Structural studies of membrane transport proteins

Strukturelle Studien von Proteinen involviert in Membrantransport

  • My graduate thesis is on the "Structural studies of membrane transport proteins". Transporters are membrane proteins that have multiple membrane-spanning a-helices. They are dynamic and diverse proteins, undergoing a large conformational change and transporting wide range of susbtrates. Based on their energy source they can be classified into primary and secondary transport systems. Primary transport systems are driven by the use of chemical (ATP) or light energy, while secondary transporters utilize ion gradients to transport substrates. I began my PhD dissertation on secondary transporters by two-dimensional crystallization and electron crystallographic analysis and recently my focus also has shifted towards 3D crystallization. The following projects constitute my PhD thesis: 1) 2D crystallization of MjNhaP1 and pH induced structural change: MjNhaP1, a Na+/H+ antiporter that is regulated by pH has been implicated in homeostasis of H+ and Na+ in Methanococcus jannaschii, a hyperthermophilic archaeon that grows optimally at 85°C. MjNhaP1 was cloned and expressed in E. coli. Two-dimensional crystals were obtained from purified protein at pH4. Electron cryo-microscopy yielded an 8Å projection map. The map of MjNhaP1 shows elongated densities in the centre of the dimer and a cluster of density peaks on either side of the dimer core, indicative of a bundle of 4-6 membrane-spanning helices. The effect of pH on the structure of MjNhaP1was studied in situ in 2D crystals revealing a major change in density within the helix bundle relative to the dimer interface. This change occurred at pH6 and above. The two conformations at low and high pH most likely represent the closed and open states of the antiporter, respectively. This is the first instance where a conformational change associated with the regulation of a secondary transporter appears to map structurally. Reconstruction of 3D map and high-resolution structure by x-ray crystallography would be necessary to understand the mechanism of ion transport and regulation by pH. 2) 2D crystallization of Proline transporter: Proline transporter (PutP) from E.coli belongs the sodium-solute symporter family that includes disease related sodium dependent glucose and iodide transporter in humans. Sodium and proline are co-transported with a stoichiometry of 1:1. Purified PutP was reconstituted to yield 2D crystals that were hexagonal in nature. The 2D crystals had tendency to stack indicating their willingness to form 3D crystals. A projection map of PutP from negatively stained crystals showed trimeric arrangement of protein. Other members of the SSF family have been shown to be monomers. My analysis of oligomeric state of PutP in detergent by blue native gel indicates a monomer in detergent solution. It is likely that PutP can function as a monomer but at higher concentration and in lipid bilayer it tends to form trimer. 3) Oligomeric state and crystallization of carnitine transporter from E.coli: E.coli carnitine transporter (CaiT) belongs to the BCCT (Betaine, Carnitine and Choline) superfamily that transports molecules with quaternary amine groups. CaiT is predicted to span the membrane 12 times and acts as a L-carnitine/g-butyrobetaine exchanger. Unlike other members in this transporter family, it does not require an ion gradient and does not respond to osmotic stress. Over-expression of the protein yielded ~2mg of protein/L of culture. The structure and oligomeric state of the protein were analyzed in detergent and lipid bilayers. Blue native gel electrophoresis indicated that CaiT was a trimer in detergent solution. Gel filtration and cross-linking studies further support this. Reconstitution of CaiT into lipid bilayers resulted in 2D crystals. Analysis of negatively stained 2D crystals confirmed that CaiT is a trimer in the membrane. Initial 3D crystallization trials have been successful and currently, the crystals diffract to 6Å and are being improved. 4) Monomeric porin OmpG: OmpG is a bacterial outer membrane b-barrel protein. It is monomeric and its size (33kDa) places it as a prime candidate for a structural solution, using the recently developed method of solid state NMR (work in collaboration with Prof.Hartmut Oskinat, FMP, Berlin). A long-term aim would be to study porins as templates for designing nanopores, for DNA sequencing and identification. I have expressed OmpG in inclusion bodies and refolded at an efficiency of >90% into a functional form using detergent. OmpG was then crystallized by 2D crystallization yielding an 8Å projection map whose structure was similar to native protein. In addition, these crystals were used for structure determination by solid state NMR. An initial spectrum of heavy isotopically labeled OmpG has allowed identification of specific amino acid residues including threonine and proline. Additionally, I obtained 3D crystals in detergent that diffract to 5.5Å and are being improved.
  • Transporter sind Membranproteine, welche mehrere, die Membran durchspannende, a-Helices aufweisen. Diese beweglichen und vielfältig vorkommenden Proteine ermöglichen durch eine Änderung ihrer Konformation den Transport eines großen Spektrums an verschiedenen Substraten. Zu Beginn meiner Dissertation habe ich an sekundären Transportern, deren 2D Kristallisation mit anschließender elektronenkristallographischer Analyse gearbeitet. Da die mittels Elektronenmikroskopie (EM) erzielte Auflösung begrenzt war, hat sich mein Fokus vor kurzer Zeit zusätzlich auch in Richtung 3D Kristallisation verschoben. Die folgenden Projekte bilden die Basis meiner Doktorarbeit. 1) 2D Kristallisation von MjNhaP1 und pH-Wert induzierte Strukturänderung Der Na+/H+ Antiporter MjNhaP1 ist pH-reguliert und an der Homöostase von H+ und Na+ im hyperthermophilen Archäon Methanococcus jannaschii, dessen optimale Wachstumstemperatur 85°C beträgt, beteiligt. MjNhaP1 wurde in E. coli kloniert und exprimiert. Zweidimensionale Kristalle konnten mit aufgereinigtem Protein bei einem pH-Wert von 4 erhalten werden. Mittels Cryo-Elektronenmikroskopie wurde eine Projektionskarte mit einer Auflösung von 8Å erstellt, welche verlängerte Elektronendichten in der Mitte und strukturierte Elektronendichten zu beiden Seiten des Dimers aufzeigte, die indikativ für ein Bündel aus 4-6 transmembran Helices sind. Der Effekt des pH-Werts auf die Struktur von MjNhaP1 wurde an den 2D Kristallen in-situ untersucht und enthüllte eine deutliche Veränderung der Elektronendichte innerhalb des Helix-Bündels relativ zur Dimergrenze. Diese Veränderung trat ab einem pH-Wert von 6 und darüber auf. Die beiden, bei hohem und niedrigem pH-Wert erhaltenen, Konformationen repräsentieren aller Wahrscheinlichkeit nach den geöffneten beziehungsweise geschlossenen Zustand des Antiporters. Dies ist das erste bekannte Beispiel für eine mit der Regulation eines sekundären Transporters einhergehenden Konformationsänderung, die strukturell dargestellt werden konnte. 2) 2D Kristallisation eines Prolin-Transporters: Der Prolin-Transporter PutP von E. coli gehört zur Familie der Natrium-abhängigen Symporter, welcher auch die für bestimmte Krankheiten beim Menschen relevanten Glukose- und Iodid-Transporter zugehörig sind. Aufgereinigtes PutP wurde rekonstituiert, um hexagonale 2D Kristalle zu erhalten, welche die Tendenz aufwiesen sich übereinander zu Stapeln anzuordnen, was ihre Bereitschaft aufzeigte 3D Kristalle zu bilden. Die Projektionskarte von negativ kontrastierten PutP Kristallen offenbarte eine trimere. Meine Analyse des oligomeren Zustands von in Detergenz gelöstem PutP mittels nativer Gelelektropherese zeigte im Gegensatz zu den 2D Kristallen einen monomeren Zustand auf. Es ist wahrscheinlich, dass PutP als Monomer funktionsfähig ist, aber in höheren Konzentrationen und der Lipiddoppelschicht dazu neigt, Trimere zu bilden. 3) Oligomerer Zustand und Kristallisation des Karnitin-Transporters von E.coli Der Karnitin-Transporter CaiT aus E. coli gehört zur BCCT (Betain, Karnitin und Cholin) Superfamilie, welche Moleküle transportiert, die quaternäre Amingruppen aufweisen. CaiT ist ein L-Karnitin/g-Butyrobetain-Antiporter. Im Gegensatz zu anderen Mitgliedern dieser Transporterfamilie benötigt es keinen Ionengradienten und reagiert nicht auf osmotischen Stress. Die Überexpression des Proteins ergab ~2mg Protein pro Liter Kulturvolumen. Die native Gelelektrophorese zeigte auf, dass CaiT in Detergenzlösung als Trimer vorliegt, was zusätzlich durch Gelfiltrations- und Cross-Linking-Experimente untermauert wurde. Die Rekonstitution von CaiT in eine Lipiddoppelschicht ergab 2D Kristalle, deren Analyse nach der negativen Kontrastierung bestätigte, dass CaiT als Trimer in der Membran vorliegt. Erste Versuche einer 3D Kristallisation waren erfolgreich und ergaben bisher Auflösungen von bis zu 6Å, welche momentan verbessert wird. 4) Monomeres Porin OmpG: OmpG ist ein aus b-Faltblättern bestehendes Protein der äußeren bakteriellen Zellmembran. Es ist monomer und seine Größe (33 kDa) macht es zu einem idealen Kandidaten für die Strukturaufklärung mittels der kürzlich entwickelten Methode der Festkörper-NMR (mit Prof. H. Oschkinat, FMP, Berlin). OmpG wurde von mir in Einschlusskörper exprimiert und durch die Nutzung von Detergenz mit einer Effizienz von mehr als 90% zur funktionell aktiven Form rückgefaltet. Die anschließende 2D Kristallisation von OmpG ergab eine Projektionskarte mit einer Auflösung von 8Å und einer dem nativen Protein ähnlichen Struktur. Außerdem wurden diese Kristalle zur Strukturbestimmung mittels Festkörper-NMR verwendet. Eines der ersten Spektren mit dem Schwerisotopen markiertem OmpG ermöglichte die Identifizierung von spezifischen Aminosäureresten einschließlich Threonin und Prolin. Weiterhin erhielt ich 3D Kristalle in Detergenz, welche bis zu 5,5Å beugten und nun verbessert werden.

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Metadaten
Author:Vinothkumar Kutti Ragunath
URN:urn:nbn:de:hebis:30-23701
Referee:Bernd Ludwig
Advisor:Werner Kühlbrandt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2005
Year of first Publication:2005
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/01/10
Release Date:2006/01/16
Tag:Protein Expression; Purification
GND Keyword:Membrantransport; Membranproteine; Stofftransport <Biologie>; Elektronenmikroskopie; Kristallisation; Kristallographie; Mikroskopie
Page Number:254
HeBIS-PPN:135242223
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
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