Open Access

Karla Werner

• Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.
• Light-sensitive proteins are particularly suited for the investigation of the relation between dynamical changes in protein structure and their function. Such biological photoreceptors are readily activated with short (laser) light pulses, and thus excellent time-resolution can be achieved for the study of dynamical structure alterations. In addition, because they are signal-transduction proteins, one may expect that considerable conformational transitions occur during their signalling state formation and its decay. For many different photoreceptor proteins details of the light-induced conversion via a bound chromophore into a signalling state and eventually a biological response have been published. This work deals with the interaction between (membrane) proteins and light, studied by different NMR methods with a main focus on timeresolved solution NMR spectroscopy. Three systems of different size and origin have been investigated: the small α-helical peptide gramicidin A, the GPCR (G-protein coupled receptor) bovine rhodopsin and the BLUF (blue light using FAD) domain of the putative membrane protein Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) from E. coli. Gramicidin A (gA), an antibiotic produced by the soil bacterium B. brevis, forms channels for the transport of monovalent cations. Stabilized in detergent micelles, gA surprisingly showed an interaction with blue light, which has been studied in more detail by static and time-resolved NMR methods. Based on the findings described in Chapter 2, it is postulated that a tryptophan residue (Trp9) undergoes a light-induced conformational change, from the preferred solution conformation to a ~70:30 equilibrium of the solution conformation and a second conformation. It was postulated that the second conformation of Trp9 may be identical with the solid state conformation. The life-time of the light-induced new conformation was found to be ~1 sec. The G-protein coupled receptor rhodopsin is responsible for the transduction of light signals in photoreceptor cells. Capture of a photon isomerizes the bound chromophore 11-cis retinal and induces conformational changes in the protein. The active metarhodopsin II (metaII) state is capable of mediating an enzymatic cascade which leads to a neural impulse. A wide range of NMR methods, including time-resolved NMR techniques and solid state NMR have been applied to investigate the dynamics of wild type bovine rhodopsin stabilized in detergent micelles or lipids. In Chapter 3.1 several optimisation steps towards an inexpensive isotope labelled medium for mammalian cells are described. In the following, samples with half of all amino acids isotope labelled were prepared, which is the highest labelling rate reported for a mammalian GPCR so far. With the labelled samples at hand, it could be demonstrated that specific regions of very large macromolecules are well suited for a detailed characterisation by high resolution liquid NMR. Specifically, the C-terminus, which is located on the cytoplasmic side of rhodopsin, was found to display mobility similar to soluble proteins of moderate size. Additionally, no relevant structural features could be detected for the C-terminus. In Chapter 3.2 the non-invasive assignment of the backbone resonances of all five tryptophan residues using a combination of solution and solid state NMR spectroscopy of 13C- and 15N-isotope labelled rhodopsin is reported. Specifically, samples with all possible 13C’i-1- carbonyl/15Ni-tryptophan isotope labelled amid pairs have been prepared. Partial assignment of the indole side chains could be achieved in solution by analysis of differential solvent exchange rates and measurement of heteronuclear relaxation rates. The results suggest that the combined solution and solid state NMR approach can provide highly complementary information in the study of structure and dynamics of large membrane proteins. In Chapter 3.3 time-resolved NMR techniques for the in vitro investigation of the metaII decay of the 150 kD large rhodopsin/micelle complex at different temperatures are described. The analysis of time-resolved proton experiments performed on unlabelled protein, focused on the far downfield shifted indole region. For the considered signals strong chemical shifting and differential decay behaviour was observed after the metaII state induction. Besides the expected metaII decay, a second much slower process is observed, possibly reflecting on the slow unfolding of secondary structure elements in the apoprotein upon the loss of the chromophore. The BLUF domains are members of the blue-light receptor family that uses FAD as a chromophore. In Chapter 4 the fate of the light-adapted state of the E. coli BLUF domain is investigated in detail on protein and ligand level applying time resolved 1H and 31P detected experiments respectively. Following the proton detected dark adaptation at different temperatures the activation energy of the light state could be quantified. For the very first time, 31P detected NMR experiments were successfully applied to characterize a biologically relevant process in a time-dependent manner.