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Raffaella Calligaris

• The heat stress response is characterized by the presence of heat stress transcription factors (Hsfs) which mediate transcription of heat stress genes. In tomato (Lycopersicon peruvianum) cell cultures the simultaneous expression of four Hsfs, which are either constitutively (HsfA1 and HsfA3) or heat-stress inducible (HsfA2 and HsfB1) expressed, results in a complex network with dynamically changing cellular levels, intracellular localization and functional interactions. In order to examine the relevance of their multiplicity as well as to get more insights into the complexity of the plant heat stress response, the individual tomato Hsfs were investigated with respect to their protein interactions in vitro and in vivo. To this aim, I used pull-down assays as well as yeast assays to study the following aspects: 1. Oligomeric state of Hsfs: the results show that all class A Hsfs (HsfA1, HsfA2 and HsfA3) are trimeric proteins and interact with each other via the oligomerization (HR-A/B) domain. The similarity of their HRA/B regions allows formation of homo- and heterooligomeric complexes between all class A Hsfs. This special property was investigated by mutational studies with HsfA2 indicating that the linker and the HR-B regions are the minimal part required for Hsf/Hsf interactions. The conserved hydrophobic amino acid residues of the HR-B region are most important whereas the amino acid residues of the linker may provide higher flexibility to the HR-B region. Another investigated factor was HsfB1. HsfB1 is a member of class B Hsfs, which are characterized by an oligomerization domain without the 21 amino acid residues linker inserted between the HR-A and HR-B regions. It has a low activator potential and exists exclusively as dimer. HsfB1 can not physically interact with class A Hsfs. However, HsfB1 and HsfA1, binding to adjacent HSE sites, are assumed to cause strong synergistic effects in gene activation. 2. Potential HsfB1 interacting proteins: we searched for HsfB1 interacting proteins by using recombinant His-tagged proteins with HsfB1 as baits in pull-down assays. Histones H2A, H2B and H4 were identified by means of Peptide Mass Finger Printing and N-terminal sequencing analyses. The three histones represent the major proteins in tomato whole cell extracts retrieved by HsfB1. 3. HsfA2/small heat stress proteins (sHsps) interaction: pull-down and yeast two-hybrid assays were used to study the specific interaction of HsfA2 with tomato class II sHsp. This interaction occurs via the oligomerization domain of HsfA2. Other members of the plant Hsp20 family, including class I sHsp, do not interact with HsfA2. Heterooligomers of HsfA2 with class II sHsp may represent precursor forms of the plant higher molecular weight cytoplasmic complexes of heat stress granules, which form during heat stress. The findings presented in this thesis are a contribution to support the concept of a Hsfs network via protein-protein interactions. These data, together with information obtained from other studies, are used to propose a tentative model of the complex Hsfs network controlling the plant heat stress response.
• Hitzestresstranskriptionsfaktoren (Hsfs) sind die zentralen Kontrollfaktoren der Hitzestressantwort in Eukaryoten. In Tomatenzellkulturen (Lycopersicon peruvianum) sind unter Hitzestressbedingungen vier Hsfs detektierbar: die konstitutiv exprimierten Faktoren HsfA1 und HsfA3 und die hitzestressinduzierbaren Faktoren HsfA2 und HsfB1. Die simultane Expression dieser Hsfs führt zu einem regulatorischen Netzwerk, das durch dynamische Veränderungen in der intrazellulären Lokalisation der Hsfs und durch Interaktion untereinander und mit anderen Proteinen gekennzeichnet ist. Um die intramolekularen Wechselwirkungen dieser pflanzlichen Hsfs näher zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl in vitro als auch in vivo Interaktionsstudien mit Hilfe von „pull-down“ Experimenten, sowie dem Hefe-2-Hybridsystem durchgeführt. Folgende Aspekte wurden näher untersucht: 1. Darstellung des Oligomerisierungszustands der Hsfs: Es konnte gezeigt werden, dass alle Hsfs der Klasse A (HsfA1, HsfA2 und HsfA3) als Trimere vorliegen, die über ihre Oligomerisierungsdomäne (HR-A/B) miteinander in Wechselwirkung treten. Innerhalb der Oligomerisierungsdomäne (HR-A/B Region) befinden sich zahlreiche hydrophobe Aminosäurereste. Hierdurch kommt es zur Bildung von Homo- und Heterokomplexen zwischen Hsfs der Klasse A. Diese einzigartige Fähigkeit, die nicht bei Hsfs anderen Organismen vorkommt, wurde durch Analyse verschiedener HsfA2-Mutanten näher untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass die „Linker-“ und die „HR-B-Region“ die Minimaldomäne darstellen, um eine entsprechende Wechselwirkung mit anderen Hsfs einzugehen. Die hochkonservierten hydrophoben Aminosäurereste der HR-B-Region sind für das Zustandekommen und die Stabilisierung von Hsf-Komplexen verantwortlich. Die Linker-Region ist nicht direkt an Interaktionen beteiligt aber sie ist offensichtlich wichtig für die Flexibilität der HR-B-Region. Ein weiterer Hsf, der untersucht wurde, ist HsfB1. Dieser Hsf ist ein Mitglied aus der Klasse der B-Hsfs, die sich durch das Fehlen der Linker-Region von 21 Aminosäuren auszeichnen und ein geringes Transaktivierungspotential aufweisen. Es konnte gezeigt werden, dass HsfB1 ausschliesslich Homodimere ausbildet und nicht mit Hsfs aus der A-Klasse interagiert. 2. Identifizierung von potentiellen Interaktionsproteinen von HsfB1: Zur Suche nach unbekannten HsfB1 Interaktionspartnern, wurden mit rekombinanten HsfB1 als Köder „pull-down“ Experimente durchgeführt. Die Histone H2A, H2B und H4 wurden mit Hilfe von Peptide Mass Finger Printing Analyse und N-terminaler Sequenzanalyse identifiziert. Im Gesamtzellextrakt von Tomatenzellen wurden hauptsächlich diese drei Histone durch HsfB1 gebunden. 3. Interaktion von HsfA2 und niedermolekulare Hitzestressproteine (sHsps). Es konnte gezeigt werden, dass HsfA2 über seine Oligomerisierungsdomäne mit zytoplasmatischen sHsp der Klasse II aus Tomate interagieren kann. Andere pflanzliche sHsps, einschliesslich sHsp der Klasse I können nicht mit HsfA2 interagieren. Die Komplexe aus HsfA2 und sHsp der Klasse II könnten vermutlich eine Vorstufe der pflanzlichen hochmolekularen Hitzestressgranula darstellen, die unter Stressbedingungen ausgebildet wird. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen einen wichtigen Schritt zum Verstehen des komplexen Netzwerks der Hsfs und der mit ihnen verbundenen Koregulatoren dar. Zusammen mit anderen Befunden aus Arbeiten in unserer Gruppe wurde ein Modell für das komplexe Netzwerk regulatorischer Proteine in der pflanzlichen Hitzestressantwort entwickelt.