and faults are trending NW-SE, whereas in the eastern part they are trending NE-SW. GPS data confirm N-S shortening including dextral strike-slip along ESE-WNW trending faults, and sinistral strike-slip along ENE-WSW trending faults. The present thesis is focusing on the active Garmsar salt nappe, the fragmented roof of which is pierced by rock salt which extruded near the front of the Alborz Mountains Range. During the past 5 m.y. the front of the Alborz chain migrated towards SSW on top of the salt of the Garmsar basin. The salt was squeezed towards SSW and took place at the Great Kavir. The extruded salt is forming the Eyvanekey plateau between the cities of Eyvanekey and Garmsar. Both the Garmsar salt nappe and the Eyvanekey plateau are dextrally displaced for ca. 9 km along the Zirab-Garmsar fault. Structural analyses of the Garmsar salt nappe indicate three different groups of joints which are trending perpendicular and parallel to the local mechanical anisotropy. The folds of the study area are congruent (type 2 and 3 after Ramsay) resulting from viscose inhomogeneous flow. InSAR-Investigations suggest the Alborz Mountains to be lifted up by ca. 1 cm/a, while horizontal shortening is active at a rate of 8 ±2 mm/a. These values are consistent with GPS data. Based on nine „Advanced Synthetic Aperture Radar“ (ASAR) scenarios, produced by the ENVISAT satellite of the European space agency between 2003 and 2006, we used interferograms to map the displacement via 22 increments during 2 – 18 months. The results suggest that the topographic height of the surface of the salt is changing at a rate which is controlled by the season. The displacement ranges from subsidence at -40 to -50 mm/a to uplift of 20 mm/a. In order to investigate the time-dependent deformation with high spatial resolution, we used algorithms which are based on data of small base lines (SBAS). The resulting interferometric SAR time series analyses also suggest that the study area is largely subsiding at a rate that is controlled by the seasons. The map with the averaged LOS deformation velocities, on the other hand, suggests the subsidence to increase from the upper part of the salt nappe towards deeper topographic 5 levels of the agricultural lowlands. The major part of subsidence is probably caused by the annual rainfall which results in subrosion of salt. The spatial changes in the subsidence rate are probably controlled by the distribution of fountains, mining activity at the margin of the salt glacier, and faults and fractures inside the salt. Striking seasonal imprints are obvious along the agricultural areas which are surrounding the Garmsar salt nappe. These areas are rapidly subsiding in summer and spring when groundwater is used for irrigations. The maximum rate of subsidence (40-50 mm/a) is located E and W of the Eyvanekey plateau, where large areas are irrigated. The maximum displacement is 20 mm/a in the farmland and 5 mm/a in the center of the salt nappe. Depth estimates using Euler deconvolution method for gravimetric and magnetic data suggest the salt to extrude from a depth less than ca. 2000 m. The gravity field of the study area is characterized by strong anomalies in the SW and weak anomalies in the NE. A considerable negative anomaly in the N indicates that the northern part subsided, whereas the southern part was lifted up. The seismic data show three major horizons inside the Miocene sediments: the Lower Red Formation, the Qom Formation, and the Upper Red Formation. The western part of the study area seems to be free from salt domes. The layers of the upper part of the Qom Formation show thinning along the NE and NW trending faults. In some areas the seismic reflectors indicate steep faults close the saddle of the folds. NE-SW-, NW-SE and E-Wtrending faults prevail. Analogue experiments have been carried out to extend our knowledge about the evolution of the Garmsar salt dome. We used a scaled model (34 cm * 25 cm * 2.5 cm) that was shortened perpendicular to its long side. The wedge shape of the Alborz Mountains was simulated by a wedge consisting of Styrofoam. Rock salt was simulated using Polydimethylsiloxan (PDMS), a linear viscous material with a viscosity of 2.3*104 Pa s and a density of 0.96 g/cm3 at room temperature. Other sediments were modeled using dry quartz sand. The experimental results can be used to simulate the structural evolution of the study area: The Alborz deformation front was emplaced on top of the salt rocks in the Garmsar area while migrating towards SSW. A salt basin and a salt extrusion have also been produced in the model. Cross sections through the wedge shaped analogue model indicate N- and S-dipping reverse faults, which are in line with the wedge shape of the Alborz chain. Moreover, ENE-WSW trending sinistral and ESE-WNW trending dextral strike-slip faults led to N-S shortening during the Miocene. Structural marker horizons, 6 which have been turned into Z-folds on the western fold limbs and to S-folds on the eastern fold limbs, are comparable with the folds of the study area. Solving the problem of waste is one of the central tasks of environmental protection. It is becoming increasingly difficult to find suitable sites that are acceptable to the public. Salt and salt formations have relevant properties to be utilizing as a repository for each kind of waste. The favorable properties make rock salt highly suitable as a host rock, in particular for nonradioactive and radioactive wastes. The Qom and Garmsar basins are the nearest salt diapirs to the Tehran province, and there are suitable repositories for waste disposal. Based on surface and subsurface data, the Garmsar salt diapir has been investigated as a case example for its suitability as a host and repository for various types of waste. The data used are based on field studies, interferometry, and geophysical investigations. The results of this study suggest the deep bedded salt of the Garmsar Salt Basin to be an appropriate host for the deposition of industrial waste. Rock salt of surficial layers or domes, on the other hand, is not regarded as an appropriate candidate for waste disposal.
Das positions-spezifisch integrierende TRE5-A Retrotransposon besitzt zwei Promotorregionen (A- und C-Modul). Für das C-Modul konnte ein spezifisch bindendes Protein (CbfA) gefunden werden, das vermutlich über die Expression des Minusstrang-Transkripts regulativ in den Transpositionsmechanismus eingreift. Gleichzeitig stellt CbfA in D. discoideum einen kritischen Faktor dar, der sowohl auf das Wachstum als auch auf die Differenzierung Einfluss nimmt.
Es konnte gezeigt werden:
• Der AT-Haken in CbfA ist für die DNA-Bindung essentiell. Die Inaktivierung hat zur Folge, dass keine Differenzierung stattfindet. Es scheint, dass primär der AT-Haken für die DNA-Bindung sorgt und von den Zinkfingern unterstützt wird.
• Die JmjC-Domäne in CbfA ist essentiell. Transformanden mit CbfA ohne aktive JmjC-Domäne zeigen Defekte sowohl in Wachstum als auch Differenzierung.
• CbfA ist ein nukleares Protein. Es konnte zwar keine Kernlokalisationssequenz identifiziert werden, jedoch weisen die Versuche auf zumindest eine Kernlokalisierungssequenz im C-Terminus des cbfA hin.
• Ein C-terminal verkürztes CbfA ist funktionslos: wahrscheinlich aufgrund fehlender Kernlokalisation und somit fehlender DNA-Bindung.
• Ein N-terminal verkürztes CbfA ist teilweise funktionsfähig: die Komplementation in JH.D2-Zellen führt zu einer partiellen Revertierung hin zum Phänotyp der AX2-Zellen.
• Struktur-Homologien der JmjC-Domäne in CbfA zu Mitgliedern aus der Familie der Fe(II)/2OG-Oxygenasen, DNA-bindende Motive und die Lokalisation im Zellkern weisen auf eine Funktion des CbfAs als Chromatin-Remodeller im Zellkern hin.
• In der Transit von Wachstums- zu Entwicklungsphase kann der CbfA-Mangel durch artifizielle Proteinase A-Expression ausgeglichen werden, aber nicht durch Komplementation mit YakA, Adenylat-Zyklase oder cAMP Rezeptor 1.
• CbfA fungiert wahrscheinlich als Regulator der acaA-Transkription auf Ebene der chromosomalen Strukturen.
• cbfB, ein weiteres Gen mit einer JmjC-Domäne wurde in D. discoideum identifiziert, die Gensequenz vervollständigt und vom Dictyostelium Genom-Projekt verifiziert.
In vorliegender Studie wurde lebend und tot gesammeltes Schalenmaterial der Europäischen Flussperlmuschel Margaritifera margaritifera verschiedener Lokalitäten in Schweden, Finnland und Deutschland (bzw. Frankreich) sklerochronologisch und isotopengeochemisch untersucht. Sauerstoffisotopen-Zeitreihen, trendbereinigte und standardisierte stabile Kohlenstoffisotopen-Zeitreihen (SSCI) sowie jährliche Zuwachsraten (SGI-Zeitreihen) jeder der acht Populationen sind zu Compound-Chronologien zusammengefasst und auf Zusammenhänge mit Temperatur, Sonnenflecken-Zyklen und Niederschlag untersucht sowie auf Korrelationen mit verschiedenen Klimaindizes (z.B. dem Dipol der Meeres-Oberflächenwasser Temperatur-Anomalien im Nordatlantik, NADP-SST, und der Nordatlantischen Oszillation, NAO) getestet worden. Im Vergleich ergaben sich für die geglätteten Zeitreihen (25-Jahresfilter) Korrelationskoeffizienten von r = 0,57 (SGI Master-Chronologie und NAO) bzw. r = 0,59 (Master-Chronologie) und NADP-SST. Obwohl weder Isotopendaten noch Zuwachschronologien der Muscheln auf hochfrequenten Signalen hohe Korrelationen mit instrumentellen Messdaten aufweisen, sind dekadische Klimaoszillationen deutlich repräsentiert. Mit zunehmendem Lebensalter nimmt der Schalenzuwachs exponentiell ab. Gleichzeitig nähern sich die d13C-Werte der Schale dem d13CDIC-Wert des Wassers, der bei den hier untersuchten Lokalitäten zwischen -9,3 ‰ und -12,7 ‰ lag. Erst im hohen Lebensalter findet also die Schalenbildung nahezu im kohlenstoffisotopischen Gleichgewicht mit dem umgebenden Medium statt. In der Jugend der Tiere hingegen wirken sich lokalitätsspezifische Trends aus. Extrinsische Faktoren führen zu drei Mustern: 1) Trends hin zu stärker negativen d13C-Werten (um etwa -4,5 ‰) in den Bächen Nuortejaurbäcken (NJB) und Grundträsktjärnbäcken (GTB), 2) Trends hin zu weniger stark negativen d13C-Werten (um etwa +4,5 ‰) in den großen Flüssen (GJ: Görjeån, NWS: Tarn/Frankreich) und 3) Schwankungen um etwa ±1,5 ‰ um einen Mittelwert (RG: Regnitz). Der Einfluss auf die d13C-Trends könnte möglicherweise in Veränderungen der Bioproduktivität begründet sein, da sich diese unmittelbar auf den DIC-Pool des umgebenden Milieus und des Habitats auswirkt. In den Sauerstoffisotopen spiegelte sich die geographische Herkunft des untersuchten Materials wider. Die Chronologien der am nördlichsten gelegenen Populationen wiesen d18OMittelwerte von -11,5 ‰ (GJ), bzw. -9,5 ‰ (NJB, GTB) auf, die RG-Chronologie von -7,9 ‰ und die Zeitreihe der NWS von -5,3 ‰. Im Gegensatz zu anderen Arbeiten zeigten die untersuchten Individuen jedoch keinen statistischen Zusammenhang mit annuellen Temperaturdaten. Als beeinflussende Faktoren kommen die Schneeschmelze und die isotopengeochemische Ausprägung des Habitats (See, Fluss, Bach) in Frage. Eine sehr hohe Korrelation von r = -0,74 (25-Jahresfilter) wurde zwischen der Görjeån-Chronologie (d18OAragonit) und Niederschlagsraten für das in der Nähe des Flusses gelegene Jokkmokk festgestellt.
Millionen von Menschen weltweit leiden unter Kniegelenksarthrose. Ursachen hierfür sind nicht nur die altersbedingte Abnutzung des Knorpels, sondern auch erhöhte Beanspruchung durch Sport und Arbeit, verschiedene Gelenkserkrankungen, entzündliche oder rheumatische Ursachen, aber auch verschiedene Kniegelenksverletzungen. Zu den Therapieansätzen gehören als biologische Defektfüllung die Knorpelinduktionsverfahren, wie das Debridement, die Abrasionsarthroplastik, die Pridiebohrung, die darauf bauende Microfracture, die autologe Chondrozytentransplantation und die Transplantation chondrogener Materialien. Die künstliche Defektfüllung ist der Einsatz von Teil- und Totalprothesen. Ziel dieser Arbeit ist es gewesen, Patienten mit hochgradigen Kniegelenksarthrosen klinisch vor und nach der Microfracture zu erfassen, wobei der Schmerzverlauf im Vordergrund gestanden hat. Ausserdem ist die Schmerzsypmptomatik und die operativen Ergebnisse mit einem bestehendem Knochenmarksödem korreliert worden. In dieser retrospektiven klinischen Studie sind 59 Patienten mit einem arthroskopisch gesicherten Knorpelschaden von mindestens Grad III nach Outerbridge der Microfracture durch denselben Operateur unterzogen worden. Bei 26 Patienten ist präoperativ ein MRT durchgeführt worden. Zur klinischen Auswertung ist von allen Patienten ein Fragebogen beantwortet worden, der zum einen allgemeine Fragen, wie Symptomdauer, auslösende Faktoren für die Beschwerden und subjektive Besserung beinhaltet, zum anderen Fragen nach dem Score von Insall et al. enthält. Der Score nach Insall et al. setzt sich aus Knie- und Funktionsscore zusammen; es können jeweils 0 bis 100 Punkte erreicht werden. Ausserdem werden alle Patienten prä- und postoperativ untersucht. Präoperativ haben 98,3% der Patienten Schmerzen gehabt; 86,4% weisen Einschränkungen in ihrem täglichen Aktivitäten auf und 1,7% der Patienten haben ein instabiles Knie. Postoperativ sind 42,4% der Patienten schmerzfrei geworden; weitere 30,5% haben nur noch milde Schmerzen angegeben. Im Bereich ihrer täglichen Aktivität geben 49,2% der Patienten noch Probleme beim Treppenlaufen an. Insgesamt haben 78% der Patienten eine allgemeine subjektive postoperative Besserung angegeben. Im MRT sind bei 17 Patienten eine Grad-IV-Läsion vor allem am medialen Femur und korrelierend am medialen Femur und an der medialen Tibia gesehen worden. Ausserdem sind bei 15 Patienten Meniskusverletzungen und bei 6 Patienten Bandverletzungen diagnostiziert worden. Von den 26 Patienten mit einem präoperativen MRT sind bei 17 Patienten ein Knochenödem gefunden worden. In der Arthroskopie sind bei 57 von 59 Patienten ein Knorpelschaden des Grades IV, am häufigsten am medialen Femur gesehen worden. Arthroskopisch sind bei 34 Patienten Meniskusverletzungen und bei 5 Patienten Bandverletzungen diagnostiziert worden. Zur Verwertung des Knie- und Funktionsscores sind statistische Tests erhoben und die jeweiligen Medianwerte ermittelt worden. Der Medianwert des Kniescore liegt präoperativ bei 55 Punkten, postoperativ bei 95 Punkten. Der Medianwert des Funktionsscore liegt präoperativ bei 80 Punkten, postoperativ bei 90 Punkten. Die Patienten weisen im Kniescore eine deutlichere Besserung als im Funktionsscore auf, da die prä- und postoperative Differenz grösser gewesen ist. Somit haben wir uns auf den Schmerzverlauf der Patienten konzentriert und haben den Schmerzverlauf der Patienten mit Knochenödem nochmals hervorgehoben. Wir sind zu dem Schluss gekommen, dass das klinische Outcome von Faktoren, wie Alter des Patienten, Symptomdauer und Aktivitätsgrad abhängt. Begleitverletzungen, wie Meniskus- und/oder Bandverletzungen, oder Erkrankungen, wie Morbus Ahlbäck oder Osteochondrosis dissecans stellen kein Hindernis im Heilungsprozess dar. Ebenso zeigt ein Knochenmarksödem assoziiert mit einem Trauma keine Signifikanz in der allgemeinen Besserung.
Bei dieser Arbeit handelt es sich um eine retrospektive, klinische Studie, die die Bedeutung prognostischer Faktoren beim Morbus Hodgkin behandelt. Das Patientenkollekiv umfasst 136 Patienten, die an Morbus Hodgkin erkrankt sind. Mittels der bisher verwendeten und damals etablierten Risikofaktoren und der Stadienklassifikation nach Ann Arbor erfolgte eine prognostische Einteilung, anhand deren das jeweilige Chemotherapieprotokoll festgelegt worden ist. Zunächst wurden die Patienten anhand ihrer Risikofaktoren in zwei Gruppen untergliedert, die prognostisch günstigere, EBOEP I-Gruppe und die prognostisch ungünstigere EBOEP II-Gruppe. Nach Einführung des EEP-Protokolls wurde eine dritte Patientengruppe gebildet, die sich, genau wie die EBOEP I-Gruppe, in einem günstigen Stadium befand und nun nach dem EEP-Schema behandelt wurde. Der Vergleich der prognostischen Einteilung nach den Risikofaktoren mit dem neu entwickelten prognostischen Index nach Hasenclever et. al führte zu einem überraschenden Resultat. Nach der alten Einteilung anhand der Risikofaktoren zeigen beide EBOEP-Gruppen nahezu gleiche Ergebnisse mit 2,16 und 2,59 Risikofaktoren pro Patient für EBOEP I und EBEOP II. Die EEP-Patienten haben ein günstigeres Ergebnis mit 1,17 Risikofaktoren pro Patient. Verwendet man den neuen geprüften Prognostischen Index zur Einteilung derselben Patienten, erhält man andere Werte. Hierbei zeigen die Patienten der EBOEP I- und der EEP-Gruppe ähnliche prognostische Eigenschaften mit einem prognostischen Index pro Patient mit 1,48 bzw. 1,43 für die jeweiligen Gruppen. Betrachtet man sich nun das rezidivfreie Überleben nach 5 Jahren erkennt man deutlich schlechtere Ergebnisse der EEP- im Gegensatz zur EBOEP I-Gruppe. Auch die Resultate der Überlebenswahrscheinlichkeit nach 5 Jahren ist für das EEP-Patientenkollektiv ungünstiger. Dies bedeutet, dass die vermeintlich prognostisch günstigere Patientengruppe schlechtere posttherapeutische Ergebnisse zeigt. Der Grund dafür liegt darin, dass anhand der Einteilung nach den alten Risikofaktoren eine günstige Prognose erwartet worden ist und die Patienten eine weniger intensive Chemotherapie erhielten. Nach dem neuen prognostischen Index jedoch zeigten die Patienten der EEP-und der EBOEP I-Gruppe kaum Unterschiede. Die Bedeutung prognostischer Faktoren liegt darin, eine adäquate prognostische Einteilung treffen zu können, um die entsprechenden, der Krankheit angepassten, Therapiekonzepte anzuwenden. Weniger intensive Chemotherapien, die die Gefahren einer Zytostatika - bedingten Leukämie oder das Auftreten von Zweittumoren reduzieren, sind allerdings erstrebenswert für die Patientenkollektive mit einer gesicherten günstigen Prognose, die auch mit dieser geringer dosierten Therapie zuverlässig geheilt werden können.
Development of the timing system for the Bunch-to-Bucket transfer between the FAIR accelerators
(2017)
The FAIR project is aiming at providing high-energy beams of ions of all elements from hydrogen to uranium, antiprotons and rare isotopes with high intensities. The existing accelerator facility of GSI and the future FAIR facility employ a variety of circular accelerators like heavy ion synchrotrons (SIS18 and SIS100) and storage rings (ESR, CRYRING, CR and HESR) for the preparation of secondary beams and experiments. Bunches are required to be transferred into rf buckets among GSI and FAIR ring accelerators for different purposes. Without the proper transfer, the beam will be subject to various beam quality deterioration and even to beam losses. Hence, the proper bunch-to-bucket (B2B) transfer between two rings is of great importance for FAIR and is the topic, which has been investigated in this thesis.
These circular accelerators of GSI and FAIR have different ratios in their circumference. For example, the circumference ratio between SIS100 and SIS18 is an integer and between SIS18 and ESR is close to an integer and between CR and HESR is far away from an integer. The ring accelerators are connected via a complicated system of beam transfer lines, targets for the secondary particle production and the high energy separators mentioned above. For FAIR, not only the primary beams are required to be transferred from one ring to another, but also the secondary beams, e.g. the antiproton or rare isotope beams produced by the antiproton (pbar) target, the fragment separator (FRS) or the superconducting fragment separator (Super-FRS). An important topic for this system of accelerators is the proper transfer of beam between the different circular accelerators. Bunches of one ring must be transferred into buckets of another ring within an upper bound time constraint (e.g. 10 ms for most FAIR use cases) and with an acceptable B2B injection center mismatch +-1 degree for most FAIR use cases). Hence, a flexible FAIR B2B transfer system is required to realize the different complex B2B transfers between the FAIR rings in the future. In the focus of the system development and of this thesis is the transfer from SIS18 to SIS100, which can be tested at GSI on the transfer from SIS18 to ESR and from ESR to CRYRING. The system is based on the existing technical basis at GSI, the low-level radio frequency (LLRF) system and the FAIR control system. It coordinates with the Machine Protection System (MPS), which protects SIS100 and subsequent accelerators and experiments from damage caused by high intensity primary beams in case of malfunctioning. Besides, it indicates the beam status and the actual beam injection time for the beam instrumentation and diagnostics.
The conceptual realization of the FAIR B2B transfer system was introduced in this thesis for the first time. It achieves the most FAIR B2B transfers with a tolerable B2B injection center mismatch (e.g. +-1 degree) and within an upper bound time (e.g. 10 ms). It supports two synchronization methods, the phase shift and frequency beating methods. It is flexible to support the beam transfer between two rings with different ratios in their circumference and several B2B transfers running at the same time, e.g. the B2B transfer from SIS18 to SIS100 and at the same time the B2B transfer from ESR to CRYRING. It is capable to transfer beam of different ion species from one machine cycle to another and to transfer beams between two rings via the FRS, the pbar target and the Super-FRS. It allows various complex bucket filling pattern. In addition, it coordinates with the MPS system, which protects the SIS100 and subsequent accelerators or experiments from beam induced damage.
A list of criteria for the preservation of beam qualities during the rf frequency modulation of the phase shift method was analyzed. As an example the beam reaction on three different rf frequency modulation examples were analyzed for SIS18 beams. According to the beam dynamic analysis, there is a maximum value for the rf frequency modulation. The first derivative of the rf frequency modulation must be continuous and small enough and the second derivative must be small enough.
In addition to the analysis from the viewpoint of beam dynamics, two test setups were built. The first test setup was used to characterize the FAIR timing network – white rabbit network for the B2B transfer. In the second test setup, the firmware of the FAIR B2B transfer system was evaluated, which was running on the soft CPU, LatticeMico32, of the Scalable Control Unit - the FAIR standard Front End Controller. Besides, the boundary conditions of the different trigger scenarios of the SIS18 extraction and SIS100 injection kicker magnets were investigated. Finally, the application of the FAIR B2B transfer system for all FAIR use cases was demonstrated.
The dissertation plays a significant important role for the realization of the FAIR B2B transfer system and the further practical application of the system to all FAIR use cases.
Multi-view microscopy techniques are used to increase the resolution along the optical axis for 3D imaging. Without this, the resolution is insufficient to resolve subcellular events. In addition, parts of the images of opaque specimens are often highly degraded or masked. Both problems motivate scientists to record the same specimen from multiple directions. The images, then have to be digitally fused into a single high-quality image. Selective-plane illumination microscopy has proven to be a powerful imaging technique due to its unsurpassed acquisition speed and gentle optical sectioning. However, even in the case of multi view imaging techniques that illuminate and image the sample from multiple directions, light scattering inside tissues often severely impairs image contrast.
Here we show that for c-elegans embryos multi view registration can be achieved based on segmented nuclei. However, segmentation of nuclei in high density distribution like c-elegans embryo is challenging. We propose a method which uses 3D Mexican hat filter for preprocessing and 3D Gaussian curvature for the post-processing step to separate nuclei. We used this method successfully on 3 data sets of c-elegans embryos in 3 different views. The result of segmentation outperforms previous methods. Moreover, we provide a simple GUI for manual correction and adjusting the parameters for different data.
We then proposed a method that combines point and voxel registration for an accurate multi view reg- istration of c-elegans embryo, which does not need any special experimental preparation. We demonstrate the performance of our approach on data acquired from fixed embryos of c-elegans worms. This multi step approach is successfully evaluated by comparison to different methods and also by using synthetic data. The proposed method could overcome the typically low resolution along the optical axis and enable stitching to- gether the different parts of the embryo available through the different views. A tool for running the code and analyzing the results is developed.
Das Ziel der Studie bestand einerseits in der Untersuchung der Zusammenhänge zwischen der sich im Vorschulalter entwickelnden Theory of Mind und dem sich ebenfalls zu diesem Zeitpunkt ausbildenden episodischen Gedächtnis unter der Berücksichtigung verschiedener potentieller Einflussfaktoren, wie beispielsweise den sprachlichen und exekutiven Fähigkeiten der Kinder. Auf der anderen Seite sollten zudem die Veränderungen innerhalb der einzelnen Konstrukte im zeitlichen Verlauf zwischen dem vierten und fünften Lebensjahr abgebildet werden. Dazu wurden 40 Kindern an zwei im Abstand von einem Jahr stattfindenden Erhebungszeitpunkten verschiedenste Aufgaben zur Erfassung ihrer jeweiligen Fähigkeiten in den unterschiedlichen kognitiven Bereichen vorgelegt. Das Durchschnittsalter der Kinder zum Zeitpunkt der ersten Messung betrug M = 38.73 Monate (SD = 2.84) und beim zweiten Messzeitpunkt M = 51.03 Monate (SD = 2.89). Anhand der erhobenen Daten konnte gezeigt werden, dass neben dem Zeitverständnis vor allem die Fähigkeit der dreijährigen Kinder zur Perspektivübernahme einen signifikanten Beitrag zur Erklärung ihrer späteren Kompetenzen auf dem Gebiet des episodischen Gedächtnisses leistet. Weiterhin konnten mittels der zwei Messzeitpunkte sowohl die quantitativen als auch qualitativen Veränderungen innerhalb der unterschiedlichen Theory of Mind-Kompetenzen bzw. innerhalb des sich wandelnden Repräsentationsverständnisses abgebildet werden. Zudem konnte ebenfalls die bedeutende Rolle der Sprache als optimales Medium zum verbalen Austausch über die verschiedenen Perspektiven von sich und anderen sowie über vergangene, gegenwärtige oder zukünftige Erlebnisse konstatiert werden. Im Gegensatz zu den Befunden anderer Studien scheint hingegen den vorliegenden Befunden nach dem Einfluss der exekutiven Fähigkeiten auf die Theory of Mind-Kompetenzen der Kinder keine so grundlegende Bedeutung zuzukommen.
Driving can be dangerous. Humans become inattentive when performing a monotonous task like driving. Also the risk implied while multi-tasking, like using the cellular phone while driving, can break the concentration of the driver and increase the risk of accidents. Others factors like exhaustion, nervousness and excitement affect the performance of the driver and the response time. Consequently, car manufacturers have developed systems in the last decades which assist the driver under various circumstances. These systems are called driver assistance systems. Driver assistance systems are meant to support the task of driving, and the field of action varies from alerting the driver, with acoustical or optical warnings, to taking control of the car, such as keeping the vehicle in the traffic lane until the driver resumes control. For such a purpose, the vehicle is equipped with on-board sensors which allow the perception of the environment and/or the state of the vehicle. Cameras are sensors which extract useful information about the visual appearance of the environment. Additionally, a binocular system allows the extraction of 3D information. One of the main requirements for most camera-based driver assistance systems is the accurate knowledge of the motion of the vehicle. Some sources of information, like velocimeters and GPS, are of common use in vehicles today. Nevertheless, the resolution and accuracy usually achieved with these systems are not enough for many real-time applications. The computation of ego-motion from sequences of stereo images for the implementation of driving intelligent systems, like autonomous navigation or collision avoidance, constitutes the core of this thesis. This dissertation proposes a framework for the simultaneous computation of the 6 degrees of freedom of ego-motion (rotation and translation in 3D Euclidean space), the estimation of the scene structure and the detection and estimation of independently moving objects. The input is exclusively provided by a binocular system and the framework does not call for any data acquisition strategy, i.e. the stereo images are just processed as they are provided. Stereo allows one to establish correspondences between left and right images, estimating 3D points of the environment via triangulation. Likewise, feature tracking establishes correspondences between the images acquired at different time instances. When both are used together for a large number of points, the result is a set of clouds of 3D points with point-to-point correspondences between clouds. The apparent motion of the 3D points between consecutive frames is caused by a variety of reasons. The most dominant motion for most of the points in the clouds is caused by the ego-motion of the vehicle; as the vehicle moves and images are acquired, the relative position of the world points with respect to the vehicle changes. Motion is also caused by objects moving in the environment. They move independently of the vehicle motion, so the observed motion for these points is the sum of the ego-vehicle motion and the independent motion of the object. A third reason, and of paramount importance in vision applications, is caused by correspondence problems, i.e. the incorrect spatial or temporal assignment of the point-to-point correspondence. Furthermore, all the points in the clouds are actually noisy measurements of the real unknown 3D points of the environment. Solving ego-motion and scene structure from the clouds of points requires some previous analysis of the noise involved in the imaging process, and how it propagates as the data is processed. Therefore, this dissertation analyzes the noise properties of the 3D points obtained through stereo triangulation. This leads to the detection of a bias in the estimation of 3D position, which is corrected with a reformulation of the projection equation. Ego-motion is obtained by finding the rotation and translation between the two clouds of points. This problem is known as absolute orientation, and many solutions based on least squares have been proposed in the literature. This thesis reviews the available closed form solutions to the problem. The proposed framework is divided in three main blocks: 1) stereo and feature tracking computation, 2) ego-motion estimation and 3) estimation of 3D point position and 3D velocity. The first block solves the correspondence problem providing the clouds of points as output. No special implementation of this block is required in this thesis. The ego-motion block computes the motion of the cameras by finding the absolute orientation between the clouds of static points in the environment. Since the cloud of points might contain independently moving objects and outliers generated by false correspondences, the direct computation of the least squares might lead to an erroneous solution. The first contribution of this thesis is an effective rejection rule that detects outliers based on the distance between predicted and measured quantities, and reduces the effects of noisy measurement by assigning appropriate weights to the data. This method is called Smoothness Motion Constraint (SMC). The ego-motion of the camera between two frames is obtained finding the absolute orientation between consecutive clouds of weighted 3D points. The complete ego-motion since initialization is achieved concatenating the individual motion estimates. This leads to a super-linear propagation of the error, since noise is integrated. A second contribution of this dissertation is a predictor/corrector iterative method, which integrates the clouds of 3D points of multiple time instances for the computation of ego-motion. The presented method considerably reduces the accumulation of errors in the estimated ego-position of the camera. Another contribution of this dissertation is a method which recursively estimates the 3D world position of a point and its velocity; by fusing stereo, feature tracking and the estimated ego-motion in a Kalman Filter system. An improved estimation of point position is obtained this way, which is used in the subsequent system cycle resulting in an improved computation of ego-motion. The general contribution of this dissertation is a single framework for the real time computation of scene structure, independently moving objects and ego-motion for automotive applications.
Urothelkarzinome entstehen aus dem Epithel (Urothel) der unteren Harnwege (Nierenkelche und -becken, Harnleiter und -blase, sowie proximale Harnröhre). Die Harnblase ist der bevorzugte Ort der Urothelkarzinome. Krebserregende chemische Verbindungen (Karzinogene), die im Urin konzentriert vorliegen, sind Hauptverursacher der Urothelkarzinome. Größter einzelner Risikofaktor ist das Rauchen. Urothelkarzinome alarmieren durch Mikro- oder Makrohämaturie, und werden durch zytologische Bestimmung der Urinzellen (exfoliative Urinzytologie) und durch endoskopische Untersuchung der Harnblase (Zystoskopie) diagnostiziert. Es gibt kein pathognomisches Zeichen das auf ein Urothelkarzinom hinweisen würde. Da gutdifferenzierte Urothelkarzinomzellen kaum von den normalen Urothelzellen zu unterscheiden sind, ist die falsch-negative Rate bei der Diagnose dieser G 0-1 Tumoren mit 42% besonders hoch. Bei den endoskopisch schwer zu erkennenden in situ Karzinomen, die weitgehend entdifferenziert (anaplastisch) sind, liegt die Treffsicherheit bei 94%. Keiner der bis heute vorgeschlagenen Tumormarker hat die geforderte Spezifität, Sensitivität und prognostische Aussagekraft, um für die Diagnostik des Harnblasenkarzinoms von Wert zu sein. In der vorliegenden Arbeit wurde bei der Suche nach einem geeigneten Marker für den Nachweis eines Urothelkarzinoms eine Doppelstrategie verfolgt: 1. Die Expression einiger bekannter Gene wurde mit Reverser Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) an einer Reihe von Urothelkarzinomen unterschiedlicher Malignitätsgrade (G1 bis G4) und an normalen Urothelien untersucht. Uroplakine, die einzigen bislang bekannten urothelspezifischen Moleküle, bildeten dabei den Schwerpunkt. Ein Uroplakin-RT-PCR Bluttest wurde entwickelt, mit dem es möglich ist, disseminierte Urothelkarzinomzellen zu entdecken, noch bevor sie Metastasen gebildet haben. Die Nachweisempfindlichkeit des Tests liegt bei einer Zelle pro ml Blut. Von den untersuchten Urothelkarzinomprimärtumoren exprimierten alle gut bis mäßig differenzierten Tumoren (G1 und G2) Uroplakin (UP), bei den wenig differenzierten und anaplastischen Tumoren (G3 und G4) war etwa die Hälfte UP-positiv. 2. Die differentielle Genexpression derselben Urothelkarzinome und Urothelien wurde mittels Differential Display RT-PCR (ddRT-PCR) dargestellt, um auch unbekannte Genprodukte zu erfassen, die an der Krebsentstehung beteiligt sein und als spezifische Marker dienen könnten. Die gebräuchliche ddRT-PCR wurde durch eine Homologiedomänen-Konsenssequenz-RT-PCR ergänzt. Es konnten einige bekannte Gene identifiziert werden, darunter das DNA-bindende und transkriptionsregulierende HMG-1 (high mobility group) Protein und das mit Metastasierung assoziierte mts-1 Produkt. Einige Sequenzen zeigten keine Übereinstimmung mit bekannten Genen und sind damit potentiell neue Krebsgenkanditaten.
Bei der Expression einer Phospholipase A2 aus Soja in Aspergillus oryzae (Probe PL-1007), Trichoderma viride (Probe PL-1008) und Pichia pastoris (Probe PL-1035) wurde neben der erwarteten Phospholipaseaktivität auch eine deutliche Lysophospholipaseaktivität beobachtet. Eine Trennung dieser Aktivitäten war nur mittels einer Free-Flow-Elektrophorese kurzzeitig möglich, bevor sich in jeder Fraktion wieder das ursprüngliche Aktivitätsverhältnis zwischen Phospholipase und Lysophospholipase einstellte. Zur näheren Untersuchung und Charakterisierung dieser Enzymsysteme wurden für einen gaschromatischen Aktivitätstest hochspezifisch substituierte Substrate eingesetzt, die eine parallele Bestimmung der Phospholipase- und Lysophospholipaseaktivitäten ermöglichten. So konnte gezeigt werden, dass nicht in allen Organismen eine Phospholipase A2 exprimiert wird, sondern es in Pichia pastoris (Probe PL-1035) zur Expression einer Phospholipase A1 kommt. Im Falle der Probe PL-1007 konnte die beobachtete Lysophospholipaseaktivität durch Versuche mit veränderten Substratverhältnissen zwischen Lysophospholipase- und Phospholipasesubstrat einem separaten aktiven Zentrum zugeschrieben werden. Durch elektrophoretische Trennungsversuche konnte gezeigt werden, dass es sich nicht nur um separate aktive Zentren, sondern um verschiedene Enzyme handelt. Die Tatsache, dass sich das Aktivitätsverhältnis nach der Trennung selbständig wieder einstellt, lässt das Vorliegen von Faltungsisomeren vermuten. Bezüglich ihrer katalytischen Eigenschaften weisen alle drei Enzymsysteme eine große Ähnlichkeit auf. Sowohl die Phospholipase- wie auch die Lysophospholipaseaktivitäten sind erst ab einer Reaktionstemperatur von über 70°C nicht mehr nachweisbar. Das Aktivitätsmaximum wurde in allen drei Fallen zwischen 45°C und 55°C beobachtet. Auch die pH-Bereiche in denen eine maximale enzymatische Aktivität zu beobachten ist, liegen mit pH 3,6 (PL-1007) bis pH 4,3 (PL-1035) für die Phospholipaseaktivitäten und pH 4,3 (PL-1007 / PL-1008) und pH 4,6 (PL-1035) in ähnlichen Bereichen. Die Aktivität der untersuchten Enzymsysteme zeigt jedoch im beobachteten pH-Bereich von pH 3 bis pH 5 nur eine geringe pH-Abhängigkeit. Deutlichere Unterschiede konnten jedoch für die Substratspezifitäten nachgewiesen werden. Die Phospholipasen A2 zeigen tendenziell höhere Umsätze bei Substraten mit C 12:0 bis C 16:0 Fettsäureresten, während die Phospholipase A1 aus Probe PL-1035 maximale Umsätze bei C 18:0 Fettsäureresten aufweist. Bei allen Enzymproben jedoch bleiben die Umsatzraten der ein- bis mehrfach ungesättigten Fettsäurereste hinter denen der gesättigten zurück. Lediglich bei der Probe PL-1007 sind die Aktivitätsunterschiede zwischen gesättigten und ungesättigten Substraten nicht signifikant. Neben der Untersuchung der katalytischen Eigenschaften konnte im Rahmen dieser Arbeit die in der Literatur mehrfach aufgestellte These der Hemmung der Phospholipaseaktivität in Gegenwart von Uteroglobin bestätigt werden. Ein Hemmungsmechanismus aufgrund direkter Wechselwirkung der Enzyme konnte ausgeschlossen werden. Vielmehr konnte zweifelsfrei bewiesen werden, dass der Hemmungsmechanismus bei den hier eingesetzten Enzymsystemen auf einer Bindung des für die Phospholipasereaktion essentiellen Ca2+ durch das Uteroglobin zurückzuführen ist.
Das Buch nimmt die Beobachtung zum Ausgangspunkt, dass wahrnehmende Lebewesen immer auch sich bewegende Lebewesen sind. Der Zusammenhang zwischen den Vermögen der Wahrnehmung und der Selbstbewegung wird hier als ein konstitutiver gefasst, der insofern Auswirkungen für das Verständnis und die philosophische Analyse des jeweiligen Vermögens hat. Im Fokus steht das wechselseitige Verhältnis zwischen Wahrnehmung und Handeln beim Menschen und damit auch die Frage, in welcher Beziehung das begriffliche Denken zu den genannten Vermögen steht. Die Arbeit diskutiert Schriften von Wittgenstein, Anscombe, Merleau-Ponty, Dreyfus, McDowell, sowie neuere Beiträge aus der enaktivistischen und phänomenologischen Tradition.
Im ersten Kapitel wird der Zusammenhang zwischen Wahrnehmung und Handlung in der Erkenntnistheorie untersucht. Hier stehen enaktivistische Theorien, die auf den grundsätzlichen Handlungscharakter der Wahrnehmung verweisen, im Mittelpunkt. Anhand einer Kritik der Kamerametaphorik des menschlichen Blicks wird dafür argumentiert, dass die (visuelle) Wahrnehmung als aktiver Prozess verstanden werden muss. Das Sehen ist weder punktförmig noch bildhaft aufzufassen, vielmehr ist es eine stets prekäre Errungenschaft eines leiblichen Wesens im Austausch mit der es umgebenden Welt. Die Ergebnisse aus dem ersten Kapitel werden im zweiten Kapitel mit Ludwig Wittgensteins Überlegungen zum Aspektsehen in Kontakt gebracht. Wittgensteins Bemerkungen zum Sehen und Aspektsehen lassen sich als Anstoß zu einem pluralistischen Verständnis der Wahrnehmung verstehen. In Anbetracht der vielfältigen Diskussionen, für die Wittgensteins Bemerkungen über das Aspektsehen relevant sind, wird hier herausgearbeitet, inwieweit sie als eine Kritik an jeder Form des Gegebenseins in der Wahrnehmung verstanden werden können. Eine Diskussion des ebenso ungewöhnlichen wie wenig beachteten Beitrags Anscombes zur Theorie der Wahrnehmung, den sie hauptsächlich in »The Intentionality of Sensation« ausarbeitet, beschließt das zweite Kapitel.
Im dritten Kapitel geht es um den zweiten Teil der These, Wahrnehmung und Handeln seien wechselseitig voneinander abhängig. In diesem Kapitel geht es um Theorien, für die die Wahrnehmung nicht einfach Informationen über die Umwelt bereitstellt, sondern selbst Bestandteil des Handelns ist. Eine besondere Herausforderung besteht darin, die Rolle der Wahrnehmung sowohl für das geistesabwesende Tun als auch für das überlegte Handeln und auch für mentale Handlungen, wie etwa Entscheidungen, zu bestimmen. Besonders offensichtlich wird die Rolle der Wahrnehmung im Handeln immer dort, wo das Überlegen zurücktritt und das gekonnte Handeln auf die Wahrnehmung von Gelegenheiten angewiesen ist – also insbesondere dort, wo das Handeln Ausdruck spezialisierter Fähigkeiten ist.
Der Wahrnehmungsbegriff, der in der Arbeit im Mittelpunkt steht, ist gerade kein allgemeiner oder übergreifenden – und erst recht kein »zugrundliegender« Begriff der Wahrnehmung. Vielmehr soll Wahrnehmung plural verstanden werden: die Wahrnehmung im Alltag, die beobachtenden Wahrnehmung, die Wahrnehmung des Profis, die begriffliche Wahrnehmung. Diese Herangehensweise läuft zwangsläufig auch auf die Frage hinaus, inwiefern sich die menschliche Wahrnehmung und die Wahrnehmung der Tiere unterscheiden. Zwar gilt für Tiere wie für Menschen, dass sie wahrnehmen und sich bewegen – aber bestimmte Formen der Wahrnehmung sind klarerweise dem Menschen vorbehalten, etwa die ästhetische, die moralische und die begriffliche Wahrnehmung. Das vierte Kapitel diskutiert – ausgehend von der Frage nach der Begrifflichkeit der menschlichen Vermögen des Wahrnehmens und Handelns –, in welchem Verhältnis diese zu denen der Tiere stehen.
Ein auffälliger Unterschied zwischen den Vermögen des Menschen und denen der Tiere – so wird sich herausstellen – ist die Flexibilität und Pluralität der menschlichen Vermögen. Doch diese Pluralität ist kein natürliches Faktum, sondern Produkt bestimmter Tätigkeiten und Praktiken. Erst im tätigen Umgang mit der Welt, durch den Erwerb bestimmter Techniken und innerhalb bestimmter Praktiken verwirklicht sich die grundsätzliche Offenheit der menschlichen Vermögen. Diese Idee, dass unsere natürlichen Vermögen in Kontakt und Auseinandersetzung mit unserer Lebenswelt sich allererst entwickeln, ist Gegenstand des fünften Kapitels.
Die konstitutiven Beziehungen zwischen Wahrnehmung und Handeln in den Mittelpunkt dieser Untersuchung zu rücken, ist dabei Ausdruck eines bestimmten Philosophieverständnisses, nämlich eines, das das wahrnehmende, denkende und handelnde Lebewesen in den Fokus seiner Untersuchung stellt – nicht das einzelne Vermögen, sondern der ganze Organismus sind der point of interest.
In this thesis we study strongly correlated electron systems within the Density Functional Theory (DFT) in combination with the Dynamical Mean-Field Theory (DMFT).
First, we give an introduction into the theoretical methods and then apply them to study realistic materials. We present results on the hole-doped 122-family of the iron-based superconductors and the transition-metal oxide SrVO3. Our investigations show that a proper treatment of strong electronic correlations is necessary to describe the experimental observations.
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei motivationale Erklärungsmodelle, Zielorientierungen und das kognitiv-motivationale Prozessmodell, im Rahmen des selbstregulierten Lernens integriert. Selbstregulationsprozesse sind nach Carver und Scheier (1981) zyklisch angelegt. Zu den Bestandteilen der Selbstregulation gehören nach Boekaerts (1999)Regulation der Informationsverarbeitung, Regulation des Lernprozesses und Regulation des Selbsts. Auf dieser Ebene sind die Zielorientierungen angesiedelt. In dieser Arbeit das 2 x 2 Modell von Elliot und McGregor (2001) herangezogen. Es berücksichtigt zwei Dimensionen, die Valenz (Annäherungs- und Vermeidungskomponente) und die Kompetenz (Vergleichsmaßstab intern und extern). Hieraus resultieren: 1) Lern-Annäherungs-Ziele (positive Valenz & interner Vergleich, 2) Lern-Vermeidungs-Ziele (negative Valenz & interner Vergleich), 3) Leistungs-Annäherungs-Ziele (positive Valenz & externer Vergleich) und 4) Leistungs-Vermeidungs-Ziele (negative Valenz & externer Vergleich). Diese vier Zielorientierungen sind der erste Teil des integrierten Modells, der zweite zentrale Teil ist das kognitiv-motivationale Prozessmodell (Vollmeyer & Rheinberg, 1999, 2006). Ausgangspunkt ist die aktuelle Motivation, die aus 1) der Erfolgswahrscheinlichkeit, 2) der Misserfolgsbefürchtung, 3) dem Interesse und 4) der Herausforderung als unabhängige Faktoren besteht. Diese aktuelle Motivation wirkt nicht direkt auf die Leistung, sondern durch kognitive (hier: Metakognition) und motivationale (hier: Flow-Erleben) Mediatoren. Es wurden drei Fragestellungen bearbeitet. Die erste Fragestellung betraf das Zusammenspiel der Zielorientierungen und der aktuellen Motivation. Eine Überprüfung dieses integrierten Motivationsmodell erfolgte mittels Pfadanalyse. Die zweite und dritte Fragestellung befasste sich spezifisch mit dem kognitiv-motivationalen Prozessmodell. Es wurden Subgruppen auf der Basis der aktuellen Motivation identifiziert und ihre Bedeutung für die Mediatoren und die Leistung untersucht. Die dritte Fragestellung fokussierte den Prozesscharakter des Modells. Hier erfolgten Analysen über den Arbeitsprozess hinweg. Die Fragebögen (Achievement Goal Questionnaire (Elliot & McGregor, 2001), Metakognitionsfragebogen (aufbauend auf LIST (Wild, 2000) und Metacognitive Awareness Inventory (Schraw & Dennison, 1994), Fragebogen zur aktuellen Motivation (Rheinberg, Vollmeyer & Burns, 2001), Flow-Kurz-Skala (Rheinberg, Vollmeyer & Engeser, 2003)) und die Problemlöseaufgaben (Sudokus) wurden in einer Pilotstudie getestet. An der Hauptstudie nahmen 202 Personen teil (73% weiblich). Das integrierte Motivationsmodell geht davon aus, dass eine positiver Effekt der Zielorientierungen als Personenvariable auf die aktuelle Motivation besteht. Die aktuelle Motivation als Startpunkt des situationalen Geschehens wiederum wirkt positiv auf die Mediatoren Flow-Erleben und Metakognition, hat aber keinen direkten Effekt auf die Leistung. Dieser wird nämlich über die Mediatoren vermittelt. Deswegen wird ein positiver Effekt des Flow-Erlebens und der Metakognition auf die Leistung erwartet. Das Zusammenwirken der beiden Mediatoren kann aus dem kognitiv-motivationalen Prozessmodell nicht abgeleitet werden. Ob ein Zusammenhang besteht oder nicht wird geprüft. Für das Vorwissen wird ein positiver Effekt auf die aktuelle Motivation und die Leistung erwartet. Die Pfadanalyse zur Überprüfung des integrierten Motivationsmodells zeigte, dass eine Integration nicht nur theoretisch sinnvoll ist, sondern auch empirisch gestützt wird. Die Bedeutung der Metakognition als kognitiver Mediator wurde gezeigt. Die zweite Fragestellung fokussierte auf die aktuelle Motivation. Auf der Basis dieser wurden mittels Clusteranalyse drei distinkte Gruppen identifiziert: hoch Motivierte, niedrig Motivierte und ängstlich Motivierte (vergleichbar zu Vollmeyer & Rheinberg, 2004). Diese Gruppen unterschieden sich hinsichtlich ihres Flow-Erlebens, ihrer Metakognition und ihrer Leistung. Die hoch Motivierten erlebten am meisten Flow, berichteten mehr Metakognition und zeigten bessere Leistung. Der Prozesscharakter des kognitiv-motivationalen Prozessmodells stand im Mittelpunkt der dritten Fragestellung. Diese Analyse über die drei Sudokus hinweg zeigte eine ähnliche Entwicklung des Flow-Erlebens bei den hoch und niedrig Motivierten. Vom ersten zum zweiten Sudoku stieg es an, um dann wieder abzufallen. Dies war bei der Metakognition nicht der Fall. Die hoch Motivierten berichteten einen stärkeren Rückgang der Metakognition beim dritten Sudoku als die niedrig Motivierten. Bei der Leistung zeigte sich für die hoch Motivierten ein Anstieg beim zweiten Sudoku und dann ein Rückgang beim dritten, wohingegen die Leistung der niedrig Motivierten kontinuierlich abfiel. Abschließend wurden die Schwierigkeiten und Grenzen der vorliegenden Arbeit diskutiert und Implikationen der Ergebnisse für die Theorieentwicklung und ihre Bedeutung für den Anwendungskontext aufgezeigt.
Quarks and gluons are the building blocks of all hadronic matter, like protons and neutrons. Their interaction is described by Quantum Chromodynamics (QCD), a theory under test by large scale experiments like the Large Hadron Collider (LHC) at CERN and in the future at the Facility for Antiproton and Ion Research (FAIR) at GSI. However, perturbative methods can only be applied to QCD for high energies. Studies from first principles are possible via a discretization onto an Euclidean space-time grid. This discretization of QCD is called Lattice QCD (LQCD) and is the only ab-initio option outside of the high-energy regime. LQCD is extremely compute and memory intensive. In particular, it is by definition always bandwidth limited. Thus—despite the complexity of LQCD applications—it led to the development of several specialized compute platforms and influenced the development of others. However, in recent years General-Purpose computation on Graphics Processing Units (GPGPU) came up as a new means for parallel computing. Contrary to machines traditionally used for LQCD, graphics processing units (GPUs) are a massmarket product. This promises advantages in both the pace at which higher-performing hardware becomes available and its price. CL2QCD is an OpenCL based implementation of LQCD using Wilson fermions that was developed within this thesis. It operates on GPUs by all major vendors as well as on central processing units (CPUs). On the AMD Radeon HD 7970 it provides the fastest double-precision D= kernel for a single GPU, achieving 120GFLOPS. D=—the most compute intensive kernel in LQCD simulations—is commonly used to compare LQCD platforms. This performance is enabled by an in-depth analysis of optimization techniques for bandwidth-limited codes on GPUs. Further, analysis of the communication between GPU and CPU, as well as between multiple GPUs, enables high-performance Krylov space solvers and linear scaling to multiple GPUs within a single system. LQCD calculations require a sampling of the phase space. The hybrid Monte Carlo (HMC) algorithm performs this. For this task, a single AMD Radeon HD 7970 GPU provides four times the performance of two AMD Opteron 6220 running an optimized reference code. The same advantage is achieved in terms of energy-efficiency. In terms of normalized total cost of acquisition (TCA), GPU-based clusters match conventional large-scale LQCD systems. Contrary to those, however, they can be scaled up from a single node. Examples of large GPU-based systems are LOEWE-CSC and SANAM. On both, CL2QCD has already been used in production for LQCD studies.
Chronische Herzinsuffizienz ist eine der führenden Todesursachen im Rahmen kardiovaskulärer Erkrankungen und ist mit einer hohen Anzahl an Komorbiditäten assoziiert. Unter anderem führt Herzinsuffizienz zu Veränderungen des Immunsystems, welche denen der Immunoseneszenz ähneln. Als einflussreiche Modulatoren ganzer molekularbiologischer Regelkreise sind microRNAs in den letzten Jahren zunehmend in den Fokus gerückt. Diese nicht-kodierenden, kurzen RNA-Einzelstränge können die Genexpression von vielen Zielgenen durch spezifisches Binden der jeweiligen mRNA Transkripte kontrollieren. Aufgrund zum Teil gewebe-, zelltyp- und prozess-spezifischer Expression können microRNAs auch als mögliche Biomarker für spezifische klinische Fragestellungen dienen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von immunmodulatorischen microRNAs im peripheren Blut (PB) von jungen und gealterten gesunden Probanden (y/h bzw. o/h) sowie Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz (CHF) untersucht. Dabei wurde ein Bezug auf Immunoseneszenz bzw. die Auswirkung von CHF auf das Immunsystem hergestellt. Im Rahmen dessen wurden Leukozyten-, insbesondere Lymphozyten-Subpopulationen analysiert.
Hierzu wurden Probanden in die drei folgenden Gruppen eingeschlossen: Patienten mit CHF (n=18, durchschnittliches Alter 64 Jahre), alters-korrelierte gesunde Probanden (n=13, durchschnittliches Alter 64 Jahre) sowie junge gesunde Probanden (n=30, durchschnittliches Alter 25 Jahre). Neben der Erhebung der klinischen Daten wurde peripheres Blut zur Bestimmung der microRNA-Expressionslevels sowie für durchflusszytometrische Analysen der Leukozytenpopulationen gewonnen.
In den Expressionsanalysen konnte eine alters- und herzinsuffizienz-abhängige Dysregulation einzelner microRNAs beobachtet werden. Insbesondere Mitglieder der miR-181-Familie, spezifisch miR-181a und miR-181c, waren im Alter niedriger exprimiert, zudem war die Expression von miR-181c bei Vorliegen einer CHF deutlicher reduziert. Des Weiteren zeigte sich eine altersabhängige erhöhte Expression von miR-34a, wobei das Vorliegen von CHF keine Auswirkung auf die Expression zeigte. Bei den microRNAs miR-146a und miR-223 konnte keine signifikante alters- oder CHF-abhängige Regulation nachgewiesen werden. Lediglich zeigte bei der miR-155 zeigte sich eine signifikante Reduktion bei Vorliegen einer CHF im Vergleich o/h Probanden.
In Hinblick auf die Leukozytenpopulationen im peripheren Blut wiesen Patienten mit CHF höhere Zahlen an Leukozyten auf, alle miR-181 Mitglieder zeigten hierbei eine inverse Korrelation. Dagegen stellte sich in Hinblick auf die Zusammensetzung der Leukozyten-Subpopulationen eine Reduktion der Lymphozytenfraktion im Alter dar, besonders bei Patienten mit CHF. Insbesondere zeigte sich eine altersabhängige Abnahme der B-Lymphozytenpopulation, wobei auch hier das Vorliegen einer CHF diesen Effekt verstärkte. Die Expression miR-181a und miR-181c sowie miR-146a und miR-223 korrelierte positiv mit dem Anteil der B-Lymphozyten. Innerhalb der B-Zellen zeigte sich eine alters- und CHF-abhängige Reduktion der naïven B-Zellen, welche positiv mit der Expression von miR-181c, miR-146a und miR-223 korrelierte. Die beobachteten Veränderungen der B-Zell-Subpopulationen zeigten sich insbesondere bei CHF Patienten mit ischämischer Ursache im Vergleich zur dilatativen Kardiomyopathie.
Bei den untersuchten T-Lymphozyten-Subpopulationen zeigte sich eine altersabhängiger Abfall bei den zytotoxischen T-Zellen. Das Vorliegen einer CHF verstärkte diesen Effekt. Die beobachteten Veränderungen der T-Zell-Subpopulation korrelierten nicht mit der Expression der untersuchten microRNAs.
Im Gegensatz zu den lymphoiden Subpopulationen zeigte sich ein Anstieg der neutrophilen Granulozyten und der Monozyten im Alter, es stellte sich jeweils eine negative Korrelation mit der Expression von miR-181 Transkripten sowie miR-155, miR-146a und miR-223 dar.
Zusammenfassend zeigten sich signifikant erniedrigte Expressionslevels von miR-181c im Alter, was mit Immunoseneszenz-bedingten Veränderungen des peripheren Bluts einherging. Diese Veränderungen zeigten sich zusätzlich verstärkt bei Patienten mit CHF. Zukünftig könnten miR-181c Expressionslevel in peripherem Blut als Biomarker für die Immunfunktionen bei CHF Patienten dienen und in Hinblick auf eine mögliche prospektive Information evaluiert werden.
Reggie-1 (flotillin-2) and reggie-2 (flotillin-1) are membrane microdomain proteins which are associated with the membrane by means of acylation. They influence different cellular signaling processes, such as neuronal, T-cell and insulin signaling. Upon stimulation of the EGF receptor, reggie-1 becomes phosphorylated and undergoes tyrosine 163 dependent translocation from the plasma membrane to endosomal compartments. In addition, reggie-1 was shown to influence actindependent processes. Reggie-2 has been demonstrated to affect caveolin- and clathrin-independent endocytosis. Both proteins form homo- and hetero-oligomers, but the function of these oligomers has remained elusive. Moreover, it has not been clarified if functions of reggie-1 are also influenced by reggie-2 and vice versa. The first aim of the study was to further investigate the interplay and the heterooligomerization of reggie proteins and their functional effects. Both reggie proteins were individually depleted by means of siRNA. In different siRNA systems and various cell lines, reggie-1 depleted cells showed reduced protein amounts of reggie-1 and reggie-2, but reggie-2 knock down cells still expressed reggie-1 protein. The decrease of reggie-2 in reggie-1 depleted cells was only detected at protein but not at mRNA level. Furthermore, reggie-2 expression could be rescued by expression of siRNA resistant wild type reggie-1-EGFP constructs, but not by the soluble myristoylation mutant G2A. This mutant was also not able to associate with endogenous reggie-1 or reggie-2, which demonstrates that membrane association of reggie-1 is necessary for hetero-oligomerization. In addition, fluorescence microscopy studies and membrane fractionations showed that correct localization of overexpressed reggie-2 was dependent on co-overexpressed reggie-1. Thus, hetero-oligomerization is crucial for membrane association of reggie-2 and for its protein stability or protein expression. Moreover, the binding of reggie-2 to reggie-1 required tyrosine 163 of reggie-1 which was previously shown to be important for endosomal translocation of reggie-1. Since reggie-2 was implicated to function in clathrin- and caveolin-independent endocytosis pathways, the effect of reggie-2 depletion on reggie-1 endocytosis was investigated. Indeed, reggie-1 was dependent on reggie-2 for endosomal localization and EGF-induced endocytosis. By FRET-FLIM analysis it could be shown that reggie heterooligomers are dynamic in size or conformation upon EGF stimulation. Thus, it can be concluded that reggie proteins are interdependent in different aspects, such as protein stability or expression, membrane association and subcellular localization. In addition, these results demonstrate that the hetero-oligomers are dynamic and reggie proteins influence each other in terms of function. A further aim was the characterization of reggie-1 and reggie-2 function in actindependent processes, where so far only reggie-1 was known to play a role. Depletion of either of the proteins reduced cell migration, cell spreading and the number of focal adhesions in steady state cells. Thus, also reggie-2 affects actin-dependent processes. Further investigation of the focal adhesions during cell spreading revealed that depletion of reggie-1 displayed different effects as compared to reggie-2 knock down. Reggie-1 depleted cells had elongated cell-matrix-adhesions and showed reduced activation of FAK and ERK2. On the other hand, depletion of reggie-2 resulted in a restricted localization of focal adhesion at the periphery of the cell and decreased ERK2 phosphorylation, but it did not affect FAK autophosphorylation. Hence, reggie proteins influence the regulation of cell-matrix-adhesions differently. A link between reggie proteins and focal adhesions is the actin cross-linking protein -actinin. The interaction of -actinin with reggie-1 could be verified by means of co-immunoprecipitations and FRET-FLIM analysis. Reggie-1 binds -actinin especially in membrane ruffles and in other locations where actin remodeling takes place. Moreover, -actinin showed a different localization pattern during cell spreading in reggie-1 depleted cells, as compared to the control cells. These results provide further insights into the function of both reggie proteins. Their interplay and hetero-oligomerization was shown to be crucial for their role in endocytosis. In addition, both reggie proteins influence actin-dependent processes and differentially affect focal adhesion regulation.
This work is about resumptive and non-resumptive relative clauses (RCs) in the three big Ibero-Romance languages: Spanish, Portuguese, and Catalan. In (1), the examined structures are exemplified for Spanish: (1a.) No conozco el hombre que viste _ ayer. “I don’t know the man that you saw yesterday.” (1b.) Es este el hombre que le enviaron el libro. “This is the man to whom they sent the book.” (1c.) Es este el hombre a quien le enviaron el libro. “This is the man to whom they sent the book.”
(1a.) displays a non-resumptive, or canonical, RC, which is characterized by the canonical use of a relativizing operator and a gap in the subordinate’s object position, a piece of evidence which has induced most of the generative literature to assume wh-movement of the relative operator in the sense of Chomsky (1977). The last two decades, however, have seen a big debate regarding the exact derivational analysis, starting with Kayne’s (1994) antisymmetry theory and the following focus on reconstruction and anti-reconstruction effects in RCs. This search for the correct starting site of the RC’s head noun has dismissed the original Head External Analysis (HEA) (Chomsky 1965, 1977) and led to the development of a Head Raising Analysis (RA) (Kayne 1994, Bianchi 1999, a.o.) and a Matching Analysis (MA) (Munn 1994, Sauerland 1998, a.o.). The discussion in this work argues that the data on reconstruction and anti-reconstruction effects are not sufficiently clear and reliable in order to adopt one of the head-internal analyses, i.e. a HEA or a MA. Instead, the work follows a variant of the HEA proposed for Portuguese by Rinke & Aßmann (2017), which adheres to standard assumptions about Romance syntax, and avoids the empirical problems that the other proposals have to face. Arguing that the HEA holds for all Ibero-Romance languages, this work also takes a stance in the debate around the categorical status of the relativizing element que and argues that it is always a D-element, and never of category C, i.e. there is no such thing as a relativizing complementizer (cf. also Kayne 2010, Kato & Nunes 2008, Poletto & Sanfelici 2018).
The work argues that wh-movement in a HEA fashion is the correct analysis also for resumptive relative clauses as in (1b., c.), which crucially lack a gap in argument position but show a resumptive pronominal element instead. Furthermore, it takes advantage of the fact that the choice of such genetically closely related languages like Spanish, Portuguese, and Catalan enables research to address the phenomenon under consideration from a microcomparative perspective, which is “the closest we can come … to a controlled experiment in comparative syntax” (Kayne 2005: 281-282). The descriptive literature suggests that, at least for Spanish and Catalan, there are two types of a resumptive RC structure available: a simple resumption as in (1b.), including mere que, and a complex resumption structure which displays a more complex relativizer like a quien in combination with a resumptive pronoun (1c.). However, a corpus study carried out for this work reveals that speakers of the three languages behave alike insofar as the only resumptive RC used in spontaneous speech is a simple-resumption structure, while complex resumption never occurs. Additionally, a multivariate analysis shows that in all three languages, grammatical case is the most important factor when it comes to the possibility of a resumptive structure in RCs: with a dative argument, simple resumption is obligatory, while for accusative and nominative arguments, resumption is optional. The discussion concludes that simple and complex resumption constitute different phenomena also on a structural level: the latter one is argued to be a subcase of clitic doubling, and therefore, receives an analysis along the lines of Pineda (2016), who argues against a dative alternation in Romance languages and locates the (non-)realisation of the dative clitic in a transitive clitic-doubling structure outside of syntax, it being a case of silent variation along the lines of Sigurðsson (2004) and Kayne (2005). From this perspective, it follows naturally that in Portuguese, complex resumption structures are ungrammatical. Simple resumption, on the other hand, which is a possible structure in all three languages, is argued to represent the phonological counterpart of “scattered deletion”, i.e. the preferred interpretation for an A’-chain according to Chomsky (2003): in the operator position SpecCP, every feature except for the operator feature is deleted, resulting in the phonological outcome que, while in the variable position, everything but the operator is interpreted, resulting in a pronominal element according to the argument’s phi-features.
This work takes a stance in the latest topics on generative analyses for relative clauses. Using not only theoretical considerations but conclusions drawn from empirical data on three languages, it offers a new perspective on pending questions and proposes to take a fresh look on supposedly outdated analyses.
Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder world wide, causing presenile dementia and death of millions of people. During AD damage and massive loss of brain cells occur. Alzheimer’s disease is genetically heterogeneous and may therefore represent a common phenotype that results from various genetic and environmental influences and risk factors. In approximately 10% of patients, changes of the genetic information were detected (gene mutations). In these cases, Alzheimer’s disease is inherited as an autosomal dominant trait (familial Alzheimer’s disease, FAD). In rare cases of familial Alzheimer’s disease (about 1-3%), mutations have been detected in genes on chromosomes 14 and 1 (encoding for Presenilin 1 and 2, respectively), and on chromosome 21 encoding for the amyloid precursor protein (APP), which is responsible for the release of the cell-damaging protein amyloid-beta (ß-amyloid, Aß). Familial forms of early-onset Alzheimer’s disease are rare; however, their importance extends far beyond their frequency, because they allow to identify some of the critical pathogenetic pathways of the disease. All familial Alzheimer mutations share a common feature: they lead to an enhanced production of the Aß, which is the major constituent of senile plaques in brains of AD patients. New data indicates that Aß promotes neuronal degeneration. Therefore, one aim of these thesis was to elucidate the neurotoxic biochemical pathways induced by Aß, investigating the effect of the FAD Swedish APP double mutation (APPsw) on oxidative stress-induced cell death mechanisms. This mutation results in a three- to sixfold increased Aß production compared to wild-type APP (APPwt). As cell models, the neuronal PC12 (rat pheochromocytoma) and the HEK (human embryonic kidney 293) cell lines were used, which have been transfected with human wiltyp APP or human APP containing the Swedish double mutation. The used cell models offer two important advantages. First, compared to experiments using high concentrations of Aß at micromolar levels applied extracellularly to cells, PC12 APPsw cells secret low Aß levels similar to the situation in FAD brains. Thus, this cell model represents a very suitable approach to elucidate the AD-specific cell death pathways mimicking physiological conditions. Second, these two cell lines (PC12 and HEK APPwt and APPsw) with different production levels of Aß may additionally allow to study dose-dependent effects of Aß. The here obtained results provide evidence for the enhanced cell vulnerability caused by the Swedish APP mutation and elucidate the cell death mechanism probably initiated by intracellulary produced Aß. Here it seems likely that increased production of Aß at physiological levels primes APPsw PC12 cells to undergo cell death only after additional stress, while chronic high levels in HEK cells already lead to enhanced basal apoptotic levels. Crucial effects of the Swedish APP mutation include the impairments of cellular energy metabolism affecting mitochondrial membrane potential and ATP levels as well as the additional activation of caspase 2, caspase 8 and JNK in response to oxidative stress. Thereby ,the following model can be proposed: PC12 cells harboring the Swedish APP mutation have a reduced energy metabolism compared to APPwt or control cells. However, this effect does not leads to enhanced basal apoptotic levels of cultured cells. An exposure of PC12 cells to oxidative stress leads to mitochondrial dysfunction, e.g., decrease in mitochondrial membrane potential and depletion in ATP. The consequence is the activation of the intrinsic apoptotic pathway releasing cytochrome c and Smac resulting in the activation of caspase 9. This effect is amplified by the overexpression of APP, since both APPsw and APPwt PC12 cells show enhanced cytochrome c and Smac release as well as enhanced caspase 9 activity as vector transfected control. In APPsw PC12 cells a parallel pathway is additionally emphased. Due to reduced ATP levels or enhanced Aß production JNK is activated. Furthermore, the extrinsic apoptotic pathway is enhanced, since caspase 8 and caspase 2 activation was clearly enhanced by the Swedish APP mutation. Both pathways may then converge by activating the effector enzyme, caspase 3, and the execution of cell death. In addition, caspase independent effects also needs to be considered. One possibility could be the implication of AIF since AIF expression was found to be induced by the Swedish APP mutation. In APPsw HEK cells high chronic Aß levels leads to enhanced apoptotic levels, reduce mitochondrial membrane potential and ATP levels even under basal conditions. Summarizing, a hypothetical sequence of events is proposed linking FAD, Aß production, JNK-activation, mitochondrial dysfunction with caspase pathway and neuronal loss for our cell model. The brain has a high metabolic rate and is exposured to gradually rising levels of oxidative stress during life. In Swedish FAD patients the levels of oxidative stress are increased in the temporal inferior cortex. This study using a cell model mimicking the in vivo situation in AD brains indicates that probably both, increased Aß production and the gradual rise of oxidative stress throughout life converge at a final common pathway of an increased vulnerability of neurons to apoptotic cell death from FAD patients. Presenilin (PS) 1 is an aspartyl protease, involved in the gamma-secretase mediated proteolysis of Amyloid-ß-protein (Aß), the major constituent of senile plaques in brains of Alzheimer’s disease (AD) patients. Recent studies have suggested an additional role for presenilin proteins in apoptotic cell death observed in AD. Since PS 1 is proteolytic cleaved by caspase 3, it has been prosposed that the resulting C-terminal fragment of PS1 (PSCas) could play a role in signal transduction during apoptosis. Moreover, it was shown that mutant presenilins causing early-onset of familial Alzheimer's disease (FAD) may render cells vulnerable to apoptosis. The mechanism by which PS1 regulates apoptotic cell death is yet not understood. Therefore one aim of our present study was to clarify the involvement of PS1 in the proteolytic cascade of apoptosis and if the cleavage of PS1 by caspase 3 has an regulatory function. Here it is demonstrated that both, PS1 and PS1Cas lead to a reduced vulnerability of PC12 and Jurkat cells to different apoptotic stimuli. However a mutation at the caspase 3 recognition site (D345A/ PSmut), which inhibits cleavage of PS1 by caspase 3, show no differences in the effect of PS1 or PSCas towards apoptotic stimuli. This suggest that proteolysis of PS1 by caspase 3 is not a determinant, but only a secondary effect during apoptosis. Since several FAD mutation distributed through the whole PS1 gene lead to enhanced apoptosis, an abolishment of the antiapoptotic effect of PS1 might contribute to the massive neurodegeneration in early age of FAD patients. Here, the regulate properties of PS1 in apoptosis may not be through an caspase 3 dependent cleavage and generation of PSCas, but rather through interaction of PS1 with other proteins involved in apoptosis.
Diese Arbeit etabliert eine nicht-invasive, volloptische Methode zur in-vivo Beobachtung des Membranpotentials in erregbaren Zellen des Fadenwurms C. elegans, die als Ersatz oder komplementär zu invasiven, elektrophysiologischen Methoden verwendet werden kann.
Zahnfarbene, ästhetisch unauffällige Brackets bestehen meist aus Keramik oder Kunststoff. Besonders Keramikbrackets weisen durch den starken Haftverbund zum Zahn ein gewisses Risiko der Gefährdung von Zahnhartsubstanz beim Debonding auf. Klinisch sollte eine Haftkraft von 5-10 MPa erreicht werden, damit die einwirkenden therapeutischen Kräfte nicht zum Verlust des Brackets führen. Ziel der Studie war es, ein neuartiges selbstligierendes Bracket (Opal/Ultradent) aus glasfaserverstärktem Kunststoff auf die Haftfestigkeit und das Risikopotenzial beim Debonding zu testen und mit Keramik-Brackets und einem weit verbreiteten Standard-Metall-Bracket zu vergleichen. Es wurden neben dem Opal-Bracket (Ultradent) vier Keramik-Brackets (Clarity/ 3M, Fascination2/ Dentaurum, Aspire/ Forestadent, Inspire Ice/ Ormco) und ein Metall-Bracket (Victory/ 3M) mit dem vom Hersteller empfohlenen Adhäsivsystem getestet. Die zur Untersuchung der Haftfestigkeit verwendeten 120 humanen Weisheitszähne wurden für 7 Tage in einer 0.5 % Chloramin T-Lösung und anschließend in Wasser gelagert und danach nochmals mikroskopisch auf Unversehrtheit des Zahnschmelzes überprüft. Mit einer Messschablone wurde der Krümmungsradius der bukkalen Flächen überprüft. Der Krümmungsradius der Zahnoberfläche durfte nicht kleiner als 12,5mm sein. Nach gründlicher Reinigung mit Bimsmehl wurden die Weisheitszähne auf sechs Gruppen mit jeweils 20 Brackets aufgeteilt. Die Brackets wurden mit dem vom Hersteller empfohlenem Adhäsiv- Primer-System nach Herstellerangaben auf die Schmelzoberfläche geklebt. Alle Prüfkörper wurden mit einer Einbetthilfe in Palapress Vario (Heraeus Kulzer) eingebettet und anschließend in einer selbst hergestellten Justierhilfe einheitlich ausgerichtet. Nach einer Lagerungszeit von 24 Stunden in Wasser bei 37° C erfolgte die Abscherung der Prüfkörper nacheinander im rechten Winkel zur Bracketbasis mit der Zwick-Universalprüfmaschine (Ulm, Germany). Die Vorschubgeschwindigkeit betrug 1mm/min. Der Weg bis zum Abscheren und die dazu benötigte Kraft eines jeden Prüfkörpers wurden digital aufgezeichnet. Anhand der Fläche der Bracketbasis, der Abscherkraft und dem dazu benötigten Weg konnten die Haftfestigkeiten in MPa umgerechnet und miteinander verglichen werden. Der Gruppenvergleich erfolgte mit dem ANOVA und Scheffe-Test. Die Zahnoberflächen wurden zusätzlich mikroskopisch auf Schmelzdefekte überprüft. Das Metall-Bracket, das als Vergleichs- und Normierungsgröße diente, zeigte eine mittlere Haftfestigkeit von 10,2 MPa. Das Opal-Bracket wies mit 4,17 MPa die signifikant niedrigste durchschnittliche Haftkraft auf. Es erreichte nicht die klinisch ausreichende Haftkraft von 6 MPa. Die Keramik-Brackets erzielten mit 14.7 MPa (Clarity), 15,3 MPa (Aspire) und 14.7 MPa (Inspire Ice) ähnliche Haftwerte, ohne zu Hartsubstanzdefekten zu führen. Bei Fascination2 mit einer durchschnittlichen Haftkraft von 19,7 MPa konnten nach dem Debonding bei ca. 1/3 der Proben Schmelzausrisse nachgewiesen werden. Fascination2 zeigte im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höhere Haftwerte (19,7 MPa). Die Haftfestigkeit des Opal-Brackets scheint im Vergleich zu den in der Literatur geforderten Angaben für die sichere klinische Anwendung zu gering. Die Haftkraft von Fascination2 (Dentaurum) ist durch die zeitweise auftretenden Schmelzausrisse für ein sicheres Debonding als zu hoch zu bewerten. Die anderen Keramik-Brackets zeigen ein gutes Verhältnis zwischen sicherer Entfernbarkeit und ausreichendem Haftverbund und bieten eine Alternative zu den Metallbrackets.