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Elena Herzog

• The chemiosmotic theory suggested by Peter Mitchell (Mitchell, 1961, Nature 191:144-148; see Mitchell, 1979, Science 206:1148-1159 for review) postulated that the energy released upon the oxidation of electron donor substrates is transiently stored as electrochemical proton potential, delta-p across energy-transducing membranes, which acts then as the driving force for the ATP synthesis. Membrane protein complexes can both generate and utilise a transmembrane electrochemical proton potential, either by transmembrane proton transfer or by transmembrane electron transfer coupled to protolytic reactions on opposite sides of the membrane. The dihaem-containing membrane protein complex quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic epsilon-proteobacterium Wolinella succinogenes apparently combines both of these mechanisms (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961; Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865; Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728; Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970). QFR is the terminal enzyme of anaerobic fumarate respiration that allows bacteria to use fumarate as the terminal electron acceptor (Kröger, 1978, Biochim Biophys Acta 505:129-45; Lancaster, 2004, In: Respiration in Archaea and Bacteria Volume 1:57-85). QFR couples the two-electron reduction of fumarate to succinate to the two-electron oxidation of quinol to quinone. QFR contains two haem b groups bound by the transmembrane subunit C, which are termed the ‘proximal haem’, bP, and the ‘distal haem’, bD, according to the relative proximity to the hydrophilic subunits A and B (Lancaster et al, 1999, Nature 402:377-85). The two-electron transfer via the two haem groups has been proposed (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1565:215-231) and demonstrated (Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970) to be coupled to a compensatory, parallel transfer of two protons via a transmembrane proton transfer pathway. The two most prominent constituents of the proposed pathway were suggested to be the haem bD ring C propionate and the side chain of amino-acid residue Glu C180, after which the proton transfer pathway was named the ‘E-pathway’ (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 565:215-231). The essential role of Glu C180 was supported by site-directed mutagenesis and structural and functional characterization of the enzyme E180Q, where the Glu C180 was replaced with a Gln residue (Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865). Moreover, multiconformer continuum electrostatics (MCCE) calculations (Haas and Lancaster 2004, Biophys J 87:4298-4315) and Fouriertransformed infrared (FTIR) spectroscopy experiments (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961) indicated the Glu C180 side chain to undergo a combination of a conformational change and protonation upon haem reduction. The contribution of haem bD propionate is less clear, however, a combination of 13C labelling of the haem propionates with redox-induced FTIR experiments (Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728) and MCCE calculations (Haas and Lancaster, 2004, Biophys J 87:4298-4315) support a change in protonation, possibly accompanied by a change in environment upon haem reduction. These experiments and their results strongly support the existence of the ‘E-pathway’ which is transiently open during the reduction of the haem groups and blocked in the oxidized state of the enzyme (Lancaster, 2002b, Biochim Biophys Acta 1565:215-231). All available crystal structures of the QFR, however, are those of the oxidized enzyme. Therefore, it is advantageous to perform simulations of various redox states of the enzyme to determine for instance, how the side-chain of Glu C180 and haem bD ring C propionate behave upon changes of the redox states of the haem groups and why is the ‘E-pathway’ blocked in the oxidized state of the enzyme. Although the distal haem ring C propionate and Glu C180 were identified as the most prominent components of the proton transfer pathway, it was not clear, on the basis of the structure, how proton transfer could occur between them. In addition, two constituents are not enough to span the membrane region and the additional participants in the proton transfer pathway must be identified. Since an atomistic investigation of proton transfer in this system is not yet possible experimentally, I used available theoretical methods such as classical molecular dynamics (MD) simulation (Alder and Wainwright, 1959, J Phys Chem 31:459-466; McCammon et al, 1977, Nature 267:585-590) and Q-HOP molecular dynamics (Q-HOP MD) simulation (Lill and Helms, 2001, J Chem Phys 115:7993-8005) to investigate the postulated mechanism of electron coupled proton transfer in QFR. MD simulations allowed us to move away from static difference pictures obtained from FTIR experiments and MCCE calculations. The advantage of the MD simulations over the experiments and the simulations performed so far is that the time-dependent properties could now be analyzed. The behaviour of various residues and their side-chains and any environmental changes may be directly observed during MD simulations. Although classical MD simulations cannot be used to study proton transfer reactions, they can provide information on formation of configurations that would allow either direct proton transfer between donor and acceptor residues or indirect proton transfer mediated by water molecules. To avoid the static protonation of residues which is inherent in classical MD simulations, Q-HOP MD simulations were performed which explicitly describe proton transfer reactions by allowing the change of the protonation state of residues ‘on the fly’. The structures obtained after classical molecular dynamics simulations ....
• Nach der von Peter Mitchell (Mitchell, 1961, Nature 191:144-148; siehe Mitchell, 1979, Science 206:1148-1159 für eine Übersicht) vorgeschlagenen chemiosmotischen Theorie wird die bei der Oxidation von Elektronendonorsubstraten freiwerdende Energie in Form eines elektrochemischen Protonenpotentials delta-p über energiewandelnde Membranen zwischengespeichert, welches dann zur Synthese von ATP verwendet werden kann. Sowohl die Erzeugung als auch die Verwendung des delta-p erfolgt mit Hilfe von Membranproteinkomplexen, entweder durch Protonentranslokation über die Membran oder durch Kopplung von protolytischen Reaktionen auf unterschiedlichen Seiten der Membran durch membrandurchspannende Elektronenübertragung. Der dihämhaltige Membranproteinkomplex Chinol:Fumarat-Reduktase (QFR) vom anaeroben epsilon-Proteobakterium Wolinella succinogenes vereinigt offenbar diese beiden Mechanismen (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961; Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865; Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728; Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970). QFR ist das terminale Enzym der anaeroben Fumarat-Atmung, die Bakterien die Verwendung von Fumarat als terminalen Elektronenakzeptor ermöglicht (Kröger, 1978, Biochim Biophys Acta 505:129-45; Lancaster, 2004, In: Respiration in Archaea and Bacteria Volume 1:57-85). Das QFR-Enzym koppelt die Zwei-Elektronen-Reduktion von Fumarat zu Succinat an die Zwei-Elektronen-Oxidation von Chinol zu Chinon. Es enthält zwei von der membranständigen C-Untereinheit gebundenen Häm b-Gruppen, welche aufgrund ihrer relativen Lage zu den hydrophilen Untereinheiten A und B als das ‚proximale Häm’ bP, und das ‚distale Häm’ bD bezeichnet werden (Lancaster et al, 1999, Nature 402:377-385). Es wurde vorgeschlagen (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1565:215-231) und gezeigt (Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970), dass die Übertragung von zwei Elektronen über die beiden Hämgruppen an die kompensatorische, parallele Übertragung von zwei Protonen über einen membrandurchspannenden Protonentranslokationsweg gekoppelt ist. Als auffälligste Bestandteile des postulierten Protonentranslokationswegs wurden das C-Ring-Propionat von Häm bD und die Seitenkette des Aminosäurerests Glutamat C180 vorgeschlagen, nach dessen Einbuchstabencode der Protonentranslokationsweg „E-Weg“ genannt wurde (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1565:215-231). Die essentielle Rolle von Glu C180 wurde durch gerichtete Mutagenese und strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Variantenenzyms E180Q gezeigt, bei dem der Glutamatrest durch ein Glutaminrest ersetzt wurde (Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865). Außerdem weisen Multikonformer-Kontinuumelektrostatik (MCCE)- Rechnungen (Haas and Lancaster 2004, Biophys J 87:4298-4315) und Fourier-Transform Infrarot (FTIR)-spektroskopische Experimente (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961) darauf hin, dass bei Hämreduktion eine Kombination aus Konformationsänderung und Protonierungsänderung der Glu C180-Seitenkette erfolgt. Die Beteiligung der Häm bD-Propionatgruppe ist weniger klar, allerdings unterstützen eine Kombination aus 13CMarkierung der Hämpropionate und redox-induzierten FTIR-Experimenten (Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728) sowie MCCE-Rechnungen (Haas and Lancaster, 2004, Biophys J 87:4298-4315) eine Protonierungsänderung, möglicherweise in Kombination mit einer Umgebungsänderung, nach Häm-b-Reduktion. Diese experimentellen Ergebnisse unterstützen die Existenz des im oxidierten Enzym blockierten ‚E-Wegs’, der bei Reduktion der Hämgruppen transient geöffnet wird (Lancaster, 2002, Biochim Biophys Acta 1565:215-231). Alle verfügbaren Kristallstrukturen der QFR sind allerdings die des oxidierten Enzyms. Deshalb ist es vorteilhaft, Simulationen des Enzyms in verschiedenen Redoxzuständen durchzuführen, um z.B. mögliche Konformationsänderungen der Seitenkette von Glu C180 und der C-Ring-Hämpropionatgruppe bei Veränderung des Oxidationszustandes der Hämgruppen zu diskutieren und zu erkennen, warum der ‚E-Weg’ im oxidierten Zustand des Enzyms blockiert ist. Obwohl die Beteiligung der C-Ring- Propionatgruppe von Häm bD und der Seitenkette von Glu180 am Protonenübertragungsweg gezeigt wurde, war es auf Grundlage der Struktur unklar, wie die Protonenübertragung zwischen beiden erfolgt. Außerdem sind zwei Bestandteile nicht ausreichend, um die membranüberspannende Protonentranslokation zu gewährleisten, so dass weitere Bestandteile des Protonentranslokatioswegs identifiziert werden müssen. ....