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Ignacio Portero Robles

• Colorectal cancer is one of the most cause of cancer and death in Western societies. Recently, histone deacetylase inhibitors (HDIs), which regulate transcription through modification of chromatin structure, received considerable interest on the ground of they ability to stop the growth and induce cell death in colon cancer tumours, representing a promising transcriptional cancer therapy. This kind of cancer initiates with an activating mutation in the Wnt cascade, allowing the nuclear import of ß-catenin binding to LEF/TCF. This induces the overexpression of growthpromoting oncogenes affecting the cell cycle arrest, lineage-specific cell differentiation and apoptosis processes. In addition, ß-catenin also participates in cell-cell adhesion via interactions with E-cadherin, which can be repressed by families of transcription factors Snail and ZEB. This, and gain of vimentin has been closely correlated with local invasion and metastasis since they avoid the induction of apoptosis through the loss of cell anchorage, a phenomenon called anoikis. In this process the inactivation of the kinases Src an FAK provoking disruption of focal adhesion complexes through is involved. LAQ824 is a HDAC inhibitor derivative of hydroxamic acid, which present antitumor effect in colon and other cancer cells. The aim of this study is to analyse the effect of LAQ824 in cell proliferation, apoptosis, motility and tumour invasion in a colon carcinoma model based on the adenoma-carcinoma sequence descrying trough which pathways LAQ824 is able to cause these effects. Here I demonstrate for the first time that a HDAC inhibitor, LAQ824, induces detachmentinduced cell death of colon cancer cell lines HCT116 and HT-29, a phenomenon called anoikis, in a caspase-dependent and p53-independent manner. In this process the component of the Wnt signalling pathway ß-catenin is involved. Furthermore LAQ824 upregulates the adhesion molecule E-cadherin expression in these cell lines independently of its repressor Snail, but probably mediated by the repressor ZEB. In addition LAQ824-induced anoikis is caused by disruption of focal adhesion complexes through inhibition of the activity of the kinases FAK and Src inhibiting cell motility indicating a strong antimetastatic potential for LAQ824.
• Das Kolonkarzinom ist die zweit häufigste Ursache für den krebsbedingten Tod Erwachsener in der westlichen Gesellschaft und gleichzeitig die am meisten verbreitete Krebsform in Europa (Bates, 2005). Es entsteht aus der fehlerhaften Erneuerung des Magenepithels (Debruyne et al., 2006). Adulte Enterocyten werden kontinuierlich von Stammzellen erneuert und erzeugen ihrerseits neue Zellen. Diese Zellen differenzieren zu absorbierenden oder sekretorischen Zellen aus. Während dieses Prozesses wandern Kolonenterozyten vom Stammzell Kompartiment, das sich an der Kryptabasis befindet, zur Oberfläche des Lumens, wo sie vom Stroma durch die Basallamina getrennt sind (Radtke and Clevers, 2005). Invasiv wachsendes Kolonkarzinom entsteht durch Mutationen der Stammzellen oder der proliferativen Zellen, welche die Basallamina zerstören (Debruyne et al., 2006). Kolonkarzinom entsteht in den meisten Fällen als Folge einer Mutation im Wnt-Signalweg (Reya and Clevers, 2005). Dies führt zur Dephosphorylierung von ß-catenin welches kontinuierlich in dem Nukleus transportiert wird. Dort bindet es an LEF/TCF, induziert die Überexpression von Onkogenen, die das Zellwachstum stimulieren (Evan and Vousden, 2001) und verhindert die Zellzyklusarrest, Zelldifferenzierung und Apoptose (Cheng and Leblond, 1974; Gordon, 1989). Außerdem spielt ß-catenin auch bei der Zell-Zell Adhäsion eine wichtige Rolle. Es interagiert mit E-cadherin (Gumbiner, 2000; Polakis, 2000), dessen Expression durch die Transkriptionsfaktoren Snail und ZEB (Perez-Moreno et al., 2001) reprimiert werden kann. Das Fehlen von E-cadherin und die Expression von Vinculin korrelieren mit Lokalinvasion und Metastasierung (Grunert et al., 2003), weil so Apoptose durch den Verlust der Zelladhäsion verhindert wird. Apoptose, die durch den Verlust der Zelladhäsion induziert wird, wird als Anoikis bezeichnet (Grossmann, 2002). Als Auslöser wird die Inaktivierung der Kinasen FAK und Src und die damit verbundene Auflösung der fokalen Adhäsionen (Golubovskaya et al., 2003). Anoikis kann der Metastasierung eines Tumors entgegenwirken, da sie das Überleben von Krebszellen frühzeitig verhindert bevor diese über Blut oder Lymphe im Körper verteilt werden und zur Entstehung sekundäre Tumore führen können (Douma et al., 2004; Versteeg et al., 2004). Metastase gelten als Hauptursache für den Krebsbedingten Tod. Aufgrund seiner Häufigkeit und Invasivität dient Kolonkarzinom als Prototyp für die Analyse von Tumorentwicklung und Metastase (Debruyne et al., 2006). Des Weiteren ist bekannt, dass Hypoacetylierung von Histonen invasive Tumore und Metastasen wie beispielweise das Kolonkarzinom fördert. Das Enzym Histon Deacetylase (HDAC) hemmt die Acetylierung der Histone (Yasui et al., 2003). In den letzten Jahren erlangen Histon Deacetylase Inhibitoren (HDIs) immer größere Bedeutung aufgrund ihrer Fähigkeit, das Tumorwachstum zu stoppen und den Kolonkarzinom zelltod zu induzieren. LAQ824 (Novartis Pharmaceuticals) gehört zur Klasse der Hydroxamate, die einen antineoplastischen Effekt auf viele solide Tumore und Leukämie haben (Drummond et al., 2005b). Die Antitumoraktivität von LAQ824 im Kolonkarzinom ist bereits anhand der Zelllinie HCT116 demonstriert worden (Atadja et al., 2004). Zusätzlich zu dieser Zelllinie habe ich HCT116 p53(-/-), HT-29 und CaCo-2 hinsichtlich der molekularen und zellulären Auswirkungen von LAQ824 auf Zellwachstum, Apoptose, Zelladhäsion und Motilität analysiert. Diese Zelllinien vereinen die wichtigsten Mutationen von p53 und des Wnt-Signalwegs, die eine entscheidende Rolle bei Tumorprogression und Invasion spielen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass LAQ824 eine starke HDAC Inhibitor Aktivität in den Kolonkarzinom Zelllinien HCT116, HT-29 und CaCo-2 hat, weil es die Hyperacetylierung der Histone–3 und -4 hervorruft. Des Weiteren zeige ich einen positiven Effekt von LAQ824 auf die Expression von p21WAF1/Cip1. Diese Ergebnisse zeigen, dass LAQ824 Einfluss auf den Zellzyklus hat. Außerdem beschreibe ich die antiproliferative und proapoptotische Wirkung von LAQ824 in diesen Zelllinien. Die Apoptoseinduktion durch LAQ824 erfolgt dabei Caspase-abhängig wie ich eindeutig mit Hilfe des PAN-Caspase Inhibitor z-VAD-fmk nachweisen konnte. ...