Identification and characterisation of a novel integral membrane protein, shrew-1 that complexes with adherens junctions in polarised cells

  • In an attempt to search for potential candidate molecules involved in the pathogenesis of endometriosis, a novel 2910 bp cDNA encoding a putative 411 amino acid protein, shrew-1 was discovered. By computational analysis it was predicted to be an integral membrane protein with an outside-in transmembrane domain but no homology with any known protein or domain could be identified. Antibodies raised against the putative open-reading frame peptide of shrew-1 labelled a protein of ca. 48 kDa in extracts of shrew-1 mRNA positive tissues and also detected ectopically expressed shrew-1. In the course of my PhD work, I confirmed the prediction that shrew-1 is indeed a transmembrane protein, by expressing epitope-tagged shrew-1 in epithelial cells and analysing the transfected cells by surface biotinylation and immunoblots. Additionally, I could show that shrew-1 is able to target to E-cadherin-mediated adherens junctions and interacts with the E-cadherin-catenin complex in polarised MCF7 and MDCK cells, but not with the N-cadherin-catenin complex in non-polarised epithelial cells. A direct interaction of shrew-1 with beta-catenin could be shown in an in vitro pull-down assay. From this data, it could be assumed that shrew-1 might play a role in the function and/or regulation of the dynamics of E-cadherin-mediated junctional complexes. In the next part of my thesis, I showed that stable overexpression of shrew-1 in normal MDCK cells. causes changes in morphology of the cells and turns them invasive. Furthermore, transcription by ²-catenin was activated in these MDCK cells stably overexpressing shrew-1. It was probably the imbalance of shrew-1 protein at the adherens junctions that led to the misregulation of adherens junctions associated proteins, i.e. E-cadherin and beta-catenin. Caveolin-1 is another integral membrane protein that forms complexes with Ecadherin- beta-catenin complexes and also plays a role in the endocytosis of E-cadherin during junctional disruption. By immunofluorescence and biochemical studies, caveolin-1 was identified as another interacting partner of shrew-1. However, the functional relevance of this interaction is still not clear. In conclusion, it can be said that shrew-1 interacts with the key players of invasion and metastasis, E-cadherin and caveolin-1, suggesting its possible role in these processes and making it an interesting candidate to unravel other unknown mechanisms involved in the complex process of invasion.
  • Auf der Suche nach Molekülen, die potentiell zur Pathogenese der Endometriose betragen könnten, wurde eine 2910 bp große cDNA identifiziert, die für ein bisher unbekanntes, hypothetisches Protein von 411 Aminosäuren codiert, das wurde shrew-1 genannt wurde. Eine Computeranalyse der Proteinsequenz ergab, dass es sich bei dem Protein um ein integrales Membranprotein handelt. Jedoch konnten keinerlei Homologien mit bekannten Proteinen oder Proteindomänen festgestellt werden. Antikörper gegen zwei verschiedene Peptidsequenzen aus potentiellen offenen shrew-1-Leserahmen markierten in Extrakten von shrew-1 positivem Gewebe ein Protein von etwa 48 KDa. Ausserdem kann mit diesen Antikörpern ektopisch exprimiertes shrew-1 nachgewiesen werden. Antikörper gegen zwei verschiedene Peptidsequenzen aus potentiellen offenen shrew-1-Leserahmen markierten in Extrakten von shrew-1 positivem Gewebe ein Protein von etwa 48 KDa. Ausserdem kann mit diesen Antikörpern ektopisch exprimiertes shrew-1 nachgewiesen werden. Desweiteren wurde gefunden, dass shrew-1 an Adhäsionsverbindungen transportiert wird, die durch E-Cadherin vermittelt werden. Shrew-1 interagiert mit dem E-Cadherin-Catenin-Komplex polarisierter Epithelzellen (MCF7- oder MDCKZellen). Im Gegensatz dazu kann in nicht-polarisierten Epithelzellen (EJ28-Zellen), welche einen N-Cadherin-Catenin-Komplex enthalten, keine Interaktion nachgewiesen werden. Eine direkte Interaktion von Shrew-1 mit ²-Catenin in einem in vitro Pull-down-assay lässt vermuten, dass die Einbindung von shrew-1 in den E-Cadherin-Catenin Komplex zumindest teilweise über beta-Catenin erfolgen kann. Die physiologische Auflösung der E-Cadherin-vermittelten Adhäsionskomplexe durch die Aktivierung der Rezeptortyrosinkinase c-met führt, zusammen mit E-Cadherin, zu einer Internaliserung von shrew-1 in Vesikeln, vermutlich den caveolae, in denen E-Cadherin und shrew-1 zu kolokalisieren scheinen. Zusammmengefasst könnten diese Daten könnten darauf hinweisen, dass shrew-1 eine Rolle in der Funktion und/oder Regulation dynamischer Prozesse in E-Cadherin-vermittelten Adhäsionsverbindungen spielen könnte. Eine stabile Überexpression von shrew-1 in MDCK-Zellen zeigte, dass shrew-1 Veränderungen in der Zellmorphologie und, damit verbunden, der Invasivität der Zellen verursacht. Ausserdem konnte in den shrew-1 transfizierten MDCK-Zellen beta-Catenin vermittelte Transkriptionsaktivierung beobachtet werden. Dies ist ist möglicherweise darauf zurück zu führen, dass ein Ungleichgewicht des transfizierten shrew-1 im Adhäsionskomplex eine Deregulation der dort befindlichen Proteine, wie z.B. E-Cadherin und beta-Catenin ergibt. Caveolin-1 ist ein weiteres integrales Membranprotein, das mit E-Cadherin-²- Catenin-Komplexen direkt interagieren kann. Außerdem spielt es eine Rolle bei der Endozytose von E-Cadherin während der Auflösung von Adhäsionskomplexen zwischen zwei Zellen. Durch Immunfluoreszenz und biochemische Untersuchungen konnte Caveolin-1 in dieser Arbeit als ein weiterer Interaktionspartner von shrew-1 identifiziert werden. Eine funktionelle Relevanz dieser Interaktion ist zur Zeit allerdings noch unklar. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass shrew-1 mit Key-playern von Invasion und Metastasierung, nämlich E-Cadherin und Caveolin-1, interagiert. Dies deutet auf eine wichtige Rolle von shrew-1 in diesen Prozessen hin und macht es zu einem interessanten Kandidaten, an dem weitere Mechanismen im komplexen Prozess der Invasivität von Zellen erforscht werden können.

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Metadaten
Author:Sanita Bharti
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000009138
Referee:Anna Starzinski-Powitz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2005/05/19
Year of first Publication:2003
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2003/12/01
Release Date:2005/05/19
HeBIS-PPN:128551461
Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht