540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
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The publication-based dissertation elaborates on the theoretical modelling of ultrafast processes of charge separation and migration as well as investigations of vibronic coupling and temperature effects on these processes in typical representatives of organic semiconductor materials. The systems considered were an aggregate of poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT) molecules stacked along the molecular normal direction, a donor-acceptor interface of a mixture of P3HT and phenyl-C61-butyric acid methyl ester (PCBM), and a highly ordered aggregate of perylenediimide molecules linked to fluorene-thiophene donor molecules by benzothiadiazole units. The parametrisation is mainly based on electronic structure calculations (density functional theory and time-dependent density functional theory) while for quantum dynamical simulations the multiconfigurational time-dependent Hartree method (within the MCTDH program package) has been applied. The thesis is divided into four parts: In part I, fundamental theoretical concepts for the interpretation of the photophysical properties and processes relevant for charge separation in organic semiconductor materials on the one hand, and for the modelling, simulation and analysis of these processes on the other hand, are examined. In particular, methods used or further developed in the underlying publications are summarised and analysed. Part II of the thesis summarises the main results and contains detailed information on the parameterisation of the models, the simulation setup, the results and their interpretation. The publications itself are included in part III. Finally, the appendix in part IV contains detailed explanations of the theoretical background of the methods used and the references.
Protein kinases are important regulators in cellular signal transduction. As one major type of Hsp90 client, protein kinases rely on the ATP-dependent molecular chaperone Hsp90, which maintains their structure and supports their activation. Depending on client type, Hsp90 interacts with different cofactors. Here we report that besides the kinase-specific cofactor Cdc37 large PPIases of the Fkbp-type strongly bind to kinase•Hsp90•Cdc37 complexes. We evaluate the nucleotide regulation of these assemblies and identify prominent interaction sites in this quaternary complex. The synergistic interaction between the participating proteins and the conserved nature of the interaction suggests functions of the large PPIases Fkbp51/Fkbp52 and their nematode homolog FKB-6 as contributing factors to the kinase cycle of the Hsp90 machinery.
Nukleäre Rezeptoren (NRs) sind eine Familie von 48 ligandengesteuerten Transkriptionsfaktoren, die in zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie Zellproliferation und -differenzierung, Metabolismus sowie Entzündungen, eine zentrale Rolle spielen. Bei ungefähr der Hälfte der NRs ist die Forschung fortgeschritten, dass ihre Funktionen und endogenen Liganden weitgehend bekannt sind und einige synthetische Liganden bereits als Arzneimittel zugelassen sind. Trotzdem bestehen weiterhin signifikante Forschungslücken, unter anderem auch bei der bereits umfangreich untersuchten NR1-Subfamilie, deren therapeutisches Potenzial bisher nur teilweise erschlossen ist. Diese Arbeit zielte darauf ab, durch den Einsatz von datenbasierten Methoden und maschinellem Lernen (ML) biologisch/pharmakologisch aktive Moleküle zu identifizieren und zu designen und mit der Anwendung in Chemogenomik (CG) und Polypharmakologie das therapeutische Potenzial der NR1-Proteine systematisch zu erweitern.
Um eine hochqualitative Datengrundlage für diese Methoden zu erhalten, wurden zu Beginn fünf verschiedene öffentlich zugängliche Moleküldatenbanken (ChEMBL, PubChem, IUPHAR\-BPS, BindingDB und Probes & Drugs) analysiert. Diese Analyse wies erhebliche Unterschiede der Datenbanken hinsichtlich des Umfangs der enthaltenen Moleküle und deren Targets sowie ihrer Bioaktivitätsverteilung auf. Deshalb wurde ein Konsensdatensatz entwickelt, der Daten aus den verschiedenen Datenbanken kombinierte und zusätzliche Anmerkungen zu den eingesetzten Testsystemen sowie zur Verlässlichkeit von Bioaktivitäts- und molekularen Strukturinformationen bereitstellte. Der resultierende Konsensdatensatz umfasste Moleküle mit Bioaktivitäten für 5.613 humane Zielstrukturen, was einen verbesserten chemischen und bioaktiven Umfang im Vergleich zu den einzelnen Datenbanken ermöglichte. In Verbindung mit den zusätzlichen Informationen führte das zu einer gesteigerten Zuverlässigkeit der Daten und könnte somit eine teilautomatisierte Weiterverarbeitung ermöglichen und die Robustheit für ML- und CG-Methoden im Vergleich zu einzelnen Datenbanken erhöhen. Diese Eigenschaften verleihen dem Konsensdatensatz einen beträchtlichen Wert als Instrument für ML und andere datengesteuerte Anwendungen im Bereich des (de novo) Wirkstoffdesigns oder für die Auswahl der besten Substanzen für die Targetidentifizierung mittels CG.
Auf Basis des generierten Konsensdatensatzes wurde eine chemogenomische Bibliothek (CGL) für die NR1-Subfamilie mit 69 Substanzen erstellt. Die Substanzen wurden mittels datengetriebener Methoden aus dem Konsensdatensatz identifiziert und nach ihrer chemischen Diversität, ihrer Modulationsart und kommerziellen Verfügbarkeit sowie nach komplementären Aktivitäts- und Selektivitätsprofilen ausgewählt. Anschließend wurden sie auf Reinheit, Toxizität, Selektivität und off-target-Aktivitäten validiert. Alle 19 NRs der Subfamilie wurden durch die CGL abgedeckt und die Substanzen wiesen meist eine gute Potenz, hohe chemische Diversität und alle bekannten NR1-Modulationsarten auf. Drei Proof-of-Concept-Anwendungen zeigten vielversprechende Ergebnisse der NR1-CGL zur Identifizierung von NR1-Targets in phänotypischen Experimenten. Potenzielle Targetfamilien für die Erzielung anti-neuroinflammatorischer Effekte, stellten die RARs (NR1B), RORs (NR1F) und RevERBs (NR1D) dar. Ebenso induzierten die RAR-Agonisten eine erhöhte und konstant verzögerte Autophagie, das auf einen genomischen Effekt hinwies. Daher könnten RAR-Rezeptoren eine potenzielle Rolle bei der Regulation der Autophagie spielen, die einen essentiellen zellulären Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Homöostase darstellt und deren Dysregulation mit Krebs, Neurodegeneration und Stoffwechselstörungen in Verbindung gebracht wurde. In einer weiteren Anwendung hemmten LXR (NR1H)-Agonisten die Proliferation von A549-Lungenkrebszellen und HT29-Kolorektal-Adenokarzinomzellen und induzierten signifikant deren Zelltod. Die konsistenten phänotypischen Effekte der CGL-Gruppen für einzelne NR1-Unterfamilien deuteten also darauf hin, dass NR1-Rezeptoren an Autophagie, Neuroinflammation und Krebszelltod beteiligt sein könnten, was weitere Untersuchungen benötigt. Diese Proof-of-Concept-Anwendungen bestätigten das Potenzial und die Eignung der CGL zur Identifizierung von NR1-Targets in phänotypischen Experimenten. Die vollständig annotierte, validierte und öffentlich verfügbare NR1-CGL kann somit die Erforschung dieser wichtigen Proteinfamilie vorantreiben und bislang unentdeckte therapeutische Möglichkeiten aufzeigen.
In this paper we evaluate the extent of freshwater reservoir effects (37 samples across 12 locations) and present new data from various archaeological sites in the Eurasian Steppe. Together with a summary of previous research on modern and archaeological samples, this provides the most up-to-date map of the freshwater reservoir offsets in the region. The data confirm previous observations highlighting that FREs are widespread but highly variable in the Eurasian Steppe in both modern and archaeological samples. Radiocarbon dates from organisms consuming aquatic sources, including humans, dogs, bears, aquatic birds and terrestrial herbivores (such as elk feeding on water plants), fish and aquatic mammals, as well as food crusts, could be misleading, but need to be assessed on a case-by-case basis.
Microorganisms contribute to the biology and physiology of eukaryotic hosts and affect other organisms through natural products. Xenorhabdus and Photorhabdus (XP) living in mutualistic symbiosis with entomopathogenic nematodes generate natural products to mediate bacteria–nematode–insect interactions. However, a lack of systematic analysis of the XP biosynthetic gene clusters (BGCs) has limited the understanding of how natural products affect interactions between the organisms. Here we combine pangenome and sequence similarity networks to analyse BGCs from 45 XP strains that cover all sequenced strains in our collection and represent almost all XP taxonomy. The identified 1,000 BGCs belong to 176 families. The most conserved families are denoted by 11 BGC classes. We homologously (over)express the ubiquitous and unique BGCs and identify compounds featuring unusual architectures. The bioactivity evaluation demonstrates that the prevalent compounds are eukaryotic proteasome inhibitors, virulence factors against insects, metallophores and insect immunosuppressants. These findings explain the functional basis of bacterial natural products in this tripartite relationship.
In biochemistry and cell biology, DNA/RNA transfection is one of the most fundamental and essential methods for modifying cellular phenotypes. This technique is critically important because it enables the study of protein function and regulation in a distinct cellular environment.
Despite their significance, conventional transfection methods however exhibit significant technical constraints or infeasibility. For example, transfection can occasionally produce inactive proteins, display cytotoxicity and most-importantly is not applicable to all targets since some cell-types are hard or even impossible to transfect.
Recently, a method to transfer membrane proteins (MPs) into live cells, has been described, effectively enabling the modification of cellular phenotypes without any genetical alteration. This approach, dubbed nanotransfer or nanodelivery, relies on the application of nanodiscs (NDs), a MP-solubilizing lipid bilayer that is kept intact by a supporting belt of so-called membrane scaffold proteins (MSP). MP/ND complexes are incubated with cells which results in the incorporation of the ND cargo into the cellular plasma membrane.
The aim of this thesis was to thoroughly evaluate this novel nanodelivery approach, to systematically screen the fundamental parameters and mechanistic details of this method and finally to establish and optimize novel cellular assays with nanotransferred cells. The main targets being a variety of G-protein coupled receptors (GPCRs). GPCRs are integral MPs with seven membrane-spanning helices and, while being one of the most relevant pharmacological targets, are notoriously difficult to express heterologously in cells – making them a perfect target for nanotransfer approaches.
In the last years, cell-free expression of GPCRs has emerged as a viable alternative to conventional cell-based expression systems. Here, the complete transcription and translation machinery is extracted from E. coli and can then be supplied with a DNA/RNA template of choice. The CF system can be optimized and adapted by addition of an energy regeneration system, customized redox conditions and the addition of NDs for the effective solubilization of MPs. In this configuration, GPCR yield of up to 1 mg/ml can be achieved.
The chosen targets of this thesis were a variety of GPCRs ranging from well-studied species such as the endothelin receptor B (ETB) via the free fatty acid receptors FFAR1, FFAR2 and FFAR3 or the histamine receptors H1R and H2R, to the prostacyclin receptor IP and the orphan receptor GPRC5B.
First, CF expression quality and quantity were optimized. Therefore, GPCR solubilization was screened for the optimal ND lipid content, using mNeonGreen (mNG) derivates and size-exclusion chromatography (SEC) profiling. All tested receptors showed strong preference for either DOPG or POPG lipids. Expression yields of the receptors ranged from 0.7 mg/ml for the IP receptor to 1.2 mg/ml for FFAR2. Using FFAR1 as exemplary target, the effects of ND concentration (30, 60 or 90 µM) as well as plasmid concentration (5, 10 or 15 ng/µl) were screened. An inverse correlation was observed, where higher ND concentrations or lowered plasmid concentrations both improved the receptor folding, as assayed via SEC profiling. Then, glutathione- and DTT-based redox systems were compared. For all receptors except IP, the glutathione-based system could improve GPCR/ND particle quality.
By further exploration of a newly established optimization strategy, ligands or cognate mini-G proteins, a miniaturized version of the full-length G proteins, were supplied to the CF reaction.
While tested ligands could effectively improve GPCR folding, only FFAR1 showed significantly improved expression quality. Another recent development in the nanoparticle field was the implementation of circularized NDs (cNDs). These have however never been applied to the CF system. In a first attempt to assay cNDs for their suitability in CF GPCR expression, FFAR1, FFAR2 and FFAR3 were expressed into these novel ND types. While yields were overall similar, SEC profiling revealed massive improvements in receptor folding quality.
Even though GPCR expression quality and quantity could be improved. GPCR/ND particles still displayed significant fractions containing soluble aggregates and/or misfolded receptor. Therefore, more sophisticated purification strategies were explored. For ETB, ligand affinity chromatography (LAC) and for the H2R G protein affinity chromatography (GPAC) were established. By immobilizing the ligand or the cognate mini-G protein, only the active receptor fraction could be isolated from the CF reaction mixture, as seen in massively improved SEC profiles.
Investigation of the lipopolysaccharide transport system using electron spin resonance spectroscopy
(2023)
In Gram-negative bacteria, phospholipids and lipopolysaccharide (LPS) form the outer membrane (OM), which is an asymmetric bilayer. The LPS molecule is assembled in the inner membrane (IM) from the lipid A core oligosaccharide and the O-antigen, which are synthesized in the cytoplasm. In Escherichia coli, seven essential proteins LptABCDEFG form the LPS transport system (Lpt), which exports the LPS molecule from the IM to the OM. The LptB2FG complex is an ATP-binding cassette exporter module and transports LPS from the outer leaflet of the IM to the periplasmic domain of LptC. Using pulsed dipolar electron spin resonance spectroscopy (PELDOR or DEER),the conformational heterogeneity of the LptB2FG complex was characterized. In proteoliposomes the nucleotide-binding domains close upon ATP binding, which is consistent with previous results in detergent micelles. This is coupled with an opening of the lateral gate formed by the transmembrane (TM) helices of LptF (TM1-F) and LptG (TM5-G). The β-jellyroll domains of LptF and LptG show a rather limited interdomain flexibility. In summary, while the NBDs closes upon ATP binding as expected, the TMDs and the β-jellyroll domains show an asymmetric behavior, which might play an important role for the transport of LPS to LptC.
Die vorliegende Arbeit ist dem Gebiet der theoretischen Femtochemie zu zurechnen. Im Mittelpunkt steht eine der klassischen Methoden – das klassische Mapping-Verfahren. Dieses klassische Mapping-Verfahren wird auf seine Anwendungsmцglichkeiten im Bereich Dynamik und zeitaufgelцste Spektroskopie untersucht. Das klassische Mapping-Verfahren basiert darauf, dass der Hamiltonoperator des quantenmechanischen Systems in der Basis von harmonischen Oszillatoren dargestellt wird, in der dann der klassische Limes durchgeführt wird. Obwohl das Mapping-Verfahren, wie auch die anderen klassischen und semiklassischen Ansätze als Kurzzeitnäherungen entwickelt worden sind, kцnnen sie in gewissen Maßen auch das Verhalten der Langzeitpopulationen, der Dynamik der Wellenpakete und der Pump-Probe-Spektren sowohl der kleinen als auch der komplexen Systeme mit oder ohne Ableitung korrekt abbilden.
Im Mittelpunkt des ersten Teils dieser Arbeit stehen die Abbildung der Population und der Dynamik der Wellenpakete der untersuchten Systeme. Zunächst wurde das einfache Ein-Moden-Zwei-Niveau-System studiert. Für das diabatische und das adiabatische Verhalten der Populationen wurde der klassische Ansatz mit einer quantenmechanischen Referenzrechnung verglichen. In einem zweiten Schritt wurden Verbindungen mit auf gemischten Valenzen basierenden Modellen mit zwei Metallzentren, die für ultraschnelle Metall-Metall Ladungtransferprozesse bekannt sind, untersucht. Analysiert wurde die Dynamik der ultraschnellen Elektrontransferreaktionen, in denen die Anregung der Photonen den Übergang der Elektronen von einem Metallzentrum in das andere initiiert. In der vorliegenden Arbeit bilden zwei unterschiedliche Verbindungen mit gemischten Valenzen ( ) ( )-III II 3 5 5 NH Ru NCFe CN und ( ) ( )- III II 3 5 5 NH Ru NCFe CN den Gegenstand der Untersuchung. Ausgehend von den Arbeiten von Barbara et al. und den jüngeren Arbeiten von Wang und Thoss wurden hier mehrere unterschiedliche Systeme analysiert. Im nächsten Schritt wurde die Anwendbarkeit des klassischen Mapping-Verfahrens für die Beschreibung der Dynamik der Wellenpaketeevolution von nonadiabatischen cis-trans-Photoisomerisierung untersucht. Als Beispiel für eine solche cis-trans-Photoisomerisierungreaktion wurde das parametrisierte Modell von Retinal in Rhodopsin herangezogen. Analysiert wurden die Ergebnisse der klassischen Methode unter Berücksichtigung von verschiedenen Typen und Stärken der System-Bad-Kopplung.
Numerische exakte Berechnungen des Multi-Configuration-Time-Dependent-Hartree (MCTDH) Methode für die Analyse der Populationen und Wellenpaketsevoluationen wurden durchgeführt.
Es wurde festgestellt, dass in einigen Fällen die klassische Mapping-Näherung die quantum-mechanische Redfield Methode oder die Säkularnäherungen übertrifft.
Der zweite Teil dieser Arbeit ist dem klassischen Ansatz für die Berechnung der zeit- und frequenzaufgelцsten Pump-Probe-Spektren von nichtadiabatisch gekoppelten molekularen Systeme gewidmet. Hier wurden die Anwendbarkeit der semiklassischen Franck-Condon-Näherung erster und zweiter Ordnung auf die vibronische gekoppelte Potentialflächen verallgemeinert, eine klassischen Version der nichtadiabatischen Version der Franck-Condon-Näherung entwickelt und ein klassisches Analogon der Dipolfunktion angewendet. Die Untersuchung hat gezeigt, dass, da die numerische Anwendung der abgeleiteten Doorway- und Window-Funktionen für die zweite Ordnung der Franck-Condon-Näherung direkt sind, ist die verallgemeinernde Franck-Condon-Näherung der zweiten Ordnung die beste Methode für diese Berechnung.
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Mapping-Näherung im Vergleich zu exakten quantenmechanischen Simulationen, die korrekte Abbildung der Populationen und der Dynamik der Wellenpakete der komplexen molekularen Systeme ermцglicht. Außerdem wurde hier ein besseres Verständnis der Anwendungsmцglichkeiten dieser Theorie erreicht und verschiedene Methoden für die Simulation der meisten Fälle der Pump-Probe-Spektroskopie-Signale vorgeschlagen.
The occurrence of Cr-bearing oxide phases as inclusions in diamonds and in extraterrestrial materials has the potential to serve as an indicator of formation conditions. However, such an application requires detailed knowledge of phase stabilities and the influence that Cr may have on its stability. To this end, the incorporation of Cr in high-pressure post-spinel Fe–Mg oxide phases was experimentally investigated at pressures of 14–22 GPa and temperatures between 1100 and 1600 °C using a multi-anvil press. We find that neither the Fe3Cr2O6 nor the Mg3Cr2O6 endmember composition is stable over the expected range of pressure and temperature where Fe5O6 itself is known to be stable. Further experiments along the FeFeO6–FeCr2O6 binary indicate only small amounts of Cr substitution are possible: ∼ 0.12 cations Cr per formula unit or ∼ 6 mol % FeCr2O6 component. In contrast, complete solid solution is apparent across both the Fe(Cr,Fe3+)2O5 and the Mg2(Cr,Fe3+)2O5 binaries, and there are indications of complete solution in the entire (Mg,Fe2+)2(Cr,Fe3+)2O5 quaternary system. The O5-structured phase usually coexists with (Fe,Mg)O. At 16–20 GPa, a post-spinel phase with O4 stoichiometry was occasionally encountered, having either a modified Ca-ferrite- (mCF-FeCr2O4) or a Ca-titanate-type (CT-MgCr2O4) structure. In one high-temperature experiment at 1600 °C, an unquenchable Mg-rich phase with a reconstructed Mg4FeO7 stoichiometry occurred together with Mg2(Cr,Fe3+)2O5. In one experiment at 1100 °C and 16 GPa with a bulk composition of Mg2(Cr0.6,Fe)2O5, an assemblage of O5 phase + eskolaite–hematite solid solution + periclase was obtained together with minor amounts of the CT-type phase and a β-(Cr,Fe)OOH phase. The occurrence of these two minor phases in this low-temperature experiment is an indicator of variable reaction kinetics amongst the starting materials, which caused chemical heterogeneities to develop at the onset of the experiment.
The structural systematics of Fe (Cr,Fe3+)2O5 and (Fe2+,Mg)2(Cr,Fe3+)2O5 solid solutions were investigated. It is notable that the Fe3+ and Cr endmembers have somewhat different crystal structures, belonging to space groups Cmcm (no. 63) and Pbam (no. 55), respectively. The phase transition occurs around the midpoint of the Fe3+–Cr joins. In spite of complexities in the behavior of the unit-cell parameters, the variation in molar volume with composition deviates only slightly from linearity.
Wüstite and periclase coexisting in our experiments reveal the incorporation of up to 9 wt % and 25 wt % Cr2O3, respectively. This is consistent with the minor Cr contents reported for some ferropericlase inclusions in natural diamond. The limited solubility of other cations in Fe5O6 limits the likelihood of it being an accessory phase in the Earth's deep upper mantle and transition zone, except in Fe-rich environments. In contrast, the O5 phase appears to be more flexible in accommodating a range of divalent and trivalent cations, suggesting that this phase is more likely to be stabilized, potentially where redox reactions related to diamond formation occur.
Viele Medikamente basieren auf Kleinmolekülen. Sie entfalten ihre heilende Wirkung im Körper, indem sie ein Protein aktivieren oder hemmen. Um neue Arzneistoffe zu finden, entwickelt das Verbundforschungsprojekt EUbOPEN selektive chemische Werkzeuge zur Beeinflussung von insgesamt 1000 Zielproteinen – unabhängig davon, ob bereits bekannt ist, inwiefern diese Zielproteine an bestimmten Krankheitsprozessen beteiligt sind oder nicht.
