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Radhan Ramadass

• Cellular metabolism can be envisaged by fluorescence lifetime imaging of fluorophores sensitive to specific intracellular factors such as [H+], [Ca2+], [O2], membrane potential, temperature, polarity of the probe environment, and alterations in the conformation and interactions of macromolecules. Lifetime measurements of the probes allow the quantitative determination of the intracellular factors. Fluorescence microscopy taking advantage of time-correlated single photon counting is a novel method that outperforms all other techniques with its single photon sensitivity and picoseconds time resolution. In this work, a time- and space-correlated single photon counting system was established to investigate the behavior of 2-(4-(dimethylamino)styryl)-1-methylpyridinium iodide (DASPMI) in living cells. DASPMI is known to selectively stain mitochondria in living cells. The uptake and fluorescence intensity of DASPMI in mitochondria is a dynamic measure of membrane potential. Hence, an endeavour was made to elucidate the mechanism of DASPMI fluorescence by obtaining spectrally-resolved fluorescence decays in different solvents. A bi-exponential decay model was sufficient to globally describe the wavelength dependent fluorescence in ethanol and chloroform. While in glycerol, a three-exponential decay model was necessary for global analysis. In the polar low-viscous solvent water, a mono-exponential decay model fitted the decay data. The sensitivity of DASPMI fluorescence to solvent viscosity was analysed using various proportions of glycerol/ethanol mixtures. The lifetimes were found to increase with increasing solvent viscosity. The negative amplitudes of the short lifetime component found in chloroform and glycerol at the longer wavelengths validated the formation of new excited state species from the initially excited state. Time-resolved emission spectra in chloroform and glycerol showed a biphasic increase of spectral width and emission maxima. The spectral width had an initial fast increase within 150 ps and a near constant thereafter. A two-state model based on solvation of the initially excited state and further formation of TICT state has been proposed to explain the excited state kinetics and has been substantiated by the de-composition of time-resolved spectra. The knowledge of DASPMI photophysics in a variety of solvents now provides the means of deducing complex physiological parameters of mitochondria from its behavior in living cells. Spatially-resolved fluorescence decays from single mitochondria or only very few organelles of XTH2 cells signified distinctive three-exponential decay kinetics of viscous environment. Based on DASPMI photophysics in a variety of solvents, these lifetimes have been attributed to the fluorescence from locally excited state (LE), intramolecular charge transfer state (ICT) and twisted intramolecular charge transfer (TICT) state. A considerable variation in lifetime among mitochondria of different morphology and within single cell was evident corresponding to the high physiological variations within single cells. Considerable shortening of the short lifetime component (τ1) under high membrane potential condition, such as in the presence of ATP and/or substrate, was similar to quenching and dramatic decrease of lifetime in polar solvents. Under these conditions τ2 and τ3 increased with decreasing contribution. Upon treatment with ionophore nigericin, hyperpolarization of mitochondria resulted in remarkable shortening of τ1 from 159 ps to 38 ps. Inhibiting respiration by cyanide resulted in notable increase of mean lifetime and decrease of mitochondrial fluorescence. Increase of DASPMI fluorescence on conditions elevating mitochondrial membrane potential has been attributed to uptake according Nernst distributions, to de-localisation of π electrons, quenching processes of the methyl pyridinium moiety and restricted torsional dynamics at the mitochondrial inner membrane. Accordingly, determination of anisotropy in DASPMI stained mitochondria in living XTH2 cells, revealed dependence of anisotropy on membrane potential. Such changes in anisotropy attributed to restriction of the torsional dynamics about the flexible single bonds neighboring the olefinic double bond revealed the previously known sub-mitochondrial zones with higher membrane potential along its length. Membrane-potential-dependent changes in anisotropy have further been demonstrated in senescent chick embryo fibroblasts. In conclusion, spectroscopic observations of excited-state kinetics of DASPMI in solvents and its behavior in living cells had revealed for the first time its localisation, mechanism of voltage sensitive fluorescence and its membrane-potential-dependent anisotropy in living cells. The simultaneous dependence of DASPMI photophysics on mitochondrial inner membrane viscosity and transmembrane potential has been highlighted.
• Der Zellstoffwechsel kann durch die räumliche Messung der Fluoreszenz-Abklingzeit von Fluorophoren, die auf spezifische Änderungen intrazellulärer Bedingungen reagieren, wie z.B. [H+], [Ca2+], [O2], Membranpotential, Temperatur, lokale Polarität und Konformationsänderungen oder Interaktion von Makromolekülen ins Auge gefasst werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Versuchsstand zur Zeit- und Orts-korrelierten Einzelphotonenregistrierung aufgebaut und spektral und ortsaufgelöste Messungen der Fluoreszenz-Abklingzeit von 2-(4-(dimethylamino)styryl)-1-methylpyridinium iodide (DASPMI) in lebenden Zellen durchgeführt. DASPMI reichert sich in lebenden Zellen in den Mitochondrien an, wobei sowohl der Grad der Anreicherung als auch die Fluoreszenzintensität vom mitochondrialen Membranpotential abhängen. Um den Mechanismus der Fluoreszenz von DASPMI aufzuklären wurden zunächst zeitaufgelöste Spektren in unterschiedlich polaren Lösungsmitteln aufgenommen: In Ethanol und Chloroform konnte der Fluoreszenzabfall global durch ein bi-exponentielles Modell beschrieben werden, wogegen in Glycerin ein tri-exponentielles Modell notwendig war. In Wasser, das stark polar und niedrig viskös ist war ein mono-exponentielles Modell hinreichend. Der Einfluss der Lösungsmittelviskosität wurde in Ethanol / g-Mischungelyzerinn unterschiedlicher Verhältnisse untersucht. Mit zunehmender Viskosität des Lösungsmittels stieg auch die Fluoreszenz-Abklingzeit. Das Auftreten einer negativen Amplitude der kurzen Abklingzeit in Chloroform und Glycerol bei größeren Wellenlängen belegt die Entstehung eines weiteren angeregten Zustandes aus dem anfänglichen angeregten Zustand. Die zeitaufgelösten Emissionsspektren in Chloroform und Glycerol zeigten einen biphasischen Anstieg des Emissionsmaximums und der spektralen Breite. Die spektrale Breite stieg anfänglich stark an und blieb nach 150 ps nahezu konstant. Um die Kinetik des angeregten Zustands zu erklären, wurde ein zweistufiges Modell entwickelt, das auf der Solvation des initialen angeregten Zustands und des TICT Zustands basiert. Die Untersuchung von einzelnen Mitochondrien bzw. wenigen Organellen von XTH2-Zellen zeigte eine tri-exponentielle Kinetik des Fluoreszenzabfalls. Auf Basis der photophysikalischen Eigenschaften von DASPMI in verschiedenen Lösungsmitteln wurden die gefundenen Fluoreszenz-Abklingzeiten drei unterschiedlichen angeregten Zuständen zugeordnet (locally excited (LE), intramolecular charge transfer (ICT) und twisted intramolecular charge transfer (TICT) state. Eine bemerkenswerte Variation in der Abklingzeit von Mitochondrien unterschiedlicher Form innerhalb einer Zelle war offensichtlich, was den hohen Variabilitaten der Zellphysiologie entspricht. Die starke Verringerung der kurzen Abklingzeit (1) unter Bedingungen hohen Membranpotentials, wie z. B. in Anwesenheit von ATP oder Substrat entsprach dem Quenching und der dramatischen Abnahme der Abklingzeit in polarem Lösungsmittel. Unter diesen Bedingungen nahmen 2 und 3 mit abnehmendem Beitrag zu. Nach Behandlung mit dem Ionophor Nigericin, führte die Hyperpolarisation der Mitochondrien zu einer bemerkenswerten Verkürzung von 1 von 159 ps auf 38 ps. Die Hemmung der Zellatmung mit Cyanid führte zu einer beachtlichen Zunahme der Abklingzeit und einer Abnahme der mitochondrialen Fluoreszenz. Die Zunahme der DASPMI Fluoreszenz unter Bedingungen eines erhöhten mitochondrialen Membranpotentials ist einer Aufnahme entsprechend einer Nernst-Verteilung, der Delokalisation von -Elektronen, Quenching der Methylpyridinium-Gruppe und der eingeschränkten Torsionsdynamik an der inneren Mitochondrienmembran zugeschrieben worden. Dementsprechend enthüllte die Bestimmung der Anisotropie von DASPMI-markierten Mitochondrien in lebenden XTH2-Zellen, die Abhängigkeit der Anisotropie vom Membranpotential. Solche Änderungen in der Anisotropie, die der Beschränkung der Torsionsdynamik um die flexiblen Einzelbindungen in Nachbarschaft der olefinischen Doppelbindung zugeschrieben werden, erwiesen die bereits vorher bekannten submitochondrialen Zonen erhöhten Membranpotentials entlang des Mitochondriums. Der direkte Einfluss des lokalen elektrischen Feldes auf das Übergangsdipolmoment des Farbstoffs und seiner Torsionsdynamik spiegelt Veränderungen des mitochondrialen Energiestatus in lebenden Zellen wieder. Membranpotential-abhängige Veränderungen der Anisotropie wurden darüber hinaus in seneszenten Hühnerembryo-Fibroblasten nachgewiesen. Zusammenfassend wurden spektroskopische Beobachtungen der Kinetik des angeregten Zustands von DASPMI in verschiedenen Lösungsmitteln sowie in lebenden Zellen durchgeführt. Damit konnte zum ersten Mal die genaue Lokalisierung, der Mechanismus spannungssensitiver Fluoreszenz und die Membranpotential-abhängige Anisotropie in lebenden Zellen gezeigt werden.