Open Access

Eva Janas

• The mechanism of peptide transport has been studied on two different ABC transporters of S. cerevisiae. Thereby, the aim of this PhD thesis was to characterise the transporter function on molecular level and shed light on the physiological role of these transporters. The ABC gene YLL048 encodes a novel intracellular transporter translocating peptides from the cytosol to the lumen of the ER. Deletion of the gene resulted in loss of peptide transport activity. The transport activity was fully restored after transformation of the deletion mutant by plasmid-encoded YLL048. Studying the substrate specificity using randomized peptide libraries it was demonstrated that peptides of the size from 6 to 56 amino acids are recognized. So far, no upper limit of the substrate size was obtained. Introduction of D-amino acids in various positions of a nonamer peptide did not impair transport activity. The physiological function of YLL048p is not well understood. The gene product is not essential for cell viability as the deletion mutant did not show any growth phenotype. To examine the possibility that YLL048 encoded protein is part of a quality control of yeast cells involved in the unfolded protein response (UPR), upregulation of YLL048 transcription by heat shock and stress conditions were investigated. We could not observe an influence of stress factors on YLL048 mRNA level. Upregulation of gene expression by the transcription factors Pdr1p and Pdr3p was excluded. The ABC transporter Mdl1p has been identified as peptide transporter of the inner mitochondrial membrane. This protein is required for the export of peptides with the size of 6 to 21 amino acids from the matrix into the intermembrane space. These peptides are generated by m-AAA proteases degrading non-assembled or missfolded membrane proteins. In order to understand the transport mechanism in detail, Mdl1p was expressed in S. cerevisiae and E. coli. Partially enriched protein was reconstituted into liposomes and was active in ATP binding. The association of the NBDs has been described as a central step of the ATPase cycle of ABC transporters, but it is still controversial how both motor domains cooperate and coordinate ATP hydrolysis. To address this question, the Mdl1p-NBD was overexpressed in E. coli and purified to homogeneity. The isolated NBD was active in ATP binding and hydrolysis with a turnover of 0.5 ATP per min and a Km value of 0.2 mM. Isolated NBDs did not show cooperativity in ATPase activity. However, the ATPase activity was observed to be non-linearly dependent on protein concentration suggesting the active form of this enzyme is not a monomer. Very importantly, for the first time an ATP-induced dimer was observed after trapping the NBD by ortho-vanadate or BeFx. The nucleotide composition of the trapped intermediate state was determined and two ADP molecules were simultaneously bound per dimer. An ATP-induced dimer of the ATPase inactive mutant (E559Q) was observed already in the absence of ATPase inhibitor. The E599Q dimer contained two ATP molecules in the absence of Mg2+ at 4°C. Prolonged incubation at 30°C in the presence of Mg2+ induced a stable dimer in which one ATP and ADP molecule were trapped at the same time. Based on these experiments, a new cycle for ATPase activity of ABC transporters was proposed. Binding of ATP to two NBD monomers induces dimerization. Both nucleotides are hydrolysed sequentially. During the hydrolysis cycle the nucleotides cannot be released from the dimer. After hydrolysis of two ATP molecules the domains dissociate and start a new cycle.
• ABC (ATP-Binding Cassette) Transporter stellen eine der grössten Superfamilien von Membranproteinen dar, die aktiv Substanzen über Membranen transportieren. Alle Vertreter dieser Proteinfamilie weisen den gleichen modularen Aufbau aus vier Untereinheiten auf. Zwei Transmembrandomänen (TMD) durchspannen die Membran mehrfach und bilden die Translokationspore für das Substrat. Die zwei löslichen Nukleotidbindedomänen (NBD) energetisieren den Transportprozess durch ATP Hydrolyse, die an stark konservierten Regionen der NBD stattfindet: dem Walker A, Walker B Motiv und dem C-Loop. Kommunikation und Kooperation der einzelnen Untereinheiten sind von zentraler Bedeutung, um den Transportprozess effizient und vektoriell zu leisten. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung des molekularen Mechanismus, durch den Substrattranslokation an ATP-Hydrolyse gekoppelt wird. Dabei diente der Peptidtransport, der durch ABC Transporter in der Hefe S. cerevisiae ausgeführt wird, als Modellsystem. Mdl1p (multidrug resistance like) ist in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert und exportiert Peptide, die aus der Degradation von missgefaltenen Membranprotein in der Matrix entstehen, in den Intermembranraum. In dieser Arbeit wurde die lösliche NBD von Mdl1p in E. coli überexprimiert und bis zur Homogenität gereinigt. Die Aktivität des Proteins wurde bezüglich ATP Bindung und Hydrolyse demonstriert (Wechselzahl von 0.5 ATP/min und einem Km-Wert von 0.2 mM). Zum ersten Mal ist es uns gelungen, einen dimeren Zwischenzustand der Wildtyp-NBD unter dem Einfluss von ATPase lnhibitoren wie Berylliumfluorid in der Gelfiltrationschromatographie zu beobachten. Mutation des konservierten Glutamats stromabwärts des Walker B Motivs führte zu einer ATPase inaktiven NBD (E599Q), die in Gegenwart von ATP einen Dimer bildete. Stöchiometrieuntersuchungen haben gezeigt, dass im BeFx stabilisierten Wildtyp zwei ADP Moleküle inkorporiert waren, während im E599Q Dimer zwei ATP Moleküle vorlagen. Wurde jedoch die E599Q NBD in Gegenwart von Mg2+ bei 30°C inkubiert, konnte ein Dimer isoliert werden, in dem ein ATP und ein ADP in das Molekül eingebaut waren. Basierend auf diesen unterschiedlichen Intermediaten konnte ein Modell für eine sequentielle ATP-Hydrolyse erstellt werden, in dem die Bindung der Nukleotide an die monomeren Untereinheiten eine Assoziation der NBD induziert. Im zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurde ein ABC Transporter charakterisiert, der durch den Leserahmen YLL048 kodiert wird und Peptide in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums transportiert. Durch den Einsatz von zufallsgerichteten Peptidbibliotheken wurde die Substratspezifität des Transporters im Detail untersucht.